Rangkuman Primer/ Oligonukleotida

Primer adalah untai tunggal fragmen DNA pendek yang digunakan untuk teknik
laboratorium seperti PCR. Dalam metode PCR, sepasang primer akan menghibridisasi sampel
DNA dan daerah yang akan diamplifikasi sehingga dapat dihasilkan jutaan salinan dalam
waktu singkat. Teknik laboratorium yang menggunakan primer selain PCR adalah sekuensing
DNA. Pasangan primer oligonukleotida sintetik berguna untuk mengapit atau sebagai
pembatas urutan fragmen DNA target yang akan diamplifikasi. Primer berfungsi sebagai
penyedia gugus hidroksi pada ujung 3’ yang diperlukan dalam proses eksistensi DNA dan
merupakan komponen PCR yang nantinya akan menempel pada ssDNA saat proses
annealing. Primer juga dapat membantu dalam identifikasi gen. Oligonukleotida primer
(desain primer) memegang peranan penting untuk spesifikasi dan efisiensi PCR. Primer yang
baik ditentukan oleh beberapa sifat/karakter primer: (Abd-Elsalam, 2003)
1. Panjang primer
Sepasang primer yang dikenal dengan primer forward dan reverse memiliki Panjang
18-30 basa. Primer dengan panjang lebih dari 30 basa tidak disarankan karena tidak
menunjukkan spesifikasi yang tinggi dan dapat terhibridisasi dengan primer lain
sehingga tidak membentuk polimerisasi DNA.
2. Ta (Temperature annealing)
Ta merupakan suhu yang diperkirakan agar primer dapat menempel dengan
template DNA secara stabil. Suhu annealing yang tinggi akan menyulitkan terjadinya
ikatan primer sehingga menghasilkan produk PCR yang kurang efisien. Sebaliknya,
jika suhu annealing terlalu rendah menyebabkan terjadinya penempelan primer
pada DNA ditempat yang tidak spesifik.
3. Selisih Tm
Pasangan primer sebaiknya tidak memiliki selisih suhu leleh yang tinggi. Jika suhu
leleh lebih dari 5oC dapat menyebabkan penurunan proses amplifikasi atau bahkan
memungkinkan tidak terjadinya proses amplifikasi.
4. GC Clamp
GC Clamp yang dimaksud adalah ujung C, G, CG atau GC, yang diyakini membuat
hibridisasi lebih stabil. Namun perlu dihindari lebih dari 3 basa G atau C pada 5 basa
terakhir ujung 3’ karena ujung 3’ bisa melipat membentuk struktur dimer yang
mengakibatkan ujung 3’ primer tidak menempel pada template.
5. Struktur sekunder
Primer yang baik sebaiknya tidak mengandung struktur sekunder seperti hairpin atau
dimer. Hairpin adalah struktur yang dibentuk pasangan asam polynucleic antara
urutan komplementer untai tunggal baik DNA maupun RNA. Dimer adalah primer
yang berikatan dengan primer lainnya. Stabilitas struktur sekunder ditentukan oleh
energi bebas (delta G) dan suhu lelehnya. Hal ini menyebabkan primer tidak dapat
menempel dengan template DNA.
6. Repeats and Runs
Perulangan yang cukup Panjang dengan basa yang sama (lebih dari tiga basa
berurutan sama, missal basa AGCGGGGGATG memiliki 5 basa berurutan G) harus
dihindari karena dapat menyebabkan terjadinya breathing pada primer dan
mispirming, sehingga proses penempelan primer menjadi sulit. Sebaiknya tidak
memiliki urutan pengulangan dari 2 basa.
7. Product Length
 Merupakan jarak antara ujung 5’ kedua primer yang pada umumnya memiliki
panjang <2000 basa.

Oligonukleotida atau biasa disebut primer membutuhkan penanganan tersendiri agar

kualitas tetap terjaga terutama untuk penggunaan jangka panjang. Jika primer masih dalam
bentuk serbuk maka harus diresuspensi (dilarutkan) terlebih dahulu dengan menggunakan TE
buffer yang mengandung tris dan EDTA. Tris berfungsi membantu menjaga kestabilan pH
sementara EDTA dapat menghambat nuclease digestion pada DNA. Untuk konsentrasi
resuspensi disarankan tidak kurang dari 1 uM dan tidak lebih dari 10 mM. Konsentrasi
optimum yang disarankan adalah 100 uM. Cara menghitung volume TE buffer yang harus
ditambahkan untuk mendapatkan master stock 100 uM adalah dengan mengalikan jumlah
nanomole dengan 10. Contoh: jika pada data sheet primer tertulis 20.3 nm maka untuk
mendapatkan konsentrasi 100 uM dapat ditambahkan 203 uL TE buffer.
Setelah dilarutkan, primer perlu diencerkan terlebih dahulu sebelum digunakan untuk
PCR. Dari master stock 100 uM dapat mengencerkan lagi menjadi working solution. Jika
membutuhkan 100 uL working solution dengan konsentrasi 100 uM, maka dapat melakukan
pengenceran 1:9 yaitu melarutkan 10 uL master stock dengan 90 uL ddH2O sehingga
didapatkan working solution dengan konsentrasi 10 uM dan volume sebesar 100 uL.
Kemudian untuk penyimpanan primer disarankan disimpan dalam suhu -20oC yang dapat
stabil hingga 2 tahun.

Sumber:

Abd-Elsalam, K. A. 2003. Minireview Bioinformatic tools and guideline for PCR primer
design. African Journal of Biotechnology. 2 (5): 91-95.
Sasmito et al. 2014. Karakteristik Primer pada Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk
Sekuensing DNA: Mini Review. Seminar Nasional Informatika Medis (SNIMed).
93-102.
Speicher, N. 2017. Storing oligos: 7 things you should know. Retrieved August 15, 2022
Integrated DNA Technologies:
https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/storing-oligos-7-things-
you-should-know
Wagner, E. 2014. My oligos have arrived: Now what?. Retrieved August 15, 2022 from
Integrated DNA Technologies:
https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/my-oligos-have-
arrived-now-what