Universidad Técnica Particular de Loja

Titulación de Medicina

Biología Molecular Práctica

Informe No. 1 -Bimestre 2

PCR

Integrantes:

Emily Cueva

Carlos Cuenca

Fecha:

07/07/2022

Dra. Kathy Ojeda

Paralelo C

Abril - Agosto 2022

Introducción:

La PCR que en sus siglas en inglés significa 'Reacción en Cadena de la Polimerasa', es una prueba de

diagnóstico molecular que permite detectar un fragmento del material genético y lo amplifica millones

de veces. (Zaragoza, 2020, párr. 3) La PCR implica el uso de fragmentos cortos de ADN sintético,

denominados cebadores, para seleccionar un segmento del genoma que se amplificará, y luego

múltiples sesiones de síntesis de ADN para amplificar ese segmento.

La prueba PCR tiene unas características básicas que son: alta especificidad, ya que puede diferenciar

entre dos microorganismos muy cercanos evolutivamente; alta sensibilidad, ya que puede detectar

cantidades de 20 copias/ml, o incluso menos, de material genético viral, y finalmente es precoz porque

se detecta virus en las primeras fases de la infección respiratoria (Zaragoza, 2020).

La PCR se utiliza con mayor frecuencia en el diagnóstico de infecciones como gripe, COVID-19,

virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), Chlamydia trachomatis y hepatitis vírica, entre otras.

También ha ayudado a revolucionar el cribado del cáncer de cuello de útero y desempeña un papel

fundamental a la hora de garantizar la seguridad del suministro de sangre. (Kosarikov, s.f., , párr. 9)

La glutatión S-transferasa theta 1 (GSTT1) es miembro de una superfamilia de proteínas que catalizan

la conjugación de glutatión reducido a una variedad de compuestos electrófilos e hidrófobos, y se

expresa preferentemente en células del hígado y riñón y en eritrocitos. Algunos genes presentan

polimorfismos homocigotos de deleción (genotipo nulo). (Broberg et al., 2015)

Tanto la enzima GSTT1 como la GSTM1 son conocidas por su capacidad de catalizar la

desintoxicación de oxígeno reactivo y los productos de la peroxidación lipídica, por esta razón la

inactividad enzimática de GSTT1/M1 se relaciona con una mayor exposición al estrés oxidativo.

(Mendoza et al., 2016, p. 538)

La glutatión S-transferasa Mu 1 (GSTM1) es un gen codificante de proteínas parálogo importante del

gen GSTM5. Entre sus vías relacionadas se encuentran el metabolismo del benceno y la

biotransformación metapathway Fase I y II. Las enfermedades asociadas con GSTM1 incluyen

asbestosis y leucoplasia oral.. Las anotaciones de Ontología Génica (GO) relacionadas con este gen

incluyen la actividad de homodimerización de proteínas y la actividad de la glutatión transferasa

(Garrido et al., 2020).

Objetivos:

● Determinar las características distintivas entre los genes GSTT1 y GSTM1

● Identificar la importancia de las pruebas PCR y su repercusión en la detección y amplificación

del material genético.

● Establecer el alcance de la B-globina al margen de la actividad de las enzimas glutatión S

transferasa (GST)

Materiales:

● Guantes desechables de látex, vinil o nitrilo

● Tubos para PCR

● Puntas para micropipetas

● Pipetas microscópicas 2, 20, 100 y 200 µl.

● Termociclador

● Gradilla

Reactivos:

● 3 muestras de ADN: 2 uL

● Taq Polimerasa

● dNTPs

● Primers:

○ GSTT1 (Forward and reverse): 0,2 uL

○ GSTM1 (Forward and reverse): 0,2 uL

○ B-Globina (Forward and reverse): 0,2 uL

● H2O desionizada estéril: 3,4 uL

● Master mix: 6.0 ul

Procedimiento:

Tabla 1: Reactivos, volúmenes y concentraciones finales usadas para una reacción estándar de PCR.

Reactivo: Volumen: Concentración final (X5):

Master Mix 6 ul 30 uL

Primer G5TT1 0,2 uL 0,1 uL

Primer G5TM1 02 uL 0,1 uL

Primer B-Globina 0,2 uL 0,1 uL

H2O desionizada estéril 3,4 uL 17 uL

Muestra de ADN 2 uL 1 uL

Total: 12 uL 57.3 uL

Primeramente se identificó los tubos de mezcla según los nombres de los tubos de ADN de la

siguiente forma: 2C1, 2C2, y 2J3; y se añadió un tubo más de control denominado: 1CC, que nos

ayudará a verificar si el procedimiento se ha realizado bien. Luego, se calculó que cada tubo debe

contener 10 uL de master mix y 2 uL de ADN para completar los 12 uL totales, es importante

mencionar que el tubo de control 1CC en vez de ADN, se pone 2 uL de agua. Asimismo, se multiplicó

cada cálculo por cinco ya que se consideran dos tubos extras: el tubo de control y el tubo de error de

pipeteo. De tal forma, ya en la práctica en cada tubo de ubico: 30 uL de master mix; 0, 1 uL de

G5TT1 (Forward and reverse), 0,5 uL de G5TM1 forward y 0,5 uL de G5TM1 reverse; 0,5 uL de

B-Globina Forward y 0,5 uL de B-Globina reverse; 17 uL de H2O; 1 uL de ADN en los tubos 2C1,

2C2, y 2J3 y 1 uL de agua en el tubo de control 1CC. Una vez hecha la mezcla, se etiquetó los tubos

de PCR más pequeños de la misma forma que los primeros tubos, y se pasó 12 uL de cada mezcla a

los nuevos tubos, respectivamente.

Finalmente, se ubicaron la muestras en el termociclador y se programó el termociclador a 35 ciclos

de: Pre-desnaturalización a 95ºC por 5 minutos, desnaturalización a 95ºC por 30 segundos, Alineación

a 56ºC por 1 minuto, Extensión a 72ºC por 30 segundos. Y una extensión final a 72ºC por 5 minutos.

Metodología:

Según Díaz et al., (s/f), explica que en la PCR se realizan entre 25 a 35 ciclos sucesivos de los

siguientes procesos:

1. Desnaturalización:

Consiste en la desnaturalización del ADN donde se separan las dos cadenas de ADN. Para

lograrlo se recomiendan temperaturas de 94ºC a 95 ºC a 1 minuto. Si el ADN tiene un alto

contenido de guaninas y citosinas, se recomienda aumentar el tiempo o la temperatura.

2. Alineamiento:

Al disminuir la temperatura de incubación los iniciadores se unen al ADN molde en las zonas

3´complementarias. Ambos iniciadores se unen de manera específica al ADN flanqueando el

fragmento que se quiere amplificar. En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender

de 3 factores relacionados con los iniciadores: la concentración, el número de bases y el

porcentaje de guaninas-citosinas. En la práctica, la temperatura de alineamiento oscila entre

45 y 65 ºC durante un tiempo entre 30 segundos y 1 minuto.

3. Extensión:

Esta etapa, también conocida como elongación, amplificación o polimerización, consiste en la

síntesis de la nueva cadena de ADN, a partir del extremo 3’ del iniciador por acción de la

ADN polimerasa, empleando como sustrato los cuatro dNTPs. En la mayoría de las

reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72 ºC porque es la temperatura a la cual la Taq

polimerasa (enzima más utilizada) alcanza su mayor actividad. El tiempo de extensión

depende de la longitud del fragmento a amplificar, la Taq polimerasa añade de 500 a 1000

nucleótidos por minuto.

 4. Extensión final:

Generalmente, al terminar los ciclos, se realiza una última extensión de aproximadamente 5

minutos a 72 ºC para permitir que la polimerasa termine de sintetizar todos los fragmentos

que pueden haber quedado incompletos.

5. Conservación:

Este paso se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a

corto plazo.

6. Electroforesis:

Técnica para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función de su tamaño y carga

eléctrica. Se usa una corriente eléctrica para mover las moléculas a través de un gel o de otra

matriz.

Resultados:

Se obtuvo cuatro muestras con el master mix necesario para realizar el PCR, cada una de ellas con un

volumen total de 12 uL; 3 de ellas con 10 uL de máster mix y 2 uL de ADN; y la cuarta muestra con

10 uL de máster mix y 2 uL de Agua ya que es la muestra de control. Las muestras se etiquetaron de

la siguiente forma: 2C1, 2C2, y 2J3; y en ese mismo orden se las ubicó en el termociclador.

Una vez que el termociclador culminé con los 35 ciclos lo que se espera obtener múltiples copias una

región específica de ADN, en este caso se amplificaron los genes: GSTT1, GSTM1 y B-Globina. La

electroforesis que se realizará posteriormente permitirá ver si el PCR se realizó de forma correcta, este

proceso se encargará de separar los fragmentos de ADN por su tamaño y carga mediante la aplicación

de corriente por un gel que contiene las moléculas de interés.

Conclusiones:

● Los genes GSTT1 comparten un 55% de identidad de secuencia de aminoácidos con la

GSTT2 y GSTT2B y pueden desempeñar un papel en la carcinogénesis humana, este gen es

específico del haplotipo y está ausente en el 38% de la población; el empalme alternativo de

este gen da como resultado múltiples variantes de transcripción y las enfermedades asociadas
 con GSTT1 incluyen sensibilidad mutágena y catarata senil. Por otra parte, se tiene a los

genes GSTM1 que permiten la conjugación de glutatión reducido a un amplio número de

electrófilos hidrófobos exógenos y endógenos; intervienen en la formación de conjugados de

glutatión tanto de la prostaglandina A2 (PGA2) como de la prostaglandina J2 (PGJ2) y

participan en la formación de nuevos regioisómeros de hepoxilina.

● Las pruebas de PCR se usan para diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas como lo es el

covid en la actualidad, identificar un cambio genético que puede causar una enfermedad,

encontrar cantidades pequeñas de células cancerosas que podrían pasar desapercibidas en

otros tipos de pruebas. Algunos virus están formados por ARN en lugar de ADN, por lo que

la transcripción del virus pasa de ARN a ADN antes de copiarse, conociéndose este proceso

como PCR de transcripción inversa (rtPCR).

● El gen HBB Hemoglobina Subunidad Beta encontrado en el cromosoma 11 del genoma

humano, contiene una secuencia que codifica para la cadena polipeptídica de la beta globina,

que es una subunidad de la hemoglobina. La globina HBB tiene una función muy importante,

pues forma parte de la estructura de la hemoglobina. La HBB tiene una región hemo, en la

cual se le une el oxígeno, dióxido de carbono e hidrógeno y permite el transporte de estos. En

caso de que hubiera un cambio en la secuencia o una malformación, se darían ciertos efectos

en nuestro organismo, al no llegar las moléculas indispensables a nuestras células como la

beta talasemia, anemia falciforme o la metahemoglobinemia. A diferencia de las enzimas

glutatión S transferasa (GST) la B-globina presenta 10 mutaciones en el gen HBB debido a un

patrón autosómico dominante.

Recomendaciones:

● En cualquier PCR es muy importante utilizar siempre un control negativo, un tubo que

contenga todos los reactivos menos el ADN molde, para poder monitorear posibles

contaminaciones.

● También es recomendable usar un control positivo, que consiste en una muestra que sabemos

amplificar sin problemas bajo las condiciones establecidas. Este control es muy útil para

asegurarnos que los reactivos ocupados se encuentran en condiciones apropiadas.

● Es importante utilizar siempre materiales consumibles (tubos, puntas, etc.) nuevos y estériles.

Para aplicaciones muy sensibles a la contaminación se recomienda emplear puntas con filtro.

● Se recomienda usar pipetas exclusivas para PCR y tener áreas exclusivas para extracción de

ADN, PCR y electroforesis.

● Los reactivos de PCR son sensibles a la temperatura, por lo cual durante su uso se deben

mantener en hielo e inmediatamente después de utilizarlos se les debe regresar al congelador

● Es recomendable hacer alícuotas de todos los reactivos, si se tiene alguna contaminación o

hidrólisis se puede tomar una nueva alícuota.

Bibliografía:

Broberg, K., Engström, K. y Ameer, S. (2015). Genes relacionados con la glutatión y otros genes y

toxicodinámica del mercurio. Handbook on the Toxicology of Metals 4th Edition (pp.

239-264). Ediciones Diaz de Santos.

Garrido, J., Rojano, J., Fernández, M. (2020). Relevancia del polimorfismo de eliminación del gen

Gstm1 y Gstt1 en pacientes con Nefritis Lupica. Biociencias, 15(1), 69-86. https://

doi.org/10.18041/2390-0512/biociencias.1.6359.

Kosarikov, D. (s.f.). La PCR es uno de los avances científicos más importantes del siglo 20.

Diagnostics Roche. https://diagnostics.roche.com/es/es/article-listing/what-is-pcr.html

Mendoza, E., Alcala, E. y Fernandez, M. (2016). Papel de las variantes GSTM1, GSTT1 y MnSOD en

el desarrollo de enfermedad de Alzheimer de aparición tardía y su relación con el alelo 4 de

APOE. ELSEVIER, 31(8), 535-542.

https://www.elsevier.es/es-revista-neurologia-295-articulo-papel-variantes-gstm1-gstt1-mnsod

-S0213485314002357

Serrato Díaz, A., Flores Rentería, L., Aportela Cortez, J., & Palacios, E. (s.f.). PCR: reacción en

cadena de la polimerasa. http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf

Zaragoza, O. (2020). Pruebas de diagnóstico del coronavirus: ¿qué es la PCR?, ¿qué son los test

rápidos? ¿En qué se diferencian? ISCIII.

https://www.isciii.es/InformacionCiudadanos/DivulgacionCulturaCientifica/DivulgacionISCII

I/Paginas/Divulgacion/COVID19_PCR_test.aspx
Anexos: