3.1.1 Obtención del aceite esencial.

El material vegetal empleado en esta investigación serán hojas e inflorescencias de

orégano común (Lippia origanoides Kunth) de la zona del Alto Patía, vereda Alto de
Mayo, municipio de Taminango (N).

El aceite esencial se extraerá mediante la técnica de hidrodestilación, según la

metodología descrita por Bolaños (2010), usando vapor saturado a presión
atmosférica bajo las siguientes condiciones de extracción: densidad del lecho (D.L.) de
95,4g/L, presión de 3,7 psig y tiempo de extracción de 3,4 horas.

3.1.2 Fraccionamiento de aceite esencial mediante cromatografía en capa

delgada (C.C.D.).

El fraccionamiento de aceite esencial se realizará mediante la aplicación de 200 mg

de aceite por placa de cromatografía en capa delgada preparativa (20 x 20 cm, con
fase estacionaria de 1mm de sílica-gel 60GF254) utilizando como fase móvil
diclorometano y hexano (2:1 v/v) (Sridhar et al.,2003).

Las fracciones serán visualizadas con luz ultravioleta con longitud de onda de 254 nm
a través de revelado con solución de vainilina sulfúrica.

3.2 Bioensayos.

3.2.1 Aislamiento de los fitopatógenos.

Para el aislamiento de Rhizoctonia solani, se tomarán muestras de raíces, estolones y

tallos sintomáticos con esclerocios colectados en un cultivo de papa.Para el caso del
hongo Alternaria solani, se colectarán muestras de tejido foliar afectado por la
enfermedad, identificando para cada muestra su posición geográfica mediante GPS.

Las muestras serán transportadas al laboratorio para su aislamiento siguiendo la

metodología descrita por Cedeño et al. (2001) y Agrios (2002), para lo cual se cortaran
los tejidos sintomáticos en pedazos pequeños (5 mm x 5 mm), sumergiéndolos por
tres minutos en solución 0,5% hipoclorito de sodio, lavando tres veces en agua
destilada y sembrándolos asépticamente en cajas de Petri con medio Agar PDA
acidificado y repicando por transferencia continua hasta obtener un aislamiento puro
delos patógenos.

Para el caso del Oomyceto Phytophthora infestans, se colectarán muestras de tejido

foliar afectado con el patógeno en un cultivo comercial de papa identificando su
posición geográfica mediante GPS; este material será llevado al laboratorio, cortado
en pedazos pequeños (5 mm x 5 mm), desinfectado con hipoclorito de sodio al 3% por
dos minutos y enjuague en agua destilada durante un minuto, éste material se
sembrará en cajas de Petri con medio nutritivo Agar tomatesegún la metodología de
Caicedo y Chalparizan (2008). El patógeno se purificará por transferencia continua a
nuevas cajas de Petri hasta obtener una colonia pura.

3.2.2 Evaluación de la actividad biofungicida del aceite esencial.

La evaluación de la actividad antifungica del aceite esencial de orégano común (L.

origanoides) se determinará mediante el crecimiento micelial in vitro de los patógenos
P. infestans, R. solani y A. solani en medios de cultivo enmendados bajo
concentraciones de 10, 100 y 1.000 µg.ml-1 emulsificando con Tween 20 en relación
1:1 para cada relación.
En cada caja de Petri se sembrarán discos de micelio de 1,1 cm de diámetro obtenidos
con sacabocado de aislamientos puros de los patógenos sembrados 8 días antes del
ensayo, cada crecimiento micelial se medirá mediante el programa gráfico Tpsdig2®
(Rohlf, 2005) después de un período de incubación de 8 días a temperatura promedio
de 22°C.

Determinando el porcentaje de crecimiento respecto al testigo absoluto sin enmendar,

utilizando la relación:

DMCM −1,1 cm
PC = x 100
DMCA

Dónde: PC = porcentaje de crecimiento; DMCM = diámetro medio de la colonia

creciendo en tratamiento; 1,1 cm corresponde al diámetro del cilindro con micelio y
DMCA = diámetro medio de la colonia sin enmendar (Riveros et al., 2003).

El ensayo se dispondrá siguiendo un diseño completamente al azar, utilizando cinco

repeticiones por tratamiento, los datos obtenidos a través de la evaluación del
porcentaje de crecimiento serán normalizados con la relación arcosen√x y sometidos a
un análisis de varianza (0,05), encontradas diferencias se procederá a realizar una
comparación de medias mediante prueba de Tukey a 5% de probabilidad, utilizando el
paquete estadístico S.A.S versión 9.1.

3.2.3 Identificación y recuperación de la fracción antifúngica del aceite esencial

mediante la técnica (C.C.D).

La fracción activa de aceite esencial será determinada basándose en la técnica de

bioautografia en capa delgada descrita por Sridhar et al. (2003). Se aplicará 75 mg de
aceite esencial en una placa preparativa (20 x 5 cm). La placa se disolverá con
diclorometano:hexano (2:1 v/v), y revelada con luz UV para la identificación de sus
fracciones; posteriormente se cubrirá con una fina capa de medio de cultivo e
inoculado con estructuras reproductivas de los fitopatógenos Phytophthora infestans
(3x105 esporangios/ml), Alternaria solani (1x106 esporas/ml)y Rhyzoctonia solani
(1x106 esporas/ml). La placa se depositará en una bandeja esterilizada y humedecida
con agua estéril y cubierta con una película plástica de PVC transparente, luego se
incubará a 20ºC por un período de 8 días para el crecimiento de los patógenos. La
región donde el hongo no se desarrolle será atribuida a la fracción activa del aceite
esencial. Esa fracción se identificará en otras placas por comparación entre el factor
de retención y el largo de la banda.

Para recuperar la fracción activa de los aceites esenciales que incidan en el

crecimiento del patógeno, se procederá a raspar cada placa (solamente las que se
visualizaron con luz ultravioleta), posteriormente se extraerá con diclorometano y con
agitación magnética por 3 horas, se recuperará la fracción evaporando el solvente con
un rotaevaporador.

3.2.4 Identificación y cuantificación de la fracción activa del aceite esencial

mediante cromatografía de gases (GC-FID).

El aceite esencial de orégano se someterá a una prueba cromatográfica para

determinar sus componentes químicos. El análisis se realizará con un Cromatógrafo
de Gases con detector de ionización en llama FID SHIMADZUGC-17A. Columna
Capilar DB-5 J&W (30m x 0,25mm ID 0,25um), gas carrier: Helio DAP (99,995%) a
flujo de 1,0 mL/min, presión de entrada de la columna: 80 kPa, con temperatura
inyector de 250°C, modo inyección: Split, relación 50:1; detector FID a temperatura de
280°C.

Programación de Temperatura Columna: 45°C (5 min) hasta 150°C (2 min) a razón de

4°C/ min, posteriormente se incrementará a 250°C (5 min) a razón de 5°C/min, por
último se llevará a una temperatura de 275°C (15 min) aumentando a 10°C/min.

La identificación de los diferentes compuestos presentes en los aceites esenciales se

realizará mediante el análisis de los espectros de masas y complementariamente
mediante el método de cálculo de índices de Kovats (1958). Este método requiere de
los tiempos de retención obtenidos por cromatografía de gases y se relaciona con los
tiempos de retención de una mezcla de parafinas de C6 a C28 (Estándar RESTEK,
Bellefonte) analizada en las mismas condiciones cromatográficas.