Vaksin 37 (2019)

6996-7002

daftar Isi tersedia di

ScienceDirect

homepage jurnalVaksin:www.elsevier.com/locate/vaccine

Pengembangansuspensi disesuaikan Vero teknologi proses kultur

sel untuk produksi vaksin virus
⇑,
Chun Fang Shen sebuah, Claire Guilbault sebuah
, Xiuling Li b, S. Mehdy Elahi a, Sven Ansorge a, Amine
Kamen a,c, Rénald Gilbert a
a
Human Health Therapeutics Research Center, National Research Council of Canada, 6100 Royalmount Ave, Montreal, Quebec H4P 2R2, Kanada b China
National Biotec Group Company Limited, Beijing, China
c
Department of Bioengineering, McGill University, Montreal, Kanada

Info yang menunjukkan bahwa sel-sel suspensi mempertahankan stabilitas genetiknya.

Lebih lanjut, sel-sel Vero suspensi pada nomor bagian 163 diuji untuk
artikel Sejarah artikel : tumorigenisitas, dan tidak ditemukan tumorigenik.
Tersedia online 6 Juli 2019 Produktivitas virus suspensi sel Vero dievaluasi dengan menggunakan virus
stomatitis vesikular (VSV) sebagai model. Kultur sel suspensi menunjukkan
produktivitas VSV yang lebih baik daripada kultur sel Vero yang patuh. Selain itu,
Kata kunci:
Kultur sel Vero kultur suspensi dapat terinfeksi pada kepadatan sel yang lebih tinggi, sehingga
Vaksin virus meningkatkan produktivitas virus volumetrik. Lebih dari satu log dari peningkatan
Adaptasi sel produktivitas VSV dicapai dalam 3L budaya bioreaktor perfusi terinfeksi dengan
Media kultur kepadatan sel 6,8 106 sel / mL.

1. Pendahuluan
abstrak

Sel Vero dianggap sebagai garis sel kontinu yang paling banyak diterima oleh otoritas
pengatur (seperti WHO) untuk pembuatan vaksin virus untuk manusia menggunakan.
Pertumbuhan sel Vero bergantung pada penjangkaran. Peningkatan skala dan Crown Copyright 2019 Diterbitkan oleh Elsevier Ltd. Ini adalah artikel akses terbuka
manufaktur dalam budaya yang menganut adalah padat karya dan rumit. Adaptasi sel di bawah lisensi CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Vero untuk tumbuh dalam suspensi akan menyederhanakan subkultivasi dan
peningkatan proses secara signifikan, dan karenanya mengurangi biaya produksi.
Di sini kami melaporkan adaptasi yang berhasil dari sel Vero yang patuh untuk
tumbuh dalam suspensi dalam media bebas serum dan bebas komponen hewan polio, enterovirus 71, influenza dan vaksin lainnya [11,17,2].Vero
(IHM03) yang dikembangkan di rumah. Suspensi mengadaptasi kultur sel Vero di Teknologi kultur seljuga telah dieksplorasi untuk produksi
IHM03 tumbuh dengan kepadatan sel maksimum yang serupa atau lebih baik seperti
yang diamati untuk sel Vero yang patuh yang ditumbuhkan dalam media bebas
Sebagian besar proses kultur sel untuk produksi vaksin terutama
serum komersial dan dengan waktu penggandaan sel 40–44 jam. Densitas sel jauh didasarkan pada sel-sel yang melekat: misalnya, sel paru-paru manusia
lebih tinggi (8 106 sel / mL) dicapai dalam kultur curah ketika tiga volume media kultur MRC5, sel epitel ginjal Vero simian (Vero), sel Madin-Darby Canine
diganti selama proses kultur batch. Kidney (MDCK), dan sel fibroblast embrio ayam (CEF) [7]. Sel Vero
Sel Vero yang melekat dan suspensi dari berbagai tahap diuji keasliannya dianggap sebagai garis sel kontinu yang paling banyak diterima oleh
menggunakan analisis ulangan tandem pendek. Hasil pengujian menunjukkan bahwa otoritas pengatur (seperti WHO) untuk pembuatan vaksin virus untuk
semua sampel sel Vero memiliki kesesuaian 100% dengan sampel kontrol DNA Vero, penggunaan manusia [10]. Sel Vero rentan terhadap berbagai virus dan
telah digunakan secara luas dan komersial, setelah disebarkan pada
microcarrier, untuk produksi rabies,
Penulis yang sesuai.
Alamat email: chunfang.shen@nrc-cnrc.gc.ca (CF Shen).
https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.07.003
0264-410X/Crown Copyright 2019 Diterbitkan oleh Elsevier Ltd.
dari lebih banyak vaksin virus selama dua dekade terakhir [14].
Pertumbuhan sel Vero bergantung pada penjangkaran dan sel Vero
Ini adalah artikel akses terbuka di bawah lisensi CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Peningkatan massa sel untukberbasis sel patuh skala besar menjadi
perhatian khusus atau menantang karena pemrosesan kultur yang
bergantung pada lampiran umumnya memerlukan lebih banyak langkah
(pelepasan dan pemasangan kembali sel yang diperlukan selama
lewat) dan waktu dari suspensi [13]. Akibatnya, peningkatan proses
kultur sel yang patuh tidak hanya rumit tetapi juga padat karya yang
melibatkan biaya barang yang lebih tinggi [16,22].
Adaptasi sel Vero untuk tumbuh dalam suspensi akan
menyederhanakan penanganan kultur seperti inokulasi, passaging sel
dan peningkatan proses secara signifikan, dan oleh karena itu,
mengurangi biaya produksi. Baru-baru ini, beberapa tim peneliti telah
berusaha untuk mengadaptasi sel-sel Vero yang melekat untuk tumbuh
dalam kultur suspensi [18,12], namun, beberapa kendala, seperti
viabilitas sel yang rendah, waktu penggandaan sel yang relatif lebih
lama (>50 jam), masih harus dipecahkan. dalam perkembangan proses
adaptasi.
Bekerja pada adaptasi sel Vero yang melekat untuk tumbuh dalam
suspensi dimulai beberapa tahun yang lalu di fasilitas penelitian kami.
Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk mengadaptasi sel-sel Vero yang
melekat untuk tumbuh dalam suspensi dalam media bebas serum,
untuk mengkarakterisasi sel yang diadaptasi dalam hal stabilitas
genetik dan tumorigenisitas, dan untuk meningkatkan pertumbuhan sel
dan produktivitas virus dari suspensi sel Vero yang diadaptasi di bawah
proses budaya yang berbeda melalui intensifikasi proses.
2. Bahan dan Metode
2.1. Garis sel, media kultur, dan virus
Sel Vero yang melekat yang berasal dari ATCC CCL-81
ditumbuhkan dan dipelihara baik dalam ProVero 1 (Lonza, MD), VP-
SFM (Gibco, NY) atau IHM03, bebas serum dan bebas komponen
hewani medium yang dikembangkan di rumah, dalam labu-T dalam
inkubator yang dilembabkan dengan 5% CO 2 dan pada 37 C. Kultur
diencerkan dan dilewatkan dua kali seminggu.
Virus stomatitis vesikular rekombinan yang mengekspresikan protein
fluoresen hijau (VSV-GFP) [20], pemberian Dr. John Bell, Institut
Penelitian Rumah Sakit Ottawa, dipilih sebagai virus model untuk
mengevaluasi produktivitas virus dari sel Vero yang teradaptasi dan
suspensi. .
2.2. Adaptasi sel Vero yang melekat untuk tumbuh dalam suspensi
dan pemeliharaan suspensi yang diadaptasi Kulturdiambil
sel Vero Sel-sel Vero yang melekat yangdari vial yang diawetkan
dengan krio dan ditumbuhkan dalam media ProVero 1 atau IHM03
dalam labu-T dipindahkan ke labu kocok pada konsentrasi 0,25 10 6
sel/mL dalam media IHM03 bebas serum atau media komersial untuk
memulai proses adaptasi pensiun. Setengah dari media bekas dalam
kultur suspensi diganti dua kali seminggu selama periode adaptasi
sampai sel-sel mulai tumbuh dalam suspensi pada tingkat yang wajar
seperti pada waktu ganda kurang dari 72 jam. Setelah sel-sel diadaptasi
untuk tumbuh dalam suspensi, sel-sel Vero yang diadaptasi suspensi
secara serial dilewatkan dengan subkultur kultur suspensi sel Vero dua
hanya dapat berkembang biak jika diberi permukaan yang sesuai.
Format kultivasi sel yang bergantung pada penjangkaran mencakup
banyak pendekatan planar ''2D", seperti botol rol dan sistem berbasis
permukaan bertumpuk atau bertumpuk dari banyak jenis, dan teknologi
microcarrier. Saat ini, teknologi microcarrier, yang menggunakan butiran
kecil kaca, plastik atau komposisi lain yang memiliki berbagai
kepadatan, porositas dan perlakuan permukaan yang tersebar dalam
suspensi dalam reaktor tangki berpengaduk, menyediakan platform
paling populer untuk produksi sel dengan menyediakan luas permukaan
yang besar. untuk pertumbuhan sel.
CF Shen dkk. / Vaccine 37 (2019) 6996–7002 6997pembuatan pabrik
kali seminggu dalam labu kocok plastik yang diaduk pada 120 rpm
dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5% CO2 dan pada 37 C .
Setiap bagian dicapai dengan cara pengenceran kultur sel suspensi
pada inokulum rang ing antara 0,13 dan 0,25 10 6 sel / mL dalam serum
bebas menengah IHM03. Bank sel dikembangkan di bagian yang
berbeda dan disimpan untuk evaluasi di masa mendatang.
2.3. Otentikasi sel Vero yang diadaptasi dari suspensi
Sampel DNA diekstraksi dari sel Vero yang diadaptasi dan suspensi
yang diadaptasi di berbagai bagian dan dikirim ke Institut Nasional
Standar dan Teknologi (Gaithersburg, MD) untuk analisis short tandem
repeat (STR) sesuai dengan metode yang dikembangkan
oleh Almeida dkk. [1]. Kontrol Vero DNA juga digunakan dalam tes
otentikasi.
2.4. Pengujiansel Vero suspensi yang diadaptasisel Vero yang
diadaptasi
tumorigenisitasUji tumorigenisitasdari suspensi pada nomor bagian
163 dikontrakkan ke BioReliance Corporation (Rockville, MD), sebuah
organisasi penelitian kontrak. Evaluasi pembentukan tumor pada tikus
athymic telanjang (nu/nu) setelah injeksi subkutan suspensi sel Vero
dilakukan sesuai dengan "Poin yang Perlu Dipertimbangkan dalam
Karakterisasi Garis Sel yang Digunakan untuk Menghasilkan Biologis",
sistem uji yang direkomendasikan oleh The Pusat Evaluasi dan
Penelitian Biologi, FDA [6]. Secara singkat, 30 ekor mencit Athymic
nude (nu/nu) betina berumur empat minggu ditempatkan dalam tiga
kelompok perlakuan (10 mencit setiap kelompok) dalam pengujian.
Mouse masing-masing di Grup 1 (Uji artikel) disuntikkan subcuta
simultan antara skapula dengan 107 sel VEROsuspensi di 0,2 ml serum
bebas menengah IHM03. Sementara masing-masing tikus di Grup 2
(Kontrol positif) dan Grup 3 (Kontrol negatif) masing-masing disuntik
dengan 107 sel 18Cl-10T (garis tumor hamster Suriah yang berasal dari
garis sel embrio hamster Suriah yang diubah secara kimia) dan 0,2 mL
serum -media IHM03 gratis. Semua hewan diamati setiap hari kerja dan
tempat suntikan dipalpasi dua kali seminggu untuk perkembangan lesi
untuk jangka waktu hingga 84 hari. Setiap lesi diamati dan diameternya
diukur. Pada hari ke 18, semua hewan di Grup 2 di-eutanasia dan
dilakukan nekropsi sesuai dengan protokol penelitian mereka karena
ukuran tumor. Pada hari ke 84, semua hewan di Grup 1 dan 3 di-
eutanasia dan dilakukan nekropsi. Lesi kotor, paru-paru, kelenjar getah
bening skapula, dan tempat suntikan dari semua hewan di semua
kelompok telah dihapus untuk analisis histopatologi.
2.5. Batch, makan-batch dan budaya batch dengan penggantian media
Suspensi disesuaikan sel Vero yang diunggulkan di kisaran antara
0,13 dan 0,25 106 sel / mL dalam media IHM03 di 125 mL labu goyang
plastik dengan volume budaya kerja dari 25 mL. Sampel diambil secara
teratur untuk penghitungan sel dan analisis metabolit dan komponen
media residu. Beberapa budaya diberi makan dengan feed komersial
seperti HyCloneTM Cell Boost 5 (GE Healthcare), HEK FS (Xell AG,
Bielefeld, Jerman) ketika kepadatan sel mencapai 1,5-2 10 6 sel / mL.
 Selain itu, media bekas di beberapa kultur diganti dengan media IHM03
segar selama beberapa kali selama proses kultur batch untuk menguji
pengaruh penggantian media pada pertumbuhan sel dan kepadatan sel
maksimum.
2.6. Kultur
bikarbonat (7,5% (b / v)). Kecepatan agitasi dipertahankan pada 100
rpm. Dalam mode perfusi, sel dipertahankan dalam reaktor
menggunakan filter akustik BioSep 10L (Aplikon Inc., Foster City, CA).
Pompa peristaltik Masterflex L/S (model 7521-40, Cole Palmer, Vernon
Hills, IL) digunakan untuk menambahkan media segar, sel panen, dan
memompa kultur melalui loop resirkulasi.

bioreaktor Kultur dilakukan dalam bioreaktor Chemap CF 3000 3,5 L
terkontrol (Mannedorf, Swiss) yang dilengkapi dengan tiga baffle
permukaan dan dua impeler laut, dan juga dengan probe untuk
mengukur dan mengontrol suhu dan oksigen terlarut (DO) pada 37 C
dan 40% saturasi udara. pH budaya itu dikendalikan di kisaran 7,1-7,2
dengan penambahan CO2 melalui permukaan atau larutan natrium
6998 CF Shen et al. / Vaksin 37 (2019) 6996–7002
2.7. Hitung sel dan analisis metabolit
Sampel kultur pertama kali dicampur dengan volume yang sama dari
larutan Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.) dalam botol 1,5
mL, campuran tersebut kemudian diinkubasi pada 37 C dan dengan
agitasi

selama 30 menit. Jumlah sel dilakukan dengan penghitung sel otomatis
(Cedex Automated Cell Counter) atau menggunakan hemasitometer
dan eritrosin B. Metabolit seperti laktat dan amonia dianalisis dengan
Cedex Bio Analyzer (Roche CustomBiotech). Asam amino sisa dalam
media kultur bekas dikuantisasi dengan HPLC.
2.8. Produksi virus stomatitis vesikular rekombinan yang
mengekspresikan protein fluoresen hijau (VSV-GFP)
Sel Vero yang diadaptasikan atau suspensi ditumbuhkan dalam
media IHM03 dalam labu-T, labu kocok atau bioreaktor hingga
kepadatan yang diinginkan dan kemudian diinfeksi dengan VSV-GFP di
MOI 0,1 dengan atau tanpa penggantian medium. Supernatan dari
kultur yang terinfeksi dipanen pada waktu pasca infeksi yang berbeda
dan disimpan pada suhu 80 C untuk analisis lebih lanjut. Infeksi
suspensi sel Vero pada kepadatan tinggi (seperti 5 10 6 sel/mL) dalam
labu kocok atau 6 kultur pelat sumur dicapai dengan memusatkan sel
dari kultur sel dengan kepadatan rendah (seperti 1 106 sel/mL) dan
suspensi ulang pelet sel dalam media segar sebelum infeksi virus. Titer
virus ekstra seluler (titer virus dalam media kultur setelah klarifikasi)
diukur dalam rangkap dua dengan 50% kultur jaringan dosis infektif/ml
(TCID50%/ml) pada HEK293A seperti yang dijelaskan oleh Elahi et al.
[5]. TCID50% dihitung menggunakan metode Spearman-Karber dan
dinyatakan sebagai TCID50%/ml [8].
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Adaptasi sel-sel Vero yang melekat untuk tumbuh dalam suspensi
dalam media bebas serum Sel-sel Vero yang melekat yang
permukaan dinding bioreaktor terhadap volume kultur. Morfologi sel
Vero yang ditumbuhkan dalam kultur yang melekat dalam labu-T atau
dalam kultur pensiun sus dalam labu kocok ditunjukkan pada Gambar.
1.
Waktu penggandaan (40-44 jam) suspensi yang mengadaptasi sel
Vero dalam media IHM03 lebih lama dari sekitar 24 jam yang dilaporkan
dalam kultur yang mengandung serum dan kultur yang tumbuh secara
aktif [15]. Peningkatan waktu penggandaan sel dari suspensi yang
mengadaptasi sel Vero dalam kultur bebas serum lebih mungkin dan
sebagian karena penghilangan serum, karena penghilangan serum
biasanya meningkatkan waktu penggandaan sel, seperti dari 31
menjadi 43 jam [17,19] ]; Juga tegangan geser dalam kultur suspensi,
terutama dalam kultur tanpa dukungan pembawa mikro, mungkin juga
mengurangi laju pertumbuhan sel. Ini mungkin dibuktikan dengan waktu
penggandaan sel yang relatif lebih lama yaitu 28-38 jam dalam sebuah
penelitian yang dilakukan oleh Yang et al. [22] untuk memeriksa transfer
manik ke manik sel Vero dalam labu pemintal dengan media yang
mengandung serum. Oleh karena itu, tampak bahwa, ketika sel Vero
dikultur dalam media bebas serum terutama dalam kultur yang diaduk,
waktu penggandaan sel Vero biasanya lebih lama dari 24 jam [9,3,4].
3.2. Pertumbuhan suspensi disesuaikan Vero sel dalam kultur batch
yang
Suspensi disesuaikan Vero sel tumbuh kepadatan sedikit lebih tinggi
dari 2x106 sel / mL dalam budaya labu goyang(Gbr.2).Kepadatan sel ini
lebih tinggi dibandingkan atau mirip dengan apa yang dilaporkan dalam
microcarrier

sebelumnya dikultur dalam media yang mengandung serum dengan

mudah diadaptasi untuk tumbuh baik dalam media ProVero, VP-SFM
atau IHM03 bebas-serum dalam labu-T. Setelah sel-sel patuh
melanjutkan pertumbuhan normal dalam media bebas serum, mereka
kemudian dipindahkan ke labu kocok plastik dengan media komersial
yang disebutkan di atas atau media IHM03 bebas serum untuk memulai
adaptasi sel-sel patuh untuk tumbuh dalam kultur suspensi. Sel Vero
mulai tumbuh dalam suspensi hanya dalam medium IHM03 bebas
serum setelah 5-8 minggu proses adaptasi untuk mencapai waktu
penggandaan dalam kisaran antara 40 dan 44 jam. Sementara dalam
kultur media bebas serum komersial, sel-sel Vero berkumpul dan
adaptasi tidak berhasil. Data percobaan menunjukkan bahwa media
kultur (media awal) yang digunakan untuk menumbuhkan sel pada
tahap kultur patuh tidak mempengaruhi waktu yang dibutuhkan untuk
mengadaptasi sel-sel patuh tumbuh dalam suspensi. Kultur suspensi
terutama terdiri dari sel tunggal tetapi beberapa agregat juga diamati.
Pekerjaan selanjutnya menunjukkan bahwa pembentukan agregat sel
terutama disebabkan oleh perlekatan sel pada permukaan labu kocok
dan pembentukan cincin sel. Agregat sel dihasilkan Gambar. 2. Pertumbuhan suspensi disesuaikan Vero sel dalam kultur batch yang () dengan
ketika cincin sel terlepas dari permukaan. Agregat sel yang jauh lebih media IHM03 bebas serum dan juga dalam budaya bets () dengan tiga volume pengganti media
sedikit diamati dalam kultur bioreaktor karena berkurangnya rasio selama proses budaya . Viabilitas sel selalu lebih tinggi dari 98% selama kedua proses kultur.
Gambar 1. Morfologi sel Vero yang ditumbuhkan sebagai kultur patuh (A) dalam labu-T atau sebagai kultur suspensi (B) dalam labu kocok plastik 125 mL. Kultur suspensi terutama terdiri dari sel
tunggal tetapi juga beberapa agregat juga ada.
kultur [17,3,21]. Kepadatan sel maksimum dalam kultur batch tidak
ditingkatkan secara signifikan dengan memberi makan kultur batch
dengan Cell Boost 5 (Hyclone, Logan, UT) atau HEK TF (Xell, Bielefeld,
Ger many) (data tidak ditampilkan). Umpan ini telah dilaporkan
mengandung nutrisi kompleks yang diperlukan untuk mendukung
pertumbuhan substansial sel HEK293. Selain itu, mencampur IHM03
dengan media komersial berperforma tinggi lainnya seperti HEK GM
(Xell, Bielefeld, Ger many) tidak meningkatkan kepadatan sel
maksimum dalam kultur batch atau waktu penggandaan sel. Analisis
komponen nutrisi sisa dalam media bekas yang diambil dari proses
kultur batch mengungkapkan bahwa masih ada sejumlah besar glukosa
(hampir 20 mM/L) dan asam amino dalam media bekas pada akhir
kultur. Sementara konsentrasi laktat (sekitar 20 mM/L) dan amonia (4–5
mM/L), dua metabolit penghambat yang umum, berada pada kisaran
normal yang diamati pada jenis kultur sel lainnya. Thomassen dkk. [21]
juga menemukan pertumbuhan sel Vero dalam kultur diaduk tidak
dihambat oleh laktat dan amonia pada rentang konsentrasi di atas. Data
ini menunjukkan bahwa pertumbuhan sel dalam kultur batch mungkin
tidak dibatasi oleh ketersediaan nutrisi atau dihambat oleh metabolit
umum, laktat dan amonia. Akumulasi metabolit yang tidak diketahui
dalam lingkungan mikro seluler mungkin bertanggung jawab atas
penghambatan pertumbuhan sel yang bergantung pada kepadatan yang
diamati di bawah kondisi lingkungan yang dioptimalkan [15].
Penggantian medium dieksplorasi sebagai sarana untuk
meningkatkan pertumbuhan sel dan kepadatan sel maksimum dalam
kultur batch dengan menghilangkan metabolit penghambat/pengisi
nutrisi dalam kultur. Data pada Gbr. 2 menunjukkan densitas sel viabel
6
dalam kultur labu kocok mencapai 8 10 sel/mL setelah 3 medium
lengkap
Hasil elektroferogram semua sampel menunjukkan 100% sesuai
penggantian selama proses kultur yang lebih tinggi dicapai oleh
batch. Demikian pula, kepadatan sel Thomassen et al. [21], ketika cul
ture dioperasikan di bawah mode resirkulasi, di mana sel-selsuspensi sel Vero yang diadaptasi yang telah dikultur di IHM03 media
dipertahankan dalam bioreaktor sementara 5 volume kultur media segar untuk 33 dan 59 bagian. Sampel DNA ini bersama dengan sampel DNA
per hari diedarkan.
3.3. Stabilitas genetik sel Vero yang diadaptasikan dan suspensi suspensi
selama kultur lolos dan proses pemeliharaan
Sampel DNA diekstraksi dari sel Vero patuh yang telah dipertahankan
dalam media IHM03 masing-masing selama 5 dan 37 bagian, dan dari
CF Shen dkk. / Vaksin 37 (2019) 6996–7002 6999
dengan sampel kontrol DNA Vero, menunjukkan bahwa adhesif dan
suspensi mengadaptasi Vero sel mempertahankan stabilitas genetik
mereka setelah melewati dan / atau beradaptasi untuk tumbuh dalam
suspensi dalam media IHM03 bebas serum untuk banyak bagian.
Gambar 3 menunjukkan elektro ferogram sel Vero yang melekat setelah
5 bagian dalam IHM03 dan suspensi mengadaptasi sel Vero setelah
total 59 bagian dalam IHM03.
3.4. Tumorigenisitas sel Vero yang diadaptasi dari suspensi
Untuk mengevaluasi tumorigenisitas sel Vero setelah adaptasi dalam
kultur suspensi, tikus telanjang disuntikkan secara subkutan dengan 1,0
107 sel Vero pada bagian 163. Sebagai kontrol positif, tikus disuntik
dengan jumlah sel Vero yang sama. sel 18C1- 10T. Tikus yang disuntik
secara subkutan dengan media kultur berfungsi sebagai kontrol negatif.
Semua tikus kontrol positif (Kelompok 2) mengembangkan tumor di
tempat suntikan seperti yang diharapkan, meskipun tumor tidak
ditemukan di tempat lain yang diperiksa. Tikus-tikus ini dijadwalkan
dikorbankan dan dinekropsi 18 hari setelah penyuntikan, karena mereka
memiliki massa (>1 cm) yang terdeteksi di tempat penyuntikan. Tak satu
pun dari artikel uji (Kelompok 1, suspensi yang diadaptasi sel Vero)
tikus yang diobati atau artikel kontrol negatif (Kelompok 3) tikus yang
diberi perlakuan memiliki massa teraba yang dicatat di tempat injeksi di
sakus terminal dan dinekropsi pada hari ke 84 pasca injeksi. Temuan
klinis pada nekropsi kasar disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1
Ringkasan Temuan Nekropsi Bruto.
Test Kontrol Positif Kontrol
Article Negatif
lain yang diekstraksi dari berbagai klon sel Vero diprofilkan dengan
analisis ulangan tandem singkat.
No. yang diperiksa: 10 10 10 Tissue/Temuan
Lesi Kotor
Tidak ada lesi yang terlihat 10 10 10 Tempat Injeksi
Tidak ada lesi yang terlihat 10 0 10 Perubahan warna; merah; kasar; kelipatan 0 1 0
Massa 0 2 0 Massa, gelap 0 1 0 Massa; merah; kasar 0 3 0 Massa: kasar 0 4 0 Paru-
paru
Tidak ada lesi yang terlihat 10 10 10 Kelenjar Getah Bening, Skapula
Tidak ada lesi yang terlihat 10 10 10
 Gambar 3. DNA dari sel-sel yang teradaptasi dan suspensi pada berbagai bagian diprofilkan dengan analisis STR. Gambar kiri, elektroferogram sel Vero yang melekat telah dipertahankan di
IHM03 selama 5 bagian; Gambar kanan, elektroferogram suspensi mengadaptasi sel Vero yang telah dikultur di IHM03 selama 59 bagian.
7000 CF Shen dkk. / Vaccine 37 (2019) 6996–7002

Massa tempat suntikan yang ditemukan pada semua tikus di Grup 2 Gambar. 4. Produksi VSV dalam kultur sel Vero yang patuh (T175) dan suspensi yang
diadaptasi (SF125). Medium kultur di T-175 labu dan 125 mL goyang labu digantikan sebelum
diperiksa dengan mikroskop, dan menunjukkan bahwa mereka terdiri
infeksi virus pada kepadatan sel dari 0,3 106 sel / mL untuk 1,0 106 sel / mL.
dari populasi sel neoplastik yang kemungkinan muncul dari sel 18C1-
5.0 106 sel/mL pada saat infeksi tidak menghasilkan peningkatan yang
10T yang disuntikkan yang berfungsi sebagai bahan kontrol positif.
nyata dalam produksi VSV, yang menunjukkan potensi keterbatasan
Massa ini diberi diagnosis mikroskopis Xenograf, dan hanya ditemukan
ketersediaan nutrisi. Hasil ini menunjukkan bahwa adalah mungkin
di tempat suntikan, dan tidak menyebar ke organ atau jaringan lain
untuk meningkatkan produktivitas volumetrik VSV melalui infeksi pada
yang diperiksa. Tak satu pun dari tikus yang menerima artikel uji
kepadatan sel yang lebih tinggi. Namun, proses kultur perlu
(Kelompok 1), atau media kultur sel bebas serum saja (Kelompok 3)
dioptimalkan untuk menghindari keterbatasan nutrisi dan parameter
memiliki bukti proliferasi sel neoplastik, yaitu tumor, di tempat suntikan
lainnya.
atau di organ atau jaringan lain yang diperiksa. Kesimpulannya, di
bawah kondisi penelitian ini, artikel uji, suspensi yang mengadaptasi sel
Vero pada nomor bagian 163, tidak ditemukan bersifat tumorigenik. 3.6. Produksi virus stomatitis vesikular (VSV) dalam kultur batch
bioreaktor suspensi
3.5. Produksi virus stomatitis vesikular (VSV) dalam biakan sel Vero
yang diadaptasikan dan suspensi Pertumbuhan sel Vero suspensi dan produksi VSV ditingkatkan
menjadi bioreaktor terkontrol 3L. Sel Vero suspensi menunjukkan
tingkat pertumbuhan yang sama (data tidak ditampilkan) seperti yang
Produksi VSV dalam biakan Vero yang melekat dalam labu T175
dicapai dalam kultur labu kocok kecil, tetapi dengan gerbang agregat
dan dalam suspensi sel Vero yang diadaptasi dalam kultur labu kocok
sel yang jauh lebih sedikit. Kultur diinfeksi pada kepadatan sel 1,2 10 6
125 mL dilakukan untuk membandingkan produktivitas virusnya. Kedua
sel/mL tanpa penggantian medium. Gambar. 6 menunjukkan bahwa
patuh dan suspensi kultur terinfeksi di kepadatan sel masing-masing
VSV pro ductivity dicapai dalam budaya 3L bioreaktor mirip dengan titer
sekitar 0,4 dan 1 106 sel / mL dengan media menggantikan ment
yang diperoleh dalam budaya labu goyang kecil terinfeksi pada 1 10 6
sebelum infeksi virus. Data pada Gambar 4 menunjukkan bahwa
sel / mL(gbr.4),menunjukkan ketersediaan nutrisi mungkin tidak menjadi
produktivitas virus volumetrik sel Vero yang diadaptasi suspensi lebih
faktor pembatas ketika budaya terinfeksi dengan kepadatan sel yang
tinggi daripada titer yang dicapai oleh sel Vero yang melekat dalam
labu-T. Selain itu, produksi VSV meningkat dengan meningkatnya rendah seperti 1 106 sel / mL, sebagai pengganti media sebelum infeksi
kepadatan sel dalam kultur labu kocok suspensi, sedangkan virus tidak secara dramatis meningkatkan titer virus.
produktivitas virus volumetrik menurun pada kultur Vero yang patuh Data pada Gambar 6 juga mengungkapkan bahwa kinetika produksi
VSV dalam kultur bioreaktor 3L lebih cepat daripada kultur kontrol labu
ketika kepadatan sel pada infeksi meningkat menjadi 1,0 106 sel/mL dari
kocok. Produktivitas volumetrik VSV mencapai puncaknya pada 28 jam
0,30 106 sel/mL dalam kultur yang melekat. Produktivitas virus yang
pasca infeksi dalam kultur bioreaktor 3L, sedangkan titer VSV tertinggi
sedikit menurun dapat disebabkan oleh peningkatan persentase
muncul pada kultur labu kocok setelah 45 jam pasca infeksi.
pertemuan lapisan tunggal atau ketersediaan nutrisi dalam kultur labu-
T.
Eksperimen dilakukan untuk mengeksplorasi apakah produktivitas 3.7. Pertumbuhan sel Vero suspensi dan produksi VSV dalam kultur
volumetrik VSV dapat ditingkatkan dengan menginfeksi kultur suspensi perfusi bioreaktor 3L Kultur
pada kepadatan sel yang lebih tinggi. Untuk mencapai tujuan, budaya
sion suspen ini tumbuh 0,87 106 sel / mL disentrifugasi dan pelet sel
perfusi dieksplorasi sebagai alternatif kultur batch dengan
yang disuspensi di segar IHM03 kepadatan masing-masing lebih tinggi
penggantian medium untuk mencapai kepadatan sel yang tinggi untuk
sel 2,5 dan 5,0 106sel / mL. Data pada Gambar. 5 menunjukkan
infeksi guna meningkatkan produktivitas virus volumetrik. Seperti
produktivitas volumetrik meningkat dari 2,3 10 9 TCID50%/ mL untuk 8,9
ditunjukkan pada Gambar.7,perfusi dimulai pada tingkat 0,5 vol media
109 TCID50%/ mL atau 3,8 lipatan peningkatan, ketika sity sel den di per volume bioreaktor per hari (VVD) ketika kepadatan sel dalam
infeksi meningkat dari 0,87 106 sel / mL hingga 2,5 10 6 sel/mL. Namun,
bioreaktor mencapai 2x106 sel / mL. Kepadatan sel mencapai 4,2 106
peningkatan lebih lanjut dalam kepadatan sel ke
sel / mL setelah 2 hari perfusi pada tingkat 0,5 VVD, dan selanjutnya
meningkat menjadi 6,8 106 sel / mL ketika budaya dioperasikan pada
tingkat perfusi dari 1 VVD untuk satu hari tambahan sebelum infeksi
virus. Data ini menunjukkan bahwa perfusi merupakan cara yang efektif
untuk meningkatkan kepadatan sel maksimum dari kultur. Kepadatan
sel meningkat sebesar 2,2-2,5 106 sel/mL setelah perfusi
 Gambar 5. Pengaruh peningkatan kepadatan sel pada infeksi pada produksi VSV. Virus
produktivitas volumetrik meningkat lebih dari 3,5 kali ketika kepadatan sel meningkat dari 0,87
Gambar 6. Produksi VSV dalam bioreaktor 3 L dan kultur labu goyang kontrol yang
terinfeksi pada kepadatan sel 1,2 106 sel/mL tanpa penggantian media sebelum infeksi virus
selama perjalanan waktu.
Gambar 7. Profil kepadatan sel dipantau oleh probe kapasitansi dalam bioreaktor perfusi.
Kepadatan sel mencapai 6,8 106 sel / mL setelah 2 hari perfusi 0,5 VVD dan hari lain pada 1
VVD sebelum infeksi virus. Kepadatan sel diverifikasi oleh jumlah sel harian, dan viabilitas sel
selalu lebih tinggi dari 98%.
setiap volume bioreaktor media, yang kira-kira setara dengan kepadatan
sel maksimum yang dicapai dalam kultur batch. Budaya dalam
bioreaktor terinfeksi pada kepadatan sel dari 6.8x106 sel / mL. Kultur
yang terinfeksi diambil dari bioreaktor dan disimpan dalam labu kocok
sebagai kontrol bioreaktor (BioR CTL-6.8E6). Secara paralel, sel yang
ditumbuhkan dalam labu kocok (belum pernah berada di bioreaktor)
dengan penggantian media juga terinfeksi sebagai kontrol labu kocok
(SF-CTL-6E6). Kultur yang terinfeksi di atas juga diencerkan dengan
media segar menjadi 1 106 sel/mL sebagai referensi (BioR-CLT-1E6 dan
SF-CTL-1E6) dari kultur dengan keterbatasan nutrisi dan penghambatan
metabolit yang tidak mungkin selama fase infeksi dan produksi virus.
Perbandingan produktivitas virus antara referensi dan bioreaktor dan
goyang budaya labu memberikan beberapa wawasan ke dalam potensi
keterbatasan nutrisi dan / atau penghambatan metabolit dalam budaya
bioreaktor dan goyang labu terinfeksi pada densitas sel yang lebih tinggi
(6,8 106 sel / mL). Data pada Gambar. 8 menunjukkan bahwa produksi
VSV dalam bioreaktor dan kultur labu goyang kontrol semuanya
mencapai puncaknya pada 22 jam pasca infeksi. Produktivitas virus
dalam bioreaktor (Bioreaktor) sedikit lebih baik daripada kultur labu
kocok kontrol yang terinfeksi (BioR-CTL-6.8E6 dan SF CTL-6E6)
dengan sel-sel baik dari bioreaktor atau dari labu kocok dengan
penggantian media, menunjukkan kondisi yang memungkinkan
mendukung dalam bioreaktor untuk produksi virus. Produktivitas virus
baik dalam kultur bioreaktor atau labu kocok
Gambar 8. Produksi VSV dalam kultur bioreaktor perfusi. Kultur terinfeksi yang diambil dari
7002 CF Shen et al. / Vaccine 37 (2019) 6996–7002
106 sel / mL 2,5 10 6 sel / mL. Namun, peningkatan lebih lanjut dalam kepadatan sel menjadi 5,0
106 sel/mL mengakibatkan penurunan titer virus alih-alih perbaikan.
CF Shen dkk. / Vaccine 37 (2019) 6996–7002 7001
bioreaktor disimpan dalam labu kocok sebagai kontrol bioreaktor (BioR-CTL 6.8E6). Secara
paralel, sel yang ditumbuhkan dalam labu kocok (belum pernah berada di bioreaktor) dengan
penggantian media juga terinfeksi sebagai kontrol labu kocok (SF-CTL-6E6). Kultur yang
terinfeksi di atas dari bioreaktor atau labu kocok juga diencerkan dengan media segar hingga 1
106 sel/mL sebagai referensi (BioR-CLT-1E6 dan SF-CTL-1E6).
terinfeksi pada 6 106 sel/mL menunjukkan hampir satu log lebih tinggi
dari pada kultur kontrol yang terinfeksi pada 1 10 6 sel/mL (BioR-CTL-
1E6 dan SF-CTL-1E6). Ini jelas menunjukkan bahwa kultur perfusi
dikombinasikan dengan infeksi pada kepadatan sel yang tinggi adalah
pendekatan yang layak untuk meningkatkan produksi virus volumetrik.
4. Kesimpulan
Hasil eksperimen dari penelitian ini menunjukkan bahwa sel Vero
yang melekat berhasil beradaptasi untuk tumbuh dalam suspensi dalam
media bebas serum yang dikembangkan sendiri. Sel-sel yang
diadaptasi suspensi mempertahankan stabilitas genetiknya dan tidak
ditemukan bersifat tumorigenik. Sel-sel yang diadaptasi ini dapat
digunakan untuk produksi virus dengan hasil tinggi, seperti VSV, dalam
kepadatan sel yang tinggi dan dalam kultur suspensi dengan biaya
produksi yang lebih rendah.
Ucapan Terima Kasih
Para penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr. John Bell
(The Ottawa Research Hospital Institute, Ottawa, Ontario) atas
pemberian virus VSV yang murah hati. Kami sangat menghargai
dukungan Stephane Lanthier untuk operasi bioreaktor, dan Mélanie
Leclerc untuk pekerjaan kultur Vero. Penghargaan juga diberikan
kepada Dr. Jamie L Almeida di Institut Nasional Standar dan Teknologi
(Gaithersburg, MD) untuk analisis STR sampel sel Vero. Penulis juga
berterima kasih kepada Dr. Lakshmi Krishnan, Rhonda Kuo Lee dan
Stacey Nunes atas dukungannya dalam manajemen proyek dan diskusi
dengan kolaborator kami.
Deklarasi Kepentingan Bersaing
Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki konflik
kepentingan. References
[1] Almeida JL, Hill CR, Cole KD. Authentication of African green monkey cell lines using
human short tandem repeat mark. BMC Biotechnol 2011;11:102. [2] Barrett PN, Berezuk G,
Fritsch S, Aichinger G, Hart MK, El-Amin W, et al. Efficacy, safety, and immunogenicity of a
Vero-cell-culture-derived trivalent influenza vaccine: a multicentre, double-blind, randomised,
placebo controlled trial. The Lancet 2011;377(9767):751–9.
[3] Chen A, Poh SL, Dietzsch C, Roethl E, Yan ML, Ng SK. Serum-free microcarrier based
production of replication deficient influenza vaccine candidate virus lacking NS1 using Vero
cells. BMC Biotechnol 2011;11:81.
[4] Delagrave D, Oubelaid R, Hamberger J. Compositions and Methods for the Production of
Alpha-Herpesviruses. United States Patent 8,877,492 B2; 2014.
 [5] Elahi1 SM, Shen CF, Gilbert R. Optimization of Production of Vesicular Stomatitis Virus
(VSV) in suspension serum-free culture medium at high cell density. J Biotechnol
2019;289:144–9.
[6] FDA. Points to consider in the characterization of cell lines used for the production of
biologics; 1993. <https://www.fda.gov/media/76255/download> [accessed 28.06.2019].
[7] Genzel Y. Designing cell lines for viral vaccine production: Where do we stand? Biotechnol
J 2015;10:728–40.
[8] Kaerber G. Beitrag zur Kollektiven Behandlung Pharmakologischer Reihenversuche. Arch
Exp Path Pharmacol 1931;162:480–7.
[9] Kolell K, Padilla-Zamudio J, Schuchhardt B, Gilliland S, McNorton S, Dalton B, et al. Virus
production in Vero cells using a serum-free medium. In: Smith R, editors. Cell technology
for cell products. Dordrecht: Springer; 2007. hal. 583–5.
[10] Knezevic I, Stacey G, Petricciani J, Sheets R. Substrates W. Evaluation of cell substrates
for the production of biologicals: revision of WHO recommendations. Report of the WHO
Study Group on Cell Substrates for the Production of Biologicals, 22–23 April 2009,
Bethesda, USA. Biologicals 2010;38:162–9.
[11] Liu CC, Lian WC, Butler M, Wu SC. High immunogenic enterovirus 71 strain and its
production using serum-free microcarrier Vero cell culture. Vaccine 2007;25:19–24.
[12] Logan M, Aucoin M. Media formulation to support the growth of Vero cells in suspension..
Proceedings of vaccine technology VII conference, June 17-22, Mont Tremblant, Quebec,
Canada, 2018.
[13] Madeline B, Ribaud S, Xenopoulos A, Simler J, Schwamborn K, Léon A. Culturing a duck
es-derived cell line in single-use bioreactors: a rapid, efficient, and cost-effective vaccine
manufacturing system based on suspension culture.. Bioprocess Int 2015;13(3):26–33.
[14] Morrow KJ, Sha M. Vero Cell-based Vaccine Production: Rabies and Influenza Cell lines,
Media and Bioreactor Options. Review Article. 2013. <https://online
shop.eppendorf.us/US-en/eshopdownload/downloadbykey/93796_186> [accessed
29.11.2018].
[15] Nahapetian AT, Thomas JN, Thilly WG. Optimization of environment for high density Vero
cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in
metabolites. J Cell Sci 1986;81:65–103.
[16] Peschel B, Frentzel S, Laske T, Genzel Y, Reichl U. Comparison of influenza virus yields
and apoptosis-induction in an adherent and a suspension MDCK cell line. Vaccine
2013;31:5693–9.
[17] Rourou S, Ark A, Velden T, Kallel H. A microcarrier cell culture process for propagating
rabies virus in Vero cells grown in a stirred bioreactor under fully animal component free
conditions. Vaccine 2007;25:3879–89.
[18] Rourou S, Zakkour MB, Kallel H. Adaptation of Vero cells to suspension culture and rabies
virus production on different serum free media.. Proceedings of vaccine technology VII
conference, June 17-22, 2018, Mont Tremblant, Quebec, Canada, 2018.
[19] Souza MC, Freire MS, Schulze EA, Gaspar LP, Castilho LR. Production of yellow fever
virus in microcarrier-based Vero cell cultures. Vaccine 2009;27:6420–3. [20] Stojdl DF, Lichty
BD, tenOever BR, Paterson JM, Power AT, Knowles S, et al. VSV strains with defects in their
ability to shutdown innate immunity are potent systemic anti-cancer agents. Cancer Cell
2003;4:263–75.
[21] Thomassen YE, Rubingh O, Wijffels RH, Leo A, van der Pol LA, Bakkera WAM. Improved
poliovirus d-antigen yields by application of different Vero cell cultivation methods. Vaccine
2014;32:2782–8.
[22] Yang J, Guertin P, Jia G, Lv Z, Yang H, Ju D. Large-scale microcarrier culture of HEK293T
cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Exp 2019;9:70–83.