Control biológico

Volumen 141 , febrero de 2020 , 104145

Actividad de biocontrol de Trichoderma asperellum e inducción de defensas sistémicas contra

Sclerotium cepivorum en plantas de cebolla bajo condiciones de clima tropical
William Rivera-Méndez a, b , Miguel Obregón c , María E. Morán-Diez b , Rosa Hermosa b , Enrique Monte b

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https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2019.104145 Obtener derechos y contenido

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Reflejos
• T. asperellum BCC1 es un agente de biocontrol eficaz contra S. cepivorum.

• BCC1 reduce la pudrición blanca en cultivos de cebolla en condiciones climáticas

tropicales.

• BCC1 mejora el rendimiento de las cebollas de bulbo en ensayos de campo.

• BCC1 desencadena defensas sistémicas contra S. cepivorum en plantas de cebolla.

Resumen
Se ha evaluado el potencial de biocontrol de tres cepas costarricenses nativas de Trichoderma asperellum contra el ascomiceto necrotrófico
Sclerotium cepivorum , el agente causal de la podredumbre blanca de la cebolla ( Allium cepa L.). En Costa Rica, donde las condiciones
climáticas favorecen el desarrollo de este patógeno, la pudrición blanca reduce los rendimientos de cebolla hasta en un 50% de la cosecha
total. En nuestro estudio, las tres cepas de T. asperellum probadas en ensayos in vitro mostraron su capacidad para antagonizar a S. cepivorum
, mostrando BCC1 porcentajes de inhibición del crecimiento de colonias del patógeno del 81 y 90 % en ensayos de cultivo dual y
membrana de celofán , respectivamente. Además, esteLa cepa Trichoderma fue capaz de reducir un 74% la mortalidad de las plantas en
comparación con las plantas no tratadas en condiciones de invernadero. En ensayos de campo, realizados en dos años de cosecha
consecutivos y en dos localidades tropicales diferentes, las dos dosis probadas de T. asperellum BCC1 redujeron la incidencia de pudrición
blanca en un 3,41 % para la dosis más baja y en un 3,61 % para la dosis más alta en comparación a las plantas de cebolla tratadas con
fungicidas químicos . Además, se registró un aumento significativo del 20,4 % en el rendimiento del bulbo de cebolla para la dosis más alta
de BCC1. El potencial de T. asperellum BCC1 para inducir defensas sistémicas en plantas de cebolla frente a S. cepivorumse evaluó para cuatro
genes marcadores de defensa de cebolla en un estudio de 21 días mediante PCR cuantitativa en tiempo real y utilizando plantas de cebolla
cultivadas en condiciones de invernadero. El perfil de expresión de AcPR1 y AcPAL1 , caracterizado por ser ondulante, indica una activación
inicial de las vías de defensa dependientes del ácido salicílico (1 y 7 días) por parte de T. asperellum BCC1 cuando se aplica solo o en
combinación con el patógeno, mientras que el up- la regulación de AcEIN3 observada en esos mismos tratamientos en el día 21 reveló la
activación de vías de defensa dependientes de etileno por parte de esta cepa de Trichoderma . T. asperellum BCC1 ejerce un biocontrol
eficiente contra S. cepivorumy activa las defensas sistémicas de la cebolla contra este patógeno en condiciones de invernadero, a la vez que
reduce la incidencia de pudrición blanca de la cebolla y aumenta el rendimiento del cultivo en ensayos de campo realizados en las
condiciones climáticas tropicales de Costa Rica.
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Palabras clave
podredumbre blanca; Antagonismo; Resistencia sistémica; Rendimiento de bulbo de cebolla

1 . Introducción
La cebolla ( Allium cepa L.) es una hortaliza rentable cultivada por los apreciados atributos de sus bulbos asociados al sabor y los beneficios
para la salud. La cebolla también es considerada entre las hortalizas más consumidas a nivel mundial, siendo superada únicamente por el
tomate ( Havey, 2018 ). Su superficie mundial cosechada alcanzó más de 5 millones de ha y una producción cercana a los 100 millones de
toneladas en 2017 ( FAO, 2017 ), con un mercado estimado en 18 mil millones de dólares estadounidenses en 2014 ( Havey, 2018 ).). En
términos de tierra cultivable, el clima tropical de Costa Rica permite el cultivo exitoso de diferentes variedades de cebolla. La mayor parte de
la producción en este país se concentra en las regiones del norte de la provincia de Cartago a altitudes superiores a los 1700 m en un
ecosistema de montaña tropical, y la cebolla es considerada un producto valioso para los mercados locales con una producción total de
33.000 toneladas por año. ( Serrano y Morales, 2017 ).

El hongo ascomiceto del suelo Sclerotium cepivorum Berk (teleomorfo: Stromatinia cepivora ) es un patógeno necrótrofo económicamente
importante que causa la pudrición blanca de varias especies de Allium , siendo este un factor limitante para la producción de cebolla a nivel
mundial ( Hanci, 2018 , Havey, 2018). , Hovius y McDonald, 2002 ). S. cepivorum tiene un micelio blanco sin desarrollo de conidios, pero en
ausencia de una planta huésped, persiste como una estructura de supervivencia, llamada esclerocio , que puede sobrevivir en el suelo hasta
por 20 años ( Coley-Smith et al., 1990).). Estas masas compactas de micelio endurecido de color negro, de forma esférica y con un tamaño
que oscila entre 200 y 500 μm de diámetro, son la principal fuente de infección del patógeno ( Elsherbiny et al., 2015 ). Los exudados de
raíces de Allium juegan un papel activo en la liberación de compuestos orgánicos volátiles que estimulan la germinación de los esclerocios (
Coley-Smith y King, 1969). ). Una vez que se produce la germinación, las hifas crecen a través del suelo hasta encontrar la planta de cebolla,
penetrando en las raíces y destruyendo su sistema radicular. En Costa Rica, especialmente en la provincia de Cartago, con suelos ricos en
materia orgánica y condiciones ambientales muy estables durante todo el año, la pudrición blanca es la enfermedad más relevante y tiene
efectos negativos en el rendimiento de los cultivos con pérdidas que alcanzan el 50% de la producción esperada. ( Aguilar-Ulloa et al., 2016
).

El control de la enfermedad de la podredumbre blanca es complicado ya que tiene que enfrentar una serie de desafíos biológicos y
ambientales. El uso de variedades de plantas con resistencia genética al patógeno sería el método elegido de preferencia para controlar esta
enfermedad, aunque estos germoplasmas de cebolla no se utilizan ampliamente en cultivares comerciales ( Havey, 2018 ). Adicionalmente,
el uso de agroquímicos ha sido poco eficiente, debido a la resistencia acumulada por la aplicación amplia de un número limitado de
moléculas registradas, lo que ha favorecido el uso de otros métodos como la introducción de agentes de control biológico , especialmente
cepas de Trichoderma ( McLean et al. al., 2012 ).

Los mecanismos de control biológico que muestran las especies de Trichoderma se han estudiado durante décadas ( Harman et al., 2004 ,
Lorito et al., 2010 ). Estos microorganismos no patógenos del suelo tienen la capacidad de antagonizar y micoparasitar hongos patógenos,
colonizar el sistema radicular de la planta e inducir respuestas de defensa de la planta ( Hermosa et al., 2012 ). Las defensas mediadas por
fitohormonas se conocen como resistencia sistémica adquirida (SAR) y resistencia sistémica inducida (ISR) ( Pieterse et al., 2009 ). Como
hongos beneficiosos para las plantas, Trichoderma spp. son conocidos por su capacidad para desencadenar respuestas ISR basadas en
jasmonatos(JA) y vías dependientes de etileno (ET) ( Hermosa et al., 2012 ). También se ha reportado que algunas especies de Trichoderma
desencadenan defensas de las plantas mediadas por ácido salicílico (SA) ( Martínez-Medina et al., 2013 , Morán-Diez et al., 2009 , Salas-
Marina et al., 2011 , Tucci et al. ., 2011 ). En trabajos tempranos, Metcalf et al. (2004) probaron Trichoderma koningii como antagonista para
proteger las raíces de cebolla y Clarkson et al. (2004) trabajando con Trichoderma viride y Trichoderma pseudokoningii , lograron 80% de
parasitación de esclerocios. Más recientementeHussain et al. (2017) reportaron el uso de T. viride, Trichoderma hamatum y Trichoderma
harzianum para el control de la pudrición blanca en plantas de cebolla con una eficiencia cercana al 75% en condiciones de invernadero. Sin
embargo, no se dispone de estudios centrados en los mecanismos subyacentes a la inducción de respuestas de defensa de cebolla mediadas
por Trichoderma asperellum contra S. cepivorum en plantas de cebolla. Además, no existen evidencias del efecto de T. asperellum en el control de
la pudrición blanca de la cebolla y el rendimiento del cultivo en ensayos de campo en agroecosistemas tropicales.

El objetivo de este estudio fue evaluar el potencial de biocontrol de cepas de T. asperellum contra S. cepivorum en plantas de cebolla. Para
lograr este objetivo, los ensayos de antagonismo in vitro sirvieron para seleccionar la cepa de T. asperellum más prometedora , que luego se
probó en ensayos de invernadero in vivo , en términos de aptitud de la planta, biocontrol de S. cepivorumy activación de defensas contra este
patógeno, y en ensayos de campo bajo las condiciones climáticas tropicales de Costa Rica, en términos de eficiencia de biocontrol y
rendimiento de cultivos. Hasta donde sabemos, ni los datos de biocontrol de la pudrición blanca en el bulbo de cebolla ni los estudios
con genes marcadores de defensa de cebolla se han informado en este escenario ambiental, lo que hace de este estudio de investigación una
contribución significativa a este campo.

2 . materiales y métodos

2.1 . Hongos y semillas de cebolla

Como hongos antagónicos se utilizaron las cepas BCC1, BCF2 y BCF7 de Trichoderma asperellum , aisladas de raíces de cebolla en campos de
producción del distrito de Llano Grande (Cartago, Costa Rica). La cepa Sclerotium cepivorum SCM, previamente caracterizada como un
patógeno altamente virulento para las plantas de cebolla, se utilizó como objetivo en nuestros experimentos. Las cepas fúngicas se
cultivaron de forma rutinaria en agar papa dextrosa (PDA) (Difco, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) en placas de Petri durante 8–14 días a 22–25
°C en la oscuridad. Las cepas de T. asperellum se conservaron en suspensión de conidios de glicerol al 30 % a -80 °C, y las de S. sclerotiorumLa cepa
SCM se almacenó como tapones de PDA suspendidos en agua estéril a 4 °C. Los hongos se encuentran depositados en la colección de
cultivos del Laboratorio de Biocontrol del Instituto Tecnológico de Costa Rica (ITCR) de Cartago.

Las semillas de cebolla ( Allium cepa “Alvara”) (Bejo Eurosemillas, Costa Rica) se esterilizaron superficialmente mediante agitación secuencial
vigorosa en soluciones de etanol al 70 % e hipoclorito de sodio al 2 % durante 10 min cada una, luego se lavaron minuciosamente cuatro
veces en agua destilada estéril, y secado al aire sobre una gasa estéril. Esta variedad de cebolla se utilizó a lo largo de este estudio.

2.2 . Ensayos de inhibición del crecimiento fúngico

Los ensayos de confrontación (cultivos duales) entre las cepas BCC1, BCF2 y BCF7 de T. asperellum y la cepa SCM de S. cepivorum se realizaron
como se describió anteriormente ( Rubio et al., 2009 ) con algunas modificaciones. Brevemente, un tapón de agar de 5 mm de diámetro
colonizado por S. cepivorum se cultivó en una placa de Petri a 23 °C en la oscuridad durante 3 días antes de colocar un tapón de agar de 5
mm de diámetro colonizado por una cepa de T. asperellum a 2 cm del borde en el lado opuesto de la placa. Se usaron como controles
cultivos de la cepa SCM que crecía sola. Después de 12 días de cultivo dual, se midió el diámetro de crecimiento micelial del patógeno y se
calculó el porcentaje de inhibición fúngica (FI) según Royce y Ries (1978). IF (%) = RGI × 100; RGI = (CT)/C; donde T es el diámetro
promedio del crecimiento del micelio en presencia de una cepa de T. asperellum y C es el diámetro promedio del crecimiento del micelio en
las placas de control. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Los ensayos antifúngicos de membrana en láminas de celofán se llevaron a cabo en medio PDA y por triplicado como se describió
anteriormente ( Rubio et al., 2009 ). Los diámetros de las colonias de hongos se midieron después de 5 días de incubación a 23 °C en la
oscuridad. Los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibición del crecimiento de la cepa SCM de S. cepivorum por cada cepa de
T. asperellum probada, BCC1, BCF2 y BCF7, con respecto a los diámetros medios de las colonias de la cepa SCM cultivada sola.

2.3 . Ensayos en planta

2.3.1 . Promoción del crecimiento vegetal por T. asperellum

Se realizó un ensayo in vitro para analizar el efecto de las cepas BCC1, BCF2 y BCF7 de T. asperellum en el crecimiento de plántulas de cebolla.
Semillas de cebolla, previamente esterilizadas superficialmente, se cultivaron en medio Murashige y Skoog (MS) (Duchefa Biochemie,
Haarlem, Países Bajos), suplementado con sacarosa al 1% y agar al 0,8% (pH 5,7), durante 3 días. Cada réplica biológica incluía una placa
con cuatro semillas por cepa probada. Se recolectaron conidios de placas de PDA de 7 días de edad agregando 5 ml de agua a las placas y
raspando el cultivo con una espátula de goma. Estas suspensiones se filtraron a través de una doble capa de estopilla para separar los
fragmentos grandes de micelio de los conidios. Las concentraciones de conidios se calcularon usando una cámara de conteo y se usaron
suspensiones para inocular el medio MS. Un inóculo que contiene 1 × 10 6 conidios de cada TrichodermaLa cepa se colocó en el lado
opuesto de las placas que contenían plántulas de cebolla de 3 días de edad. Las placas se cultivaron en una cámara de crecimiento en
condiciones de 40 % de humedad, 24 °C y un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad . Se usaron como control placas que
contenían solo plántulas de cebolla, sin Trichoderma conidios, y cultivadas en condiciones similares. Los experimentos se realizaron por
triplicado, y las medidas de las raíces de las plántulas de cebolla y las secciones aéreas se registraron 5 días después de la inoculación de
Trichoderma .

2.3.2 . Ensayos de biocontrol en condiciones de invernadero

Se realizaron pruebas de biocontrol con T. asperellum BCC1 y S. cepivorum SCM en plantas de cebolla bajo condiciones de invernadero. Se
cultivaron 200 plantas de cebolla en una mezcla de turba:tierra (3:1) durante 50 días antes de trasplantarlas y usarlas en este ensayo. Las
plantas se sembraron individualmente en macetas de 0,7 L de capacidad utilizando una mezcla estéril turba:tierra (3:1) suplementada con
fertilizante de liberación inteligente (Osmocote®, dosis 4 kg/m 3 de sustrato) (Agrotico, Cartago, Costa Rica). ). Se consideraron cuatro
tratamientos diferentes (T1 a T4), utilizando 50 plantas de cebolla por tratamiento, en un ensayo completamente al azar: T1, testigo (sin
tratar); T2, plantas tratadas con T. asperellum BCC1; T3, plantas infestadas con S. cepivorumSMC; y T4, plantas tratadas con ambas cepas
fúngicas. Para los tratamientos T2 y T4, se aplicaron a las raíces de plantas de cebolla de 50 días de edad, 10 mL de una suspensión de
conidios de T. asperellum BCC1, con una concentración de 1 × 10 7  conidios/mL. Para los tratamientos T3 y T4, se mezclaron 10 g de arena
con 100 esclerocios de S. cepivorum /g con la mezcla estéril turba:tierra (3:1) por maceta y se trasplantaron plantas de cebolla de 57 días. Por
lo tanto, las plantas del tratamiento T4 se infestaron con el patógeno una semana después de la aplicación de Trichoderma , y ​se siguió un
tiempo de infección similar para las plantas del T3, excepto que no hubo T. asperellum.se les aplicó antes. Las plantas se mantuvieron en un
invernadero a 23 ± 4 °C y se regaron según fuera necesario. Quince días post-inoculación (dpi) con el patógeno, se registraron las
longitudes de raíz y parte aérea, así como sus respectivos pesos secos para 10 plantas en cada tratamiento. Se evaluó la mortalidad a los 21
dpi en 20 plantas por tratamiento. Para los niveles de expresión de genes marcadores de defensa, se recolectó la hoja central de cinco
plantas de cebolla de cada tratamiento y cada tiempo considerado (1, 2, 7 y 21 días), y se congeló inmediatamente para posteriores
experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real (RT -qPCR) y mediciones de actividad de fenilalanina amoniaco-liasa (PAL). El ensayo de
invernadero se repitió dos veces.

2.3.3 . Ensayos de biocontrol en condiciones de campo

Se establecieron parcelas experimentales en dos fincas (denominadas aquí “Tierra Blanca” y “Llano Grande”) en la provincia de Cartago en
Costa Rica, bajo las condiciones climáticas de la montaña tropical. El suelo de “Tierra Blanca” se caracterizó como franco limoso (pH 5.9)
mientras que “Llano Grande” fue franco arcilloso con un pH de 5.7. Los experimentos se realizaron en la época de lluvias de los años 2017
y 2018. Bajo estas condiciones se evaluó la mortalidad de plantas de cebolla por S. cepivorum y el rendimiento total. El nivel de inóculo inicial
de S. cepivorum se estableció según el método de Papavizas (1972). Brevemente, se mezclaron 50 g de suelo con 200 mL de agua destilada en
una licuadora a 2000 rpm y se tamizaron a través de tamices de malla 20 y malla 80. El residuo en el tamiz de malla 80 se lavó con agua
corriente del grifo durante 15 min y luego se secó en una estufa durante 1 h a 50 °C. Los esclerocios se observaron al microscopio óptico y
su número se expresó como esclerocios por g de suelo. En estos ensayos de campo se usaron plántulas de cebolla de cincuenta días de
edad, cultivadas en una mezcla de turba:tierra (3:1) en condiciones de invernadero como se describe anteriormente. Se consideraron tres
tratamientos: T1, control; T2 y T3, T. asperellum utilizado en dos concentraciones diferentes. Para el tratamiento de control (T1), las plantas
de cebolla se rociaron con una mezcla (proporción 1:1) de los fungicidascarboxina y captan (Vitamax 400®, Arysta Lifesciences, Saltillo,
México) en campo en la etapa inicial del experimento, y con el fungicida tebuconazol (Folicur 25 EC®, Bayer CropScience, San José, Costa
Rica) después de 30, 45 , 60 y 75 días de la siembra. Se aplicó carboxin-captan a razón de 0,25% (p/v) del producto por ha de suelo y
tebuconazol al 0,12% (v/v) del producto por ha de suelo. Tratamiento T2, plantas de cebolla tratadas por inmersión de raíces en 4 L de una
suspensión de conidias (1 × 10 6  conidios/mL) de T. asperellum BCC1 durante 5 min, luego sembradas en el suelo del campo y luego una
aspersión adicional de 4 mL de 1 × 10 6Se aplicaron conidios BCC1/mL por planta a los 30, 45, 60 y 75 días después de la siembra; para T3,
las plantas de cebolla se trataron de manera similar a las del tratamiento T2, pero en su lugar se utilizó una concentración de 1 × 10 7
 conidios/mL de BCC1. Cada unidad experimental fue de 1.1 × 1.1 m 2 con una densidad de 100 plantas/m 2 . Para cada tratamiento se
realizaron 10 repeticiones con 100 plantas en cada repetición. Además de los tratamientos aplicados, cada unidad recibió los mismos
cuidados generales con aplicaciones de fertilizante NPK granulado de fórmula 10-30-10 a los 30 días, de 20-20-20 a los 60 días, y de 12-11-
17 a los 90 días. días. Además, una solución de 400 mL/m 3de nitrato de calcio (20 g de compuesto activo por kg de producto comercial)
(AugeCalcio 18®, AgroPro Centroamérica, San José, Costa Rica) sobre las hojas, y 4 mL de un acaricida (Akaramic 1.8 EC®, a base de
abamectina B1a y B1b) (0,25% v/v) (Rotam CropSciences, Hong Kong, China) se aplicaron por planta 70 días después de la siembra. La
mortalidad total y el rendimiento final se registraron en la última etapa del experimento, 5 meses después de la siembra inicial.
2.4 . PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
Los análisis de expresión se realizaron con hojas de plantas de cebolla muestreadas del ensayo de invernadero descrito anteriormente. La
hoja central de cinco plantas se recolectó por separado para cada tratamiento a 1, 2, 7 y 21 dpi y se consideró como réplica biológica. El
ARN total se extrajo con GenElute Universal Total RNA Purification Kit® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y luego se usó para
sintetizar ADNc con ReadyScript cDNA Synthesis Mix® (Sigma-Aldrich) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La reacción de PCR
se realizó en un Light Cycler 480® (Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA, EE. UU.) y utilizando el Light Cycler 480 SYBR Green I
Master® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania). Las mezclas de reacción y las condiciones de amplificación se llevaron a cabo
como se describió anteriormente (Montero-Barrientos et al., 2011 ). La reacción se llevó a cabo en un volumen total de 10 μL y tres
repeticiones técnicas para cada condición ensayada. Los valores de Ct se normalizaron con los valores del gen de actina de cebolla ( AcACT )
y la expresión génica relativa se calculó mediante el método 2 −ΔΔCT ( Schmittgen y Livak, 2008 ). Se analizaron los genes marcadores de las
vías de defensa dependientes de SA, JA y ET: AcPR1 y AcPAL1 , AcLOX1 y AcEIN3 , respectivamente. La secuencia de cebadores utilizados en
este estudio y los números de acceso de GenBank de cada gen se enumeran en la Tabla de material complementario S1. La disponibilidad
de cualquier base de datos genómica para Allium se limita a la Base de datos genómica de cebolla ( Shukla et al., 2016 ) y se utilizó como
fuente de referencias para estos genes. Se utilizaron el software Primer3Plus® (Free Software Foundation Inc., Boston, MA, EE. UU.) y el
OligoAnalyzer 3.1 (Integrated DNA Technologies, Skokie, IL, EE. UU.) para diseñar y probar in silico las secuencias.

2.5 . Determinación de la actividad de L-fenilalanina amoniaco-liasa (PAL)

La hoja central de cinco plantas del ensayo de invernadero por tratamiento y tiempo de muestreo se procesó como se describe
anteriormente y se usó para determinar la actividad PAL. El material vegetal se homogeneizó en 3 mL de tampón de borato trisódico 0,1 M
(pH 8,5) que contenía 2-mercaptoetanol 1,4 mM y 0,1 g de polivinilpirrolidona insoluble . El extracto se filtró a través de una gasa y se
centrifugó a máxima velocidad durante 15 min. La determinación de la actividad PAL se analizó como la tasa de conversión de L-
fenilalanina en ácido trans - cinámico a 270 nm en un espectrofotómetro .. Se añadió una alícuota de 200 μL de la muestra a 400 μL de
tampón de borato y 200 μL de L-fenilalanina 40 mM, y la mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 15 min. La reacción se detuvo con
un volumen igual al 10 % (p/v) de ácido tricloroacético (TCA) y las muestras se centrifugaron a máxima velocidad durante 15 min. Los
sobrenadantes se usaron para medir la absorbancia a 270 nm y el ácido trans -cinámico se calculó usando una curva estándar según Lee et
al. (2015) . Los resultados se presentan como μmol/min (U) por g de tejido fresco.

2.6 . Análisis estadístico

Los datos se analizaron utilizando el software estadístico Minitab 18 (Minitab, Inc., State College, PA, EE. UU.). Se evaluaron la normalidad
y la homocedasticidad. Todos los datos se analizaron con ANOVA seguido de la prueba de Fisher ( P  < 0,05), con la excepción de los niveles
de expresión génica que se analizaron mediante ANOVA y la prueba de Tukey ( P  < 0,05). En particular, los datos registrados de los ensayos
de campo se analizaron utilizando un modelo lineal generalizado (GLM) con una significación del 5 % y una comparación de Fisher.

3 . Resultados

3.1 . Antagonismo de cepas de T. asperellum frente a S. cepivorum

Tanto en el cultivo dual como en las pruebas de membrana de celofán , las tres cepas de T. asperellum redujeron el crecimiento de S. cepivorum.
Se observaron diferencias significativas en los porcentajes de FI de S. cepivorum para las tres diferentes cepas de T. asperellum evaluadas (
Cuadro 1 ). En la prueba de antagonismo de cultivo dual, las cepas BCC1 y BCF7 mostraron el FI más alto mientras que la cepa BCF2 dio
un valor significativamente más bajo. La capacidad antagónica de TrichodermaLas cepas también se analizaron en ensayos de celofán que
permitieron determinar el efecto de las enzimas hidrolíticas y los metabolitos secretados al medio de cultivo. La cepa BCC1 mostró un
porcentaje de FI significativamente más alto, en comparación con las otras dos cepas, BCF2 y BCF7, que no presentaron diferencias
significativas.

Tabla 1 . Porcentaje de inhibición del crecimiento de SCM de S. cepivorum por tres cepas de T. asperellum (BCC1, BCF2 y BCF7) en ensayos de
cultivo dual (12 días) y membrana de celofán (5 días). Los valores son medias de tres réplicas biológicas ± desviaciones estándar. Letras
diferentes indican diferencias significativas (prueba de Fisher, P  < 0,05).

T. asperellum cultura dual Membrana de celofán

BCC1 80,66 ± 2,76 a 89,86 ± 0,63a

BCF2 69,39 ± 2,65b 83,70 ± 1,09b

T. asperellum cultura dual Membrana de celofán

BCF7 79,20 ± 1,09 a 81,52 ± 3,92b

3.2 . Efecto de cepas de T. asperellum en el crecimiento de plántulas de cebolla

El efecto de T. asperellum sobre el crecimiento de plántulas de cebolla de 3 días de edad se evaluó en ensayos in vitro ( Cuadro 2 ). Las raíces
de cebolla tratadas con Trichoderma fueron significativamente más cortas que las del tratamiento control, pero no hubo diferencias entre las
cepas. En cuanto a la longitud del tallo, no hubo diferencias entre los tratamientos, incluida la condición testigo.

Tabla 2 . Efecto de tres cepas de T. asperellum (BCC1, BCF2 y BCF7) en el crecimiento de plántulas de cebolla de 3 días. Se registraron medidas
de longitud de raíz y tallo en plántulas de 8 días de edad, cinco días después de aplicar los tratamientos con Trichoderma . Los valores son
medias de tres réplicas biológicas ± desviaciones estándar. Letras diferentes indican diferencias significativas (prueba de Fisher, P  < 0,05).

Tratamiento Longitud de la raíz (cm) Longitud del tallo (cm)

Control 2,19 ± 0,64a 2,78 ± 0,63a

BCC1 1,56 ± 0,24b 2,66 ± 0,75a

BCF2 1,54 ± 0,56b 2,82 ± 0,99a

BCF7 1,76 ± 0,50b 3,06 ± 0,94a

3.3 . Biocontrol de la podredumbre blanca de la cebolla por T. asperellum BCC1 en condiciones de invernadero
Se evaluó la capacidad de T. asperellum BCC1 para controlar la pudrición blanca de cebolla en plantas de cebolla de 50 días de edad. La
longitud de la raíz y el peso seco, la longitud del tallo, el peso seco del dosel y la mortalidad se evaluaron en un ensayo de invernadero (
Cuadro 3 ). El análisis de los parámetros de crecimiento de raíz y tallo, evaluados 15 dpi con el patógeno, reveló que las plantas de cebolla
infestadas con S. cepivorum solo presentaron los valores más bajos, diferenciándose significativamente de los otros tres tratamientos,
mientras que los correspondientes al testigo y T. asperellum  +  S .cepivorumlos tratamientos mostraron los más altos para los cuatro rasgos de
crecimiento medidos. Las plantas de cebolla tratadas únicamente con BCC1 mostraron valores de longitud de tallo y raíz menores que los
del control, aunque no se observaron diferencias significativas para los pesos secos correspondientes. Se evaluaron los porcentajes de
mortalidad en 20 plantas de cebolla por cada tratamiento 21 dpi con S. cepivorum . Como era de esperar, los tratamientos de control y T.
asperellum presentaron plantas 100% sanas, lo que indica que esta cepa de Trichoderma no causó daño a ninguna planta. Además, las plantas
de cebolla tratadas con BCC1 mostraron un efecto positivo en la protección de la cebolla contra S. cepivorumya que la proporción de
mortalidad observada en las plantas de cebolla tratadas con ambas cepas fúngicas fue del 14 % frente al 88 % de mortalidad registrada en las
plantas infectadas únicamente con S. cepivorum .

Tabla 3 . Efecto del tratamiento con T. asperellum BCC1 sobre la aptitud de las plantas de cebolla y el biocontrol contra S. cepivorum .

Tratamiento Longitud de la raíz (cm) Peso seco de la raíz (g) Longitud del tallo (cm) Peso seco del dosel (g) Porcentaje de mortalidad (%)

Mando T1 10,73 ± 1,61a 0,10 ± 0,03 a 16,91 ± 1,78a 0,17 ± 0,04a 0

T2 9,18 ± 1,47b 0,12 ± 0,02 a 14,61 ± 1,85b 0,17 ± 0,02a 0

T3 6,88 ± 0,99c 0,08 ± 0,01b 10,09 ± 2,34c 0,11 ± 0,03b 88

T4 9,32 ± 2,05ab 0,11 ± 0,03 a 15,49 ± 1,73ab 0,18 ± 0,03a 14

Los valores son la media de las réplicas (n = 10, para los parámetros de crecimiento) y (n = 20, para la mortalidad) con su correspondiente desviación estándar.
Los datos se recolectaron 15 dpi (para parámetros de crecimiento) y 21 dpi (para mortalidad) con el patógeno. Los tratamientos probados fueron: control T1
(plantas sin tratar); T2 (plantas tratadas con T. asperellum BCC1); T3 (plantas infestadas con S. cepivorum ); y T4 (plantas tratadas con BCC1 y S. cepivorum ).

Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes según la prueba de Fisher ( P  < 0,05).
3.4 . Biocontrol de la podredumbre blanca de la cebolla por T. asperellum BCC1 en condiciones de campo
El inóculo inicial determinado para la finca “Tierra Blanca” fue de 0.020 esclerocios/g de suelo y para la finca “Llano Grande” fue de 0.025
esclerocios/g de suelo. Con base en estos valores, ambos suelos se consideraron homogéneos y aptos para los ensayos.

Las pruebas de campo mostraron los efectos de dos dosis de T. asperellum BCC1 en el biocontrol de la pudrición blanca de la cebolla en
comparación con los agroquímicos comúnmente aplicados por los agricultores que se usaron como control ( Cuadro 4 , Cuadro 5 ). Para el
análisis de mortalidad ( Cuadro 4 ), la prueba GLM determinó que solo el tipo de tratamiento tuvo un efecto significativo en este parámetro.
La prueba de comparación (método de Fisher) determinó que no hubo diferencias entre los datos de las dos fincas consideradas ( P  < 0.05),
pero sí entre los tratamientos. La condición testigo presentó la mayor mortalidad de plantas (4.59 ± 0.39 plantas/m 2) lo que equivale a
45.900 plantas/ha o 4,59% de mortalidad. Las plantas de cebolla tratadas con la concentración más baja de esporas de BCC1 (tratamiento
T2) mostraron la tasa de mortalidad más baja (3,41 %), mientras que una dosis más alta aumentó la mortalidad de la planta (3,61 %). Para el
análisis de rendimiento ( Cuadro 5 ), la prueba GLM determinó que tanto el año ( P  = 0.03) como el tratamiento ( P  = 0.00) tuvieron un
efecto significativo en el rendimiento de cebolla ( P  < 0.05). El menor rendimiento (2,45 ± 0,28/m 2 , equivalente a 24,5 ton/ha) se obtuvo
con el testigo (tratamiento T1). Por otro lado, la dosis más alta de T. asperellum(tratamiento T3) produjo el mayor rendimiento con 30.5
ton/ha, es decir un incremento de 20.4% con respecto al testigo. El rendimiento de cebolla a la dosis más baja de BCC1 (tratamiento T2)
también fue significativamente mayor que el testigo, con una media de 29,02 ton/ha y un incremento del 18,4%.

Tabla 4 . Modelo lineal generalizado de mortalidad de cebollas en experimentos de campo.

Efecto principal d.f. Probabilidad*

Granja 1 0.06

Tratamiento 2 0.00*

Año 1 0.84

Finca*Tratamiento 2 0.76

Finca*Año 1 0.48

Tratamiento*Año 2 0.91

Granja*Tratamiento*Año 2 0.65

Error 108

Términos para las comparaciones de Fisher Medios (plantas/m 2 )

Tratamiento Mando T1 4,59 ± 0,39a

T2 3,41 ± 0,34c

T3 3,61 ± 0,34b

Modelo
Mortalidad = 3,87 + 0,72 T1 Control −  0,46 T2 −  0,26 T3

Los datos representan el promedio de las réplicas (n = 10) ± desviaciones estándar. Los tratamientos ensayados fueron: Control T1 (plantas sin tratar); T2
(plantas tratadas con 1 × 10 6 conidios/mL de BCC1); y T3 (plantas tratadas con 1 × 10 7 conidios/mL de BCC1).

*Para cada efecto, los asteriscos indican diferencias significativas ( P  < 0,05). Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes según la
prueba de Fisher ( P  < 0,05).

Tabla 5 . Modelo lineal generalizado para el rendimiento de cebollas en experimentos de campo.

Efecto principal d.f. Probabilidad*

Granja 1 0.40

Tratamiento 2 0.00*

Año 1 0.03*

Finca*Tratamiento 2 1.00

Finca*Año 1 0.57

Tratamiento*Año 2 0.71

Granja*Tratamiento*Año 2 0.62

Error 108

Términos para las comparaciones de Fisher Medios (Kg/m 2 )

Año 2017 2,86 ± 0,36 a

2018 2,75 ± 0,37b

Tratamiento Mando T1 2,45 ± 0,28c

T2 2,90 ± 0,25b

T3 3,05 ± 0,27a

Modelo
Rendimiento = 2,80–0,35 T1 Control + 0,10 T2 + 0,25 T3 + 0,05  Año 2017–0,05  Año 2018

Los datos representan el promedio de las réplicas (n = 10) ± desviaciones estándar. Los tratamientos ensayados fueron: Control T1 (plantas sin tratar); T2
(plantas tratadas con 1 × 10 6 conidios/mL de BCC1); y T3 (plantas tratadas con 1 × 10 6 conidios/mL de BCC1).

*Para cada efecto, los asteriscos indican diferencias significativas ( P  < 0,05). Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes según la
prueba de Fisher ( P  < 0,05).

3.5 . Defensa sistémica desencadenada por T. asperellum BCC1 frente a S. cepivorum SCM en plantas de cebolla
Se analizaron los niveles de expresión de genes marcadores de defensa en la hoja central de plantas de cebolla para los cuatro tratamientos
(T1, T2, T3 y T4) comparados en el ensayo de invernadero en cuatro puntos de tiempo (1, 2, 7 y 21 dpi con el patógeno).

La expresión de AcPAL1 mostró un perfil diferente según si la planta fue desafiada por T. asperellum BCC1 o S. cepivorum ( Fig. 1 ). Este gen
estaba fuertemente regulado por BCC1 a 1 y 7 dpi en comparación con el control, pero estaba regulado a la baja en el día 2 y 21 mostrando
un patrón de expresión ondulante. El nivel de expresión de AcPAL1 en el tratamiento T2 fue 49,7 y 3,3 veces mayor que en las plantas que
recibieron el tratamiento T3 en los días 1 y 7, respectivamente. Cuando las plantas de cebolla se trataron con el patógeno, los niveles de
expresión de AcPAL1 fueron significativamente más bajos, en comparación con el tratamiento de control, a 1 (0,12 veces), 2 (0,87 veces) y 21
ppp (0,30 veces) .La combinación de agente de biocontrol y patógeno provocó un aumento significativo de la expresión de este gen en
comparación con las plantas tratadas únicamente con el patógeno en todos los tiempos analizados; sin embargo, los niveles fueron
significativamente más bajos que los de las plantas tratadas con T. asperellum en el día 1 (0,32 veces) pero más altos a los 2 (1,13 veces) y 21
(2,32 veces) ppp.
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Figura 1 . Expresión relativa de AcPR1 , AcPAL1 , AcLOX1 y AcEIN3 en plantas de cebolla tratadas con T. asperellum , S. cepivorum o la
combinación de ambas cepas fúngicas ( T. asperellum  +  S. cepivorum ) en un estudio de 21 días. Los valores corresponden a mediciones
relativas frente a la respectiva condición de control (plantas sin tratar) (2 −ΔΔCT  = 1) para cada punto de tiempo. Las barras de error
representan las desviaciones estándar de cinco réplicas biológicas en cada momento. El gen de la actina ( AcACT) se utilizó como referencia.
Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional y prueba de Tukey. Letras diferentes representan diferencias significativas ( P  <
0,05).

AcPR1 también mostró un patrón de expresión diferente según el microbio inoculado. Los niveles más altos de expresión se observaron el
día 7 para aquellas plantas tratadas con T. asperellum o la combinación de agente de control biológico y patógeno (en comparación con las
plantas de control) ( Fig. 1 ). La expresión de AcPR1 en el tratamiento T3 fue 0,33 veces (en el día 1), 0,87 veces (en el día 2) y 0,30 veces (en el
día 21) menor, donde solo se aplicó S. cepivorum a las plantas, en comparación con las plantas no tratadas. plantas (T1), excepto en el día 7
donde no se observaron diferencias significativas. Aunque más tarde en el tiempo que la expresión observada para AcPAL1 , AcPR1también
mostró un patrón de expresión ondulante a partir del día 2 para aquellas muestras tratadas solo con BCC1.

En comparación con las plantas de control, T. asperellum provocó una fuerte disminución en la expresión de AcLOX1 en el día 1 (34,4 veces)
( Fig. 1 ). Aunque esta regulación a la baja se redujo moderadamente desde el día 2, y la expresión de este gen nunca se reguló al alza en
ninguno de los otros tres puntos de tiempo analizados. La expresión de AcLOX1 parece estar más inducida por el patógeno, pero solo se
detectó una regulación positiva significativa a los 7 (3,6 veces) y 21 (6,3 veces) ppp.

Los niveles de expresión de AcEIN3 mostraron un incremento continuo desde el día 1 al 21 en aquellas plantas tratadas con T. asperellum ,
aunque solo se reguló a la baja a 1 ppp (0,25 veces) y se reguló al alza a 21 ppp (2 veces) en comparación para controlar las plantas. No se
observaron diferencias significativas entre los tratamientos en los días 2 y 7 y solo la combinación de ambas cepas fúngicas mostró una
regulación positiva significativa de AcEIN3 a los 21 ppp en comparación con las plantas de control (1,7 veces).

La actividad enzimática de PAL se calculó para todos los tratamientos ( Tabla 6 ). Solo los datos recopilados en el día 2 no mostraron
diferencias significativas entre los tratamientos. La mayor actividad PAL se detectó en las plantas del tratamiento con T. asperellum a 1 y 7
dpi (19,15 y 16,21 U/g, respectivamente), mientras que las plantas infectadas con S. cepivorum mostraron la menor actividad (0,77 U/g y 6,40
U/g). g, respectivamente).

Tabla 6 . Actividad PAL (U/g de tejido fresco) medida en hojas de cebolla en 4 tratamientos.
Tratamiento * ppp 1 2 ppp 7 ppp 21 ppp

Control 4,68 ± 0,18c 4,50 ± 0,15 a 4,58 ± 0,26c 4,52 ± 0,12a

T. asperellum 19,15 ± 0,12a 4,42 ± 0,34a 16,21 ± 0,54a 1,61 ± 0,08c

S. cepivorum 0,77 ± 0,00 días 4,25 ± 0,09a 6,40 ± 0,33 días 2,70 ± 0,20b

T. asperellum  +  S. cepivorium 9,03 ± 0,20b 4,76 ± 0,12a 12,30 ± 0,94b 1,87 ± 0,07c

Los valores son la media de las réplicas con su correspondiente desviación estándar.

Los valores seguidos de letras diferentes son significativamente diferentes según la prueba de Fisher ( P  < 0,05).

*Días post-inoculación.

Ecuación de regresión de la curva estándar del ácido transcinámico (y = 0,3836x−0,6501).

4 . Discusión
El potencial de T. asperellum BCC1 como agente efectivo de biocontrol de S. cepivorum en plantas de cebolla quedó claramente demostrado
en este estudio, ya que se observaron reducciones en la mortalidad de las plantas debido a la pudrición blanca en aquellas plantas tratadas
con esta cepa en experimentos de invernadero y de campo. Cabe señalar aquí que las tres cepas de T. asperellum evaluadas en este trabajo
fueron aisladas de raíces de cebolla en campos de producción del distrito de Llano Grande en Cartago, Costa Rica ( Alvarado-Marchena y
Rivera-Méndez, 2016), donde se llevaron a cabo los experimentos de campo descritos en este estudio. Este aspecto debe considerarse un
activo valioso para las aplicaciones de biocontrol, ya que los aislamientos nativos se adaptan mejor a sus condiciones climáticas locales y
objetivos patogénicos que los aislamientos foráneos ( Debbi et al., 2018 ).

Sobre la base de los resultados in vitro , se seleccionó T. asperellum BCC1 para ensayos de biocontrol en plantas de cebolla en ensayos de
invernadero y de campo. De hecho, se observó antagonismo directo, en grado variable de rendimiento entre las tres cepas de T. asperellum
probadas, tanto en ensayos de cultivo dual como de membrana de celofán. En cualquier caso, BCC1 mostró el mejor desempeño. La
capacidad de antagonismo de las especies de Trichoderma contra S. cepivorum es bien conocida ( Hernández et al., 2011 , Shalaby et al., 2013 ),
pero a pesar de que este patógeno es una de las principales causas de pérdidas económicas importantes en los cultivares de cebolla, aún el
control de la pudrición blanca no se ha explorado completamente con Trichodermapresiones. Algunos estudios describen estrategias para el
biocontrol de S. cepivorum en ensayos de invernadero o de campo en diferentes regiones climáticas. Torrés-Barragán et al. (1996) inocularon
plantas de cebolla con el consorcio de micorrizas arbusculares Glomus sp. Zac-19 logró una protección significativa contra S. cepivorum y un
incremento del rendimiento del 22 % en comparación con los controles sin micorrizas en los ensayos de campo de México. De manera
similar, las plantas de cebolla tratadas con Rhizophagus irregularis (anteriormente Glomus intraradices ) mostraron menor incidencia de
pudrición blanca que aquellas plantas no tratadas en campos orgánicos de cebolla en la región de Ontario (Canadá) ( Jaime et al., 2008 ).
Antagonista bacterianoTambién se ha descrito que los aislamientos reducen la podredumbre blanca en las plantas de cebolla en
comparación con el control no tratado en los ensayos de campo de Egipto ( Elshahawy et al., 2018 ). El uso de especies de Trichoderma para
biocontrolar S. cepivorum en plantas de cebolla también ha sido descrito en ensayos de campo localizados en Egipto, utilizando T. koningii y
T. harzianum ( Shalaby et al., 2013 ), Reino Unido con T. viride ( Clarkson et al. al., 2006 , Coventry et al., 2006 ), o Australia con T. koningii (
Metcalf et al., 2004). Sin embargo, en países como Costa Rica con suelos ricos en materia orgánica y donde las condiciones climáticas
tropicales favorecen fácilmente el desarrollo de la pudrición blanca, no existen estudios relevantes que puedan contribuir a implementar el
uso de Trichoderma spp. como agentes de biocontrol en sí mismos o como herramienta dentro del control de manejo integrado de esta
enfermedad de la cebolla.

Antes de que se llevaran a cabo los experimentos de campo, se llevaron a cabo ensayos de invernadero con T. asperellum BCC1 para probar
sus capacidades contra S. cepivorum en plantas de cebolla. Varios estudios han demostrado el potencial de T. asperellum para biocontrolar
patógenos con diversos estilos de vida en diferentes plantas como Rhizoctonia solani en pepino ( Trillas et al., 2006 ), Pythium myriotylum en
cocoya ( Mbarga et al., 2012 ), Fusarium oxysporum en tomate ( Debbi et al., 2018 ), o Verticillium dahliae en cultivares de olivo ( Carrero-Carrón
et al., 2016 ). La cantidad deLos esclerocios de S. cepivorum que se utilizaron como dosis infectiva en el ensayo de invernadero, resultaron
adecuados para el inicio del desarrollo de pudrición blanca en plántulas de cebolla, ya que se registraron porcentajes de mortalidad del 88%
en el tratamiento T3. Como era de esperar, las plantas de cebolla infestadas con S. cepivorum (tratamiento T3) presentaron significativamente
menos biomasa seca de raíces y dosel y longitudes de raíces y tallos más pequeñas. El porcentaje de mortalidad obtenido para el
tratamiento T4 fue del 14%, demostrando la eficacia de la cepa BCC1 frente a S. cepivorum . Aunque se obtuvieron menores valores de
longitud de raíz y tallo al aplicar T. asperellumBCC1 a plantas de cebolla (tratamiento T2), no se observaron diferencias significativas en los
valores de peso seco entre estas plantas y las de la condición control. Es importante señalar la reducida respuesta de crecimiento radicular
de las plántulas de cebolla inoculadas con cualquiera de las tres cepas de T. asperellum ensayadas. Al respecto, cabe mencionar que la
capacidad de promover el crecimiento vegetal no es una característica común extensible a todas las cepas de Trichoderma ( Rubio et al., 2012
). Sin embargo, las plantas de cebolla tratadas con la combinación de la cepa BCC1 y S. cepivorum(tratamiento T4) no mostró peores
parámetros fenotípicos (longitud de raíz y tallo) en comparación con las plantas de control, pero disminuyó la mortalidad de las plantas de
cebolla en comparación con el tratamiento T3. La ausencia de diferencias significativas en la aptitud de la planta entre el tratamiento T4 y
los tratamientos T1 y T2 puede ser indicativa de que se está produciendo una activación de las defensas de la planta en respuesta a la
aplicación de T. asperellum BCC1 solo. Este resultado ha sido descrito anteriormente en Trichoderma ( Alonso-Ramírez et al., 2014 , Hermosa
et al., 2013), y en este estudio se ha investigado la activación de las defensas sistémicas de la cebolla. En el ensayo de invernadero donde se
controlaron las condiciones ambientales, se analizaron los genes marcadores de defensa de cebolla en un estudio de 21 días de duración
para saber si la reducción en la mortalidad de las plantas de cebolla observada a los 21 dpi con el patógeno en el tratamiento T4, se reflejó
en los cambios. de los niveles de expresión génica.

Las respuestas de defensa de las plantas a la inoculación de la raíz de T. asperullum se han descrito como del tipo ISR ( Shoresh et al., 2005 ),
pero cada vez más estudios informan respuestas de defensa dependientes de SA provocadas por Trichoderma spp. ( Salas-Marina et al., 2011 ,
Tucci et al., 2011 ). Nuestros datos muestran un patrón de expresión ondulante para los genes AcPAL1 y AcPR1 , ambos marcadores de
defensa dependientes de SA, desencadenados por la cepa BCC1 cuando se aplica solo a plantas de cebolla, como se observa en las
interacciones Trichoderma parareesei -tomate ( Rubio et al., 2014 ). En este punto, como se muestra en la Fig. 1 , también se observó una
regulación a la baja de los genes de defensa dependientes de JA/ET ( AcLOX1 y AcEIN3 ) 1 día después de la aplicación de la cepa BCC1 a las
plantas de cebolla. La falta de una fuente de información relevante sobre la regulación de las defensas en las plantas de cebolla frente a S.
cepivorum nos lleva a especular que la respuesta podría ser dependiente de JA/ET, de manera similar a la mostrada frente a otros patógenos
necrotróficos ( Glazebrook, 2005 ). En este sentido, la expresión de AcLOX1 aumentó a los 7 y 21 ppp, mientras que no hubo una regulación
positiva significativa de los genes dependientes de SA en comparación con las plantas de control. El uso de S. cepivorumesclerocios como
inóculo podría explicar el retraso en la defensa sistémica mediada por JA observado en plantas a 1 dpi con el patógeno. Como informaron
Adams y Papavizas (1971) , en suelo esterilizado en autoclave, las hifas emergen del esclerocio en un período de aproximadamente 1 a 2 días.
Teniendo en cuenta que T. asperellum se aplicó a las plantas de cebolla 7 días antes que el patógeno en el tratamiento combinado (T4), es
muy probable que pueda haber un cebado dependiente de SA basado en el mayor AcPAL1niveles de expresión en esta condición en
comparación con lo que se observó en las plantas tratadas con BCC1 solo. Así, al día 21 cuando se registró la mortalidad de las plantas de
cebolla, la reducción observada en las plantas de cebolla del tratamiento T4 podría explicarse por la actividad sinérgica del antagonismo
directo de T. asperellum contra S. cepivorum observado en los estudios in vitro y la planta defensas sistémicas inducidas por la cepa BCC1. Una
observación adicional que corrobora el patrón de expresión de AcPAL1 , fueron los datos de actividad enzimática de PAL ( Tabla 6 ) que
mostraron un comportamiento ondulante similar a los detectados en la expresión de este gen ( Fig. 1 ). El factor de transcripción
EIN3activa genes sensibles a ET ( Contreras-Cornejo et al., 2015 ). La ET es un factor clave en la regulación de los procesos de desarrollo
radicular, al inhibir la formación y elongación de raíces laterales ( Contreras-Cornejo et al., 2015 , Hermosa et al., 2012 ). Entonces, la
regulación al alza de AcEIN3 observada en plantas de cebolla para el tratamiento T2 a los 21 días, tratadas únicamente con T. asperellum ,
podría explicar la ausencia de promoción del crecimiento. Sin embargo, cuando se combinó con el patógeno, los datos de crecimiento de
la planta también fueron similares a los de las plantas de control, siendo la expresión de AcEIN3 regulada a la baja en comparación con el
tratamiento T2 pero regulada al alza en comparación con las plantas no tratadas.

Los resultados de los ensayos en ambientes controlados, como los invernaderos, rara vez se traducen en evaluaciones de campo debido a
las condiciones ambientales fluctuantes. Sin embargo, la evaluación del rendimiento de T. asperellum BCC1 realizada en dos experimentos
independientes en dos ensayos de temporadas consecutivas proporcionó resultados concluyentes en cuanto a la utilidad de esta cepa para
fines comerciales futuros. Nuestros datos no indican diferencias en el factor "Granja", lo que nos lleva a concluir que las características del
suelo (pH y composición del suelo) son lo suficientemente similares como para no ser un factor clave que controle el desarrollo de S.
cepivorum o T. asperellumel rendimiento y, por tanto, la producción de bulbos de cebolla. Sin embargo, el año de siembra reveló ser un factor
que afecta el rendimiento, pero no la mortalidad, lo que puede estar relacionado con las condiciones climáticas (temperatura o humedad), a
pesar de que no se registraron variaciones relevantes en la estación meteorológica más cercana a las fincas (datos no mostrados). Sin
embargo, hubo un claro efecto dependiente de la dosis relacionado con la aplicación de T. asperellum BCC1 en los ensayos de campo.
Cuando se utilizó en la concentración más alta, mejoraron la incidencia de pudrición blanca y los parámetros de rendimiento del bulbo de
cebolla, independientemente de la ubicación de la granja y las variaciones estacionales de la cosecha. Asimismo, concentraciones más altas
de conidios de T. asperellum parecen funcionar mejor contra R. solanicuando se aplica a plántulas de pepino ( Trillas et al., 2006 ). Y en las
plantas de arroz expuestas al estrés por sequía, las dosis crecientes de T. harzianum aplicadas a las raíces mejoraron la tolerancia a la sequía
de la planta ( Pandey et al., 2016 ). En Costa Rica, la ausencia de cultivares de cebolla tolerantes o resistentes a S. cepivorum , ligado a su clima
tropical y al alto contenido orgánico propio de los suelos volcánicos , facilitan las enfermedades fúngicas. Este hecho ha sido
consistentemente observado en resultados previos que indican que, usando un S. cepivorum similarinóculo sin ningún tratamiento químico
o biológico, el nivel de pudrición blanca alcanzó el 85-100% del total de plantas en menos de 25 días ( Del Milagro-Granados, 2005 ). Esta
es la razón que nos llevó a no incluir como control en los ensayos de campo plantas no tratadas. En nuestro estudio, la mayor incidencia
de pudrición blanca se observó en el tratamiento T1 donde se aplicó una mezcla de fungicidas químicos a las plantas de cebolla, aunque el
resultado más significativo a destacar aquí es el hecho de que la enfermedad de la pudrición blanca se redujo en las plantas inoculadas con
cualquier de las concentraciones de T. asperellum BCC1 (tratamientos T2 y T3) lo que se tradujo en un aumento del rendimiento de bulbo
de cebolla para este último. Estos resultados parecen contradecir otros estudios que reportan el uso de bacterias antagonistas (Elshahawy et
al., 2018 ) o T. viride ( Clarkson et al., 2006 ) para el control de la podredumbre blanca en ensayos de campo de cebolla, y en los que el uso de
estos agentes de biocontrol, aunque se pensaba que mostraba resultados prometedores, era menos efectivo que el tratamiento químico. .
Durante décadas, el control químico de la pudrición blanca en plantas de cebolla en Costa Rica ha tenido como resultado un número cada
vez mayor de cepas de S. cepivorum resistentes a estos tratamientos. En lugar de usar dosis más altas de pesticidas químicos para superar el
problema, como se establece en el manejo de la podredumbre blanca, nuestros resultados proponen no solo una alternativa amigable con
el medio ambiente, sino también un método efectivo de producción de cultivos para ser utilizado por los agricultores de esta región.

5 . Conclusión
La aplicación de T. asperellum BCC1 a plántulas de cebolla antes de trasplantarlas a suelos infestados con esclerocios de S. cepivorum en Costa
Rica bajo clima tropical, reduce la incidencia de pudrición blanca y aumenta el rendimiento de bulbos de cebolla. Nuestros resultados
podrían considerarse un gran avance en este campo, ya que no solo se confirma el biocontrol en ensayos de campo e invernadero, sino que
también se presentan evidencias de la activación de la defensa sistémica por parte de T. asperellum contra S. cepivorum en plantas de cebolla
basadas en el análisis de genes marcadores de defensa. aquí. Estos resultados indican el potencial de los productos comerciales de control
biológico de T. asperellum BCC1 para reducir drásticamente el uso excesivo de fungicidas en la agricultura de Costa Rica.

Declaración de contribución de autoría CRediT

William Rivera-Méndez: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Obtención de financiamiento, Investigación,
Metodología, Recursos, Validación, Redacción - borrador original. Miguel Obregón: Conceptualización, Análisis formal, Investigación,
Validación. María E. Morán-Diez: Curación de datos, Análisis formal, Investigación, Supervisión, Validación, Redacción - borrador
original, Redacción - revisión y edición. Rosa Hermosa: Conceptualización, Curación de datos, Análisis formal, Investigación,
Metodología, Supervisión, Redacción - borrador original, Redacción - revisión y edición. Enrique Monte: Conceptualización, Obtención de
fondos, Administración de proyectos, Recursos, Redacción - borrador original.

Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Gobierno de Costa Rica [Proyecto FITTACORI 0318] y el Instituto Tecnológico de Costa Rica (ITCR)
[Proyecto 5402 1510033]; por el Gobierno de España [Proyecto RTI2018-099986-B-I00]; el Fondo Europeo de Desarrollo Regional ( FEDER )
dependiente de la Junta de Castilla y León (España) apoya [Proyecto SA270P18]. El MEM-D fue otorgado por el Programa II de Becarios
Postdoctorales de la Universidad de Salamanca.

Apéndice A. Dato suplementario

Los siguientes son los datos complementarios a este artículo:

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Datos complementarios 1 .

Artículos recomendados

Referencias
Adams y Papavizas, 1971 Visas PB Adams , GC Poppy
Efecto de la densidad del inóculo de Sclerotium cepivorum y algunos factores ambientales del suelo sobre la gravedad de la
enfermedad
Fitopatología , 61 ( 1971 ) , pp. 1253 - 1256
View PDF Referencia cruzada Ver registro en Scopus Google Académico

Aguilar-Ulloa et al., 2016 W. Aguilar-Ulloa, P. Arce-Acuña, W. Rivera-Méndez