Mol Plant Pathol. 2011 mayo; 12(4): 341–354.

PMCID: PMC6640367
Publicado en línea el 18 de noviembre de 2010. doi:  10.1111/j.1364-3703.2010.00674.x PMID: 21453429

El efecto beneficioso de Trichoderma spp. en tomate está modulada por el genotipo de

la planta
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MARINA TUCCI , MICHELINA RUOCCO , LUIGI DE MASI , MONICA DE PALMA , y MATTEO LORITO

RESUMEN

Los hongos competentes en la rizosfera del gé nero Trichoderma son ampliamente utilizados como
biofertilizantes y bioplaguicidas en fó rmulas comerciales debido a los mú ltiples efectos benefi‐
ciosos sobre el crecimiento de las plantas y la resistencia a enfermedades. En este trabajo, de‐
mostramos que la variabilidad gené tica entre las líneas de tomate cultivadas y silvestres afecta el
resultado de la interacció n con dos cepas de control bioló gico "é lite" de T. atroviride y T.
harzianum . La respuesta beneficiosa, que incluyó un mayor crecimiento y resistencia sisté mica
contra Botrytis cinerea, fue claramente evidente para algunas, pero no todas, las líneas probadas.
Al menos en un caso (línea M82), el tratamiento con los agentes de biocontrol no tuvo efecto o
incluso fue perjudicial. Los estudios de expresió n de genes relacionados con la defensa sugirieron
que el hongo es capaz de desencadenar, en las líneas sensibles, una regulació n positiva prolon‐
gada de la vía del á cido salicílico en ausencia de un pató geno, lo que posiblemente active un
mecanismo de cebado en la planta. En consecuencia, la infecció n con B. cinerea en plantas pre‐
tratadas con Trichoderma va seguida de una mayor activació n de los genes que responden al jas‐
monato, lo que eventualmente aumenta la resistencia sisté mica al pató geno de una manera de‐
pendiente del genotipo de la planta. Nuestros datos indican que, al menos en tomate, el
TrichodermaEl mecanismo de resistencia sisté mica inducida es mucho má s complejo de lo que se
ha considerado hasta ahora, y la capacidad de la planta para beneficiarse de esta interacció n
simbió tica puede mejorarse gené ticamente.

INTRODUCCIÓ N

La aplicació n masiva y cada vez mayor de productos químicos sinté ticos para el control de plagas
de plantas causa serios problemas tanto para la salud humana como para el medio ambiente (
Budnik y Baur, 2009 ; Debenest et al ., 2010 ). En este contexto, el uso de agentes de control bioló ‐
gico (BCA) como alternativa a las prá cticas convencionales para el manejo de enfermedades es un
objetivo declarado de las políticas agrícolas en todo el mundo. Muchos productos bioplaguicidas y
biofertilizantes está n ahora disponibles en el mercado, la mayoría de los cuales se basan en sim‐
biontes beneficiosos del gé nero Trichoderma ( Woo et al ., 2006 ). Estos hongos son bien conoci‐
dos por su capacidad para matar pató genos de plantas ( Benítez et al.., 2004 ; Verma et al ., 2007
), así como para promover el crecimiento y la resistencia de las plantas frente a estreses bió ticos y
abió ticos ( Harman et al ., 2004a ; Shoresh et al ., 2010 ). Se ha informado que algunas cepas de
Trichoderma pueden activar la resistencia sisté mica inducida (ISR) ( Hanson y Howell, 2004 ; Man‐
dal y Mitra, 2007 ; Segarra et al ., 2007 ), un mecanismo desencadenado despué s de la coloniza‐
ció n de la raíz por rizobacterias u hongos no pató genos y regulado por una cascada de transduc‐
ció n de señ ales específica ( Pieterse et al ., 1996; Segarra et al ., 2009 ). Ademá s, las plantas cuyas
raíces son colonizadas por aislamientos seleccionados de Trichoderma se 'sensibilizan' y respon‐
den má s rá pida y/o má s intensamente al ataque de pató genos, siguiendo un mecanismo conocido
como cebado ( Ahn et al ., 2007 ; Conrath et al ., 2006 ). La interacció n molecular que se establece
entre el BCA fú ngico y la planta brinda beneficios a ambos jugadores, y el ú ltimo recibe protec‐
ció n y má s nutrientes disponibles y los compuestos orgá nicos del hongo. Despué s de la penetra‐
ció n de la raíz por Trichoderma competente en la rizosferacepas, que preparan el escenario para el
intercambio de compuestos bioactivos, las plantas controlan la colonizació n endofítica del hongo
mediante la deposició n de calosa, el aumento de las actividades de quitinasa y peroxidasa, y la
acumulació n de compuestos fenó licos antimicrobianos, en algunos casos asociados con la expre‐
sió n de fenilalanina amoniaco liasa ( PAL), genes de hidroxiperó xido liasa y glucanasa ( Segarra et
al ., 2007 ; Shoresh et al ., 2005 ; 1999 , 2003 ). La hipó tesis actual es que las plantas inicialmente
perciben la colonizació n endó fita de la raíz por Trichodermacomo un potencial ataque de pató ge‐
nos, y reaccionar con la activació n de mecanismos de defensa locales y sisté micos típicos que in‐
volucran vías de transducció n de señ ales que responden al á cido jasmó nico (JA) y al etileno (Et) (
Shoresh et al ., 2005 ). Despué s de limitar con é xito la penetració n del hongo a las primeras capas
de cé lulas corticales de la raíz, la expresió n de algunos genes relacionados con la defensa y la acti‐
vidad antimicrobiana vuelven a los niveles previos a la infecció n ( Shoresh et al ., 2005 ; 1999 ,
2003 ). Esto demuestra la existencia de un diá logo cruzado molecular entre la planta y el hongo
que involucra a los elicitores producidos por Trichoderma que son reconocidos por la planta y es‐
timulan las respuestas de defensa (Woo et al ., 2006 ). Sin embargo, el mecanismo por el cual Tri‐
choderma puede permanecer dentro del sistema de raíces como un simbionte avirulento aú n no
está claro y posiblemente depende de efectores fú ngicos que suprimen las defensas de la planta.

Algunas cepas seleccionadas de Trichoderma tambié n promueven el crecimiento y desarrollo de

las plantas y, por lo tanto, aumentan los rendimientos ( Harman et al ., 2004a ; Lorito et al ., 2010
). Este efecto beneficioso adicional, que es muy popular entre los usuarios de bioinó culos, se ha
relacionado con el control de la microflora del suelo nociva, la degradació n de compuestos tó xi‐
cos, la estimulació n directa del desarrollo de la raíz por la producció n de compuestos similares a
hormonas o efectos sobre ciertas hormonas vegetales. vías sinté ticas, y/o la promoció n de la ab‐
sorció n de agua y nutrientes ( Bae et al ., 2009 ; Contreras‐Cornejo et al ., 2009 ; Verma et al..,
2007 ). En el caso de plantas tratadas con cepas de Trichoderma , se ha demostrado una mayor dis‐
ponibilidad de fó sforo y varios micronutrientes, asociada con una mayor solubilidad pero tam‐
bié n con otros mecanismos ( Altomare et al ., 1999 ; Gravel et al ., 2007 ; Yedidia et al . , 2001 ).
Esta capacidad de algunas cepas de Trichoderma para mejorar la eficiencia del uso de fertilizantes
por parte de los cultivos brinda la oportunidad de reducir el aporte de productos químicos en la
agricultura, así como la contaminació n de las aguas subterrá neas y superficiales.
Incluso en el caso de cepas como T. harzianum T22, uno de los biopesticidas má s utilizados, toda‐
vía existe una falta sustancial de conocimiento sobre có mo los efectos beneficiosos esperados de
la aplicació n de Trichoderma dependen del genotipo de la planta tratada. La importancia de este
concepto ya ha sido probada en maíz, al punto que existen variedades para las cuales el uso de
productos basados ​en T22 puede estar recomendado o contraindicado ( Harman, 2006 ; Harman
et al ., 2004b ). A pesar de la importancia obvia para la agricultura, todavía hay una falta de cono‐
cimiento sobre có mo responde la planta a Trichoderma.spp., especialmente a las cepas utilizadas
actualmente como biopesticidas/biofertilizantes, está influenciado por el genotipo de la planta en
té rminos de mayor resistencia sisté mica y promoció n del crecimiento. Con el fin de arrojar luz so‐
bre este importante tema, estudiamos la interacció n de T. harzianum T22 y T. atroviride P1, dos mi‐
crobios ampliamente utilizados con fines agrícolas y científicos, con cinco líneas de tomate diver‐
sas: M82 y TA209, dos variedades de tomate de procesamiento puras. con un há bito de creci‐
miento determinado, utilizado durante mucho tiempo en investigació n y mejoramiento, y porta‐
dor de los genes de resistencia I y Ve, con frutos de tamañ o mediano, cilíndricos o cuadrados, res‐
pectivamente; una variedad autó ctona de Corbarino, una variedad endogá mica regional italiana
indeterminada, tolerante al estré s (principalmente a la sequía) con frutos parecidos a la cereza,
utilizada tanto para el procesamiento como para el mercado de productos frescos; SM36, una lí‐
nea de mejoramiento avanzado, tolerante a altas y bajas temperaturas y portadora de los genes
de resistencia I y Ve , con un há bito de crecimiento determinado y frutos cilíndricos, derivada de
un cruce entre Solanum pimpinellifolium y el tomate de procesamiento tradicional cultivar San
Marzano; y LA1777, una accesió n peruana de la especie silvestre aló gama S. habrochaites, caracte‐
rizada por un há bito de crecimiento indeterminado, pubescencia muy densa en todas las partes
aé reas de la planta, pequeñ os frutos verdes y resistencia al frío y al tizó n tardío.

En este trabajo demostramos que diferencias sustanciales en la respuesta a la interacció n simbió ‐

tica con dos cepas seleccionadas de Trichoderma spp. ocurren cuando se prueban diferentes va‐
riedades de tomate. Se encontró que el efecto de T. harzianum T22 y T. atroviride P1 sobre el creci‐
miento y la resistencia sisté mica contra Botrytis cinerea depende del genotipo de la planta. Final‐
mente, reportamos datos sobre la inducció n de vías de respuesta de defensa que pueden ayudar
a la selecció n o mejoramiento de líneas de tomate con mayor capacidad para beneficiarse de la
interacció n con Trichoderma .

RESULTADOS

Efectos sobre el crecimiento y el desarrollo

Se evaluó la respuesta de cuatro líneas cultivadas gené ticamente distantes de S. lycopersicum y

una accesió n silvestre de S. habrochaites , que difieren en cuanto a su há bito de crecimiento, a los
hongos promotores del crecimiento T. atroviride cepa P1 y T. harzianum cepa T22. Se evaluó el
desarrollo de las plantas, para cada experimento, en dos juegos de plantas de 2 meses de edad,
uno de los cuales no fue inoculado con el pató geno para determinar el efecto de los tratamientos
sobre el peso seco de los brotes. El otro conjunto se utilizó para los demá s ensayos (promoció n
del crecimiento, resistencia a pató genos, expresió n gé nica, etc.).
Como era de esperar, el tamañ o de la copa de todas las líneas probadas fue estimulado en gene‐
ral, aunque en diferente medida, por al menos una de las dos cepas de Trichoderma en las condi‐
ciones de ensayo utilizadas (Figura 1a). De manera similar, se encontró que el peso seco de los
brotes, como se probó en experimentos paralelos, aumentó en casi todas las interacciones entre
el genotipo de la planta y las especies de Trichoderma (tabla 1). Ademá s, en cuanto a la longitud
del tallo, el aná lisis de varianza ( anova ) y la prueba de Duncan revelaron diferencias significati‐
vas entre genotipos y tratamientos (Figura 1b). Cuando se combinaron y promediaron los datos
del mismo tratamiento (T22, P1 o controles) de las cinco líneas probadas, solo se encontró que T.
harzianum T22 estimulaba significativamente el crecimiento del tallo del tomate ( P ≤ 0.05), mien‐
tras que las plantas tratadas con T. atroviride P1 no difirió estadísticamente de los controles no
tratados. Sin embargo, se detectaron diferencias estadísticamente significativas ( P ≤ 0,05) entre
los cinco genotipos en sus respuestas individuales a cualquiera de las dos cepas de Trichoderma .
Se obtuvo una estimulació n del crecimiento del tallo má s significativa para SM36 y TA209 con T.
harzianum T22, y para TA209 con T. atroviride P1 (Figura 1b). Curiosamente, el crecimiento del
tallo de Corbarino, M82 y LA1777 fue inhibido por P1, aunque la diferencia fue estadísticamente
significativa solo para LA1777 (Figura 1b).

Figura 1

Efectos de Trichoderma spp. tratamientos sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas de tomate. El tamañ o
del dosel (a) y la longitud del tallo (b) de las líneas de Solanum lycopersicum (Corbarino, TA209, M82 y SM36) y
S. habrochaites (LA1777) de 2 meses de edad, desarrolladas a partir de T. atroviride P1‐ sin tratar (Cont.) . Se pre‐
sentan semillas tratadas (P1) o tratadas con T. harzianum T22 (T22). Los valores indicados con la misma letra no
son estadísticamente significativos para P ≤ 0,01 segú n la prueba de Duncan.
 tabla 1

Efectos de Trichoderma spp. tratamientos sobre el desarrollo de brotes en plantas de tomate.

Peso seco de los brotes (% del control sin tratar)

genotipo tomate P1 T22

Corbarino 130,7 ± 15,4 130,1 ± 11,3

LA1777 129,7 ± 4,6 83,2 ± 0,3
M82 112,6 ± 3,9 156,9 ± 15,2
SM36 139,5 ± 5,9 158,1 ± 11,0
TA209 75,6 ± 3,7 113,8 ± 5,5

Cambios en el peso seco de los brotes de las líneas de Solanum lycopersicum (Corbarino, TA209, M82 y SM36) y
S. habrochaites (LA1777) de 2 meses de edad, desarrolladas a partir de T. atroviride P1 (P1) o T. harzianum T22 (
T22) semillas, se reportan como un porcentaje del control no tratado ± SE.

Las plantas tratadas con Trichoderma atroviride P1 y T. harzianum T22 tambié n se evaluaron en
té rminos de desarrollo de raíces en comparació n con los controles no tratados. Se recolectaron
los pesos fresco y seco de las raíces y se sometieron a aná lisis estadístico. Los sistemas de raíces
de las diversas líneas de tomate respondieron diferencialmente a las dos especies de Trichoderma
( P ≤ 0.05 para la interacció n planta genotipo × tratamiento). Como tanto el peso seco como el
fresco se vieron afectados de manera similar, solo se informan los datos sobre el peso seco. Las
líneas Corbarino y TA209 mostraron un incremento altamente significativo ( P ≤ 0.01) en el peso
seco de la raíz causado por T. atroviride P1 (Figura 2a). El ú nico efecto significativamente negativo
se detectó en TA209 tratado con T22, mientras que todas las demá s muestras no fueron diferen‐
tes de los controles (Figura 2a).
 Figura 2

Efectos de Trichoderma spp. tratamientos sobre el crecimiento y desarrollo de raíces de tomate. El peso seco de
la raíz (a) y el desarrollo (b) de las líneas de Solanum lycopersicum (Corbarino, TA209, M82 y SM36) y S. habro‐
chaites (LA1777) de 2 meses de edad, desarrolladas a partir de T. atroviride P1‐ sin tratar (Cont.) . Se presentan
semillas tratadas (P1) o tratadas con T. harzianum T22 (T22). Los valores indicados con la misma letra no son
estadísticamente significativos para P ≤ 0,01 segú n la prueba de Duncan.

La aplicació n de cualquiera de las especies de Trichoderma tambié n produjo diferencias notables

en la arquitectura del sistema radicular de los diversos genotipos de tomate. Se encontró que Cor‐
barino, LA1777 y M82 eran altamente sensibles a la cepa P1 en té rminos de mayor elongació n de
la raíz, mientras que la misma cepa redujo significativamente la longitud del sistema de raíces
SM36. La cepa T22 mejoró el desarrollo de la raíz lateral en las líneas SM36 y Corbarino, y lo re‐
dujo en TA209 y M82, pero, en la mayoría de los casos, no tuvo efecto sobre la longitud de la raíz
(Figura 2b).

Efectos sobre la tolerancia a pató genos

Plantas de dos meses de edad de las cinco líneas de tomate, tratadas con T. atroviride P1 o T. har‐
zianum T22, fueron inoculadas artificialmente con el pató geno foliar B. cinerea . El progreso de la
infecció n se registró a intervalos de tiempo regulares, pero solo se muestran los resultados a las
48 y 96 h despué s de la infecció n (hpi). En el caso de la accesió n LA1777, la presencia de muchos
tricomas causó la dispersió n de los conidios inoculados y, por lo tanto, solo alrededor del 17 % de
los puntos de inoculació n desarrollaron lesiones necró ticas tanto en las plantas de control como
en las tratadas con T. harzianum T22, mientras que no se desarrollaron síntomas. se observó para
el T. atroviridetratamiento P1. El á rea promedio de lesiones necró ticas en plantas tratadas con T22
de esta línea a las 96 hpi fue de 2 mm 2 frente a 28 mm 2 en el control (Figura 3c). Los valores a
48 y 96 hpi, como se informa enFig. 3, indicó que los cuatro genotipos de tomate restantes tenían
una susceptibilidad diferente a B. cinerea ( P ≤ 0.01) y que la interacció n genotipo-tratamiento fue
estadísticamente significativa tanto a las 48 como a las 96 hpi ( P ≤ 0.05). Este resultado sugiere
que el genotipo de la planta es un determinante clave del efecto de los tratamientos basados ​en
Trichoderma sobre la resistencia de las plantas a pató genos, al menos en tomate. Como era de es‐
perar, la interacció n a nivel de la rizosfera entre las líneas de S. lycopersicum y las especies de Tri‐
choderma en general aumentó la resistencia contra la infecció n de la hoja por B. cinerea (
Figura 3a,b). Sin embargo, se detectaron diferencias notables entre los cuatro genotipos de to‐
mate. En el caso de T. harzianum T22, el desarrollo de lesiones de B. cinerea se retrasó en todas
las líneas ensayadas a las 48 hpi, aunque no de forma significativa en Corbarino (Figura 3a). A las
96 hpi, este efecto positivo fue superado por el pató geno en las líneas M82 y SM36, que mostra‐
ron á reas de lesió n promedio no significativamente diferentes del control, mientras que, en Cor‐
barino tratado con T22, la reducció n de la lesió n se volvió altamente significativa ( P ≤ 0.01) (
Figura 3b). La línea TA209 demostró la interacció n má s efectiva con T. harzianum T22 en té rminos
de resistencia sisté mica tanto a las 48 como a las 96 hpi (Figura 3a,b). En cuanto a T. atroviride P1,
fue menos efectivo que T22 contra el pató geno foliar. A las 48 hpi, P1 redujo significativamente el
tamañ o de la lesió n solo en la línea TA209 (Figura 3a), pero este efecto positivo no fue significa‐
tivo a las 96 hpi (Figura 3b). Notablemente, las lesiones necró ticas de B. cinerea en la línea M82
fueron mucho más grandes en las plantas tratadas con P1 que en el control (Figura 3a,b). Así, nues‐
tros datos confirman que, en tomate, los efectos protectores de Trichoderma spp. contra los pató ‐
genos foliares está n influenciados por los antecedentes gené ticos de la planta.
 figura 3

Efectos de Trichoderma spp. tratamientos sobre la resistencia de las plantas al pató geno Botrytis cinerea . Plantas
de dos meses de edad de las líneas Solanum lycopersicum (Corbarino, TA209, M82 y SM36), desarrolladas a partir
de semillas no tratadas (Cont), tratadas con T. atroviride P1 (P1) o semillas tratadas con T. harzianum T22 (T22),
se cultivaron artificialmente. inoculados con una suspensió n de esporas de B. cinerea , y el desarrollo de la le‐
sió n se midió a las 48 h (a) y 96 h (b) después de la inoculació n. Los valores indicados con la misma letra no son
estadísticamente significativos para P ≤ 0,01 segú n la prueba de Duncan. Promedio de áreas de lesió n a las 96 h
después de la inoculació n en plantas silvestres de control y tratadas con T22La línea S. habrochaites LA1777 se
informa en el recuadro (c).

Efectos sobre la expresió n de genes relacionados con la defensa

Muchas de las cepas de Trichoderma má s activas han demostrado la capacidad de mejorar la re‐
sistencia sisté mica de las plantas a los pató genos microbianos. Para probar si la respuesta del to‐
mate a Trichoderma implica una activació n diferencial de genes relacionados con la defensa, anali‐
zamos marcadores tanto de á cido salicílico (SA) ( PR1b1 y PR‐P2 ) como de JA ( PINI , PINII , Tom‐
LoxA y TomLoxC).) vías mediante la reacció n en cadena de la polimerasa en tiempo real de trans‐
cripció n inversa cuantitativa relativa (qRT-PCR). Los cambios en la expresió n gé nica se considera‐
ron significativos solo para valores del doble o má s para la regulació n al alza y ≤0,5 veces para la
regulació n a la baja en relació n con el control no tratado (calibrador).

Los genes regulados al alza incluyeron PR1b1 en LA1777, SM36 y TA209 en respuesta a T22 o P1,
con la entrada salvaje LA1777 respondiendo a ambas cepas; PR‐P2 en plantas tratadas con P1 y
T22 de Corbarino, LA1777 y TA209; PINI en Corbarino, LA1777 y SM36, pero solo en plantas tra‐
tadas con T22; PINII solo en Corbarino en respuesta a ambas cepas; TomLoxA en todos los genoti‐
pos, excepto SM36, en respuesta a T22 o P1, con la entrada salvaje LA1777 respondiendo a am‐
bas cepas; y TomLoxC solo en SM36 con ambas cepas (Figura 4). Generalmente, las líneas má s
sensibles a Trichoderma spp. fueron LA1777, Corbarino y TA209 (una línea silvestre y dos líneas
cultivadas), que tambié n mostraron una fuerte reducció n de los síntomas despué s de la inocula‐
ció n con B. cinerea (Fig. 3). Con respecto a la regulació n a la baja, ni los genes relacionados con la
patogenia (PR) ni TomLoxA se vieron afectados significativamente, y los niveles de expresió n de
los genes PIN se redujeron con frecuencia, principalmente por la cepa P1. Este hongo tambié n in‐
hibió la transcripció n de TomLoxC , pero solo en la línea LA1777. Se confirmó que la línea M82 es
la que responde menos a la interacció n con Trichoderma , ya que el tratamiento con las dos cepas
de biocontrol no indujo una variació n sustancial en la expresió n de genes relacionados con la de‐
fensa antes de la infecció n por B. cinerea (Figura 4) o disminuir los síntomas de la enfermedad
despué s del desafío con pató genos (Fig. 3). Aunque los cinco genotipos de tomate respondieron
de manera muy diferente a Trichoderma spp., los resultados anteriores indican que, en ausencia
de un desafío pató geno, la respuesta de defensa mediada por SA generalmente se regula positiva‐
mente por el tratamiento con Trichoderma (es decir, los genes PR se estimulan en la mayoría de
los casos) , mientras que los genes relacionados con JA son menos sensibles, aunque con algunas
excepciones (principalmente para TomLoxA ) (Figura 4). Este perfil cambia sustancialmente des‐
pué s de la inoculació n del pató geno (ver má s abajo). En particular, las dos cepas de Trichoderma
pudieron afectar los genes relacionados con la defensa en el tomate (un PR1 y un PR4) durante al
menos 2 meses despué s de su aplicació n como recubrimiento de semillas, lo que sugiere un
efecto duradero en la preparació n de la maquinaria de defensa.
Figura 4

Efectos de Trichoderma spp. tratamientos sobre la transcripció n de genes relacionados con la defensa en tomate.
La expresió n relativa de PR1b1 , PR‐P2 , PINI , PINII , TomLoxA y TomLoxC se midió mediante la reacció n en ca‐
dena de la polimerasa en tiempo real de transcripció n inversa cuantitativa (qRT‐PCR) en plantas de Solanum lyco‐
persicum de 2 meses de edad (Corbarino, TA209, M82 y SM36) y S. habrochaites (LA1777), desarrolladas a partir
de líneas no tratadas (Cont) o T. atroviride tratadas con P1 (P1) o T. harzianumSemillas tratadas con T22 (T22).
 Los niveles de expresió n para cada gen se informan como el aumento en veces en relació n con los del control no
tratado. Los valores dentro de las líneas punteadas no se consideraron estadísticamente significativamente dife‐
rentes del control. Faltan datos sobre la expresió n de PINII en la línea de tomate silvestre LA1777 ya que no se
pudo obtener amplificació n de este gen con el par de cebadores utilizado. Los resultados que se muestran son de
un experimento representativo de cuatro.

Cuando las plantas de control no tratadas y las tratadas con Trichoderma se desafiaron con B. ci‐
nerea , la tasa de transcripció n de los genes de defensa probados cambió de una manera peculiar
para cada línea de tomate, como se informa enFigura 5. Generalmente, los genes PR, que fueron
preactivados en plantas tratadas con Trichoderma antes de la inoculació n del pató geno (Figura 4),
mostró un pico negativo a las 24 hpi, mientras que los genes de respuesta a JA estaban regulados
al alza (Figura 5). Esto indica que, en presencia de Trichoderma , la vía SA se reprime y la vía JA se
estimula por la infecció n por B. cinerea a las 24 hpi. Al final del ensayo (48 hpi), el agente de bio‐
control comercial T22 provocó una represió n má s constante de SA y una estimulació n de los ge‐
nes dependientes de JA en comparació n con las plantas de control no tratadas en las cinco líneas
de tomate (Figura 5). Por el contrario, P1, una cepa nunca desarrollada comercialmente, mostró
un efecto má s variable (Figura 5).
Figura 5

Análisis transcripcional de genes relacionados con defensa en plantas de tomate inoculadas con el pató geno
Botrytis cinerea y pretratadas o no con Trichoderma spp. La expresió n relativa de PR1b1 , PR‐P2 , PINI , PINII ,
TomLoxA y TomLoxC se midió mediante la reacció n en cadena de la polimerasa en tiempo real con transcripció n
inversa cuantitativa (qRT‐PCR) en diferentes momentos después de la infecció n por pató genos [0, 24 y 48 h des‐
pués de la inoculació n (hpi)] en plantas de 2 meses de edad de las líneas Solanum lycopersicum (Corbarino,
TA209, M82 y SM36) y S. habrochaites (LA1777), desarrolladas a partir de T. atroviride sin tratar (cont.)Semillas
tratadas con P1 (P1) o T. harzianum tratadas con T22 (T22). Los niveles de expresió n de cada gen se informan
como el aumento de veces en relació n con las plantas de control no tratadas con Trichoderma antes de la infec‐
ció n con el pató geno (0 hpi), en una escala semilogarítmica. Los valores dentro de las líneas punteadas no se con‐
sideraron significativamente diferentes del control. Faltan datos sobre la expresió n de PINII en la línea de tomate
silvestre LA1777 ya que no se pudo obtener amplificació n de este gen con el par de cebadores utilizado. Los re‐
sultados que se muestran son de un experimento representativo de cuatro.
En contraste con los resultados en el tiempo cero, los cambios en la expresió n del gen PR obser‐
vados despué s de la inoculació n de B. cinerea no se correlacionaron con la resistencia al pató geno
(3,5). Por ejemplo, la línea TA209 tratada con T22 mostró una transcripció n reducida de PR1b1 y
PR-P2 (Figura 5), pero mayor resistencia (Fig. 3), mientras que el tratamiento con P1 aumentó la
expresió n de PR (Figura 5), pero no tuvo un efecto significativo sobre la resistencia al final del en‐
sayo (Fig. 3). Sin embargo, la activació n transcripcional de los genes PINI y PINII relacionados con
JA coincidió con el aumento de la tolerancia a B. cinerea , como se observó en las plantas SM36
tratadas con T22 (3,5) y para TA209 tratado con ambas cepas (3,5). En consecuencia, las plantas
M82 tratadas con P1 fueron má s susceptibles al pató geno y mostraron una disminució n notable
en la expresió n de PINI y PINII a las 48 hpi. Ademá s, el pretratamiento de la misma línea de to‐
mate con T22 indujo una mayor transcripció n de genes PIN a las 48 hpi (Figura 5), lo que proba‐
blemente limitó la propagació n de las lesiones de B. cinerea , aunque solo en una fase temprana (
Figura 3a). Ademá s, en el caso de los otros dos genes que responden a JA, TomLoxA y TomLoxC , la
regulació n al alza a menudo coincidía con la tolerancia mediada por Trichoderma a B. cinerea ,
mientras que lo contrario no siempre era cierto (3,5).

Estos resultados indican que el efecto de la expresió n del gen de defensa en las plantas de tomate
tratadas con Trichoderma durante la infección por B. cinerea es complejo e involucra tanto la resis‐
tencia sisté mica adquirida (SAR) como la ISR, probablemente con los genes de respuesta a SA
contribuyendo a mantener la preparació n de los primeros reacció n, y los genes que responden a
JA son má s significativos y efectivos en una etapa posterior.

DISCUSIÓ N

Se sabe que algunas cepas de Trichoderma pueden estimular el crecimiento de las plantas, al me‐
nos en parte aumentando la absorció n de nutrientes y la eficiencia del uso de nitró geno ( Alto‐
mare et al ., 1999 ; Yedidia et al ., 2001 ). Nuestros datos confirman la capacidad del agente de bio‐
control comercial T. harzianum cepa T22 para aumentar el crecimiento de la copa y del tallo en
tomate e indican que, en este sentido, T22 es má s eficaz que T. atroviridecepa P1, un hongo utili‐
zado principalmente para trabajos de laboratorio y no desarrollado comercialmente en un grado
significativo. Ademá s, nuestros hallazgos demuestran que el grado de estimulació n del creci‐
miento depende en gran medida del genotipo del tomate, lo que sugiere que la respuesta a Tricho‐
derma spp. está bajo control gené tico. El peso seco de los brotes aumentó en la mayoría de las lí‐
neas, excepto en TA209 con P1 y en la accesió n silvestre LA1777 con T22. Curiosamente, P1 fue
capaz de reducir la longitud del tallo de LA1777 y tuvo un efecto similar, aunque no significativo,
en la otra línea indeterminada en estudio, Corbarino (tabla 1yFigura 1b). Ya se ha informado so‐
bre la importancia de los antecedentes gené ticos de las plantas para la interacció n entre el maíz y
T. harzianum T22 ( Harman et al ., 2004b ). Los ensayos comerciales en varios híbridos tratados
con T22 y líneas endogá micas han revelado los aumentos de rendimiento esperados en la mayo‐
ría de los genotipos, y algunos realmente muestran una reducció n del rendimiento ( Harman et al
., 2004b ). El aná lisis gené tico ha demostrado que la respuesta del maíz está condicionada en gran
medida por los genes dominantes ( Harman, 2006 ).
Tambié n se evaluó la importancia del genotipo de tomate para el resultado de la interacció n bene‐
ficiosa planta-hongo para la promoció n del crecimiento de la raíz, con un aumento significativo en
el peso seco de la raíz obtenido al tratar Corbarino y TA209 con la cepa P1 y una disminució n sig‐
nificativa para M82 y TA209 con cepa T22 (Figura 2a). Trichoderma spp. tambié n modificó la ar‐
quitectura radicular del tomate de forma diferencial entre las cinco líneas ensayadas (Figura 2b).
En tres de las cinco líneas, T. atroviride P1 aumentó la longitud de la raíz y redujo el desarrollo la‐
teral (Figura 2b). Por el contrario, en la mayoría de los casos, la longitud de la raíz no se vio afec‐
tada por T. harzianum T22, mientras que el desarrollo lateral fue estimulado por este hongo en las
líneas Corbarino y SM36 e inhibido en las otras tres líneas (Figura 2b). No hemos investigado los
mecanismos subyacentes a estas respuestas diferenciales. Un estudio reciente sobre Arabidopsis
thaliana sugirió que dos cepas de T. atroviride y T. virens estimularon el desarrollo de la raíz lateral
y redujeron la longitud de la raíz primaria mediante la producció n de á cido indol-3-acé tico (IAA) y
compuestos similares a la auxina ( Contreras-Cornejo et al . , 2009 ). Los datos preliminares indi‐
can que ambas cepas de Trichoderma utilizadas en este trabajo sintetizan IAA (resultados no mos‐
trados), y hemos demostrado previamente su capacidad para liberar metabolitos secundarios con
un efecto similar a la auxina en las plantas ( 2008a , 2008b ). Ademá s, Gravaet al . (2007 ) sugirie‐
ron que otra cepa de T. atroviride estimula el crecimiento de la raíz del tomate de una "manera
controlada" equilibrando la síntesis y degradació n de IAA y/o limitando la síntesis de Et a travé s
de la hidró lisis de su molé cula precursora 1-aminociclopropano-1-á cido carboxílico (ACC). Sin
embargo, las citoquininas tambié n podrían estar involucradas, como se demostró para las rizo‐
bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) ( Ortiz-Castro et al ., 2009 ), como la
producció n de molé culas similares a las citoquininas, por ejemplo, zeatina, y de GA3 o giberelinas
relacionadas con GA3. ha sido reportado como posiblemente correlacionado con el potencial de
biofertilizació n de Trichoderma ( Benítez et al ., 2004). Una diafonía antagonista de auxina-citoqui‐
nina puede explicar los efectos opuestos de T. harzianum T22 en el desarrollo de brotes y raíces
de las líneas de tomate TA209 y, posiblemente, M82 (1,2ytabla 1). Dado que la capacidad de Tri‐
choderma para promover un crecimiento equilibrado de las plantas depende de una fina regula‐
ció n de hormonas y compuestos similares a hormonas en la rizó sfera, nuestros datos indican que
otros factores, como el genotipo y el estado fisioló gico de la planta, o la las condiciones culturales
(es decir, hidroponía versus suelo o alto versus bajo contenido de fertilizantes) está n
involucradas.

Ademá s de la bien caracterizada actividad de biocontrol directo de las especies de Trichoderma

sobre los pató genos del suelo, má s recientemente se ha hecho evidente que la colonizació n de las
raíces por estos microorganismos induce resistencia de las plantas a las enfermedades foliares,
en ausencia de contacto directo entre Trichoderma y el pató geno ( Bigirimana et al . , 1997 ; Har‐
man et al ., 2004a ; Shoresh et al ., 2010 ). Nuestros resultados confirman que el dañ o de la infec‐
ció n por B. cinerea en las hojas de tomate puede limitarse mediante la colonizació n de la rizosfera
con T. harzianum T22 o T. atrovirideP1, aunque la primera especie parece ser má s eficaz. Sin em‐
bargo, tambié n se detectaron diferencias importantes entre las cinco líneas de tomate probadas
con respecto a la tolerancia al pató geno inducida por Trichoderma . Aparte de la línea de especies
silvestres LA1777, cuya susceptibilidad muy baja a B. cinerea se vio reforzada por la interacció n
con cualquiera de las cepas de Trichoderma , la expansió n de la lesió n estuvo limitada inicialmente
por T22 en todas las líneas probadas. En tiempos posteriores, T22 redujo significativamente el
á rea de lesió n promedio solo en TA209 y Corbarino, es decir, las dos líneas que son menos capa‐
ces de defenderse del pató geno en suelo esterilizado (Figura 3b). Corbarino y LA1777, siendo
una variedad local seleccionada por agricultores en condiciones agrícolas de bajos insumos y una
accesió n de especies silvestres, respectivamente, podrían ser má s aptas ecoló gicamente y, por lo
tanto, capaces de beneficiarse al má ximo de la interacció n de la rizosfera con la microflora benefi‐
ciosa. La informació n sobre el pedigrí de la línea TA209 mejorada por la compañ ía de semillas es
demasiado escasa para confirmar o refutar esta hipó tesis. La línea susceptible TA209 tambié n
mostró alivio de los síntomas de la enfermedad con T. atroviride P1, que no fue eficaz para las
otras líneas de S. lycopersicum , e incluso aumentó la susceptibilidad al pató geno de M82, un resul‐
tado que merece una mayor investigació n. En particular, las respuestas inducidas por Trichoderma
muy limitadas o negativas a B. cinereade la línea M82 tambié n se extendió a la transcripció n de
genes de defensa (4,5). La capacidad de diferentes cepas de T. harzianum , incluida la T22, para
restringir significativamente el desarrollo de síntomas de B. cinerea en el tomate se ha informado
anteriormente ( De Meyer et al ., 1998 ; Dik y Elad, 1999 ; O'Neill et al . , 1996 ; Seaman et al .,
2003 ). Sin embargo, solo se realizó un estudio en diferentes variedades de tomate (dos), pero no
se investigó el efecto de las diferencias genotípicas ( Dik y Elad, 1999 ). Ademá s, informes sobre la
variació n genotípica de la respuesta del maíz a T. harzianumT22 no abordó la variabilidad en la
resistencia de la planta inducida ( Harman, 2006 ; Harman et al ., 2004b ). Nuestros resultados
destacan claramente la existencia de un componente gené tico de la respuesta de la planta a Tri‐
choderma spp. en té rminos de la inducció n de resistencia sisté mica. Esto está de acuerdo con los
informes que demuestran que los antecedentes gené ticos afectan la respuesta de diferentes varie‐
dades de pepino a las especies PGPR ( Liu et al ., 1995 ), que en realidad se considera que com‐
parten con Trichoderma spp. mecanismos similares de ISR ( Harman et al ., 2004a ).

Con el fin de estudiar má s a fondo el aumento sisté mico de la planta en la tolerancia a pató genos
mediado por Trichoderma , analizamos la activació n transcripcional de varios genes de defensa en
hojas de tomate: PR1b1 , un gen PR1 utilizado como marcador para la activació n de SAR y las res‐
puestas mediadas por SA ( Tornero et al. ., 1997 ); PR-P2 , un gen PR4 inducido principalmente
por SA en tomate ( Bertini et al ., 2003 ; Fiocchetti et al ., 2006 ; Linthorst et al ., 1991 ; Van Kan et
al ., 1995 ); PINI y PINII, que se inducen a travé s de la ruta de transducció n de señ ales JA ( Doares
et al ., 1995 ; Fidantsef et al ., 1999 ); y TomLoxA y TomLoxC , que codifican dos enzimas de la fami‐
lia de las lipoxigenasas (LOX), que está involucrada en la respuesta y defensa de JA ( Feussner y
Wasternack, 2002 ; Porta y Rocha-Sosa, 2002 ). Se sabe que la penetració n de Trichoderma en las
raíces aumenta la expresió n de genes relacionados con la defensa y la producció n de compuestos
antimicrobianos, pero solo de forma transitoria ( Shoresh et al ., 2005 ; 1999 , 2003 ).). Sin em‐
bargo, nuestros resultados demuestran que la colonizació n de la rizosfera por Trichoderma puede
apoyar la transcripció n de algunos genes relacionados con la defensa a niveles bajos pero signifi‐
cativos durante un período de tiempo relativamente largo (60 días), al menos en algunas interac‐
ciones entre el genotipo de la planta y las especies de Trichoderma . Este efecto fue particular‐
mente fuerte para la expresió n de PR1b1 y PR‐P2 (Figura 4), lo que sugiere que la respuesta a
largo plazo a Trichoderma en tomate puede implicar la señ alizació n de SA. De manera similar, el
aná lisis transcriptó mico reveló una regulació n ascendente constitutiva de PR5 en plantas de to‐
mate de 7 semanas de edad sembradas en suelo inoculado con T. hamatum 382 ( Alfano et al .,
2007 ).
Cuando las plantas se enfrentan a un pató geno poco despué s del establecimiento de la interacció n
con Trichoderma , está n preparadas para reaccionar con má s fuerza, aumentando la expresió n de
genes de defensa y la actividad de las enzimas protectoras antes y a niveles má s altos que en las
plantas no tratadas ( Shoresh et al ., 2005 , 1999 , 2003 ). Nuestros datos demuestran que este
efecto dura mucho despué s del inicio de la interacció n entre Trichoderma y la planta (60 días), ya
que se reduce el tamañ o de la lesió n (Fig. 3) y mayores niveles de expresió n de genes de defensa
en hojas sisté micas (Figura 5) fueron detectados en las líneas LA1777, TA209 y Corbarino. En ge‐
neral, la mayor acumulació n de ARN afectaba a los genes PIN y, hasta cierto punto, a los genes lox
, lo que sugiere la implicació n de una respuesta ISR 2 meses despué s del tratamiento con el
agente de biocontrol. Mayor inducció n de proteínas PR/actividades por pató genos en plantas tra‐
tadas con Trichoderma spp. ha sido reportado en pepino y maíz ( Harman et al ., 2004b ; Shoresh
et al ., 2005 ). Sin embargo, en este trabajo, los niveles de expresió n de PR1b1 y PR-P2 fueron má s
altos que en los controles en plantas tratadas solo con Trichoderma (Figura 4), pero, en la mayo‐
ría de los casos, disminuyó por debajo del valor de control despué s de la inoculació n posterior
con el pató geno (Figura 5). Estos datos está n de acuerdo con los del aná lisis proteó mico de una
interacció n de tres jugadores (pató geno, planta y Trichoderma ) ( Marra et al ., 2006 ), y sugieren
fuertemente que la presencia del agente de biocontrol reduce la intensidad de algunas respuestas
de la planta a infecció n por pató genos. Con respecto a la respuesta de los genes lox , se informó
que T. asperellum aumenta la transcripción de lox1 en raíces, pero no en hojas, de pepino ( Shoresh
et al ., 2005 ) y de lox2 en plantas de Arabidopsis thaliana ( Segarra et al ., 2009 ).) poco despué s
del tratamiento. Con base en estos resultados, los autores propusieron que las defensas de las
plantas mejoradas por Trichoderma dependen de la señ alizació n de JA y, por lo tanto, de la activa‐
ció n de la vía fenilpropanoide (a travé s de la activació n de la transcripció n de los genes PAL), lo
que finalmente conduce a la acumulació n inducida de fitoalexinas y otros metabolitos antimicro‐
bianos ( Shoresh et al. ., 2005 ; Yedidia et al ., 2003 ). Tambié n encontramos que una mayor resis‐
tencia de las diversas líneas de tomate a B. cinerea correspondía a una mayor expresió n de los ge‐
nes lox , aunque no siempre ocurría lo contrario (3,5). En el caso de los genes PINI y PINII , su ex‐
presió n a menudo se indujo y mantuvo a un nivel má s alto que en los controles en tomates trata‐
dos con Trichoderma e inoculados con B. cinerea , y generalmente se correlacionó con una mayor
tolerancia a pató genos.

Varias líneas de evidencia indican que la reacció n de defensa de la planta mediada por Tricho‐
derma involucra la vía JA y la estimulació n de genes sensibles a Et ( Korolev et al ., 2008 ; Shoresh
et al ., 2005 ). Sin embargo, la activació n informada de Pal1 ( Shoresh et al ., 2005 ; Yedidia et al .,
2003 ) tambié n podría aumentar la biosíntesis de SA. De hecho, Martínez et al . (2001 ) propusie‐
ron que la reducció n de los síntomas de oídio en cotiledones de meló n por una celulasa de T. lon‐
gibrachiatumocurre a travé s de dos mecanismos paralelos: la celulasa activa induce un estallido
oxidativo y, por lo tanto, aumenta la actividad de PAL y la síntesis de SA y compuestos fenó licos; al
mismo tiempo, induce la actividad LOX, la síntesis de JA y la acumulació n de Et, estimulando adi‐
cionalmente PAL y el metabolismo de los fenilpropanoides ( Martinez et al ., 2001 ). Tambié n se ha
sugerido que la ISR puede estar mediada por diferentes rutas de señ alizació n, segú n el BCA y el
pató geno desafiante ( Korolev et al ., 2008 ).
En té rminos de la activació n de diferentes vías de transducció n de señ ales, nuestros datos de ex‐
presió n gé nica sugieren el siguiente mecanismo para la respuesta del tomate: (i) en ausencia de
infecció n por pató genos, un tratamiento preventivo de la planta con Trichoderma , como se usa
típicamente en la agricultura, induce un aumento en la expresió n de algunos genes PR, como los
marcadores SAR PR1b1 y PR-P2 , indicativos de una preparació n de la reacció n de defensa; (ii)
cuando las plantas son desafiadas por B. cinerea , el pretratamiento con Trichoderma podría miti‐
gar la expresió n del gen dependiente de SA; (iii) poco despué s de la infecció n, la expresió n de
PINI , PINII , TomLoxA yTomLoxC mejora, posiblemente como consecuencia del efecto de cebado,
que da como resultado una mayor resistencia sisté mica, probablemente causada por la promo‐
ció n de la respuesta mediada por JA.

Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran que la respuesta de la planta a las cepas 'é lite'
de Trichoderma spp., como el agente de biocontrol comercial T. harzianum T22 o el ampliamente
estudiado T. atroviride P1, se ve afectada por la variabilidad gené tica de la planta y, por lo tanto,
está bajo control gené tico . control en especies de Solanum de la sección Lycopersicon . Diferencias
genotípicas en cualquiera de los componentes vegetales del complejo cross-talk con
Trichodermapueden ser evocados para explicar este efecto, incluyendo la capacidad del genotipo
para atraer y sostener la colonizació n de raíces por el hongo, diferentes sensibilidades a los efec‐
tores producidos por el BCA, variabilidad en la percepció n y transducció n de señ ales de cual‐
quiera de las hormonas cuyas concentraciones son controladas por Trichoderma spp., y así suce‐
sivamente. Una explicació n de los mecanismos que subyacen al control gené tico de la planta de la
interacció n estaba má s allá del alcance de este trabajo y requerirá un esfuerzo de investigació n
masivo. Sin embargo, nuestros hallazgos prometen que los estudios dirigidos a la identificació n de
los principales determinantes gené ticos de las plantas involucrados en la interacció n con Tricho‐
dermaspp. conducirá a la selecció n y mejoramiento de genotipos de tomate con una capacidad
mejorada para beneficiarse de la colonizació n de la rizosfera por estos microorganismos.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Cultivo de Trichoderma spp. y B. cinerea

En este estudio se utilizaron la cepa P1 de Trichoderma atroviride (ATCC 74058), aislada de astillas
de madera y seleccionada por su tolerancia al fungicida iprodion ( Tronsmo, 1991 ), y T. harzia‐
num T22 (ATCC 20847; Stasz et al ., 1988 ). El pató geno B. cinerea cepa 309, aislado de tabaco, se
obtuvo de la colecció n de cultivos del Departamento ArBoPaVe de la Universidad de Ná poles,
Italia.

Los hongos se cultivaron en papa dextrosa agar (PDA) y se permitió que las colonias esporularan
a 25 °C en la oscuridad durante 7 días. Las esporas se recolectaron lavando las placas con agua
destilada esté ril y se llevaron a una concentració n de 10 6  mL - 1 .

Cultivo de plantas de tomate.

Semillas de tomate cultivado ( Solanum lycopersicum L.) líneas Corbarino, M82, SM36 y TA209, y
de la accesió n de S. habrochaites silvestre LA1777, amablemente proporcionadas por el Centro de
Recursos Gené ticos del Tomate, Universidad de California en Davis, CA, EE. UU. (M82 , TA209 y
LA1777) y por el profesor L. Frusciante, Universidad de Ná poles Federico II, Italia (Corbarino y
SM36), se esterilizaron en hipoclorito de sodio al 2 % durante 20 min y se lavaron minuciosa‐
mente con agua destilada esté ril. Las semillas esterilizadas se incubaron en una suspensió n de es‐
poras frescas de 10 6  ml −1 de T. atroviride P1 o T. harzianumT22 (recubrimiento), o en agua (se‐
millas de control). Las semillas recubiertas y control se secaron al aire durante 24 h y luego se
sembraron en suelo esterilizado en charolas de poliestireno de 40 pocillos mantenidas en una cá ‐
mara de crecimiento a 25 °C, 80 % de humedad relativa, con un fotoperíodo de 16 h luz. Despué s
de 3 semanas, las plá ntulas de tomate se trasplantaron en macetas de plá stico de 14 cm de diá me‐
tro en suelo esterilizado y se cultivaron durante 5 semanas en las mismas condiciones ambienta‐
les controladas.

Inoculación de Botrytis cinerea y ensayos biométricos

Se infectaron plantas de tomate de 2 meses de edad, control no tratadas y tratadas con Tricho‐
derma , con B. cinerea mediante la inoculació n de la tercera hoja verdadera con 10 µL de una sus‐
pensió n de 10 6  mL - 1 de esporas del pató geno. Para la inoculació n se usaron tres plantas re‐
plicadas para cada tratamiento. Inmediatamente antes de la infecció n, la cuarta hoja del control y
las plantas tratadas con Trichoderma de cada ré plica se recolectó a 0 hpi como un control no in‐
fectado, se congeló inmediatamente en nitró geno líquido y se almacenó a -80 °C hasta su uso en
aná lisis moleculares. Las plantas inoculadas se envolvieron en bolsas de plá stico transparente
para lograr condiciones de alta humedad relativa y se incubaron en una cá mara de crecimiento a
18 °C con un fotoperíodo de 16 h luz.

A las 24 y 48 hpi, se recolectó la quinta o sexta hoja de cada planta replicada, se congeló inmedia‐
tamente en nitró geno líquido y se almacenó a -80 °C hasta su uso en aná lisis moleculares (mues‐
tras de 24 y 48 hpi).

La propagació n de la enfermedad se registró a las 48, 72 y 96 hpi midiendo las lesiones necró ti‐
cas con un calibre electró nico y calculando el á rea como una elipse. La gravedad de la enferme‐
dad en los diferentes tratamientos (control, T. atroviride P1 y T. harzianum T22) se expresó como
el á rea media de lesiones necró ticas.

Los experimentos de inoculació n se repitieron cuatro veces.

Al final de cada experimento de inoculació n, se midió la estimulació n del crecimiento de la planta

en té rminos de la altura del tallo y el peso fresco y seco de la raíz del control no tratado y las
plantas de tomate de 2 meses de edad tratadas con Trichoderma . Despué s de la evaluació n visual
de la arquitectura de la raíz, las raíces se cortaron en la línea del suelo y se pesaron inmediata‐
mente (peso fresco). El peso seco se registró despué s de secar las raíces a 60 °C. Como los experi‐
mentos de inoculació n con B. cinerea afectan el sistema foliar, se midió el peso seco de los brotes
en un conjunto separado de plantas sin inocular.
Los datos sobre el tamañ o de la lesió n de B. cinerea y el crecimiento de la planta se analizaron me‐
diante anova en un diseñ o de parcelas divididas con tres repeticiones, utilizando el genotipo de la
planta y el tratamiento con Trichoderma como factores experimentales. Las medias se separaron
segú n la prueba de Duncan.

Aislamiento de ARN de plantas de tomate.

Hojas de tomate no infectadas e infectadas con B. cinerea , recolectadas y almacenadas como se

describe anteriormente, se molieron en nitró geno líquido y se usaron para la extracció n de ARN
total con el sistema de purificació n de ARN total Purelink Micro-to-Midi (Invitrogen, Carlsbad, CA,
EE. UU.) segú n a las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se comprobó mediante visua‐
lizació n UV despué s de electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante en presencia de bro‐
muro de etidio. La concentració n de ARN total se midió con un espectrofotó metro NanoDrop
1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.) y la pureza se estimó con el A 260 / A
280relació n de absorbancia. Despué s de la purificació n del ARN, se realizó un tratamiento con des‐
oxirribonucleasa I (DNasa I) libre de ARNasa para eliminar el ADN genó mico residual en un volu‐
men final de 10 µL utilizando 1 U de ADNasa I (Invitrogen), 1 µL de tampó n de reacció n de AD‐
Nasa I 10X (200 m m Tris‐HCl pH 8,4, 20 m m MgCl 2 , 500 m m KCl) añ adido a 1 µg de ARN total en
agua tratada con DEPC. La digestió n del ADN se realizó a temperatura ambiente durante 15 min, y
luego la DNasa I se inactivó mediante la adició n de 1,2 µL de solució n de á cido etilendiaminotetra‐
acé tico (EDTA) 25 m m e incubació n a 65 °c durante 10 min.

Aná lisis qRT‐PCR de la expresió n génica

La expresió n de los genes de defensa seleccionados se controló en cada uno de los cuatro experi‐
mentos de inoculació n mediante qRT‐PCR; por tanto, se analizaron cuatro ré plicas bioló gicas.

Despué s del aislamiento del ARN total, se llevó a cabo una RT para la síntesis de la primera ca‐
dena de ADNc en un volumen final de 20 µl mezclando 1 µg de ARN total tratado con DNasa y 500
ng de cebadores oligo(dT) 12–18 (Invitrogen) a 70 °C. C durante 10 min. Despué s de 5 min de incu‐
bació n en hielo, 4 µL de tampó n 5X First‐Strand RT (250 m m Tris‐HCl pH 8.3, 375 m m KCl, 15 m
m MgCl 2 ), 1 µL de 10 m m de cada desoxinucleó sido trifosfato ( dNTP), 2 µL de 100 m mSe añ a‐
dieron ditiotreitol y 160 U de transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen). Las reacciones de
RT se incubaron a 42 °C durante 1 h y luego se detuvieron a 70 °C durante 10 min. Para cada
muestra de ARN, se realizó una reacció n sin RT como control de contaminació n por ADN
genó mico.

Se eligieron el gen de limpieza de referencia que codifica actina y seis genes diana que codifican
proteínas de defensa: LOXA y LOXC ( TomLoxA y TomLoxC ); inhibidores de proteinasa I y II ( PINI
y PINII ); relacionados con la patogenia 1 y 4 ( PR1b1 y PR‐P2 , respectivamente). Las secuencias
de nucleó tidos de tomate correspondientes se obtuvieron de la base de datos G en B ank y se
usaron para diseñ ar pares de cebadores específicos de genes (Tabla 2) empleando el software
Primer3 ( Rozen y Skaletsky, 1998 ) y comprobando el autorrecocido mediante el software Pri‐
mer Express 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). En el paso de configuració n, los ce‐
badores que forman dímeros se excluyeron despué s de probar las reacciones de control sin
ADNc.

Tabla 2

Cebadores específicos de genes utilizados en la reacció n en cadena de la polimerasa en tiempo real de transcrip‐
ció n inversa cuantitativa (qRT-PCR).

Tamaño
del
Nombre Número de amplicón
del gen acceso cebador delantero imprimación inversa (pb)

actina BT013524 CACCACTGCTGAACGGGAA GGAGCTGCTCCTGGCAGTTT 100

PR1b1 Y08804 GCACTAAACCTAAAGAAAAATGGG AAGTTGGCATCCCAAAGACATA 177
PR‐P2 X58548 GGAACAGGAACACAAGAAACAGTGA CCCAATCCATTAGTGTCCAATCG 104
PINI K03290 TGAAACTCTCATGGCACGAAAAG GGCCACATTTGTTTTCCTTCG 102
PIN II K03291 GGCCAAATGCTTGCACCTTT CGTGGTACATCCGGTGGGATA 101
tomloxa U09026 TGAACCATGGTGGGCTGAAA CTGCCCGAAATTGACTGCTG 106
tomloxc U37839 TCCGGCAACACCGTTTACTC GTCAATGGCCGGAAAATGTG 102

Las amplificaciones se realizaron con el sistema de PCR en tiempo real rá pido 7900HT (Applied
Biosystems). Las reacciones se prepararon en un volumen total de 20 µL con 10 µL de 2X Power
SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,2 pmol de cebadores de genes diana o 0,4
pmol de cebadores de actina y 4 µL de molde de ADNc diluido 1:4 . Se realizaron tres reacciones
independientes a partir de cada muestra de ADNc y los experimentos de qRT‐PCR se realizaron
por triplicado. El programa de ciclos té rmicos comenzó con un paso de 10 min a 95 °C para la ac‐
tivació n de la polimerasa Taq y la desnaturalizació n inicial de la plantilla, seguido de 40 ciclos de
dos pasos: 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min. Se realizó un aná lisis de ciné tica de disocia‐
ció n despué s de cada ensayo para verificar la especificidad de los productos de amplificació n. El
programa de la curva de fusió n fue de 60 a 95 °C con una tasa de calentamiento del 2% y una me‐
dició n de fluorescencia continua. Los productos de reacció n tambié n se resolvieron en gel de aga‐
rosa para verificar el tamañ o del amplicó n. Los pares de cebadores utilizados y el tamañ o de los
amplicones esperados se muestran enTabla 2. La cuantificació n de la expresió n gé nica relativa a
la muestra de control no tratada a 0 hpi (calibrador) se llevó a cabo utilizando el mé todo 2 −ΔΔ Ct (
Livak y Schmittgen, 2001 ), donde ΔΔ Ct = ( Ct del gen diana − Ct del gen de referencia) muestra − (
Ct del gen diana − Ct del gen de referencia) calibrador y Ctes el ciclo umbral de cada transcrito, defi‐
nido como el punto en el que la cantidad de diana amplificada alcanza un umbral fijo por encima
de la fluorescencia de fondo. El gen housekeeping de la actina se utilizó como gen endó geno de
referencia para la normalizació n de los niveles de expresió n de los genes diana, tras comprobar
su expresió n constante a lo largo de los puntos temporales y los tratamientos de nuestros experi‐
mentos. Para comprobar la eficacia de la PCR, se construyeron curvas está ndar basadas en los va‐
lores de Ct frente a log (dilució n de cDNA) utilizando diluciones en serie de 10 veces de cDNA
para cada par de cebadores seleccionados, donde una eficacia de PCR del 100 % corresponde a
una pendiente de −3,32 . En el presente estudio, todas las PCR mostraron eficiencias cercanas al
100%, lo que permitió la normalizació n y comparaciones realistas.

AGRADECIMIENTOS

El trabajo de MT, MDP y LDM fue apoyado parcialmente por los Ministerios italianos de Educa‐
ció n, Universidad e Investigació n Científica (proyecto GenoPOM, DD 14/03/2005 prot. 602) y de
Política Agrícola, Alimentaria y Forestal (proyecto PROM, CIPE n 17/2003). El trabajo de MR y ML
fue apoyado por las siguientes subvenciones: FIRB 2002 prot. RBNE01K2E7; PRIN 2003 prot.
2003070719-003; Proyecto MIUR PON n. DD12935 del 08/02/2002; Proyecto MIUR PON n.
DD1219 del 10/05/2004; Proyecto MIUR PON n. DD1801 del 31/12/2004; UE TRICHOEST QLK3‐
2002‐02032; UE 2E‐BCA2. Agradecemos a Gianluca Caruso (Dip. DISSPAPA, Università di Napoli
Federico II, Italia) por su ayuda con el aná lisis estadístico y la Plataforma Genó mica del Laborato‐
rio GenoPOM (Consiglio Nazionale delle Ricerche, Istituto Genetica Vegetale, Portici y Dip. DISS‐
PAPA, Università di Napoli Federico yo,

Esta es la Contribució n n. 354 del CNR‐Istituto di Genetica Vegetale, Portici (NA), Italia.

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