TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP.

HCM
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

Tiểu luận:

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12

TỪ VI KHUẨN Propionibacterium shermanii

Nguyễn Thụy Hai MSHV : 12310729

Thi Phối Phối MSHV : 12310746

TPHCM 04 - 2013
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Lời mở đầu

Vitamin B12 là một loại vitamin rất cần thiết cho cơ thể con người. Trong cơ
thể, nó tồn tại dưới dạng bốn dẫn xuất mà người ta gọi là cobalamin và hoạt
động như các yếu tố enzyme. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của
viatmin B12 trong việc chữa trị bệnh thiếu máu ác tính và các bệnh về viêm dây
thần kinh. Vitamin B12 chỉ có nhiều trong các thực phẩm đi từ nguyên liệu động
vật, thực vật chứa rất ít vitamin B12. Vì thế nhu cầu tổng hợp viatmin B12 trên
quy mô công nghiệp là thiết yếu, để bổ sung vitamin B12 cho những người ăn
chay trường và chữa các loại bệnh do thiếu vitamin B12. Trong công nghiệp,
vitamin B12 hoàn toàn được tổng hợp bởi các vi sinh vật.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 1

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

PHẦN I: TỒNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung

Vitamin là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ cho hoạt động chuyển hoá
bình thường của cơ thể sinh vật. Có nhiều loại vitamin và chúng khác nhau về
bản chất hoá học lẫn tác dụng sinh lý. Vitamin thúc đẩy các qúa trình trao đổi
chất và là thành phần không thể thiếu được trong cấu tạo của nhiều loại enzym.
Do đó việc nghiên cứu, sản xuất vitamin trở nên rất cần thiết. Vitamin được sử
dụng chủ yếu ở ba lĩnh vực:
- Y học.
- Thực phẩm cho người.
- Thức ăn cho gia súc.
Các nhà khoa học đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau trong công nghệ
sản xuất vitamin. Bao gồm các phương pháp sau:
- Chiết rút từ nguồn nguyên liệu thực vật v| động vật.
- Tổng hợp hóa học.
- Tổng hợp sinh học.
Cả ba phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng, với mỗi phương
pháp cho ra những vitamin riêng. Do đó để sản xuất vitamin từ các nguồn
nguyên liệu và phương pháp khác nhau, người ta thường nhắm vào hiệu quả
của phương pháp, trong đó giá thành đóng vai trò quan trọng cho việc quyết
định phương pháp sản xuất.
Công nghệ sản xuất vitamin theo phương pháp sinh học chỉ tập trung vào một
số vitamin đặc bao gồm vitamin B12, vitamin B2, hỗn hợp vitamin D2 và các
vitamin nhóm B khác.
1.2. Vitamin B12
1.2.1. Giới thiệu chung
Thuật ngữ vitamin B12 rất rộng, dùng để chỉ những hợp chất có chứa
cobalamin vì trong phân tử của nó có chứa kim loại Coban. Tại hội nghị quốc

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 2

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

tế về hóa sinh năm 1961, các nhà bác học đã đề nghị gọi tên nhóm vitamin B12
là corinoit. Hiện nay người ta biết khoảng 100 loại chất tương tự vitamin B12
trong số đó có các chất quan trọng thường gặp như cyancobalamin (B12),
hydroxycobalamin (B12a), nitritocobalamin. Hợp chất corinoit bị loại mất coban
được gọi là corin, còn acid corinic là corin có cả các nhánh bên. Dạng tự nhiên
của những hợp chất cobalamin là adenosylcobalamin, methylcobalamin và
hydroxocobalamin.
Cyanocobalamin, được định nghĩa là vitamin B12, là một hợp chất
cobalamin bền vững, được sản xuất ở quy mô công nghiệp nhưng không tìm
thấy trong tự nhiên. Vitamin B12 là một vitamin quan trọng để chữa bệnh thiếu
máu nguy hiểm và bệnh viêm dây thần kinh ngoại biên, đồng thời nó cũng là
một vitamin quan trọng cần bổ sung trong khẩu phần ăn động vật và cả con
người.
Bởi vì tổng hợp vitamin B12 bằng phương pháp hóa học khó khăn và tốn
kém nên người ta thường sản xuất vitamin B12 đại trà bằng phương pháp lên
men vi sinh vật gián đoạn hoặc kết hợp gián đoạn và liên tục.
1.2.2. Cấu tạo hóa học và tính chất của vitamin B12
- Tên quốc tế: cyanocobalamin và hydroxo-cobanamin
- Công thức hóa học: C63H90N14O14PCo.
- Cấu trúc hóa học của vitamin B12 bao gồm 2 phần:
+ Phần cobamid gồm 4 nhân pyrol đã hydrogen hóa, giữa nhân là
nguyên tử coban hóa trị 3; các nhân này đã bị thế bởi nhóm methyl, acetamid
và propionamid.
+ Phần nucleotid gồm 5,6-dimethylbenzimidazol đã este hóa bởi acid
phosphoric và 2 phần này nối với nhau qua cầu isopropanol.
Nguyên tử coban liên kết cộng hóa trị với 1 nitơ của một nhân pyrol, liên kết
phối trí với 3 nitơ của 3 nhân pyrol còn lại và nitơ trong nhân benzimidazol;
liên kết ion với acid phosphoric. Hóa trị cuối cùng của coban liên kết với các
nhóm chức khác nhau tạo ra các vitamin B12 khác nhau. Hai chế phẩm vững

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 3

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

bền khi bảo quản và là chế phẩm dược dụng là cyanocobalamin có công thức
cấu tạo như trên và hydroxocobalamin khi thay CN bằng nhóm OH.

Hình 1: Cấu trúc phân tử vitamin

- Vitamin B12 thường ở dạng kết tinh, có kích thước rất nhỏ, màu đỏ sẫm,
không có mùi và vị.
- Tan trong nước, trong các dung dịch trung tính, cồn; không tan trong
eter, acetol, benzen, clorofoc.
- Chúng bền nhiệt khi ở dạng cyamit, nhưng khi tiếp xúc với kim loại
nặng thì rất dễ mất hoạt tính, vitamin B12 không bền trong môi trƣờng
pH kiềm.
- Vitamin B12 có trong gan và các bộ phận khác của động vật, nhưng lại
không thấy có mặt ở các tổ chức thực vật bậc cao.
Có thể nói vitamin B12 có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình trao đổi
chất: nếu thiếu hoặc không đủ vitamin B12 trong cơ thể con người và động vật
sẽ gây ra hiện tượng rối loạn trao đổi chất hydratcacbon và axit béo. Cụ thể:
vitamin B12 tham gia vào việc sinh tổng hợp enzym metylmalomye – CoA -
mutase và rất nhiều enzym quan trọng khác. Các enzym này tham gia vào các
phản ứng chuyển metyl và quá trình tổng hợp methionin, cholin, thimin.
1.3. Sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp
Khi vitamin B12 được sản xuất theo quy mô công nghiệp thì ta phải quan
tâm, kiểm soát đến các yếu tố như giống vi sinh vật, cơ chất sử dụng, quá trình

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 4

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

phản ứng và quá trình thu nhận, tinh chế sản phẩm. Bản chất của quá trình sản
xuất theo quy mô công nghiệp là sản phẩm của quá trình có định hướng rõ
ràng, qui trình sản xuất được kiểm soát từ khâu sản xuất giống đến quá trình
lên men và cuối cùng là quá trình thu nhận sản phẩm.
Như vậy quá trình lên men công nghiệp thực chất là thực hiện và kiểm
soát những công việc sau:
 Tạo giống và nâng cao chất lượng giống.
 Tính toán, thiết kế, chế tạo các thết bị lên men phù hợp với công nghiệp và
sản phẩm.
 Thực hiện các kĩ thuật trong lên men.
 Tách, thu nhận và tinh chế sản phẩm.
Ta cần phải giải quyết hai vấn đề sau:
a) Kỹ thuật lên men: nghiên cứu điều kiện tối ƣu trong quá trình lên men
như thiết bị, công nghệ…nhằm đạt được hiệu suất cao cho các sản phẩm
mong muốn.
b) Kỹ thuật thu hồi sản phẩm sau lên men và chế biến thành các dạng
thương phẩm, nghiên cứu các điều kiện trích ly, tinh chế nhằm thu được
các chất có hoạt tính sinh học dạng tinh khiết. Nhiều kỹ thuật trong công
nghiệp hóa học như: lọc, kết tủa, ly tâm, kết tinh, hấp phụ, chưng cất,
sấy… đều được sử dụng ở đây. Điều kiện khác nhau cần lưu ý tới là các
chất có hoạt tính sinh học thường không bền vững với các điều kiện
nhiệt độ, pH và các yếu tố vật lý khác.
Điều kiện và phương pháp nuôi cấy vi sinh vật có ảnh hưởng đến sự hình
thành thành phần và tính chất của chất lỏng canh trường. Các chế độ sinh tổng
hợp cần hướng tới kết quả thu nhận môi trường có chất nền và những tạp chất
khác còn lại là tồi thiểu và có nồng độ các sản phẩm mong muốn là cực đại.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 5

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT

Sản xuất vitamin B12 trong công nghiệp đi từ nguyên liệu vi sinh vật và
rỉ đường hay hèm rượu, dịch whey.
2.1 Vi sinh vật
2.1.1. Yêu cầu về nguyên liệu
Trong công nghệ lên men, giống vi sinh vật đóng vai trò hết sức quan
trọng, ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng và giá thành của sản phẩm. Như
vậy, giống vi sinh vật sử dụng trong công nghệ lên men vitamin B12 phải thỏa
mãn những yêu cầu sau:
 Giống vi sinh vật đó phải cho ra vitamin B12 có chất lượng và số lượng cao
hơn hẳn các sản phẩm phụ khác.
 Năng suất cao.
 Phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm.
 Sản phẩm của quá trình phải dễ dàng tách ra khỏi các tạp chất môi trường và
sinh khối vi sinh vật giống.
 Vi sinh vật phải thuần khiết.
 Vi sinh vật phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện
sản xuất công nghiệp, sự ổn định nhiệt độ, áp suất thẩm thấu, pH...
 Giống phải có tốc độ sinh sản và phát triển mạnh trong điều kiện môi trường
công nghiệp.
 Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn.
 Giống phải ổn định trong bảo quản và điều kiện bảo quản dễ dàng.
2.1.2. Vi sinh vật sản xuất vitamin B12
Có rất nhiều vi sinh vật có thể tham gia quá trình sinh tổng hợp vitamin
B12. Một số quy trình sản xuất vitamin được biết đến là quy trình sản xuất
vitamin từ vi khuẩn Propionicbacterium, từ xạ khuẩn Actinomyces olivacens,
và vi khuẩn sinh khí metan.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 6

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất vitamin: Agrobacterium

tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus megaterium, Clostridium
sticklandii, Clostridium tetanomorphum, Clostridium thermoaceticum,
Corynebacterium XG, Eubacterium limosum, Methanobacterium arbophilicum,
Methanobacterium ivanovii, Methanobacterium ruminantium,
Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanosarcina barkeri,
Propionibacterium freudenreichii, Propionobacterium shermanii,
Protaminobacter ruber, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas putida,
Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas sphaeroides, Salmonella typhimurium,
Spirulina platensis, Streptomyces antibioticus, Streptomyces aureofaciens,
Streptomyces griseus, Streptomyces olivaceus..., ngoài ra còn có các giống
thuộc xạ khuẩn Actinomyces
Trước đây người ta thường sử dụng chủ yếu chủng Streptomyces griseus
để sản xuất trên quy mô công nghiệp nhưng ngày nay người ta chuyển sang sử
dụng vi khuẩn Propionibacterium shermanii và Pseudomonas denitrificans
thay thế cho vi khuẩn Streptomyces. Nguyên nhân là vitamin B12 là sản phẩm
phụ của sản phẩm Streptomicin lên men bởi Streptomyces griseus hay là sản
phẩm phụ của quá trình sản xuất Clotetracyclin lên men bởi Streptomyces
aureofaciens.Lượng vitamin được tạo ra trong các quá trình trên là rất thấp
(2mg/lít) nên rất khó chiết tách.
Việc sản xuất bằng Propionibacterium shermanii hay P. freudenreichii
cho hiệu suất vitamin cao hơn. Tế bào của các vi khuẩn này chứa một lượng
vitamin khoảng 20 mg/l.
2.1.3. Vi khuẩn Propionibacterium
- Trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di động. Kích thước nhỏ.
- Trong tự nhiên chúng xếp thành từng đôi hoặc từng chuỗi ngắn.
- Hiếu khí tùy ý.
Phân loại: vi khuẩn Propionibacterium được phân loại thành 2 nhóm:
- Nhóm vi khuẩn Propionibacterium sống trong sản phẩm sữa. Chúng
phát triển trong môi trường phômai và sữa. Trên cơ sở tính tương đồng

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 7

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

của DNA trong thành phần cấu tạo của thành tế bào, nhóm vi khuẩn
Propionibacterium sống trong sản phẩm sữa được phân loại thành 6
loài: Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P.theonii,
P.acidipropionici, P.coccoides và P.cyclohexanicum.
- Nhóm vi khuẩn propionic sống trên da. Môi trường sống chính của
giống Propionibacterium sống trên da là da người.Nhóm vi khuẩn sống
trên da được phân loại thành 6 loài: P.acnes, P.avidium, P.granulosum,
P.lymphophilums, P.propionicum và Propioniferax innocua. Nhóm vi
khuẩn sống trên da có dạng que, kị khí.
- Trái ngược với vi khuẩn propionibacteria sống trên da, nhóm vi khuẩn
Propionibacteria sống trong sản phẩm sữa không sản sinh indole và
không thể hóa lỏng gelatin. Hơn thế nữa, hai nhóm này có thể được
phân biệt rõ dựa vào các đặc điểm sinh lý học của nó. Do đó, hai nhóm
vi khuẩn Propionibacterium này khác nhau chủ yếu dựa trên môi trƣờng
sống tự nhiên của chúng.
2.1.4. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium shermanii
Trong các chủng giống vi sinh vật tham gia tổng hợp vitamin B12 thì có
giống Propionibacterium shermanii có nhiều ưu điểm nhất để đưa vào sản xuất
qui mô công nghiệp. Vi khuẩn này có một số đặc điểm như sau:
- Lên men acid lactic, glycerol, glucose, fructo, manit, lactose.
- pH hoạt động 4.5 – 7.5. pH tối ưu cho tổng hợp vitamin B12 là 5.8 – 7.5.
- Nhiệt độ thích hợp cho sản xuất vitamin B12 là 28 – 300C.
- Các chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển bao gồm: muối amon, amoniac,
CoCl2 hoặc Co(NO3)2; các kim loại: Cu, Fe, Zn, Mn thường làm giảm quá trình
tổng hợp B12.
- Các vitamin làm tăng hiệu suất tổng hợp vitamin B12 bao gồm: tiamin, biotin,
acid nicotinic, acid tolic.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 8

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Hình 2: vi khuẩn Propionibacterium shermanii

2.2. Rỉ đường
Rỉ đường là phế liệu chứa nhiều đường không kết tinh trong sản xuất
đường từ mía hoặc củ cải đường. Thông thường tỉ lệ rỉ đường trong sản xuất
đường mía chiếm khoảng 3 - 3.5% trọng lường mía. Tùy thuộc vào giống mía,
điều kiện trồng trọt, công nghệ sản xuất đường,… thành phần rỉ đường dao
động như sau:
oNước: 15-20% .
o Chất khô: 80-85% .
o Trong đó có 60% là đường (40% là đường saccharose, 20% là fructose và
glucose) và 40% chất khô còn lại là chất phi đường (không phải là đường).
o Trong thành phần phi đường có khoảng 30 - 32% hợp chất hữu cơ và 6 - 10%
hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ gồm có: K2O3 5%, Fe2O3 0,2%, MgO
0,1%, sulfat 1,6%, CaO 1,5%, SiO2 0,5%, P2O5 0,2%, Cloride 0,4%
o Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ và không chứa
nitơ ở dạng amin như: acid aspactic, acid glutamic, leucin, isoleucin. Nitơ tổng
chiếm khỏang 0,3 – 0,5% (ít hơn so với lượng nitơ có trong rỉ đường củ cải).
o Ngoài ra trong rỉ đường có một số vitamin sau:
Bảng 1. Thành phần các vitamin trong rỉ đường (tính theo µg/1g rỉ đường)

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 9

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Mặt khác, trong rỉ đường luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn,
thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua, dẫn tới làm giảm
chất lượng của rỉ đường. Vì vậy trong sản xuất ta hay dùng fluosilicate natri
20/000 so với trọng lượng mật rỉ để bảo quản.
Ưu điểm của việc sử dụng rỉ đường để sản xuất so với những nguyên
liệu khác là:
 Giá rẻ.
 Khối lượng lớn, dồi dào.
Sử dụng tiện lợi.
Nguồn cung cấp khá phổ biến.
Đặc biệt ở nước ta, không phạm đến chính sách lương thực.
2.3. Hèm rượu
Hèm rượu là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất ethanol bằng phương
pháp lên men.
Bảng 2. Thành phần hóa học của hèm rượu:

Ứng dụng: hèm rượu là một nguyên liệu để sản xuất vitamin, phân bón, thức
ăn gia súc…
- Ưu điểm: rẻ tiền , dễ kiếm, tận dụng được nguồn phế liệu.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 10

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

2.4. Dịch Whey

Sự phát triển của sinh vật và sản phẩm vitamin B12 từ dịch Whey dường
như khác với mô hình sản xuất đối với các loại cấu trúc khác. Sinh vật gần như
phát triển tối đa trước khi vitamin B12 được tích lũy.
Trong dịch Whey, lactose có thể làm nguồn cacbon cho vi sinh vật sử
dụng để phát triển. Trong dịch Whey và men chiết có đầy đủ các chất dinh
dưỡng cho sự phát triền và hình thành vitamin B12 từ vi sinh vật.
Trên phương diện đó, với nhược điểm của dịch Whey nên việc sử dụng
để sản xuất vitamin B12 thì nhỏ và rải rác, riêng lẻ, không đủ cung cấp cho quá
trình sản xuất có lợi của vitamin B12.
Việc sản xuất vitamin B12 từ dịch Whey chỉ có ý nghĩa trên quy mô công
nghiệp khi việc chuyên chở dịch Whey thực hiện gần nơi sản xuất và lượng
Whey tương đối nhiều để có thể kết hợp và sản xuất. Chi phí vận chuyển tăng
vì lượng dịch Whey thô chứa khoảng 93,1% là nước. Chi phí chuyên chở có thể
giảm khi cô đặc dịch thô thành dạng rắn trước khi chuyên chở. Một lý do khác
là dịch Whey có thể sản xuất nếu như giá trị sản phẩm của nó tăng bởi quá trình
lên men như quá trình lên men vitamin B12. Ngay cả khi quá trình chỉ thải ra
lượng thừa dịch Whey mà không tăng giá sản phẩm sữa, nó sẽ có giá trị vì giúp
giải quyết vấn đề chất thải trong quá trình sản xuất phô mai.
Bảng 3. Thành phần whey protein

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 11

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

PHẦN III: SẢN XUẤT

3.1. Quy trình công nghệ sản xuất vitamin B12 từ vi sinh
3.1.1. Sơ đồ khối

3.1.2. Sơ đồ thiết bị

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 12

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

3.2. Giải thích các giai đoạn

3.2.1. Nhân giống
Chuẩn bị: quá trình nhân giống giúp gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật,
tích lũy đủ số lượng tế bào cần thiết để cấy giống vào môi trường lên men.
Cách thực hiện: giống Propionibacterium shermanii được cấy trong môi
trường thạch nghiêng với glucose, KH2PO4, (NH4)2PO4, cao ngô hoặc nước
chiết trái cây. Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ t0 = 28 – 320C trong 7 – 8 ngày. Sau đó
bảo quản lạnh, cấy truyền mỗi tháng 1 lần.
Nhân giống cho sản xuất thường được thực hiện trong điều kiện kị khí.
Môi trường nhân giống cho lượng đường ít hơn môi trường lên men, các
thành phần khác thì giống môi trường lên men.
Trong môi trường,người ta còn cho thêm muối amon, nước amoniac, CoCl2
hoặc Co(NO3)2 .
Vi khuẩn Propionibacterium shermanii sử dụng cơ chất trong môi trường
để tăng sinh khối. Hàm lượng cơ chất trong môi trường giảm theo thời gian,
sinh khối tăng dần.
Bảng 4: Môi trường nhân giống

Glucose 0,5 – 1 %
Cao ngô 1–2%
Clorua coban 1,5 – 2 ppm
Pepton 0,1 %
Dầu đậu nành 0,1 – 2 %
pH 6,9 - 7
Nhiệt độ tiệt trùng 1210C
Thời gian tiệt trùng 30 phút

Thiết bị nhân giống: thiết bị nhân giống có dạng hình trụ bằng thép
không rỉ, bên trong có cánh khuấy. Xung quanh thiết bị là lớp vỏ áo điều nhiệt
để ổn định nhiệt độ xung quanh trong quá trình nhân giống.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 13

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Phía trên nắp thiết bị có các cửa với nhiều chức năng khác nhau:
+ cửa thông cánh khuấy gắn với motor.
+ cửa nạp giống.
+ cửa vào và ra cho không khí.
+ cửa nạp chất phá bọt.
+ cửa nạp chất điều chỉnh pH.
Cửa nạp môi trường vào thiết bị và tháo canh trường ra khỏi thiết bị thường
được bố trí ở phần đáy.
Thiết bị còn có gắn các đầu dò pH, nhiệt độ, oxy,… để các nhà sản xuất có
thể theo dõi các giá trị này thay đổi trong quá trình nhân giống.

1. Hệ thống điều nhiệt (

nhân giống trong
erlen)
2. Bình nhân giống trong
trung gian
3. Thiết bị nhân giống
4. Hệ thống lọc tách bụi
và vi sinh vật
5. Van
6. Bộ phận lọc hơi
7. Bộ phận đo pH

Hình 4: thiết bị nhân giống

3.2.2. Chuẩn bị môi trường lên men
Thành phần môi trường lên men bao gồm: Nguồn carbon, nguồn nitơ, yếu
tố tăng trưởng, muối dinh dưỡng, coban, glycine và sodium cyanide.
- Nguồn carbon là carbohydrate (dextrose, maltosse, xylose, syrup bắp,
sucrose, mật rỉ), acid hữu cơ là acid lactic. Chiếm 0.5 – 10% khối lượng
môi trường nuôi cấy.
- Nguồn Nitơ là các protein trong đậu nành, yến mạch, bắp, bột mì, dịch
chiết nấm men, nước Whey … Khối lượng chiếm 1 – 5% khối lượng
môi trường nuôi cấy.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 14

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

- Yếu tố tăng trưởng cho vi sinh vật là dịch chiết nấm men, dịch khoai
tây, bắp.
- Muối: ammonium sulfat, magnesium sulfat, potasseum photphate
dibasic, potassium photphate monbasic. Hợp chất coban: cobalt
chloride, sulfate, nitrate.
Bảng 5: Thành phần môi trường lên men

Mật rỉ 4%
Glucose 0.5 - 1%
CaCO3 0.1%
Clorua coban 1.5 - 10 ppm

Thêm glycine vào môi trường lên men giúp hàm lượng vitamin B12 sẽ
tăng lên.
Trong sản xuất người ta bổ sung thêm 5,6 – dimetylbenzinaldazol làm
tăng sự tổng hợp vitamin B12. Ngoài ra, muối coban thêm vào với nồng độ 3 -5
µg/lít.
Thiết bị sử dụng là thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20

Cấu tạo: thùng chứa môi trường, bơm ly tâm, bộ đun nóng, bộ giữ nhiệt,
bộ thu hồi nhiệt, bộ trao đổi nhiệt, hệ thống điều chỉnh tự động các thông số.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 15

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Nguyên tắc hoạt động: trước khi bắt đầu hoạt động thiết bị, đường ống
dẫn và phụ tùng YHC được thanh trùng bằng hơi quá nhiệt.
Hơi nước được đưa vào bộ đun nóng theo đường viền của van điều
chỉnh tiêu hao hơi, sau đó vào bộ giữ nhiệt, thu hồi nhiệt và theo đường viền
của van giảm áp suất vào thiết bị làm mát.
Cùng lúc mở các van xả nước khi nhiệt độ đạt lớn hơn 1400C thì bắt đầu
tiệt trùng.
Khi nhiệt độ và áp suất trong nồi phản ứng đạt trị số ổn định thì khuấy
đảo các cấu tử của môi trường dinh dưỡng, môi trường mới lại cho vào thùng
chứa để bơm đẩy qua khe đứng nhỏ vào bộ phận đun nóng.
Thông số công nghệ:
- Nhiệt độ: 1210C
- Thời gian tiệt trùng: 30 phút
- pH = 6.5 – 7
- Tốc độ bơm môi trường: 3.5 m3/s
3.2.3. Lên men
Làm tăng hàm lượng vitamin trong tế bào vi sinh vật.
Quá trình lên men gồm 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu kị khí
+ Giai đoạn sau hiếu khí
Thời gian cho mỗi giai đoạn là 72 – 88 giờ.
Nồng độ vitamin B12 sẽ làm tăng nhanh trong giai đoạn hiếu khí, khoảng 35
– 40 mg vitamin B12 /lít.
pH môi trường thay đổi. Điều chỉnh pH bằng cách thêm dextrose, succrose
hoặc thêm ammonium hydroxide, potassium photphate dibasic, ure, calcium
carbonate.
pH tối ưu = 7 - 7.5. pH kiềm sẽ làm phân hủy sản phẩm cuối hoặc ngăn cản
quá trình tạo vitamin B12 .pH acid sẽ kiềm hãm tốc độ sinh trưởng của vi sinh
vật, dẫn đến làm giảm hàm lượng vitamin B12 .
Nhiệt độ tối ưu = 28 – 320C.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 16

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Vi sinh vật sinh tổng hợp vitamin B12 trong tế bào. Trải qua nhiều giai đoạn
khác nhau nhờ sự tham gia của enzyme. Quá trình bắt đầu bằng sự tạo thành
các porhinin, sau đó gắn nucleotat và các thành phần khác vào. Coban trong
cấu tạo vitamin B12 gắn vào bằng ba hóa trị thông thường và ba hóa trị phụ.
Chính coban tạo màu đỏ cho vitamin B12 .
Sự tạo thành porphinin bắt đầu từ succinat (đây là sản phẩm trung gian của
chu trình Krebs). Dẫn xuất của acid succinic là succinyl – CoA sẽ kết hợp với
glycin tạo thành succinic – glycin. Từ đó porphinin được tạo thành trên cơ sở
acid amino cetoadipic sinh ra được khử carboxyl thành monopyrol
porphobilinogen.
Coenzyme B12 là một hợp chất có 5 – dezoxyadenozyl ở vị trí của nguyên
tử carbon trung tâm thay cho nhóm xianit. Coenzyme corinoid tham gia vào
phản ứng của các methylmalonyl – CoA trong lên men propionic.
Dưới tác dụng thông khí, carbinamit-5-dezoxyadenozin được chuyển thành
5,6 – dimetyl – benzinmidazol cobanit – 5 – dezoxyadenozin tức là phần quan
trọng nhất đối với sự tạo thành vitamin B12 .
Bên cạnh acid propionic, acid acetic cũng được sản xuất trong điều kiện
yếm khí, với tỉ lệ 2:1. Acid propinic ở hàm lượng thấp có thể ức chế các vi sinh
vật nhiễm vào môi trường lên men. Hàm lượng acid propionic là yếu tố hạn chế
sự tăng sinh khối và sản xuất vitamin B12 .
Thiết bị lên men gồm nhiều bình lên men nối tiếp. Cấu tạo giống thiết bị
nhân giống vi sinh vật.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 17

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Thông số thiết bị lên men:

- Thông khí bằng cách khuấy đảo liên tục.
- Tốc độ thông khí: 0.5 lít/ phút
- Lên men trong 6-8 ngày
- Nhiệt độ lên men: 28 -300 C.
Sau đó ta tách sinh khối ra khỏi canh trường lên men chuẩn bị quá trình
acid hóa thu vitamin B12 .

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 18

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Chất lỏng chứa vitamin B12 và tạp chất được tiếp xúc với chất hấp phụ
như divinylbenzene hay styrene copolymer resin ở nhiệt độ 10 – 300 C, vitamin
B12 được hấp phụ bởi resin ( 1gram resin hấp phụ được 1,5gram vitamin B12).

Tiếp theo rửa resin bằng dung dịch đệm (nước, dung dịch cồn có độ cồn
thấp hơn 20% hay dung dịch acid yếu) để thu vitamin B12 và thu hồi resin để tái
sử dụng. Chất rửa là dung dịch chứa nước có các hợp chất được chọn lọc từ
keton mạch ngắn, ester mạch ngắn, ether mạch ngắn. Thu dung dịch rửa.
Tiến hành cô đặc vitamin B12. Dung dịch rửa cho đi vào buồng đốt được
đun sôi để tạo thành hỗn hợp hơi lỏng đi vào buồng đốt, hơi nước đi lên phía
trên. Dung dịch quay về buồng đốt theo ống tuần hoàn ngoài. Hỗn hợp lỏng –
hơi trong buồng đốt được phân ly nhờ 2 yếu tố: chiều cao buồng bốc hơi và sự
thay đổi quán tính của hỗn hợp khi vào bộ phận tách bọt. Hơi thứ vào thiết bị
Baromet và được làm nguội tại đây.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 19

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Kết tinh: Nước bị bốc hơi làm độ hòa tan của vật liệu giảm, dung dịch dần đạt
đến trạng thái bão hòa và quá bão hòa. Có sự tạo mầm tinh thể, sau đó các tinh
thể vitamin lớn lên theo yêu cầu. Một phần dung môi được bay hơi. Hơi bay ra
theo đường bơm chân không. Nhiệt độ của dung dịch ở trạng thái bão hòa sẽ
giảm đến nhiệt độ sôi tương ứng với áp suất chân không trong thiết bị. Dung
dịch đạt quá bão hòa và kết tinh. Dung môi bay hơi không chỉ do nhiệt độ vật
lý của dung dịch mà còn do sự tỏa nhiệt khi kết tinh.
Kết tinh tiến hành đồng thời bay hơi do hút chân không và làm lạnh sẽ
làm quá trình diễn ra nhanh hơn, do đó các tinh thể sẽ hạn chế dính vào bề mặt
thiết bị và thời gian rửa thiết bị sẽ được rút ngắn.

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 20

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

Tiếp theo ly tâm để chuẩn bị sấy ở giai đoạn tiếp theo. Công đoạn sấy là
quá trình cuối cùng tạo ra sản phẩm vitamin B12 .

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 21

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

PHẦN IV: SẢN PHẨM

Tinh thể vitamin B12 tạo thành có màu đỏ do có chứa kim loại coban, có kích
thước khác nhau. Sau đó người ta sẽ dùng nguyên liệu này để tạo thành các sản
phẩm dược phẩm chứa vitamin B12 trên thị trường.

Bảng 6: Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm

Cyanocobalamin 93% khối lượng

Độ ẩm ≤ 8%
Vi sinh Không có
Màu sắc màu đỏ nhạt, bột rời, không kết dính

Hình 5: Sản phẩm bột vitamin B12

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 22

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

PHẦN V: THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ

1. Nghiên cứu khám phá ra bí ẩn cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp
vitamin B12: các nhà nghiên cứu của MIT đã cho thấy enzyme BluB xúc
tác tạo thành DMB, một đoạn của vitamin B12 .
2. Kỹ thuật đột biến gen vi sinh vật sản xuất vitamin B12 :Kỹ thuật di
truyền hiện đại là kỹ thuật tái tổ hợp gen. Có hai xu hướng thực hiện tái
tổ hợp:
- Xu hướng chuyển gen vi sinh vật sang động vật hay thực vật nhằm cải
tiến các tính trang hoặc làm tăng thêm tính trạng mà ta cần cho cơ thể
động vật hay thực vật.
- Xu hướng chuyển gen của các vi sinh vật khác sang cho vi sinh vật và
biến tế bào vi sinh vật như những nhà máy sản xuất các chất cần thiết
cho con người. Phương pháp này được sử dụng vì cơ thể vi sinh vật là
cơ thể đơn bào có chu kỳ sinh trưởng ngắn, do đó chúng có quá trình
trao đổi chất mạnh, dễ dùng cho quá trình nghiên cứu, dễ thu nhận được
một lượng sản lượng lớn các sản phẩm trong một thời gian ngắn.
3. Nghiên cứu việc ổn định thuốc viên nén vitamin B1 + B6 + B12: Do thuốc
vitamin B1 + B6 + B12 được ưa chuộng, sử dụng nhiều nên một nhu cầu
đặt ra là cần cải thiện việc sản xuất thuốc loại này như thế nào để ổn
định thuốc, giúp đạt chất lượng trong suốt thời hạn sử dụng.
Phương pháp: nghiên cứu cải tiến bào chế vitamin B1+B6+B12 bằng
cách dùng tá dược Kollidon CL-M để ổn định thuốc kết hợp với phân
tán vitamin B12 ở trạng thái khô thay vì hòa tan trong cồn như một quy
trình sản xuất trước đây đã làm.
4. Sản xuất vitamin B12 trong quá trình lên men Tempeh trên quy mô công
nghiệp

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 23

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 24

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ Propionibacterium Shermanii

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Taylor & FrancisGroup“ Vitamins In Foods Analysis, Bioavailability, a
nd Stability”, , LLC, 2006.
2. Lê Bạch Tuyết‚Các quá trình công nghệ cơ bản trong sản xuất thực phẩ
m”, NXB GD, 1996.
3. Nguyễn Đức Lượng‚Công nghệ vi sinh tập 2: Vi sinh vật học công nghiệ
p”, Nhà xuất bản ĐHQG TP.HCM, 2002
4. Ronald R. Eitenmiller and W.O.Landen, Jr, ‚Vitamin analysis for the he
alth
and the food sciences”, CRC Press LLC, 1999
5. http://www.doko.vn/luan-van/San-xuat-Vitamin-B12-tu-vi-sinh-vat-
282847
6. http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/8470128/1/

GVHD: PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng 25