12 POLYMERASE CHAIN REACTION

Tujuan Praktikum
Tujuan dari praktikum ini adalah:
1. Mahasiswa mengetahui dasar teori dan prinsip kerja dari salah satu metode berbasis
biologi molekuler, yaitu Polymerase Chain Reaction
2. Mahasiswa mengetahui komponen reaksi PCR dan kegunaannya dalam reaksi
amplifikasi
3. Mahasiswa mengetahui tentang tahapan-tahapan/tingkatan suhu pada reaksi PCR
serta perannya dalam reaksi amplifikasi DNA
4. Mahasiswa mengetahui prosedur PCR

Dasar Teori

POLYMERASE CHAIN REATION

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu metode untuk melakukan amplifikasi
enzimatik DNA secara in vitro. PCR digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu dari DNA,
yang bisa berupa sebuah gen, bagian dari gen ataupun suatu non coding sequences. Metode ini
menggunakan templat dalam mengamplifikasi DNA dan templat ini diperbanyak secara
eksponensial. PCR ditemukan oleh Kary Mullis dan saat ini sudah banyak digunakan terutama
dalam bidang biologi molekuler. Penggunaan PCR antara lain untuk kloning DNA dan sekuensing,
filogenetik berbasis DNA, analisa fungsional gen, diagnosis penyakit herediter dan deteksi
penyebab penyakit infeksi serta identifikasi (di bidang forensik).
Untuk melakukan PCR diperlukan beberapa komponen dan reagen. Antara lain :
• Templat DNA, yaitu DNA target yang akan diamplifikasi
• Sepasang primer, yang masing-masing akan berikatan (komplementer) dengan DNA target
pada ujung 5’ dan 3’
• Taq Polymerase atau enzim termostabil lainnya
• Dideoxynucleotida triphosphate (dNTP), yang menjadi penyusun rantai DNA baru
• Larutan bufer, yang berperan dalam menyediakan kondisi yang optimum bagi DNA
polymerase untuk bekerja mensistesis DNA
• Kation divalent, biasanya digunakan Mg2+, juga bekerja menstimulasi aktivitas DNA
polymerase

Beberapa tahapan PCR antara lain :

• Denaturasi awal, terjadi pada suhu 95°C-100°C. Pada proses ini diharapkan rantai DNA akan
terpisah atau mengalami denaturasi sempurna.
• Denaturasi, umumnya terjadi pada suhu 92°C-95°C. Pada tahap ini terjadi pemisahan rantai
DNA rantai ganda untuk memudahkan proses penempelan primer.
• Annealing, yaitu proses penempelan primer pada target DNA. Temperatur annealing (Tm)
merupakan komponen penting dalam proses optimalisasi spesifisitas PCR. Temperatur
annealing dapat ditentukan dengan menggunakan formula tertentu atau dapat juga
ditentukan secara empiris.
• Elongasi, terjadi pada suhu 72°C, yaitu terjadi proses pemanjangan primer dengan bantuan
DNA polymerase hingga membentuk DNA target yang baru.
• Elongasi akhir,terjadi pada suhu 72°C. Tahap ini memberikan kesempatan pada DNA
polymerase untuk melakukan pemanjangan dan memastikan elongasi telah berjalan dengan
sempurna.
Setiap pengulangan dari tahapan di atas merupakan satu siklus amplifikasi. PCR umumnya
dilakukan dalam 25-35 siklus. Peningkatan jumlah siklus akan semakin meningkatkan produk
berupa artefak sehingga akan mengganggu hasil PCR.
Pada praktikum ini mahasiswa akan melakukan amplifikasi gen 16S rDNA bakteri. Gen ini
merupakan sebuah gen yang bersifat lestari (consenserve) dalam genom organisme prokariot,
sehingga banyak digunakan sebagai dasar identifikasi bakteri berbasis molekuler.

Alat dan Bahan

Alat
1. Thermocycler
2. DNA kromosom hasil isolasi dari Escherichia coli sebagai cetakan/template
Bahan
1. Tip mikropipet
2. Komponen reaksi PCR, antara lain: Primer UniBI, primer BactFI, ddH2O, buffer PCR 10x, Taq
Polymerase, MgCl2 dan nuclease free water (ddH2O)
3. Templat DNA (hasil ekstraksi dari praktikum sebelumnya)
Prosedur Kerja
1. Selalu bekerja dalam keadaan dingin.
2. Selalu gunakan kontrol negatif untuk mendeteksi adanya kontaminasi
3. Master mix dibuat dengan menambahkan 1 reaksi tambahan (misalnya, jika jumlah sampel
yang akan diamplifikasi sebanyak 5 sampel, maka master mix dibuat dengan volume yang
dibutuhkan dalam 1 reaksi dikalikan 6x reaksi).
4. Master mix terdiri dari seluruh komponen reaksi PCR, kecuali templat. Untuk kontrol
negatif, templat diganti dengan ddH2O dengan volume yang sama.
Komposisi reaksi untuk 1x reaksi (1 tabung):
• ddH20 15.8 ul
• Bufer PCR 10x 2.5 ul
• MgCl2 25 mM 3.0 ul
• dNTP 10 mM 0.5 ul
• Primer UniBI 30 pmol/ul 1.0 ul
• Primer BactFI 30 pmol/ul 1.0 ul
• Taq DNA Pol (5U/ul) 0.2 ul
• Templat (pengenceran 100x) 1.0 ul
Total 25 ul
5. Master mix dimasukkan ke dalam tabung PCR sebanyak 24 uL, lalu masukkan templat 1 ul.
Homogenkan dengan cara memipet naik-turun secara perlahan, hindari pembentukan busa.
6. Masukkan tabung ke dalam alat thermocycler dengan kondisi sebagai berikut:
Kondisi PCR:
• Denaturasi awal : 94 °C selama 3 menit
• Siklus : 30 siklus
• Denaturasi : 94 °C selama 1 menit
• Annealing : 62 °C selama 1 menit, 30 detik
• Polimerisasi : 72 °C selama 1 menit, 30 detik
• Pemantapan/elongasi akhir : 72°C selama 10 menit
7. Produk PCR disimpan di freezer -20 °C hingga dilakukan karakterisasi dengan elektroforesis
DNA gel agarosa.
 REFERENSI

Clarrigde JE. 2004. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on
Clinical Microbiology and Infectious Disease. Clin. Microbiology. rev. 17(4); p.862-862

Glick, BR, Pasternak, JJ. 2003. PCR on Molecular Biotechnology: Principle and Application of
Recombinant DNA. ASM PRESS. p.11-59

Newton, CR, Graham A. PCR. 1994. Bios Scientific Publisher. p.1-25

J. Sambrock, E.F. Fritsch , T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second
Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA.

Reece, RJ. 2004. DNA Purification on Analysis of Gene and Genome. Wiley and Sons, p.1003-106
T.A. Brown. 2001. Gene Cloning and DNA Analysis an Introduction, Fifth Edition. Blackwell
Publishing, USA.