Reaksi berantai polimerase (PCR)

PCR adalah amplifikasi enzimatik dari sekuens DNA spesifik secara in vitro9. Proses ini menggunakan
beberapa siklus denaturasi template, annealing primer, dan elongasi primer untuk mengamplifikasi
sekuens DNA. Ini adalah proses eksponensial karena produk yang diperkuat dari setiap siklus
sebelumnya berfungsi sebagai templat untuk siklus amplifikasi berikutnya, sehingga menjadikannya
teknik yang sangat sensitif untuk mendeteksi urutan asam nukleat tertentu. Biasanya, produk amplifikasi
yang cukup dihasilkan setelah 20 hingga 40 siklus PCR, sehingga dapat divisualisasikan pada gel yang
diwarnai dengan etidium bromida. Reaksi meliputi beberapa komponen: template, primer maju, primer
balik, buffer reaksi, magnesium, campuran dNTP, dan DNA polimerase termostabil. Template dapat
mencakup DNA genomik atau plasmid yang dimurnikan; RNA diubah oleh reverse transcriptase menjadi
DNA komplementer (cDNA); atau sampel biologis mentah yang tidak dimurnikan seperti koloni bakteri
atau plak fag. Primer maju dan mundur menentukan urutan dan panjang produk yang diperkuat.
Polimerase termostabil yang paling sering digunakan adalah Taq DNA polimerase. Enzim ini sesuai untuk
amplifikasi rutin, tetapi penggunaan polimerase termostabil lainnya dapat meningkatkan hasil.
Konsentrasi ion magnesium mempengaruhi aktivitas enzim, primer annealing, temperatur leleh template
dan produk PCR, fidelitas, dan pembentukan primer-dimer19,40.

PCR mengeksplorasi kapasitas replikasi DNA. Sebuah untai DNA tunggal digunakan sebagai cetakan
untuk sintesis rantai komplementer baru di bawah aksi enzim DNA polimerase, yang mampu mengikat
nukleotida yang ada sebagai reaksi terhadap cetakan. Namun, DNA polimerase membutuhkan titik awal
dalam cetakan, yang akan mengarahkan penambahan nukleotida berikutnya. Titik awal sintesis ini
disediakan oleh oligonukleotida yang berhibridisasi (meniup) dirinya sendiri ke untai cetakan tunggal;
oligonukleotida ini disebut primer46. Kedua untai DNA asli bertindak sebagai cetakan untuk sintesis,
setelah primer spesifik disediakan untuk masing-masing untai. Dengan demikian, daerah DNA yang akan
disintesis ditentukan oleh primer, yang secara spesifik menyatu dengan sekuens komplementernya pada
untai cetakan, membatasi fragmen DNA yang akan diamplifikasi 9,46.

Setelah dimulai dengan primer yang sesuai, enzim polimerase akan menyalin untai DNA mulai dari ujung
3' primer

dan mensintesis DNA baru dalam arah 5' ke 3' – langkah ekstensi. Perpanjangan DNA dihentikan dengan
menaikkan suhu (biasanya sampai 94oC), menyebabkan pemisahan semua untai DNA. Pendinginan
pada suhu 37-60oC menyebabkan annealing pada primer dan template DNA. Menaikkan suhu lagi
(biasanya sampai 72oC) merangsang Taq polimerase yang stabil terhadap panas untuk menyalin
cetakan DNA pada langkah ekstensi lebih lanjut. Dengan demikian, setiap siklus berisi tiga langkah – anil
primer ke cetakan DNA, perpanjangan DNA, dan pemisahan untai 46,62. Jika dua primer ditambahkan, satu
komplementer untuk setiap untai, ada peningkatan eksponensial dalam salinan DNA yang diapit oleh dua
primer untuk setiap siklus:1,2,4,8,16,32,dst.;peningkatan 2 n, di mana n adalah jumlah siklus. Ini karena
setiap primer dapat mengarahkan sintesis sepanjang salinan yang dibuat oleh primer lain, serta
sepanjang template aslinya sendiri62 ) (Gambar 1).

Setelah amplifikasi, produk difraksinasi dengan elektroforesis pada gel agarosa atau poliakrilamida yang
diwarnai dengan etidium bromida. Produk muncul sebagai pita tunggal yang sesuai dengan ukuran
urutan yang diperkuat, yang berpendar ketika diterangi dengan sinar ultraviolet (Gambar 2).

Secara umum, PCR dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengamplifikasi asam nukleat dari mana
saja, terlepas dari kuantitas dan kombinasinya, karena hanya kuantitas awal yang terbatas diperlukan
untuk amplifikasi40.

Dengan cara ini, PCR digunakan dalam tes deteksi untuk agen infeksi, diagnosis prenatal penyakit
genetik, DNA genomik atau kloning cDNA, kuantifikasi RNA langka, amplifikasi RNA oleh RT-PCR, in
vitro dan pembuatan DNA rekombinan, studi forensik sampel, dan analisis variasi urutan alel.
Reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR)

Template awal untuk reaksi PCR dapat berupa DNA atau RNA. DNA biasanya merupakan cetakan yang
tepat untuk mempelajari genom sel atau jaringan (seperti pada penyakit genetik yang diturunkan, mutasi
somatik pada tumor, atau penataan ulang somatik pada limfosit) dan untuk mendeteksi virus DNA 62.

Untuk informasi tentang ekspresi gen dalam sel 60 atau jaringan11,12,31,50,51, atau keberadaan RNA genomik
dalam retrovirus seperti HIV, RNA adalah template yang sesuai. RNA bisa lebih baik daripada DNA
genom untuk mendeteksi perubahan struktural pada gen panjang, karena memperkuat transkrip RNA
yang disambung alih-alih urutan genom sangat mengurangi panjang DNA yang akan ditangani tanpa
kehilangan salah satu daerah pengkodean di mana penghapusan yang signifikan secara klinis mungkin
diharapkan62.

RT-PCR menggabungkan sintesis cDNA dari template RNA dengan PCR untuk menyediakan metode
yang cepat dan sensitif untuk menganalisis ekspresi gen (Gambar 3). RT-PCR digunakan untuk
mendeteksi atau mengukur ekspresi mRNA, seringkali dari konsentrasi kecil RNA target 25,50,51.

Template untuk RT-PCR dapat berupa RNA total atau poli (A) + RNA terpilih. Reaksi RT dapat
diprioritaskan dengan

primer acak, oligo(dT), atau primer spesifik gen (GSP) menggunakan reverse transcriptase. RT-PCR
dapat dilakukan dalam format dua langkah atau satu langkah. Dalam RT-PCR dua langkah, setiap
langkah dilakukan dalam kondisi optimal. Sintesis cDNA dilakukan terlebih dahulu dalam buffer RT dan
sepersepuluh reaksi dihilangkan untuk PCR50,51. Dalam RT-PCR satu langkah, transkripsi balik dan PCR
berlangsung secara berurutan dalam satu tabung dalam kondisi yang dioptimalkan untuk RT dan PCR 40.