Biología Molecular y Citogenética

Biología molecular y Citogenética

Biología molecular: Parte de la biología que estudia la composición, estructura y función de

moléculas, así como en los procesos implicados. Engloba el estudio de Ácidos Nucleicos.

Citogenética: Parte de la genética que estudia la estructura, función y composición de los

cromosomas en metafase.

Se podría considerar laboratorios de genética; la unidad asistencial que, bajo la

responsabilidad de un facultativo, está dedicada a la realización de pruebas genéticas y la
emisión de diagnósticos.

Se van a realizar técnicas de alta complejidad que requieren un equipamiento costoso y

especializado y un flujo de trabajo unidireccional. Un problema común es la contaminación,
por ello, se estructura en área limpia (preparan reactivos) y área sucia (con ADN).

1. Laboratorio de biología molecular.

La técnica básica es la Reacción de cadena de la Polimerasa (RCP) , ampliación del ADN.

A) Equipamiento.
 Específico: Permite realizar técnicas exclusivas.
 Termociclador: Aparato en el que se lleva a cabo la RCP y permite realizar
secuencialmente un numero de ciclos repetitivos programables con temperaturas
diferente y distintos tiempos de incubación, controlados por un microprocesador.
Cada ciclo supone la amplificación en nº de copias de ADN. Partes:
 Bloque Incubador: Soporte metálico con múltiples pocillos para colocar los
tubos de la reacción de PCR. Es capaz de mantener de manera homogénea las
distintas temperaturas y tiempos que se programan en fases. Se utilizan
sistemas de aire caliente y frío o resistencias eléctricas, y materiales
semiconductores en conjunción con el efecto Peltier.
 Tapa del bloque: Tapa termotizada a 102-105ºC, que una vez cerrada entra en
contacto con la tapa de tubos. Esto evita que el agua de la mezcla se evapore
por efecto de las temperaturas y se condense en la tapa, alterando el
desarrollo de la reacción.

Los termocicladores más actuales permiten mayor rapidez en la reacción y mayor

uniformidad en las temperaturas y disponen de un software más potente para
variar las temperaturas o tiempos de cada ciclo.

 Equipo de electroforesis: Técnica separativa para analizar los productos

amplificados de PCR o purificar y obtener fragmentos de tamaños concretos. Se
lleva acabo aplicando un campo eléctrico en una disolución tampón que contiene
las muestras de ADN. Estos migran en función de carga neta que poseen, su
tamaño y configuración tridimensional.
 Gel de agarosa: Separa fragmentos de mayor tamaño, permitiendo
electroforesis rápidas pero con resolución limitada.
 Gel de poliacrilamida: Separa fragmento de menor tamaño pero mayor
resolución.

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Equipamiento necesario para realizar la electroforesis:

 Soporte plástico: “cama”, solidifica el gel y en ella se coloca el puente.

 Cubeta: Tiene un soporte central, dos zonas de depósito de tampón en cada
extremo y electrodos positivos y negativos a cada extremo.
 Fuente alimentación: Suministra corriente eléctrica.
 Peine: Hace pocillos.
 Documentador de geles: Permite visualizar las bandas de Ácidos Nucleicos en el
gel después de electroforesis y obtener foto de él.
 Transiluminador: Fuente de luz ultravioleta (longitud de onda 245-365nm) en
una superficie transparente a luz ultravioleta. Cuando la luz UV ilumina el gel,
el agente intercalante emite fluorescencia, visualizándose las bandas de Ac.
Nucleicos.
 Cámara fotográfica: Sistema de captación de imágenes en la parte superior de
la cámara oscura.
 Genérico: Común en otro tipo de laboratorios.
 Cámara de bioseguridad: Se debe utilizar la cabina de flujo laminar de clase II,
protege la muestra, la persona manipuladora y el medio ambiente. Se utiliza para
trabajar con ADN ya que las ARNasas son omnipresentes y pueden degradar el
ARN. Son imprescindibles para cultivos celulares.
 Sistema de purificación del agua: El laboratorio requiere suministro de agua
purificada tipo II y agua ultrapura tipo I.
 Espectrofotómetro: Medida de la concentración de Ac. Nucleicos de una muestra y
su pureza.
 Microscopio de luz transmitida y fluorescencia: Interpreta las técnicas de
hibridación In situ fluorescente.
 Autoclave.
 Incubador o estufa: Cultivar células y bacterias.
 Baño termostático, termobloque y placa calefactora: Equipamiento con
temperatura regulable. La placa alcanza de manera homogénea y estable
temperaturas para neutralizar el ADN.
 Centrífuga y microcentrífuga.
 Congelador y neveras de -20ºC y -80ºC.
 Otros equipamientos:
 Balanza: Pesa reactivos.
 Agitadores magnéticos: Preparación de reactivos.
 Vórtex: Homogenizar muestras y reactivos.
 pHmetro.
B) Estructura del laboratorio.
La realización de una PCR implica:
Preparación de reactivos.
Extracción purificación de ADN de una muestra biológica.
Reacción de ampliación.
Análisis de los productos.
Cada actividad debe realizarse en un área de trabajo independiente, físicamente separadas
y con su propio equipamiento y material de trabajo.

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 Sala de preparación de reactivos: Área limpia (sin ADN), se preparan todos los
reactivos que se van a utilizar en el laboratorio, incluyendo la mezcla de reacciones de
PCR. Esta sala debe tener presión positiva para evitar la entrada de cualquier fuente de
contaminación y es imprescindible la cabina de bioseguridad.
 Sala de preparación de muestras y extracción de ADN: Área sucia (con ADN), tiene
presión negativa para evitar que pueda escaparse material contaminante. Debe tener
cabina de bioseguridad y espectrofotómetro.
 Sala de PCR: Dispone de los termocicladores y un espacio de trabajo para añadir las
muestras de ADN a la mezcla de reacción.
 Sala de post-PCR: Área sucia con presión negativa. Dispone de los equipos de
electroforesis y de documentación de geles, estas puedes situarse en una sala oscura
junto con el microscopio de fluorescencia.

Esta estructura se puede complicar, puede requerirse una sala limpia adicional para
cultivos celulares y salas sucias para los secuenciadores, técnicas de hibridación, etc.

C) El flujo de trabajo.
Marca el sentido unidireccional (único) de procesos en el circuito de trabajo.
Unidireccional desde las áreas limpias a las sucias. Pre-PCRPCRpost-PCR.
Cada área tienes que ser autónoma y en el material de trabajo encontramos las
micropipetas, EPI o el material fungible, también se debe evitar el retorno de cualquier
área sucia a limpia.
D) Condiciones de trabajo.
 Contaminación de las muestras: La contaminación es la introducción accidental en la
muestra de material exógeno que altera su pureza. Causa resultados erróneos o no
interpretables, los más peligrosos son los ácidos nucleicos extraños y las enzimas.
 Contaminación cruzada:
 Material no amplificado del medio ambiente: Aerosoles, pipeteo,
centrifugación, apertura de tubos Eppendorf…
 Contaminantes del propio personal técnico: Células de la piel, pelo, guantes
contaminados…
 Contaminantes de las superficies de trabajo.
 Contaminación por productos amplificados: Generados mediante PCR en el propio
laboratorio.
 Contaminación de los reactivos comerciales y del material fungible: Los fabricantes
garantizan esterilidad pero eso no es ausencia de ADN o nucleasas. Estéril significa
ausencia de microorganismos.
 Normas de manipulación de materiales y reactivos:
 Separación de áreas de trabajo y flujo unidireccional.
 Evitar material fungible contaminado por nucleasas.
 Control exhaustivo de los reactivos.
 Realizar controles negativos en todas las técnicas.
 Técnica aséptica: Conjunto de actividades encaminadas a prevenir la contaminación
por microorganismos, ácidos nucleicos y nucleasas. Tiene un doble objetivo: Prevenir
la contaminación de muestras y evitar la contaminación del trabajador.
 Lavado de manos: norma de higiene básica.
 Uso del equipamiento de protección individual (EPI): guantes (sin talco) y bata.

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 Descontaminación de superficies: Métodos físicos como la irradiación con luz UV o

métodos químicos como el lavado de soluciones de hipoclorito sódico al 10% o
descontaminantes comerciales.
 Prevención de contaminación ambiental:
 Cabinas de bioseguridad de clase II
 Puntas de micropipetas especiales:
(a) Desplazamiento positivo: En su interior el émbolo o pistón que las
convierte en auténticas microjeringas. Las pipetas utilizan un vástago que
encaja en el émbolo, el cual sube y baja en el interior de la punta
succionando y expulsando el fluido, sin que este toque en ningún
momento el cuerpo de la pipeta ni se produzcan aerosoles.
(b) Puntas con filtro: Tienen en su interior un filtro que impide que los
posibles aerosoles alcancen el cuerpo de la pipeta.
 Prevención de carryover: La contaminación por productos amplificados con
cantidades muy pequeñas de este producto es suficiente para producir falsos
positivos.
E) Uso eficiente de los recursos.
 Equipamiento e infraestructuras: Plan de mantenimiento y de revisiones técnicas
periódicas.
 Reactivos: La trazabilidad de los reactivos, desde su recepción o eliminación por
caducidad.
 Recursos humanos: Formación del personal en materia de seguridad y gestión de
recursos. Y un plan de formación continuada.
 Técnicas: Procedimientos normalizados de trabajo (PNT). En los laboratorios de
diagnóstico, es imprescindible una buena comunicación con los clínicos.
 Gestión medioambiental: Código de buenas prácticas en cuanto al consumo de agua,
electricidad y el garantizado reciclado de los residuos de tipo urbano.

2. El laboratorio de citogenética y cultivos celulares.

Laboratorio de cultivos celulares: Crecimiento de células eucariotas de organismos
pluricelulares en medios de cultivos artificiales en condiciones controladas.
Laboratorio de citogenética: Estudio de los cromosomas en metafase de especies
eucarióticas con perspectiva morfológica (cariotipo) y molecular (citogenética
molecular).
El laboratorio de citogenética se puede considerar como una amplificación
especializada del laboratorio genérico de cultivos celulares:
Área de cultivo celular enfocada a células en mitosis.
Área de genética enfocada a cromosomas en metafase
Ambos laboratorios comparten también su principal problema: La contaminación por
microorganismos ya que provocan la muerte de los cultivos en poco tiempo.

A) Equipamiento.
 Equipamiento específico para cultivos celulares:
 Cabina de Flujo laminar: Se realizar todos los procesos y manipulación de cultivos,
como la preparación de medios, siembra de cultivos, cambios de medio…
 Panel frontal transparente: Mantiene la estabilidad del flujo laminar en el
interior.

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 Rejilla frontal: Genera una corriente entrante de aire que impide el escape de
posibles contaminantes por la ventana de trabajo.
 Sistema mecánico: Impulsa el aire entrante y el aire recircularizado hacia la
parte superior de la cabina.
 Un filtro HEPA de gran superficie: El aire se fuerza a pasar a través del filtro,
generando un flujo laminar estable libre de partículas y microorganismos.
 Segundo filtro HEPA: Del anterior filtra el aire y por encima de este elimina al
exterior.
 Incubador de CO2: Es el aparato que proporciona las condiciones ambientales
óptimas para el crecimiento de las células en el medio de cultivo. Consta de:
 Control de temperatura: Fija y mantiene estable la temperatura óptima para
cada tipo de cultivo.
 Recircularización del aire: Para homogenizar la temperatura.
 Control de CO2: El CO2 puro está comprimido en botellas presurizadas y se
mezcla con aire en la proporción 4-7% y lo inyecta en el interior del Incubador.
 Control de humedad: Inyecta agua estéril.
 Microscopio invertido: Tiene invertidas la posición de la fuente de luz y el revólver
de objetivos respecto al convencional. Además, si tienen un sistema de contraste
de fases se visualiza mejor las células en crecimiento ya que se trata de estructuras
vivas, transparente y sin coloración.
 Equipo de criogenia: Permite conservar a largo plazo y en forma viable muestras
de células y líneas celulares. Consta de un tanque o depósito de nitrógeno líquido y
es imprescindible en los laboratorios de cultivos celulares.
 Equipamiento específico para citogenética:
 Un equipo de análisis de imagen: Documenta y analiza metafases con el fin de
obtener un cariotipo.
 Microscopio óptico convencional: Visualizar las metafases teñidas.
 Cámara digital: Obtener imágenes de metafases para su posterior análisis.
 Software específico: Análisis de metafase permitiendo su reconocimiento y su
emparejamiento para obtener el cariotipo.
 Microscopio óptico convencional y de fluorescencia: Se utiliza para recuentos de
células, estudios de viabilidad y morfología celular, visualización de preparaciones
de hibridación in situ fluorescente.
 Equipamiento común:
 Equipo de esterilización:
 Autoclave: Esterilizar el material.
 Sistema de filtración: Filtros de 0,22µm para esterilizar soluciones.
 Sistema de purificación de agua: Tiene que ser ultrapura, estéril y libre de
apirógenos.
 Nevera y congeladores de -20ºC y -80ºC: Conservar cultivos.
 Otros equipos: Centrífugas, Placa Calefactora, pHmetro, balanza, agitador
magnético, pipeteadores automáticos…
B) Estructura del laboratorio.
 Sala de cultivos: Sala limpia, se va a realizar todos los procedimientos directamente
relacionados con el cultivo celular. Está situada en una zona tranquila, alejada de vías
de paso habituales y le suministran aire filtrado y una ligera presión positiva. Dispone
de cabinas de flujo laminar, incubadores y microscopio invertido.

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 Sala de laboratorio convencional: Sala sucia, excepto el equipo de criogenia. Van a

realizar todos los procedimientos que no están en relación directa con los cultivos
celulares como la preparación de extensiones, tinciones, cariotipos, citogenética
molecular. Puede tener área oscura para el microscopio de fluorescencia.
 Sala de frío: Congeladores y equipo de criogenia. Está separada de sala de cultivos. Lo
ideal es que sea una cámara frigorífica, para minimizar el consumo de nitrógeno
líquido y alargar la vida de los congeladores.
C) Técnica aséptica.
 Lavado de manos.
 EPI.
 Puerta cerrada.
 Uso exclusivo de material y reactivos estériles.
 No introducir mecheros bunsen en las cabinas.
 En el interior de la cabina solo material que se va a utilizar.
 No sacar el material estéril de su embalaje hasta el momento de uso.
 Colocar el material reutilizable de vidrio en un recipiente de hipoclorito al 10% y luego
lavar.
 Material fungible depositar en contendedores para material contaminado.
 Restringir el acceso a la sale de cultivos, solo personal.
 Limpieza de cabinas de flujo con etanol al 70% o desinfectante comercial.
 Cabinas de UV, conectar después de la limpieza con máximo de 30min.
 Realizar mantenimiento programado de cabinas que incluya comprobación del HEPA.
 Limpieza y desinfección de superficies con etanol al 70%.

3. La Seguridad Del Laboratorio.

La seguridad es la prevención de la exposición del personal a agentes nocivos y
también a impedir la liberación al exterior.
Biológica o bioseguridad: Prevención ante patógenos y toxinas.
Química: Prevención a exposición de agentes químicos.
A) Bioseguridad.
Engloba todas las técnicas, normas, prácticas y hábitos de trabajo que intentan evitar la
exposición accidental del personal a agentes biológicos potencialmente peligrosos o su
liberación al medio ambiente.
El principal problema lo plantea el trabajo con microorganismos en general y con
organismos modificados genéticamente (GMO).
 Tipo 1: Riesgo nulo o insignificante.
 Tipo 2: Riesgo bajo.
 Tipo 3: Riesgo moderado.
 Tipo 4: Riego alto.
B) Seguridad Química.
Debe incluir medidas para prevenir la exposición del personal a estas sustancias, su
almacenamiento seguro y la gestión eficiente de los residuos que generan.
Estas medidas se establecerán con base en catálogo de productos utilizados en el
laboratorio y de acuerdo con la Ficha de Datos de Seguridad (FDS), que aporta información
de hasta 16 apartados relativos a la composición, manipulación, vías exposición, efectos
tóxicos, almacenamiento, eliminación y primeros auxilios.

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 Medidas genéricas:
 Utilización de EPI.
 Prohibición de pipetear con la boca.
 Manipulación de productos volátiles en el interior de las campanas de aspiración
de gases.
 Manipulación de productos inflamables alejados de fuentes de calor y frío.
 Correcto etiquetado incluyendo las soluciones stock y de trabajo preparadas en el
laboratorio a partir de productos puros.
 Almacenamiento de productos en armarios adaptados a sus características de
peligrosidad y respetando siempre las incompatibilidades.
 Sustancias peligrosas:
 Inflamables: Alcoholes (etanol, isopropanol, metanol).
 Tóxicos y muy tóxicos: Acrilamida, azida sódica, bromuro de etidio…
 Carcinógenos: Acrilamida, DAB, formaldehído.
 Mutágenos: Acrilamida, bromuro de etidio.
 Teratógenos y perjudiciales para la fertilidad: Acrilamida, formamida, urea.

C) Equipamiento y normas.
 Disponer de instalaciones de emergencia.
 Uso del EPI.
 Debe tener instalaciones para el almacenamiento de sustancias tóxicas y peligrosas.
 Debe tener contenedores adecuados para la recogida selectiva de residuos.
 Kits para derrames químicos y citotóxicos.
 Manual de seguridad y plan de gestión de residuos.
D) Manual de Seguridad.
Es un documento de obligado cumplimiento de todo el personal de laboratorio.
 Información que da:
 Evaluación de los riesgos inherentes a cada puesto.
 Descripción y normas de utilización del equipamiento de seguridad.
 Hábitos de trabajo apropiados.
 Normas de almacenamiento.
 Normas para la eliminación de desechos.
 Normas para la actuación en casos de emergencia, accidentes biológicos y
químicos.
E) Gestión de residuos.
El plan de gestión de residuos tóxicos y peligrosos debe incluir medidas para la recogida
selectiva, clasificación y almacenamiento temporal.
 Medidas:
 Residuos biosanitarios especiales: Incluyen objetos punzantes y cortantes que han
estado en contacto con productos biológicos, cultivos microbiológicos y material
contaminado, cultivos celulares, grandes cantidades de sangre y otros líquidos.

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 Residuos químicos: Incluyen los envases que han contenido productor químicos,
reactivos caducados o innecesarios, los EPI contaminados, filtros de cabina de
aspiración de gases, derrames…
 Residuos citotóxicos: Incluyen restos de productos carcinógenos, Mutágenos y
teratógenos así como los envases que los hayan contenido.
 Residuos radiactivos: Se recogen en contenedores para sólidos, garrafas para
líquidos y deben cumplir estar homologados y ser específicos, ser diferenciados
con códigos de colores y estar perfectamente etiquetados.
 No se debe llenar más de 2/3 y se debe cerrar herméticamente.
 Derrames: Son los accidentes más comunes en un laboratorio y entrañan cierta
peligrosidad, su gestión implica 3 acciones:
 Neutralización: Depende de las características químicas del producto derramado.
 Absorción: Material absorbente:
 Serrín: No inflamables ni tóxicos ni corrosivos.
 Carbón activo: Inflamables, tóxicos o corrosivos.
 Absorbentes-neutralizadores comerciales: Según indicaciones del comercial.
 Celulosa: Derrame en pequeñas cantidades.
 Eliminación:
 En polvo: Se recogen directamente, evitando la formación de aerosoles y de
polvo en suspensión.
 Volátiles tóxicos: Recogidos en envases adecuados con cierre hermético o con
celulosa en una cabina de aspiración de gases.
Durante la realización de estas actividades se debe restringir el acceso al laboratorio,
usar el EPI y se debe tener especial cuidado con derrames de líquidos inflamables y
volátiles.

Termociclador Electroforesis Microcentrífuga

Cabina de flujo laminar Espectrofotómetro