MATERIALES Y MÉTODOS

- Bata, cofia, tapabocas, guantes

- Cepas de organismo entomopatógenos (Bacillus thuringiensis, Lecanicillium lecanii, Beauveria
bassiana)
- Cajas de Agar nutritivo y PDA
- Reactivos para la tinción de Gram y esporas
- Azul de lactofenol
- Frascos y viales con solución salina estéril
- Frascos con agua destilada estéril
- Rastrillos estériles
- Pinzas estériles
- Micropipeta de 10-100µL y 100-1000µL
- Puntas azules y amarillas estériles
- Microscopio
- Cinta transparente
- Porta y cubreobjetos
- Asa bacteriológica recta y redonda
- ½ Libra de arroz
- 1 frasco pequeño de melaza
- 1 bomba de acuario
- 1 frasco de vidrio de tapa plástica con capacidad para 3,75 mL
- 1 frasco de vidrio mediano de tapa plástica
- 10 frascos de compota
- 1 rollo de teflón
- 1 venoclises
- 40cm de alambre dulce
- 1 bulbo de masilla epoxica
- 1 bajalenguas
- 2 jeringas de 5mL
- 1 filtro de gasolina para moto

Tabla 1.

Composición del medio de cultivo para producción de Bacillus thuringiensis

Componente Cantidad
Melaza 2g/L (2°Brix)
K2HPO4 0,2%
KH2PO4 0,7%
MgSO4. 7H20 0,2%
Caseína hidrolizada 0,005%
Tabla 2. Composición medio de cultivo producción de hongos entomopatógenos
Componente
Arroz
Agua
Ácido láctico
Observación macro y
microscópica de
entomopatogenos
Producción de
Bacillus
thuringiensis.
Armar Biorrector
Dispersor: en extremo se
introduce alambre dulce y
se hace en forma circular, y
se abre orificios para mejor
burbujeo
El otro extremos de
manguera se ajusta a
uno de los cilindros de
la tapa con teflón
Cantidad
100g
60mL
5 gotas
Describir con dibujos Realizar tinción simple
crecimiento de hongos y con azul de lactofenol a
bacterias. Macroscpica hongos. Y observar
Observa en el Realizar Tinción
microscopio Gram y de esporas
para bacterias
Colocar 2 cilindros
Abrir 3 orificios a
plásticos en orificios
tapa de recipiente de
pequeños, y una
vidrio de 1,5L
jeringa de 5mL
partida en el grande.
Sellar con rally
Filtro de moto va
Y va conectada al
conectado a bomba de
dispersor. Sellar
acuario por la
con teflón
manguera venoclisis
En otra parte de la
Se ajusta el caudal
manguera se construye un
para la bomba.
regulador de caudal de
Método de probeta
aire con venoclisis
invertida
 Preparar 1000mL de Verter en el Biorreactor
Preparación de
caldo cultivos con lo y esterilizar por 30
Medio de cultivo
indicado en Tabla 1 minutos
Bacterias para
Biorreactor

Hacer suspensión cell B. Bacteria bien

Inoculación del
thuringiensis en frasco esporulada.
biorreactor
con 90mL sn salina

Inocular al 2% en
biorrector con pipeta.
Homgenizar y airear
24horas

Control calidad Hacer suspensiones Realizar siembra en

de la bacteria en seriadas de 10˄-1 hasta Agar Nutritivo,
agar 10˄-8 de la suspensión utilizando microgota.
celular 50µL en cada mitad

Al suspender la Al día siguiente, se

aireación del hará conteo de las
biorreactor, se toma bacterias que
30mL de muestra y se crecieron
llevar a un frasco
estéril. Sellar y
refrigerar
 Producción de En frasco de vidrio De una caja de
hongos (1L), adicionar lo de hongo, suspender en
entomopatógenos. la Tabla 2. Tapar y frasco con agua estéril
Biorreactor esterilizar 15 min 1 con 0,01% de Tween
80

Y de allí se inocula el
10% . Y se deja
durante 7 días.

Control de calidad Diluciones seriadas Realizar recuento

del inóculo desde 10˄-1 hasta de Cámara de
10˄-5 Neubauer

Pasada 1 semana:

Control calidad del Hacer diluciones Sembrar en

biorreactor de seriadas con el inóculo microgota e incubar
bacterias que ahora está en por 1 día
frasco de 10˄-1 hasta
10˄-5
 A partir del inoculante Agitar. A partir de
Concentración y (arroz), tomar 10g. ésta solución, hacer
pureza para hongos Llevar a frasco de diluciones seriadas
90mL con H2O estéril hasta 10˄-5.
con 0,01% de Tween
80

Tomar dilución 10˄-1 y Realizar conteo en

sembrar en superficie Cámara de
sobre agar PDA. Neubauer
Extender con rastrillo

Tomar la primera Incubar revisando a diario

Viabilidad para dilución (10˄-1) y hasta la aparición de
hongos sembrar en superficie hongos .Contar UFC/g de
con rastrillo producto

Hacer recuento de
conidios germinados y no Cortar un 1 cuadro de A las 12 horas aplicar
germinados en Cámara de 1cm2 y colocar sobre azul de lactofenol para
Neubaeur. Mirar a 40X portaobjetos. teñir colonias
 Recolectar 10 hormigas En cada frasco, colocar
Virulencia adultas. Desinfectar con una hormiga con
para hongos NaCl 0,7% por 3 min. algodón humedecido
Enjuagar con agua azucarada

Cada hormiga que Observar a diario,

De la primera dilución
muere, incubar 7 días en anotar
(10˄-1) tomar 1mL e
cámara húmeda y comportamiento,
inocular a 5 hormigas
evaluar micosis registrar su muerte