Aislamiento de bacterias partícipes en el ciclo del nitrógeno a partir de diferentes medios de cultivo

Isolation of bacteria involved in the nitrogen cycle from different culture media

Luis Alexander Baloco Sanchez, Daniela Guerrero Rivera, Anny Marcela Sanchez Guerra, Emerson
Yesid Zamora Adrada.

Laboratorio de Microbiología Ambiental, Facultad de Ciencias Básicas

e-mail: daniela.guerrero04@usc.edu.co

RESUMEN

Antecedentes. El ciclo del nitrógeno es un ciclo biogeoquímico, el cual explica las

transformaciones y procesos biológicos y abióticos por el cual el nitrógeno circula en el planeta,
este se divide en 3 etapas, la amonificación, la nitrificación y la asimilación. Los
microorganismos fijadores de nitrógeno cumplen un papel fundamental en el ciclo y se
encuentran principalmente en el suelo, estos microorganismos son capaces de fijar el nitrógeno
atmosférico y transformar este gas en compuestos como nitratos (NO3 -) y amonio (NH4 +), este
proceso que realizan los microorganismos son necesarios para la asimilación de nitrógeno en
las plantas, ya estos adquieren el nitrógeno directamente de la atmósfera y lo fijan en
compuestos aprovechables para las plantas. Objetivo. Comprobar la capacidad bacteriana para
la fijación de nitrógeno presentes en suelo, raíces y nódulos de plantas mediante diferentes
medios de cultivo y aprender sobre cómo influyen los microorganismos en el ciclo del nitrógeno.
Metodología. Para el aislamiento de Rhizobium spp asimiladores de nitrógeno se sembró por
agotamiento y por triplicado los nódulos de las raíces de las plantas en agar YMA, para el
aislamiento de Azotobacter spp se sembraron por triplicado 20-25 gránulos de suelo en agar
Ashby, para el aislamiento de Azospirillum spp se sembraron por punción y por triplicado la raíz
tomada del pasto en el medio JMB, todo se mandó a incubar 35 C° durante 48 horas, 30 C°
durante 2 semanas y 22 C° durante 3 semanas respectivamente, por último se le realizó tinción
de Gram y tinción de Lactofenol para la identificación de bacterias, hongos y levaduras a las
placas que presentaron un crecimiento microbiano. Resultados. De las siembras de aislamiento
en agar YMA no se obtuvo un aislamiento abundante de colonias bacterianas, para el agar
Ashby de la siembra de los gránulos de suelo se obtuvo un crecimiento de bacterias y un hongo
alrededor de las muestras de gránulos, de la siembra de la muestra de las raíces en el medio
JMB no se obtuvo crecimiento microbiano y por consiguiente no se obtuvo la formación de la
sombrilla de coloración azul. Por último, para las tinciones se observaron levaduras, bacterias
coco Gram negativas y dos hongos con morfología diferentes. Conclusiones. Los resultados
obtenidos para el aislamiento de Azotobacter sp no es óptimo ni confiable debido al poco
crecimiento bactriano que presento y se recomienda realizar una revisión metodológica con el fin
de optimizar los aislamientos de los microorganismos de interés.
Palabras clave: Bacterias fijadoras de nitrógeno, Ciclo del nitrógeno, Fijación del nitrógeno, Medios
de cultivo, Suelo.

ABSTRACT

Background. The nitrogen cycle is a biogeochemical cycle, which explains the biological and abiotic
transformations and processes by which nitrogen circulates in the planet, it is divided into 3 stages,
ammonification, nitrification and assimilation. Nitrogen-binding microorganisms play a key role in the
cycle and are found mainly in soil, these microorganisms are able to fix atmospheric nitrogen and
transform this gas into compounds such as nitrates (NO3 -) and ammonium (NH4 ), this process
carried out by microorganisms are necessary for the assimilation of nitrogen in plants, since they
acquire nitrogen directly from the atmosphere and fix it in compounds usable for plants . Goal. Check
the nitrogen binding capacity of bacteria present in plant roots and nodules using the isolation
technique and learn how microorganisms influence the nitrogen cycle. Methodology. For the isolation
of Rhizobium spp nitrogen assimilators, the root nodules of the plants were sown by triplicate in YMA
agar, for the isolation of Azotobacter spp, 20-25 ground granules were sown by triplicate in Ashby
agar, for the isolation of Azospirillum spp, the root taken from the grass was sown by puncture in the
medium JMB, everything was incubated at 35 C° for 48 hours, 30 C° for 2 weeks and 22 C° for 3
weeks, respectively. Finally, Gram stain and lactophenol stain were performed to identify bacteria,
fungi and yeasts on the plates that showed microbial growth. Results. From the isolation sowing in
YMA agar, there was no abundant isolation of bacterial colonies, for Ashby agar from the sowing of
the soil granules, a growth of bacteria and a fungus was obtained around the samples of granules, no
microbial growth was obtained from the planting of the root sample in the JMB medium and therefore
no blue umbrella formation was obtained. Finally, yeast, Gram-negative coconut bacteria and two
fungi with different morphology were observed for the stains. Conclusions. The results obtained for
the isolation of Azotobacter sp is not optimal or reliable due to the little Bactrian growth that present
and a methodological review is recommended to optimize the isolates of the microorganisms of
interest.

Key words: Culture media, Nitrogen-fixing bacteria, Nitrogen cycle, Nitrogen fixation, Ground.

INTRODUCCIÓN Teniendo en cuenta que la productividad de

El ciclo del nitrógeno es un ciclo
biogeoquímico el cual explica las
interacciones del elemento en la biosfera,
donde los microrganismos cumplen un papel
crucial debido a su gran capacidad de
adaptarse en ambientes diversos y sobrevivir
al contar con una amplia diversidad de rutas
metabólicas que les permite participar
activamente en la fijación del nitrógeno, la
nitrificación u otros procesos importantes para
el aprovechamiento del nitrógeno (Gutiérrez &
Cerón, 2012).
los ecosistemas está limitada en la
disponibilidad del nitrógeno, se sabe que
aunque cerca del 78% del volumen total de la
atmósfera se compone de N2, una forma libre
nitrógeno (Universidad Nacional de Córdoba,
2014), este no puede ser aprovechado debido
a su estabilidad química, lo cual afecta
negativamente en los procesos de crecimiento
para las plantas, las cuales requieren de este
elemento como macronutriente esencial para
la formación de biomoléculas importantes
como las proteínas, ácidos nucleicos, entre
otros (Peralta & Gónzalez, 2019), con base a
esto la dinámica de este elemento en la
biosfera comprende de la fijación del
nitrógeno principalmente, sin embargo existen
otras rutas metabólicas para este elemento
como lo son la mineralización, nitrificación,
desnitrificación y la fijación anaeróbica del
amonio Anammox (Mashito & Kanako, 2008).
Para los procesos de fijación se recurren a
asociaciones con algunas bacterias y
cianobacterias poseedoras de la enzima
nitrogenasa, capaz de romper el triple enlace
del nitrógeno molecular para producir
compuestos nitrogenados como el amonio y el
nitrito, que posteriormente puede ser
procesado y asimilado por las plantas
(Ciceana, 2007).
Estas bacterias que se encuentran en vida
libre en el suelo o en simbiosis formando
nódulos con raíces de algunas plantas
(legumbres), permiten la fijación de nitrógeno
como se mencionó anteriormente, entre
algunos de estos microorganismo se
encuentran los géneros de Azotobacter sp o
Rhizobium sp, además de algunas bacterias
del género Nitrosomas sp y Nitrosococcus sp,
las cuales logran la fijación del nitrógeno por
acciones quimiosintéticas (Calvo, 2011),
todas las bacterias nombradas son capaces
de fijar nitrógeno ya sea en amonios (NH3) o
nitratos (No3) contribuyendo así a su papel en
este ciclo biogeoquímico.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para esta práctica se realizaron 3 diferentes
aislamientos.
Para determinar la presencia de Azotobacter
spp en una matriz de suelo y pasto se
agregaron entre 40 a 50 gránulos divididos en
dos cajas de Petri (20-25 gránulos por caja)
en agar Ashby por triplicado de forma
equidistante llevados posteriormente a
incubar a 37°C por 2 semanas, pasado el
tiempo se les realizó su respectiva tinción
Gram a las colonias encontradas. Para el
aislamiento de Azospirillum spp se separó y
limpio las raíces de pasto cuidadosamente,
las cuales se llevaron a un frasco de compota
con alcohol etílico al 70% durante 5 minutos,
posteriormente fueron lavadas con hipoclorito
de sodio al 0.8% agitándose durante 2
minutos y finalmente se enterraron en 2
frascos con medio semisólido JMB por
triplicado para ser incubados a 22°C durante
2 semanas. A partir de los nódulos de raíces
de bambú se realizó el aislamiento de
Rhizobium spp para ello se extrajeron los
nódulos de la planta cuidadosamente con un
bisturí, estos fueron lavados con agua
destilada y luego llevados a un frasco con
etanol al 70% durante 5 minutos, después se
llevaron a un frasco con solución de
hipoclorito de sodio al 0.8% por dos minutos,
posteriormente fueron macerados en un
mortero hasta tener una consistencia líquida
la cual finalmente se sembró por agotamiento
en agar YMA por triplicado a 37°C y se le
realizó tinción Gram.
RESULTADOS
Para la siembra por agotamiento de
Rhizobium spp en Agar YMA que se realizó
por triplicado, solo se obtuvo crecimiento
bacteriano para las placas A y B como se
puede visualizar en la figura 1.
Figura 1. Siembras por estría en agar YMA.
Para el aislamiento de Azotobacter spp se
tomó como matriz la tierra que se encontraba
en las raíces del pasto, como se puede
observar en la figura 4 no se presentó un
exopolisacárido ni ninguna pigmentación en
los gránulos, pero en la figura 5 y 6 se puede
observar un crecimiento fúngico en los
extremos del agar, mientras que en la figura 7
se puede observar el crecimiento de una
colonia bacteriana.

Figura 4. Siembra de gránulos de tierra en

Agar Ashby.

Figura 2. Siembra triplicada de gránulos de

tierra en Agar Ashby. Figura 5. Siembra de gránulos de tierra en
Agar Ashby.

Para el aislamiento de Azospirillum spp se

sembró raíces de pasto en frascos con medio
semisólido JMB que se realizó por triplicado
(figura 6), este no presentó crecimiento
microbiano, ni se observó cambio de
coloración o formación de una sombrilla en el
medio.

Figura 3. Siembra de gránulos de tierra en

Agar Ashby.

Figura 6. Siembra de raíces en frascos de

penicilina en medio JMB
Los resultados arrojados por la tinción de
Gram para las siembras por agotamiento de
Rhizobium spp por triplicado en agar YMA
fueron cocos Gram negativos como se puede
visualizar en las figuras 7,8 y 9.
Figura 7. Tinción de Gram para la siembra por
agotamiento caja A de Rhizobium spp, colonia
rosada.
Figura 8. Tinción de Gram para la siembra por
agotamiento caja B de Rhizobium spp, colonia
rosado claro.
Figura 9. Tinción de Gram para la siembra por
agotamiento caja B de Rhizobium spp, colonia
rosado oscuro.
Los resultados arrojados por la tinción de azul
de lactofenol para la siembra en agar Ashby
se puede visualizar en la figura 10 y 11,
mientras que para la tinción de Gram en la
siembra de gránulos de suelo en agar Ashby
arrojó bacilos Gram negativos y levaduras
como se puede visualizar en la figura 12.
Figura 10. Tinción de azul de lactofenol para
siembra de gránulos de tierra en Agar Ashby
caja A.

Figura
11. Tinción de azul de lactofenol siembra de
gránulos de tierra en Agar Ashby caja B.
Figura 12. Tinción de Gram Siembra de
gránulos de tierra en Agar Ashby caja C.
DISCUSIÓN
Como se puede observar en la figura 1 se
obtuvo colonias brillantes y de color rosa
pálido en el agar YMA en las placas A y B, por
lo tanto, se dice que son presuntivas para
Rhizobium sp, esto se debe a que este
género generalmente no absorbe el colorante
de rojo Congo (Pérez, 2015). Se hace uso del
agar YMA debido a su selectividad, que
permite el desarrollo de rizobios durmientes,
al mismo tiempo que permite diferenciar los
contaminantes al mostrar colonias de color
rojo debido al colorante, mientras que las
colonias de Rhizobium se pueden visualizar
de color blanquizo, rosado pálido y cremosas,
como se mencionó anteriormente
(López,2010), por lo tanto, lo hace un medio
de cultivo optimo y eficaz en el aislamiento de
este género de bacterias. Para el resultado de
las tinciones de Gram obtenidas para las
placas A y B, las cuales se pueden visualizar
en las figuras 7, 8 y 9, se dice que
presentaron una misma morfología, la cual fue
bacterias Gram negativas con forma de
bacilos cortos/ cocobacilos, la cual no
corresponde a la morfología de Rhizobium sp,
que son bacilos Gram negativos, que pueden
presentar gránulos de beta-hidroxibutirato y
gelatina de polisacáridos extracelular. La
ausencia de Rhizobium sp en la muestra de
nódulos de bambú se debe a que este género
se caracteriza por establecer interacciones de
simbiosis con plantas leguminosas (Navarro,
2020), como consiguiente no se hace extraño
no lograr aislar este género de bacterias de la
planta de bambú la cual no pertenece a este
tipo de plantas. Se debe tener en cuenta que
la matriz utilizada para esta investigación no
fue la óptima para el objetivo final, por lo
tanto, se recomienda volver a realizar la
práctica con una planta leguminosa. Sin
embargo no se puede olvidar la importancia
del género de Rhizobium sp en el ciclo del
nitrógeno y la agricultura, ya que estos
proporcionan la mayor fuente de nitrógeno en
el suelo al colonizar las células de las plantas
dentro de nódulos de las raíces, donde
convierten el nitrógeno atmosférico en
amonio, por medio de la enzima nitrogenasa,
además de actuar como potenciadores del
crecimiento de las plantas al producir
fitohormonas reguladoras del crecimiento,
enzimas hidrolizantes y solubilizadoras de
fosfato inorgánico y potasio convirtiéndolas
valiosas para plantas leguminosas tanto como
las no leguminosas (Ivami, 2019). A nivel
agrícola también toman un papel importante
como biofertilizantes y biocontroladores de
plagas/ enfermedades. De este modo
entonces se hace imperativo recalcar que las
bacterias fijadoras de nitrógeno juegan un
papel crucial en el equilibrio del planeta.
Para el aislamiento de Azotobacter spp por
una matriz de tierra en las raíces de pasto que
se puede observar en la figura 2, no presentó
ningún crecimiento de quiste o en vegetación y/o suelos, en la placa B se
exopolisacárido alrededor de los gránulos de
tierra, por lo tanto se deduce que la técnica
por siembra de gránulos de tierra no fue la
más óptima para este microorganismo, ya que
no contaba con un enriquecimiento previo a la
muestra demostrando así la importancia de
enriquecer el medio, ya que en otros estudios
de investigación con las mismas condiciones
de matriz, medios de cultivo y técnica no
cuentan con un crecimiento adecuado o
simplemente no presentan un crecimiento
directamente de Azotobacter spp (Escobar,
2011), con el enriquecimiento se busca
potenciar la fijación de nitrógeno y aumentar
la densidad de la población (Rodríguez,
2014), por lo tanto se recomienda que al
momento de nuevamente realizar la práctica
se deben hacer diluciones con la muestra y
aislarla por agotamiento. Se usó el medio de
cultivo Ashby ya que es un medio libre de
nitrógeno que facilita la identificación de
cepas bacterianas capaces de fijar nitrógeno
(Lemus, 2017), por lo tanto, lo hace un medio
de cultivo óptimo para el microorganismo de
interés, sin embargo, se debe tener en cuenta
que para resultados más óptimos se
recomienda un enriquecimiento previo a la
muestra, además como la muestra por recorte
de tiempo no se puedo incubar durante las 3
semanas, si no solo durante 6 días, esto
influyó el crecimiento bacteriano logrando que
no se diera un crecimiento favorable para el
aislamiento, ocasionando así que el
crecimiento bacteriano en el agar se limitara a
una solo colonia. También se debe tener en
cuenta que se incubó en la incubadora de
hongos cambiando así la temperatura
establecida favoreciendo el crecimiento
fúngico, contaminando las placas. Para los
resultados de la tinciones con azul de
lactofenol, se encontró hongos en los agares
A y B como se puede visualizar en la figura 3
y 4, se presume que la placa A presentó
contaminación fúngica por el género
Cladosporium (figura 10), el cual crece a
temperaturas de 18 °C a 28°C y se encuentra
presume que se presentó la contaminación
fúngica por el género Rhizopus (figura 11), el
cual se encuentra en suelos, vegetales, heces
de animales y residuos. Para el agar C se
realizó tinción de Gram porque se identificó
una colonia (figura 5), la cual arrojó como
resultado bacterias Gram negativas con forma
de bacilos y levaduras, la morfología
encontrada corresponde Azotobacter spp ya
que estos presentan un morfología de bacilos
Gram negativos con un diámetro de 1.5 a 2.0
µm, no tiene producción de endosporas pero
si unos quistes, por lo tanto a pesar de que se
logró aislar una colonia de Azotobacter, no se
puede afirmar que el aislamiento fuera
satisfactorio debido a que un aislamiento
adecuado cuenta mínimo con 10 colonias del
microorganismo de interés, aunque si se pudo
comprobar la capacidad de fijar nitrógeno
tampoco se puede afirmar que el resultado
obtenido sea confiable debido al poco
crecimiento bacteriano, por lo que se podría
tener un falso positivo de Azotobacter, ya que
no es la única bacteria fijadora de nitrógeno
que puede crecer en el medio de cultivo
utilizado. Es importante conocer que este
género en el ciclo del nitrógeno es importante
ya que se encarga de fijar nitrógeno
atmosférico en nitrógeno asimilable, también
representa un valor agrícola al ser usado
como biofertilizante mitigando así el uso de
fertilizantes artificiales (Bastida & Cristina,
2011), por lo tanto, se dice que los resultados
obtenidos para el aislamiento de Azotobacter
sp no fueron óptimos, además de ser poco
confiables.
Como se puede observar en la figura 6 no se
presentó crecimiento microbiano, por lo tanto
se le atribuye a que el forraje de la muestra
estaba maduro, y por consiguiente presentará
menor cantidad de microorganismos fijadores
de nitrógeno (Aguilar, 2020) o que la técnica
realizada para su siembra no fue las más
óptima, debido a que en estudios parecidos
realizados se recomienda realizar diluciones
seriadas para sembrar por aislamiento en lo
medios correspondientes de JMB sólidos para
resultados más rápidos, asegurando de esa
manera aislar al microorganismo de interés.
Se recomienda tomar diferentes muestras de
suelo de diferentes áreas con el fin de obtener
una mayor probabilidad de poder aislar el
microorganismo de interés.
CONCLUSIONES
● Los resultados obtenidos para el
aislamiento de Azotobacter sp no es
óptimo ni confiable debido al poco
crecimiento bactriano que presento.
● Se recomienda realizar una revisión
metodológica con el fin de optimizar
los aislamientos de los
microorganismos de interés.
● Las bacterias fijadoras de nitrógeno
influyen de manera significativa en el
ciclo del nitrógeno al convertir
nitrógeno atmosférico en nitrógeno
asimilable.
REFERENCIAS
Aguilar Gutiérrez, L. (2020). Producción
masiva de Azospirillum spp., formulación,
control de calidad y su uso en la agricultura:
Revisión de Literatura. bdigital.zamorano.
https://bdigital.zamorano.edu/server/api/core/
bitstreams/b300293e-14dd-4b8d-9a08-
60578e467891/content
Aristizábal Gutiérrez, F. & Cerón Rincón, L.
(2012). Dinámica del ciclo del nitrógeno y
fósforo en suelos | Revista Colombiana de
Biotecnología. Universidad Nacional De
Colombia.
https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecno
logia/article/view/32889
Bastida, E. & Cristina, M. (2011). Producción
de biofertilizante a partir de cepas autoctonas
de Azotobacter SPP mediante fermentación
discontinua en caldo pikovskaya modificado y
caldo alternativo a escala de diez litros .
Repositorio Institucional de la Universidad de
las Fuerzas Armadas ESPE. miento-en-
cultivo-cuantitativo-identificacion-molecular-
de-especies-pcr-y-secuenciacion
CICEANA. (2007). Ciclo del nitrógeno.
divulgación.
http://www.divulgacion.ccg.unam.mx/webfm_s
end/109
Calvo García, S. (2011). Bacterias simbióticas
fijadoras de nitrógeno. Universidad de
Salamanca.
https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/376
1553.pdf
Carranza Meléndez, C. (2004).
RHYZOOBUIM CRARACTERISTIA
MORFOFLOGIA Y FISIOLOGIA.
Academia.edu.
https://www.academia.edu/8070841/RHYZOO
BUIM_CRARACTERISTIA_MORFOFLOGIA_
Y_FISIOLOGIA
DOMÉSTICAS. Researchgate.
https://www.researchgate.net/publication/3175
88694_ENRIQUECIMIENTO_DE_MICROOR
GANISMOS_FIJADORES_DE_NITROGENO
_DE_VIDA_LIBRE_PROVENIENTES_DE_SI
STEMAS_DE_TRATAMIENTO_DE_AGUAS_
RESIDUALES_DOMESTICAS
Escobar, C., Horna, Y., Carreño, C. &
Mendoza, G. (2011). Caracterización de
cepas nativas de Azotobacter spp. y su efecto
en el desarrollo de Lycopersicon esculentum
Mill. “tomate” en Lambayeque . Redalyc.org.
https://www.redalyc.org/articulo.oa?
id=357633697005
González, V., Acosta Jurado, S. & Navarro
Gómez, P. (2020). Identificación y estudio de
genes simbióticos de Sinorhizobium fredii
HH103 previamente no caracterizados. idUS -
Depósito de Investigación Universidad de
Sevilla.
https://idus.us.es/handle/11441/102382?
show=full
IVAMI. (2019). Rhizobium spp.: Aislamiento
en cultivo cuantitativo; Identificación
molecular de especies (PCR y https://www.unavarra.es/herbario/leguminosas
secuenciación).
https://www.ivami.com/es/microbiologia-de-
abonos-y-fertilizantes/5927-rhizobium-spp-
aisla
Lemus Angulo, J. A. (2017). Multiplicación en
Medio Líquido de Microorganismos del
Genero Streptomyces Aislados de un Nicho
Ecológico del Campus Belmonte de la
Universidad Libre Seccional Pereira.
Universidad Libre.
http://media.utp.edu.co/vicerrectoria-de-
investigaciones/archivos/PONENCIA+-
+MULTIPLICACION+EN+MEDIO+LIQUIDO.p
df
López Zieher, X. M. (2010). Exapuni - Informe
microbiologia3. Microbiología Agrícola y
Ambiental. Ingeniería Agronómica.
Universidad de Buenos Aires. Exapuni.
https://www.exapuni.com/carreras/apunte/Uni
versidad+de+Buenos+Aires/Ingenier
%C3%ADa+Agron%C3%B3mica/Microbiolog
%C3%ADa+Agr%C3%ADcola+y+Ambiental/
Informe+microbiologia3/516/0
https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1111/j.
1747-0765.2007.00195.x
Pérez, G., Gómez, G., Nápoles, M. &
Morales, B. (2008). Aislamiento y
caracterización de cepas de rizobios aisladas
de diferentes leguminosas en la región de
Cascajal, Villa Clara. Redalyc.
https://www.redalyc.org/pdf/2691/2691196990
05.pdf
Peralta, J. & González, E. (2019). Ciclo del
nitrógeno. Herbario De La Universidad Pública
De Navarra.
/htm/ciclo_nitrogeno_L.htm
Rodríguez González, C. L. (2014).
ENRIQUECIMIENTO DE
MICROORGANISMOS FIJADORES DE
NITRÓGENO DE VIDA LIBRE
PROVENIENTES DE SISTEMAS DE
TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES
Herráez, A. (s. f.). Metabolismo del nitrógeno.
biomodel.
https://biomodel.uah.es/metab/nitrogeno.htm
Universidad Nacional de Córdoba. (2014).
Disponibilidad de nutrientes. agro.unc.edu.ar.
http://agro.unc.edu.ar/~microbiologia/wp-
content/uploads/2014/04/unidad-6-
Disponibilidad-de-nutrientes.pdf

Masahito, H., Kanako, T. & Masanori, S.

(2010, 21 diciembre). Various players in the
nitrogen cycle: Diversity and functions of the
microorganisms involved in nitrification and
denitrification. Taylor & Francis.