Toxi Temas 11-13

TEMA
11: FACTORES QUE AFECTAN A LA TOXICIDAD
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FACTORES QUE MODIFICAN LA TOXICIDAD
La toxicidad depende de la naturaleza del xenobiótico, la dosis y la duración de la exposición:
o Factores que dependen del individuo: especie, raza, sexo, edad, estado nutricional /
dieta, enfermedades.
o Factores genéticos: polimorfismos genéticos.
o Factores ambientales: físicos y psicosociales.
o Interacciones químicas y bioquímicas, inducción, activación y inhibición enzimática.
o Factores derivados de las condiciones de absorción del tóxico: vía de absorción, dosis y
velocidad de absorción.

1. FACTORES QUE DEPENDEN DEL INDIVIDUO
o Especie
o Raza, cepa o individuo
Reservados todos los derechos.

o Sexo
o Edad: recién nacido y ancianos
o Estado hormonal o gestacional
o Estado nutricional y la dieta
o Enfermedades

1.1 ESPECIE
Diferentes especies responden de forma similar ante un tóxico. Este hecho utiliza para
extrapolar los estudios toxicológicos realizados sobre algunos mamíferos el hombre. Las
especies más similares a el hombre: mono, rata y cerdo.

Determinados tóxicos muestran diferente toxicidad en diferentes especies. Este hecho
representa un grave problema en la determinación de dosis tóxicas en experimentación animal
y su extrapolación al hombre.

En cuanto a las diferencias más importantes, destacan, las que encontramos en lisa reacciones
de biotransformación. Debemos diferenciar:
o Biotransformaciones de fase I presentan diferencias de tipo cuantitativo.
- Las diferencias más importantes son las que observamos entre los cit p450 de
distintas especies (este sistema producía entre otras cosas los hepóxidos y
reactivos electrófilos que hemos visto en otros temas).
- Diferencia en hidroxilación aromática e hidrólisis à Ejemplo: carnívoros à o-
hidroxilación > p-hidroxilación
o Biotransformaciones de fase II presentan diferencias de tipo cualitativo (debido los
azúcares y aminoácidos empleados).
- Carnívoros conjugan con ácido glucurónico
- Herbívoros con aminoácidos (glicina)
- Omnívoros: las 2 vías en la conjugación con aminoácidos.
• El hombre conjuga con glicina
• Réptiles y aves con ornitina
• Insectos con arginina

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Comparación humano-rata
o Los humanos son más sensibles que las ratas a los efectos negativos que produce sobre
la salud varios metales tóxicos.
o A diferencia de la rata, el hombre no puede autosintetizar la vitamina C.
o Los niveles y la velocidad de recambio del GSH eritrocitario en el hombre son inferiores
a los de la rata.
o Los humanos carecen de algunas de las enzimas antioxidantes protectoras que si
tienen las ratas y otros mamíferos.
o Los humanos son más susceptibles a las sustancias oxidantes que las ratas.


Ejemplo: en el caso del BHA y BHT, sustancias que se utilizan
como antioxidantes sintéticos, en el hombre no producen
respuesta tóxica, pero en la rata pueden provocar hiperplasia
en una parte determinada de su estómago (forestomach)

Tóxico Mecanismo responsable Respuesta tóxica
BHA y BHT Presencia de forestomach (parte del estómago Hiperplasia del forestomach
concreta de los rumiantes) en la rata

1.2 RAZA, CEPA, INDIVIDUO
En este caso, hablamos de diferencias entre individuos, cepas o razas de una misma especie.

De este modo, a la hora de realizar ensayos clínicos debemos tener en cuenta las posibles
variaciones interindividuales entre distintas ratas, cepas o razas de una misma especie animal
(entre las que se incluye a los humanos).

Ejemplo: respuesta inducida por diferentes sustancias en diferentes cepas de ratones de
laboratorio. De este modo, en el caso de la sacarina:
o La cepa S-ruego-Dawley es resistente a su
acción sobre la vejiga urinaria.
o La cepa Wistar es susceptible a la acción de
la sacarina.

1.3 SEXO
La dotación hormonal, que distingue 2 sexos, hace que el metabolismo sea distinto para machos
y hembras. De este modo, las hormonas sexuales, estrógenos, estimulan la síntesis de varias
enzimas y producen diferencias en el metabolismo entre y :
o Si las enzimas están implicadas en la eliminación de los tóxicos à ¯ toxicidad
o Si las enzimas producen bioactivación à toxicidad

Ejemplos: en el caso de la rata, podemos encontrar distintas diferencias en función del sexo de
las mismas.
o En el caso del paratión observamos que las hembras lo van a metabolizar más rápido,
produciendo su bioactivación à toxicidad en hembras.
o En el caso de las sulfanilamidas, los machos las
acetilan más rápido y por tanto las inactivan de
forma más veloz à toxicidad en hembras.
o En el caso de cloroformo, que causa
nefrotoxicidad y formación de radicales libres
por el citocromo p450 (mayor presencia en
machos) à toxicidad en machos.
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Asimismo, encontramos diferencias en función del sexo, no
solo en las ratas, sino también en otros animales como el perro,
conejo, humano, gato…

Por último, desequilibrios hormonales no sexuales como
hipertiroidismo, hiperinsulinismo, adrenalectomía, etc.,
pueden modificar, también, de forma notable la respuesta a
ciertos tóxicos

1.4 EDAD
En general, edades extremas presentan mayor sensibilidad frente a los tóxicos
o Bebé/neonatos: para la mayoría de tóxicos, los neonatos y bebés presentan una
toxicidad entre 1,5 y 10 veces mayor que en los adultos (sobre todo debido a
diferencias en el sistema enzimático).
- Absorción:
• Vaciado gástrico lento à Al estar los movimientos peristálticos
disminuidos, el fármaco pasa más tiempo en el tubo digestivo,
aumentando su fase de exposición y permitiendo que los niveles de
tóxico aumenten en el plasma.
• ↑ Absorción intestinal à Está aumentada ya que la mucosa está en
proceso de formación y permite el paso de sustancias que en el adulto
no se absorberían (ejemplo de la producción de algunas alergias o

intolerancias alimentarias).
• ↑ Absorción cutánea à Sustancias que en el adulto tienen una acción
local, pueden llegar a producir en neonatos o bebés una acción
sistémica.
• ↑ Absorción percutánea à Debido a que la relación superficie
corporal/masa es muy elevada y a que la capa córnea no está
completamente formada.
- Distribución:
• ↑Proporción agua à Esto va a provocar que
tengan un ↑ Vd, por lo que las concentraciones
que se alcancen serán más bajas.
• ↓ Proteínas plasmáticas à Esto va a provocar que
la fracción libre sea más elevada (y, por tanto, la
fracción de susceptible de causar toxicidad).
• BHE inmadura àSi la barrera hematoencefálica es
ineficaz se observa mayor efecto tóxico en el SNC.
- Eliminación:
• Sistema enzimático completo a las 8 semanas à Por lo que detoxifican
más lento o son incapaces en el caso de algunas sustancias
(produciendo acumulación de sustancias tóxicas, que aumentan su
concentración en el organismo y, producen, en consecuencia, mayor
toxicidad).
• ↓ filtración y secreción renal à Mayor acumulación de sustancias
tóxicas, que aumentan su concentración en el organismo y, producen,
en consecuencia, mayor toxicidad.

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o Tercera edad: tienen la mayoría de funciones disminuidas a causa de la edad.
- Absorción:
• ¯ Movimientos peristálticos Tiempo de exposición
• Retraso en el vaciado gástrico
• pH estómago à Menor capacidad de inactivar algunos tóxicos.
• Mucosa intestinal atrofiada à Menor absorción.
- Distribución:
• ¯ Volumen cardíaco/min à ¯ Irrigación en los tejidos.
• ¯ Proteínas plasmáticas à Esto va a provocar que la fracción libre sea
más elevada (y, por tanto, la fracción de susceptible de causar
toxicidad).
• ¯ Proporción agua/lípidos à Fármacos liposolubles tenderán a
acumularse (¯ Vd)
- Excreción:
• Capaciadad de biotransformación/metabolización más reducida
(menor síntesis de enzumas).
• Hígado pierde funcionalidad y tamaño.
• ↓ flujo renal (1'5% / año)
• Deterioro en filtración y secreción, por tanto ↓ eliminación renal à
Mayor acumulación de sustancias tóxicas, que aumentan su
concentración en el organismo y, producen, en consecuencia, mayor

toxicidad.
Factores que afectan a la disposición de los tóxicos y varía con la edad
En general, hay menos metabolización en edades extremas.
o Absorción:
- Disminución de la superficie de absorción
- Disminución de la motilidad gástrica
o Distribución:
- Disminución del agua total del cuerpo
- Diminución de la masa proteica corporal
- Aumento de la proporción de grasa
- Disminución del flujo cardíaco
- Disminución de la albúmina sérica
o Metabolismo
- Disminución de la masa hepática
- Disminución de la irrigación hepática
- Cambios en la actividad enzimática
o Excreción
- Disminución de la irrigación renal
- Disminución de la filtración glomerular
- Disminución de la secreción tubular

Ejemplos: observamos diferentes respuestas frente a los tóxicos
en función de la edad

El DDT (un insecticida) actúa a nivel de la BHE, por lo que está al
no estar del todo formada en los neonatos provoca que tenga un
efecto muy tóxico y que se alcancen dosis mucho más elevadas.


1.5 ESTADO NUTRICIONAL-DIETA
La exposición a tóxicos a través de la dieta, aire y agua puede modificar la respuesta tóxica. De
este modo, el estado nutricional, la dieta y patologías asociadas a déficits de determinados
nutrientes pueden producir variaciones en la respuesta a diferentes tóxicos.

Como ejemplo, podemos poner que el paracetamol es más toxico en individuos alcohólicos o en
este cuadro observamos la actividad de las monooxidasas de acción mixta (citocromo p450 –
reacción de fase I) en función del déficit de determinados nutrientes:

Déficit de: Actividad de la MFO (monooxidasa de función mixta)
Ácidos grasos esenciales Disminuye
Proteínas Disminuye (aumenta la incidencia de tumores)
Carbohidratos (glucosa) Aumenta
Vitamina A, C y E Disminuye
Tiamina Aumenta

Safrol, flavonas, xantinas, Inductores fuertes
índoles, BPC, DDT, etc.

Asimismo, podemos destacar que la presencia de alimentos puede condicionar la
manifestación tóxica en función del xenobiótico. Como ejemplo:
o Los organofosforados se absorben más en dietas elevadas en grasas
o Mientras que los metales pesados se absorben más en ayunas.

1.6 ESTADOS PATOLÓGICOS-ENFERMEDADES
Los estados patológicos y enfermedades influyen especialmente en el metabolismo y la
excreción.

De modo, que aquellas enfermedades que afecten a los órganos encargados de metabolizar o
excretar afectarán de forma más intensa a la variación de toxicidad producida por el tóxico.

Como ejemplo, aquí encontramos factores que afectan a la toxicidad de los xenobióticos y que
varían con los estados patológicos:
Biotransformación Enfermedad
Órganos excretores
Órganos metabolizadores Hepatitis, cirrosis, necrosis, nefritis, etc.
Circulación hepática y renal
Vías respiratorias Asma

1.7 FACTORES QUIRALES DEL METABOLISMO
Un centro quiral en una sustancia da lugar a isómeros (imágenes especulares, cis-trans, de
posición, conformacionales, etc.) que pueden seguir rutas metabólicas diferentes e influenciar
sobre la su toxicidad.

En el caso de la isomería cis-trans, normalmente:
o Las formas cis son menos tóxicas (ya que el organismo es capaz de metabolizarlas mejor
à ¯ t1/2)
o Mientras que las formas trans son más tóxicas (ya que el organismo es capaz de
metabolizarlas peor à t1/2)

Ejemplo: esto se ve muy bien en el ejemplo en que observamos el tiempo de semivida de un
producto del metabolismo del benzopireno por acción del citocromo p450.
o La t1/2 de la forma cis es de 0,5 minutos (residirá
menos en el organismo y, por tanto, provocará
menos toxicidad)
o La t1/2 de la forma trans es de 8 minutos
(residirá más en el organismo y, por tanto,
provocará más toxicidad)

FACTORES GENÉTICOS
Los efectos fisiopatológicos producidos por xenobióticos no siempre se reproducen fielmente
en todos los individuos y en diferentes circunstancias.

Así, junto los efectos considerados normales, nos encontramos con otros inesperados,
anormalmente exagerados o disminuidos.

Polimorfismo
Se define como el tipo de variación en la que coexisten individuos con características muy
diferentes como miembros normales de una población.

Desde el punto de vista genético, se define como la aparición en una misma población de 2 o +
alelos en un mismo locus, cada uno de ellos con una frecuencia variable.

En otras palabras, un polimorfismo genético es la aparición de un determinado gen y de su
producto, de la que la variante menos común tiene almenos una frecuencia poblacional del
1%. Es decir, son formas hereditarias alternativas distinguibles entre sí.

Gen mutante à modificación beneficiosa para la supervivencia à se selecciona

Población: equilibrio estable o transitorio

Los poliformismos son debidos a que tenemos población en un estado intermedio de evolución,
de modo que, estas variaciones se quedarán en la población o directamente se eliminarán
(“selección natural”), seleccionándose las más adecuadas.

Podemos encontrar poliformismo en genes que determinan enfermedades graves, que en
combinación inclusivo heterocigótica, son muy frecuentes y pueden llegar confiar resistencia a
las mismas à Heterosis (ventaja de heterocigoto).

Podemos encontrar diversos lugares en el organismo donde podemos encontrar poliformismo:
o Grupos sanguíneos
o Enzimas eritrocitarias
o Proteínas plasmáticas
o Antígenos de histocompatibilidad.

Se estima que aproximadamente el 30% de los genes humanos presentan polimorfismos.


Diferencias genéticas
Los poliformismos los vamos a encontrar en:
A. Diferencias genéticas que afectan al metabolismo
- N- acetiltransferasa (NAT)
- Sistema oxidativo microsómico (cit P-450)

B. Diferencias genéticas para la sensibilidad del tejido
- Anemias (talasemia)
• Anemia hemolítica por diferencia de G-6PDH
• Anemia falciforme
- Otros: no talasemia
• a-1-antitripsina (AAT)

A. DIFERENCIAS GENÉTICAS QUE AFECTAN AL METABOLISMO
Los polimorfismos genéticos enzimáticos implicados en el metabolismo de los xenobióticos
producen variaciones en la biotransformación por lo que van a provocar variaciones
interindividuales toxicocinéticas y toxicodinámicas à Pueden ser variaciones en la naturaleza
y/o cantidad de enzimas.

Implicaciones toxicológicas à podemos tener 3 tipos de casos:
1. Tóxico à metabolito inactivo.
a. Individuos con sistemas enzimático deficiente à Susceptibles

b. Individuos normales que sufren una exposición simultánea a otra sustancia
inhibidora (se comporta como deficiente) à Fenocopiados (individuo o grupo
de individuos de una población que, careciendo de un genotipo dado, posee el
mismo fenotipo que aquel que sí posee dicho genotipo).
2. En individuos con un sistema enzimático deficiente, se incrementa la vía alternativa
generando un producto reactivo à Susceptibles
3. Tóxico à metabolito reactivo
- Individuos normales à Susceptibles

N-acetiltransferasa (NAT). Fenotipo acetiladores
Los NAT son enzimas que se encargan de transferir grupos acetil (Acetil-CoA) a aminas
aromáticas. Se caracterizan por:
o La acetilación requiere un agente conjugando, que es el Acetil-CoA.
o El producto puede ser menos soluble que el agente inicial.
o A nivel celular, estar presentes en citosol, mitocondrias y RE.
o A nivel sistémico, estar presentes en hígado, mucosa gástrica y glóbulos blancos.
o Presentan 2 genes:
- NAT 1: ubicua (presente en todos los tejidos)
- NAT 2: hígado e intestino

El mecanismo consiste en el acetilación de la enzima, seguida de la adición del sustrato y la
transferencia del grupo acetilo al sustrato.

Debemos destacar, que se trata de una enzima que presenta poliformismos genéticos. De modo,
NAT 1 y NAT 2 difieren marcadamente en la actividad y especificidad en función de si son:
o Acetiladores rápidos
o Acetiladores lentos à se asocian a un mayor riesgo tóxico (ya que este se metaboliza
más lentamente y, por tanto, aumentan sus concentraciones y reside más tiempo en el
organismo).

Ejemplo: la isoniazada es un fármaco (que, si se somete a
una exposición elevada, puede causar un efecto
neurotóxico) que es biotransformado en el hígado por la N-
acetiltransferasa a acetilsoniazida.

Asimismo, este producto da lugar por oxidación
microsomal dependiente del citocromo p450 a un
metabolito reactivo. Este metabolito reactivo en función de
si se acetila por acetiladores rápidos o lentos puede dar
lugar a un efecto secundario:
o Si los acetiladores son rápidos à se producen intermediarios que generan
hepatotoxicidad (t1/2 = 1 hora (Japón, esquimales)).
o Si los acetiladores son lentos à puede provocar un mayor riesgo tóxico por la
acumulación y, en consecuencia, exposición prolongada de la isoniazada en el
organismo (t1/2 = > 3 horas (Oriente Medio, 90% árabes)).

Sistema oxidativo microsómico (Citocromo p-450)
El citocromo p450 es un sistema multienzimático/superfamília de hemoproteínas que se
caracterizan por:
o Hemoproteinas con Fe
o Cataliza la mayoría de las oxidaciones de los xenobióticos.
o Enzimas de membrana REL

o Se encuentran en hígado, intestino, riñón, etc.
o Equivalentes reductores: NADPH y O2
o Enzimas: citocromo P-450-NADPH reductasa y citocromo
P-450
Está formado por una superfamila de genes constituida a su vez

por familias y subfamilias:
o 74 familias à 14 están en mamíferos.
o 20 subfamilias à 20 se encuentran en el genoma
humano.

De este modo, la codificación es muy sensible a distintos factores por lo que pueden dar lugar
a distintos poliformismos. Los factores que pueden condicionar la expresión de genes son:
o Especie (cualitativo y cuantitativo)
o Edad
o Alimentos
o Medio ambiente

El gen que regula la expresión de un determinado enzima del CIT-P450 puede expresar-se en
forma de dos fenotipos (debido a los poliformismos genéticos):
o Metabolizadores normales
o Metabolizadores lentos


B. DIFERENCIAS GENÉTICAS QUE AFECTAN AL TEJIDO
o Anemias (talasemia): anemia hereditaria de tipo hemolítico de incidencia étnica,
familiar y ordinariamente mediterránea.
- Anemia hemolítica por diferencias de G-6PDH: en los glóbulos rojos la G-6PDH
regula el NADPH por la vía de las pentosas fosfato. La ruptura de esta vía
supone la pérdida de viabilidad del glóbulo rojo.

El NADPH permite que el glutatión (detoxifica especies reactivas del oxígeno
como ahora H2O2) esté en su forma reducida (forma activa), de modo que, el
glóbulo rojo queda protegido frente al ataque de sustancias antioxidantes
(xenobióticos, como ahora la divicina o el isouracil).
• Reacción de detoxificación: H2O2 + 2-GSH à 2H2O + GSSG


Ahora bien, existe una patología de la cuenca mediterránea y de Oriente Medio
que se caracteriza por producir polimorfismos que reducen la enzima en un
10%, provocando la pérdida de glóbulos rojos (anemia). Los efectos tóxicos son:
• Anemia hemolítica, metahemoglobinemia
• Hemoglobinuria, ictericia, cianosis
• Fiebre

Cabe destacar, también que:
• Es más frecuente en el sexo masculino y raza negra
• Es más grave en lactantes y niños

- Anemia falciforme o drepanocitosis: debido a una mutación genética la
hemoglobina de tipo S (normalmente heS heS - homocigoto, en este caso heA
heS - heterocigoto) en la posición 6 de la cadena b tiene cambiada la glutamina
por valina. Esto da lugar a glóbulos rojos con forma de hoz, con un aspecto muy
rígido y calciforme (ya que esto provoca una disminución de la solubilidad).

De este modo, estos glóbulos faclciformes forman tapones en los vasos
sanguíneos, causando daño a los tejidos de los órganos como cerebro, bazo y
extremidades. Puede producirse toxicidad del tipo:
• Palas valía
• Dificultad en la respiración
• Cansancio
• Dolor

La mutación puede ser inducida por sustancias oxidantes, poco oxígeno,
septicemias, meningitis, etc.

En este sentido, los estudios muestran que en las
zonas donde el paludismo o malaria era o es un
problema, los individuos que heredan un solo
alelo de la hemoglobina S —y que por tanto son
portadores del rasgo de la célula falciforme—
tienen una ventaja para sobrevivir sobre los
individuos con genes de globina normales. Es
decir, el genotipo heS heA (heterocigoto)
proporciona resitencia a la malaria.

o Otros: no talasemia
- a-1-antitripsina (AAT): se trata de una enzima proteolítica del hígado. El 90% de
la fracción es a-1-globulina. Puede producir:
• Protección de liberación de elastasa (macrófagos y linfocitos)
• Enfermedad pulmonar hepática grave.
• Fumar incrementa el riesgo

2. FACTORES MEDIAMBIENTALES
1. Físicos:
- Temperatura
- Radiaciones
- Presión atmosférica

- Ritmos circadianos
2. Psicosociales:
- Aislado o en comunidad
- Predisposición: intoxicaciones voluntarias (Suicidios, drogadicción, etc.).

2.1 FÍSICOS

Temperatura ambiental
Influye en la velocidad de las reacciones químicas y en la
vasodilatación superficial alterando la cantidad de tóxicos que
llega a receptores.

Los cambios de temperatura ambiental afectan los procesos
toxicocinéticos y toxicodinámicos.

Irradiación solar
o Aumenta las reacciones de hipersensibilidad
o La irradiación y la temperatura elevada movilizan el Pb del tejido óseo.
o La intensidad de la luz aumenta la incidencia de tumores en la piel.


Presión atmosférica
o Influye sobre la absorción y excreción de gases y vapores tóxicos a nivel pulmonar.
o La influencia de los cambios de la presión atmosférica sobre la toxicidad de los
xenobióticos se atribuye a la alteración de la tensión del oxígeno más que a un efecto
directo de la presión.
o La reacción de los tóxicos sobre los receptores es más intensa a menor tensión de
oxígeno.
o Ejemplo: la ingestión de alcohol en alta montaña, provoca mayor grado de embriaguez
en descender en la base de esta.

Ritmos circadianos
Los ritmos circadianos influyen con las oscilaciones periódicas dia
y año por las variaciones de niveles hemáticos de hormonas.

El más conocido es el relacionado con las variaciones cíclicas de las
hormonas sexuales.

Ejemplo: se alcanzan mayores alcoholemias cuando se bebe la
noche, Entre las 20 y las 10 horas.
2.2 FACTORES PSICOSOCIALES

El individuo puede mostrar diferente comportamiento ante un mismo tóxico si está aislado o

en comunidad.

En comunidad los individuos presentan predisposición a determinadas situaciones que pueden
modificar la toxicidad.
- Respuesta terapéutica antimalárica diferente según la influencia de factores biológicos
y sociales.
- El cansancio físico altera la función digestiva
- Influencia del ruido sobre la respuesta tóxica
- Ritmos psicológicos
• ≠ condiciones físicas, psíquicas e intelectuales Tiempo psíquico
• ≠ ansiedad y amabilidad.

En este sentido:
• La fiebre o excitantes (mescalina, anfetamina, LSD, hormonas tiroideas ...)
aceleran metabolismo y T corporal, el tiempo psíquico pasa muy rápido
• Por el contrario, los tranquilizantes y antitiroideos disminuyen la temperatura
corporal y retrasan el "tiempo endógeno".

- Modificaciones rítmicas del comportamiento: agresividad y violencia con picos en
primavera y verano, relacionado con ciclos lunares
- Conexión entre la luz y la función de la glándula pineal, que produce melatonina
(secreción cíclica)
• Acopla a numerosas funciones metabólicas y endocrinas de carácter
circadiano y ciclo periódico
• Desacopla cuando se alteran los períodos noche / día, o por largos viajes en el
avión, que alargan o acortan el día "jet lag".


TEMA 12.- PROCEDIMIENTOS DE EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA. ESTUDIOS DE EFECTOS
GENERALES: TOXICIDAD, AGUDA SUBRCÓNICA Y CRÓNICA
INTRODUCCIÓN
TOXICOLOGÍA EXPERIMENTAL-ESTUDIOS TOXICOLÓGICOS
Legislación: Cualquier sustancia del mercado requiere previamente un estudio amplio de las
características físicoquímicas, analíticas, toxicológicas y ecotoxicológicas.
Seguridad: el hombre es el centro de interés. Evaluación del grado y tipo de toxicidad (riesgo)
a partir de los datos obtenidos en la experimentación in vivo y in vitro
Evaluación de la seguridad requiere de la identificación de los efectos tóxicos potenciales,

disponer de información toxicológica adecuada para determinar los niveles seguros para el

consumidor o las exposiciones que disminuyan al máximo el peligro o riesgo para el
consumidor.
EVALUACIÓN DE TOXICIDAD
Objetivo: evaluar el riesgo o peligro potencial que un agente químico o físico puede ocasionar
sobre la salud humana cuando es objeto de exposiciones agudas o crónicas".
Aguda: única exposición con dosis elevada

Crónica: dosis bajas durante periodos muy largos
1) Conocer la toxicidad, efectos y mecanismos de acción de los xenobióticos sobre los seres
vivos
2) Evaluar riesgo de exposición en la población
3) Combatir los efectos tóxicos
EJEMPLO
Talidomida, fármaco antiemético que alrededor de los años 60-70 provocó

efectos secundarios ya que produce la deformación de las extremidades o la falta de
las mismas en bebés.
Se había ensayado en animales de experimentación en los cuales no presentaba

efectos. Sin embargo, posteriormente se vio que en otras especies animales como en
el conejo sí que producía efectos de deformación en los bebés.
Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE), 1981 «Principios de

Buenas Prácticas de Laboratorio BPL»
Conjunto de reglas, procedimientos operativos y prácticas establecidas y promulgadas que se

consideran de obligado cumplimiento para asegurar la calidad e integridad de los datos
obtenidos en determinados tipos de estudio de investigación y análisis.
Modificado por la UE (Directivas 67/548/CEE; 87/18/CEE;2004/10/CE) y los países miembros (RD

822/1993; RD 1369/2000).
PRINCIPIOS DE BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO (BPL)
Promover la calidad y validez de los datos de ensayo por medio de un sistema por el
que pueden ser auditados.
Promover la aceptación internacional de los datos de ensayo para propósitos de
requisitos de regulación.
Ahorrar tiempo y recursos
Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT)
Protocolos escritos que describen cómo debe realizarse los estudios en cada laboratorio.
REQUISITOS
Personal: Capaz y cualificado, al menos un veterinario y

personas capaces de tratar al animal y mantenerlo en
condiciones de seguridad y salubridad adecuadas según la
legislación
Métodos operativos:
! Protocolos
Tipo y número de animales
Vía de administración

Programa de dosificación y exposición (al tóxico)
Procesos funcionales y / o patológicos
! Registros, Archivos
! Animales
Estirpe normalizada (garantías), hay empresas que se dedican
exclusivamente a la producción de animales de experimentación
Prohibido animales errantes/domésticos
Estabulación independiente de especies (no ratas y ratones por
ejemplos en los mismos biomedios)
Instalaciones
! Estabulario
Pasillos independientes de "servicio" y "limpios"
Paredes, techos y suelos sin rincones ni grietas
Temperatura: Roedores: 20-24ºC, otros: 15-21ºC que depende de la
especie con la que trabajemos
Humedad: 55% ± 10 (límites: 40-70%)
Ventilación: 15-20 renovaciones/h y adecuada; no debe haber
corrientes ni recirculación de aire
Iluminación uniforme, en fases de 12 horas de luz y 12h de oscuridad
Máximas prácticas higiénicas del personal (tipo quirófano) el personal
que entra debe ir totalmente equipado (bata únicamente para entrar
al estabulario, gorro, guantes,
! Cuarantenas: Roedores: 5-15 días; otros: 20-30 días
! Supervisión sanitaria: Personal competente titulado, para que el animal esté en
buenas condiciones tanto higiénicas como de seguridad.
! Espacio mínimo por animal: Alimento y cama: Controlados
! Dispositivos de alarma: Para casos de incendio, fallos de ventilación.

! Otros:
Programa de lavados y esterilizaciones del estabulario
Reducción máxima del sufrimiento de los animales
El trabajo con animales SPF o GF incrementa exigencias de esterilidad
(aire, cama, alimentos, etc.)
EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD O EFECTOS ADVERSOS
1. Estudios relación estructura química-actividad (QSAR)
Simulaciones computacionales que se va a introducir en un programa de ordenador.
En el programa la estructura química de la molécula a investigar va a adoptar su forma

tridimensional y haciendo uso de una base de datos muy potente de sustancias las cuales ya se
conoce sus efectos tóxicos, mecanismo de acción, características fisicoquímicas a partir de ahí
establece una relación y un efecto tóxico.
2. Estudios retrospectivos
Son estudios que se hacen en humanos haciendo uso de bases de datos, aunque es difícil
establecer relación causa-efecto tóxico.

Es la fuente más valiosa pues se está haciendo un estudio con el fin de extrapolar la toxicidad
en humanos. De manera que si hay datos de toxicidad en el hombre sabremos qué efectos va
a producir.
Sin embargo, estos estudios retrospectivos tienen un problema y es que las bases de datos se
van generando conforme se van obteniendo datos y el individuo que expresa un efecto tóxico
va a tener unas condiciones de exposición diferentes a otro.
De forma que la relación entre causa y efecto se establece, pero las condiciones para tales
efectos varían de forma que condicionan el resultado.
Un ejemplo: en un estudio se relaciona el tabaco con el cáncer de pulmón, bien podemos asociar
personas que tienen cáncer de pulmón y fuman y personas con cáncer que no fuman pero en la
base pueden faltar parámetros como enfermedades crónicas ajenas, problemas respiración Es
decir en la base de datos falta información dificultando el establecimiento de la relación causa y
efecto
3. Métodos alternativos a la experimentación animal
4. Ensayos experimentales con animales
Último paso, estos estudios se realizan desde el siglo XVIII. Son ensayos empleados
desde hace siglos con el fin de evaluar la toxicidad y ver que sustancia es tóxica para el
hombre, ya que el animal es una especie similar al hombre.
En 1927, el biólogo británico Trevan, estandariza y sistematiza ensayos con animales

para la determinación de la toxicidad aguda. Se establecen unas pautas y se lleva a
cabo de la misma forma el ensayo así los resultados obtenidos serán los mismos
independientemente de donde o quien los haga.

En estas pautas:
! Condiciones controladas de la especie, có

! Utilización previamente a la comercialización de un producto o sustancia a analizar,
pues si deseo que la sustancia sea segura debo hacer ensayos antes de lanzarla al
mercado asegurando que no es tóxica
! Establecimiento cuantitativo entre exposición respuesta, básicamente es establecer
a que dosis se obtienen una respuesta de manera que en el caso que se utilice de forma
regular calcular la dosis a la cual no tiene toxicidad.
ENSAYOS EXPERIMENTALES CON ANIMALES
Los animales son los modelos más fiables para extrapolar los resultados a los humanos. Sin
embargo, tiene su dificultad para establecer la relación con el hombre y extrapolar los
resultados.
La respuesta del animal varía, aunque seamos todos mamíferos somos muy diferentes. Los
mecanismos de acción son distintos y sobre todo, se trata de especies diferentes lo que
complica la extrapolación. Para extrapolar se debe tener en cuenta parámetros obtenidos con
los estudios de toxicología y aplicación de factores de incertidumbre.
Sacarina:

En la especie Wistar de rata macho: Tumor de vejiga
proliferación celular urotelial
En humanos, y otras especies de roedores: ratón,
hámster, cobaya y otras especies de rata: No se
produce la proliferación celular.
Siendo todo especies de mamíferos, cuando vamos a extrapolar es muy diferente lo que
establece una serie de condiciones a la hora de realizar los estudios
Los ensayos de toxicidad en animales se apoyan en dos principios fundamentales (Eaton y

Klaassen, 1996):
1) Los efectos que los tóxicos producen en animales de experimentación son extrapolables a
humanos. "Dosis por unidad de superficie corporal".
Se ha observado que, si comparamos el dato obtenido y lo extrapolamos aplicando un
factor de incertidumbre el resultado más próximo obtenido entre el animal y el hombre es
cuando nos referimos a la dosis por unidad de superficie corporal.
Sin embargo, cuando vemos estudios la mayoría se relaciona por el peso corporal, pero es
mejor la superficie.
2) La exposición de animales de experimentación a dosis altas de agentes tóxicos es un método

válido para descubrir posibles riesgos en humanos.
La razón de la utilización de dosis altas es debido a que se trata de determinar si una
sustancia es tóxica para el hombre y lo evaluamos en un animal de experimentación en un
tiempo limitado y una población limitada (Por ejemplo, 5 animales reciben dosis y vemos
si produce efecto o no).
De manera que al extrapolarlo al hombre lo hacemos con una concentración más baja pero
la población sobre la cual se hace el estudio es mucho mayor. Con el fin de compensar que

la población de estudios de animales es pequeña y tiempo limitado se le da una dosis más
alta.
Los estudios en animales de experimentación son los que mejor se relacionan con los
resultados que vamos a observar en el hombre.
La tabla indica cuales son los parámetros que se evalúan o se tienen en cuenta y el valor de

LEGISLACIÓN SOBRE EL USO DE ANIMALES EN EXPERIMENTACION
1875: Parlamento británico "Cruelty Animal Act". Se trataba de una ley que intentaba proteger
a los animales de la experimentación mal realizada, generando una serie de normas debido a:
Presión de las protectoras de animales

Mayor sensibilización de la sociedad
Científicos estandarizar protocolos y evitar sufrimiento del animal.
Con este objetivo Russel y Burch sacaron los principios de las tres R
Métodos alternativos Principios de las 3R (Rusell y Burch, 1959) Recogidos en la Directiva
86/609 / EEC
Reducción del número de animales de experimentación siempre que sea posible

Refinamiento (RD 1201/2005) del método y técnicas para que el animal no sufra o que
si ha de hacerlo sea lo menos posible por ejemplo se incluyen fármacos analgésicos y
anestésicos
Reemplazo de los ensayos que utilizan animales por otro método que no emplee
animales siempre que sea posible
En España estas directivas se transponen con este real decreto Real Decreto 53/2013, sobre
protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, incluyendo
la docencia.
Garantizar que el número de animales utilizados se reduzca al mínimo y se evite al

máximo el dolor, sufrimiento o lesión, prolongados innecesariamente.
Fomentar la puesta a punto de métodos alternativos que puedan aportar el mismo
nivel de información que el obtenido en procedimientos con animales y que suponen
una menor utilización de los mismos.
Reglament CE 1223/2009 productes cosmètics (11/07/2013) Ningún producto

cosmético puede usar animales de experimentación, pues desde el 2013 los
productos cosméticos usan métodos alternativos
La creaci n de una red de comit s nacionales de bienestar y puntos de contacto
nacionales de coordinaci n para la implementaci n de las normas de protecci n y de los
m todos alternativos se crea el Comit español para la protecci n de animales utilizados con
fines cient ficos.
El toxic logo tiene el deber moral de diseñar experimentos para obtener la mayor información
posible a partir del menor número de animales.
Se deben comenzar los estudios de toxicidad con m todos alternativos, confirmarlos y

ampliarlos mediante ensayos con animales.
Métodos retrospectivos
QSAR

In vitro
Ex vivo
In silico, Etc.

ENSAYOS TOXICÓLOGICOS. DISEÑO
CONSIDERACIONES EN EL DISEÑO DE UN ESTUDIO TOXICOLÓGICO CON ANIMALES
1. Propiedades físico-químicas de la sustancia a estudiar

2. Especie animal de experimentación
3. Número total de animales de experimentación
4. Selección de la vía de administración del agente tóxico
5. Tiempo de duración del estudio toxicológico
6. Estudio estadístico de los datos obtenidos
1. Propiedades físico-químicas de la sustancia a estudiar
Buscar información sobre la sustancia a evaluar, ya sea por base de datos u otros métodos
pero se deben que conocer las características:
Propiedades de estabilidad, solubilidad, electrofilia, reactividad química,
condiciones de manipulación y almacenamiento, etc.
2. Especie animal de experimentación

Animales pequeños, considerándose como tales ratas, ratón, cobaya, hámster y
conejo.

Se suelen emplear animales que crezcan y reproduzcan rápido, requieran poco
alimento, espacios pequeños con el fin de poder trabajar más fácilmente
Más de una especie y ambos sexos, pues a veces especies parecidas
dan resultados diferentes
Bioterio de garantía, ejemplares sanos, cepas estabilizadas,
alimentación apropiada y escrupulosa higiene
Dependiendo del tipo de estudio hay una especie de elección y especies

alternativas
TIPO DE ESTUDIO ESPECIE DE ELECCIÓN ESPECIE ALTERNATIVA

Toxicidad aguda Rata, ratón
Toxicidad por dosis Roedor (rata), no roedor Ratón, mono
repetidas (perro)
Carcinogenicidad Rata, ratón
Mutagenicidad in vivo Ratón Rata
Desarrollo y reproducción Rata, conejo Ratón, hámster, mono
Neurotoxicidad Rata Ratón
Inmunotoxicidad Ratón, cobaya Rata
Irritación piel y ojos Conejo
Se recomienda:
Especies más parecidas al hombre y vías metabólicas similares.
Por las diferencias interespecie: mínimo 2 especies diferentes

Roedores para ensayos de desarrollo y reproducción: gestación corta, alta tasa de
fertilización y amplias camadas
3. Número total de animales de experimentación

El número de animales normalmente está protocolizado.
Se obtiene a través de la campana de Gauss probabilidad individuo se comporte de la
misma manera.
Se considera:
Sensibilidad de la población
Utilizar siempre un grupo control
Si son estudios de larga duración o carcinogénesis: grupo control y grupo positivo
(se le administra una sustancia que tenga el efecto que estamos estudiando, para
compararlo pues a lo mejor no aparece tempranamente el efecto) Por ejemplo Ej:

la vitamina A se usa en estudios de teratogenia
4. Selección de la vía de administración del agente tóxico

La vía de administración depende de:
Tipo de producto
Vía de absorción en el hombre
Vía oral se utiliza por: sonda esofágica, con la comida o
bebida.
Dependiendo de la vía se suele emplear una especie u otra:

Oral y parenteral: rata, perro, raro ratón (sonda muy pequeña)
Tópica: conejo
Sensibilidad: cobaya, ratón
5. Tiempo de duración del estudio toxicológico

Los ensayos de toxicidad tienen que durar un determinado tiempo que varía según el tipo
de ensayo.
Toxicidad aguda: 1 única dosis, se espera hasta dos semanas para ver el resultado
Toxicidad subcrónica (periodo de latencia)
Toxicidad prolongada: dosis durante máximo 90 días
Toxicidad crónica: dosis mínimo 90 días, máximo 2-5 años
6. Estudio estadístico
Estudió estadístico para determinar si la distribución de la respuesta de los grupos tratados
difiere de los obtenidos en el grupo control.

ENSAYOS TOXICOLÓGICOS TIPO
ENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA
Toxicidad aguda es la capacidad de una sustancia para producir un efecto adverso con una única
dosis.
Se utilizan para obtener la CL50 o CE50, saber la naturaleza de los efectos tóxicos, la relación
dosis-respuesta, es el riesgo por exposiciones a dosis elevadas al tóxica y si las diferencias entre
las diferentes especies y el sexo.
CATEGORÍA DE PELIGRO DE TOXICIDAD AGUDA Y ESTIMACIONES DE LA TOXICIDAD AGUDA

(ETA; Reglamento 1272/2008)
Se estableció una categoría para establecer la toxicidad, en función de la dosis que produce el

efecto.
Según la vía de exposición (tabla) va a tener una clasificación de la toxicidad en distintas

características en función de la CL50.
Vía de exposición Categoría 1 Categoría 2 Categoría 3 Categoría 4
Oral (mg/kg pc*) ETA < 5

Cutánea (mg/kg 200 < ETA
pc*)
Inhalación de
gases (ppmV)
Inhalación de
vapores (mg/l)
Inhalación de 1 < ETA
polvos y nieblas
(mg/l)
Potencialidad de los tóxicos
La toxicidad aguda se experimenta mediante una única dosis,

por lo que nos permite comparar entre sustancias
Si comparamos entre dos sustancias, A y B, determinamos la DL50.

Aquella que menor DL50, será la requiera menos dosis para el mismo
efecto por tanto presentará mayor toxicidad, mayor potencia.
También permite la comparación entre especies, lo que nos indica cual

es la más sensible.
Se han diseñado para ensayar una concentración máxima, que es la que establece categoría de
menor toxicidad. La selección de la dosis inicial hasta 2000 mg/kg (5000mg/kg) tiene la
suficiente toxicidad mínima para ir sumando y detectar la elevada
En algunos ensayos sí que se permite que se busque la toxicidad
máxima. En la directiva de OCDE 401 para la determinación de
la CE50 en rata: 5 animales/sexo/dosis
Eliminación de la ley en 2001 por métodos alternativos: reducción del número de animales
y de 1 único sexo (normalmente hembra) Alternativas: e "in vitro"
Se diferencian 3 tipos de ensayos en función de la vía de administración en los que establecen
diferentes legislaciones y protocolos.
Vía oral Directrices de la OCDE / Regulación 440/2008/EC

! Procedimiento de la dosis fija (FDP). Reducción y refinamiento Directriz 420
! Método de la clase tóxica aguda (ATC). Reducción Directriz 423
! Procedimiento arriba abajo (UDP). Reducción Directriz 425
Reduce el número de animales porque se utiliza un único animal sobre el
que se inyecta una dosis. Si no surge efecto se le administra una dosis
mayor y así sucesivamente. Si el efecto que produce es la muerte, se utiliza
otro animal disminuyendo la dosis.
Vía inhalatoria Directrices de la OCDE / Regulación 440/2008/EC

! Método ATC. Refinamiento y reducción. Proceso de adaptación Directriz
436
! toxicidad inhalatoria aguda. Refinamiento y reducción. Proceso de adaptación
Directriz 403
Toxicidad aguda dérmica

! In vitro cosméticos (no se pueden utilizar animales de experimentación)
Reglamento 1223/2009 -
En estos ensayos se determina
DL intermedia
DL min (produce signos tóxicos)
DL máx causa la muerte en el 100% de los animales
Se busca la DL50
Observaciones 24h -14 días Se realizan 14 d as de observaci n tras administrar el t xico.

Despu s de los 14 d as es cuando se sacrifica el animal. Durante esos 14 d as se controlan cuanto
come, cuanto bebe, se hace an lisis de sangre, orina, etc...
Al mes: sacrificio, necropsia y estudio histológico
Requisitos
Observación previa de los animales y selección por pesos.

Mantener a todos los animales en ambiente idéntico (7 días antes del ensayo)
Administrar el tóxico a la misma hora, para evitar influencias ambientales y ritmos
circadianos.

PROCEDIMIENTO DE DOSIS FIJA
El ensayo aceptado para toxicidad aguda es el ensayo de procedimiento de la dosis fija.
Utilizamos un único animal (reducción) le administramos una dosis de 5mg/kg.
Resultado
A. Si se muere se clasifica al t xico en la categor a 1 parada del estudio

B. Hay toxicidad evidente, es decir la toxicidad se manifiesta se pasa al estudio principal
C. Sin evidencia de toxicidad, no hay toxicidad manifiesta ni muerte se continua con la
siguiente dosis (más elevada) en la escala
Una vez que hemos seleccionado la dosis que produce una toxicidad manifiesta la
seleccionamos para el estudio principal que se realiza con 5 animales.
Resultados:
A. Si mueren 2 o más animales (clasificación tipo 1) interrupción del ensayo por razones
de bienestar.
B. Si muere más o igual a 1 animal o hay signos de toxicidad en más o igual a 1 animal
(clasificación tipo 2) toxicidad evidente
C. Sin evidencia de toxicidad pasa a la siguiente dosis de la escala

PROCEDIMIENTO DE LA CLASE TÓXICA AGUDA
El preliminar se inicia con 3 animales, pero en el estudio en el que se ha seleccionado la dosis
se utilizan 3 hembras y 3 macho.
Se empieza el estudio con las hembras pues son las más sensibles.
A. Si 2 o 3 hembras mueren pasamos a una dosis más baja (ya que empezamos con

dosis 50mg/kg).
B. Si muere una o ninguna hembra se sigue el estudio con animales machos
I. Si mueren 2 o 3 machos pasamos a un estudio con una dosis más baja
II. Si muere uno o ningún animal sigue el estudio a dosis mayores
*Mirar esquemita <3
ESTUDIOS DE TOXICIDAD DE DOSIS REPETIDAS: TOXICIDAD SUBCRÓNICA Y CRÓNICA
Se trata de estudios donde se administra la dosis al animal de forma constante:
Los estudios de toxicidad a corto o medio plazo 14-28 días (subaguda) y

(subcrónica ~ 10% vida animal) en roedores
Los estudios a largo plazo deben 3 meses, toxicidad crónica
Estudios especiales (únicamente en ratas o ratones) para determinar el potencial

tumorigénica (efectos carcinogénicos) deben hacerse durante la vida entera del roedor
(1,5 ó 2 años)
Siempre que sea un estudio de toxicidad para productos farmacéuticos debe

ensayarse en 1 especie roedores y otra no roedora: perro (beagle) o primate
no humano (babuino, tití, macaco)

ESTUDIOS DE TOXICIDAD DE DOSIS REPETIDAS
Se utilizan para determinar:
Efectos tóxicos crónicos

Efectos primarios en órganos, identificación de órganos diana y sistemas Estos par metros se
potenciales. hacen para hacer
Establecer el NOEL nivel máximo sin efecto observable evaluaci n de
riesgos.
Establecer el LOEL nivel mínimo con efecto observable
Las dosis elegidas tienen que ser subletales, pero producir efectos tóxicos.
La dosis umbral es la dosis por debajo de la cual no hay efecto, si vemos el parámetro NOAEL
podríamos pensar que es lo mismo.

La diferencia entre NOEL y el umbral, la NOEL siempre es una dosis máxima sin efecto de las
que he dado a un animal en un estudio experimental, mientras que el umbral es cuando yo
dibujo la gráfica respuesta-dosis y saco un valor extrapolado (no experimental) que siempre
estará por encima del NOEL
Consideraciones:
El protocolo de trabajo debe pasar por un comit tico

Buenas prácticas de laboratorio.
Vehículo depende de la vía de administración.
! Inyección: solución salina
! Sólidos: metilcelulosa, carbometilcelulosa, aceite, polietilenglicol entre 0.1-1%
Tipo de formulación, dosis y ruta de administración (= humano)
Dosis: dosis aguda ayuda a la selección de la dosis subaguda, ésta a la subcrónica y ésta
a la crónica. Se basa en el LOEL y la dosis máxima tolerable.
Se administra una:
! Dosis baja: exposición en humano no tóxica
! Dosis media: LOEL esperada
! Dosis alta: dosis que reduce en 10% peso corporal o niveles plasmático con
máximo efecto
Animales
Animales: rata (para cáncer ratón). perro y primates no humanoides (para fármacos). Misma
edad y peso (1 lote = control)
Ensayo agudo se utilizan menos animales que en un ensayo subcrónico. Se observan

diferentes comportamientos, los hábitos, si bebe si come si duerme. S ehacen anaítiicas
urinarias, donde se recogen orina y heces. Finalmente en la necropsia y sacrificio se
analizan distintos parámetros
Ensayo subagudo: se utilizan roedores 10 sexo/grupo, o 2-3 perros
Ensayo subcrónico: se emplean roedores 10-20 sexo/grupo, o 3-8 perros
Durante el ensayo se realiza la observación de los animales: peso corporal, consumo de agua y
comida, analítica urinaria semanal.
Después del periodo de observación se realiza
sacrificio y necropsia: signos clínicos, análisis
hematológico y bioquímico, órganos,
histopatología. etc
RESUMEN
ESTUDIOS DE TOXICIDAD AGUDA
Vías de administración depende de la absorción en
el hombre
2 especies
Método por clase tóxica aguda, método de dosis fija
y up-down
Estudio histológico
DL50 o efecto adverso DLmin/ DLmax
Muerte: 24 h ó 14 días
ESTUDIOS DE TOXICIDAD SUBAGUDA, SUBCRÓNICA Y CRÓNICA
A medio y corto plazo "Subaguda, subcrónica" 14, 28 ó

A largo plazo "Crónica 3 meses, hasta años
! Varias especies de animales, ambos sexos

! De 3 niveles de dosis: dosis sin efecto a dosis con efecto tóxico
! Determinación NOAEL y LOAEL
! Vía oral, inhalatoria y cutánea
! Analítica urinaria, hematológica y bioquímica al inicio, semanal y final
! Estudio anatomopatológico a finales del ensayo
ÍNDICES DE TOXICIDAD
Ensayos de toxicidad aguda

! DL50, CE50, CL50, CI50
Dosis repetidas
! NOAEL
! LOAEL
Límites tolerables de exposición:
NOAEL
IDA, TDI, RFD
FACTORES DE SEGURIDAD
*El parámetro más importante es el NOAEL se divide por un factor de seguridad que se va a
extrapolar al hombre.
*La diferencia entre NOEL y NOAEL, es que la A se refiere a efecto adversos y si solo hay E nos
referimos a cualquier efecto

ESTUDIOS ESPECIALES
Efectos de interacción
Efectos sobre la piel
Efectos sobre los ojos
Efectos sobre diversos sistemas
Carcinogénesis
Teratogénesis
Mutagénesis
Efectos sobre la reproducción/y desarrollo
etc

TEMA 13: ENSAYOS DE EFECTOS ESPECÍFICOS: PIEL, OJOS Y OTROS (PIRÓGENOS Y
NEUROTOXICIDAD)

TOXICIDAD AGUDA: ENSAYOS SOBRE PIEL Y OJOS
Los ensayos de toxicidad aguda clásicos, fueron se caracterizaban:
o Agresividad de los métodos (test Draize)
- En el test Draize de irritación ocular se aplican soluciones de productos
directamente en los ojos de conejos conscientes, generalmente sin
administración de analgésicos. Esto provocaba en los conejos una serie de
reacciones adversas (dolor, úlceras, inflamación, hemorragias, ceguera, etc.)
que eran observadas y anotadas. Asimismo, se les inmovilizaba durante el
tiempo de duración del estudio para que no pudieran rascarse o lavarse.
- Asimismo, ocurría en el test Draize de irritación cutánea, en que los productos
se inyectaban directamente en la piel de los conejos y se buscaban señales de

edema y eritema.
o Dificultad en reproducibilidad de estudios con animales
o Dificultad de demostrar efectos nocivos leves à Estos test a veces no son capaces de
detectar las sustancias potencialmente tóxicas ya que puede haber hasta cinco veces
de diferencia en la capacidad de absorción de la piel de otros animales y la de los
humanos.
o Dificultad de extrapolación con los seres humanos

Estas pruebas son muy polémicas y son vistas como crueles tanto por la comunidad científica
como por las sociedades protectoras de animales y consumidores, que presionaron para
realizar métodos alternativos (in vitro e in vivo), siguiendo las normas de las 3R (reemplazar,
reducir y refinar), para realizar este tipo de ensayos.

Reglamento CE 1223/2009 productos cosméticos (07/11/20123) à En este sentido, cabe
destacar que, en los estudios sobre productos cosméticos, los ensayos deben ser exentos de
animales (lo que da lugar a cierta dificultad, porque es complicado sustituir totalmente al
animal).

1. ENSAYOS SOBRE PIEL
Los ensayos de piel se realizan sobre sustancias irritantes-corrosivas y estudian distintos tipos
de efectos en la zona de contacto:
1. Irritación y corrosión dérmica
2. Sensibilización cutánea Determinación efectos tópicos y sistémicos
3. Fototoxicidad (absorción)

1.1 ENSAYOS DE IRRITACIÓN Y CORROSIÓN CUTÁNEA
Tienen como objetivo determinar si los productos son irritantes o corrosivos (evalúan la
gravedad y reversibilidad del efecto):
o Irritante dérmico: daño reversible de la piel tras la aplicación de una sustancia durante
4 h. Al ponerse en contacto con una sustancia química irritante, se desencadena un
proceso de inflamación, liberándose mediadores y produciéndose una respuesta
inflamatoria. Ahora bien, al pasar un período de 14 días, la piel se observa intacta (ya
que el proceso ha revertido).
o Corrosivo dérmico: daño irreversible (necrosis y visible de la epidermis y dermis) tras la
aplicación de una sustancia durante 4 h. Las reacciones corrosivas se caracterizan por
úlceras, hemorragias, costras sanguinolentas y, al cabo de 14 días de observación,
observaremos cambio de coloración por palidez de la piel, zonas completas de alopecia
y cicatrices.

Reglamento CE 440/2008 (OCDE directriz 440) à Este reglamento establece un protocolo que
se debe seguir en la realización de ensayos de irritación y corrosión cutánea (se aplican las 3R).
Este reglamento es importante ya que establece que no se pueden realizar pruebas in vivo hasta
evaluar todos los datos sobre el potencial de corrosión / irritación in vitro.

El protocolo a seguir consiste:
1. Realizar estudios retrospectivos en humanos y animales. Es decir, realizar una
búsqueda de estudios anteriores sobre la sustancia que debemos evaluar.
2. Establecer una relación estructura-actividad. Se trata de un estudio donde se relaciona
la estructura química con el efecto mediante un modelo computacional (modelo de
predicción).
3. Se realiza una medida del pH:
Si el pH ≤2,0 à ácidos fuertes Esto indica, semejanza estructural a
- Si el pH ≥11,5 à bases fuertes sustancias irritantes o corrosivas
4. Evaluación de toxicidad sistémica por vía cutánea.
5. Ensayos de corrosión cutánea in vitro o ex vivo validados y aceptados. Los ensayos in
vitro, consisten en la utilización de cultivos de células reconstituidas humanas, mientras
que los ex vivo, consisten en sacrificar al animal y realizar el ensayo con su piel (con el
objetivo de evitar el sufrimiento). En ambos casos, los resultados se extrapolan al

hombre.
6. Ensayos de irritacióń cutánea in vitro o ex vivo validados y aceptados.
7. Ensayos in vivo con 1 animal.
8. Pruebas de confirmación con más animales Estos pasos no se realizan en cosméticos

Se debe tener en cuenta que, si en cualquier paso del protocolo se determina que la sustancia
es corrosiva o irritante, se detiene el ensayo. Es decir, el protocolo se sigue, mientras que no se
detecte corrosividad o irritabilidad en los efectos de las sustancias.

Ensayo in vivo
Un tóxico irritante severo por sus características físico-químicas o detectado en ensayos in
vitro no se ensaya con animales (con el objetivo de evitar el sufrimiento del animal).

Este ensayo se caracteriza por:
o Animal à Conejo albino
- Sin pigmentación, gran superficie dorsal y de espalda.
- Muy sensible a irritación y corrosión
- Machos y hembras (nulíparas o no grávidas).
o Método à se utiliza 1 conejo albino (se reduce el número):
1. El día anterior se afeita o rasura al animal.
2. Se aplica la sustancia.
3. Se cubre la piel con un parche y/o banda oclusiva y se colocan con un collarín.
4. Se mantienen en estas condiciones durante 4 h.
5. Eliminación del parche, banda oclusiva y cualquier resto de la sustancia.
6. Evaluación a 1, 24, 48 y 72 h según clasificación numérica, en la que se compara
la zona tratada con la control (la zona del animal no tratada actúa como control).
7. A partir de las 72 h:
- Si existe irritación à se observan hasta 14 días (para ver si revierte el
efecto)
- Si no existe irritación à se finaliza el estudio.

El grado de irritación dérmica se numera del 0-4 y se evalúa según la tabla que se dispone en la
parte inferior. Se pretende estudiar la aparición de edema y eritema, que puede ir acompañado
de hinchazón, descamación, fisura, decoloración, formación de escamas, exfoliación,
ulceración y necrosis.


Ensayo in vitro à Reemplazo parcial del test de irritación de Draize (conejo albino: directriz
de la OCDE 404).

Se trata de un ensayo que utiliza piel reconstituida humana. Así, se utilizan cultivos celulares de
piel tridimensionales (test EpiSkin) con el objetivo de:
o Imitar la función de la barrera estrato córneo
o Imitar las características morfológicas, bioquímicas y funcionales de la piel.

Esto se consigue, cultivando los queratinocitos humanos en una interfase aire/líquido unidos
a una matriz biológica (dermis o una matriz de colágeno) y se forma una epidermis diferenciada

con una capa de estrato córneo.
El procedimiento para obtener el cultivo es el siguiente:

1. Las células de la piel adultas (queratinocitos) se añaden a una placa que contiene una
matriz de colágeno.
2. La muestra se sumerge en un medio que contiene agua, azúcares, aminoácidos y las
células empiezan a crecer.
3. Tras 3 días, las células de la superficie/interfase se ponen en contacto con el aire
durante 10 días (con el objetivo que se sequen y creen una capa áspera similar a la piel
real.
4. Tras los 10 días, se someten a luz UV con la intención de que el estrato córneo adquiera
su vejez característica (alcanzando un espesor de 1,5 mm).
5. En este momento, el cultivo se encuentra listo para testar cosméticos.


Reemplazo del test irritación dérmica (directriz de la OCDE 439) y tests corrosión dérmica
(conejo albino: Directriz de la OCDE 404; directivas de la OCDE 430, 431

Encontramos distintos tipos de ensayos que nos van a permitir evaluar la irritación y la corrosión
de distintas sustancias. Se nombran a continuación, junto con su correspondiente directriz:
o D7561/2009/CE à Ensayos de irritación dérmica:
- Epi Skin Irritation Test (SIT) à de elección en cosméticos
- EpiDerm Skin Irritation Test (SIT)
- SkinEthic Skin Irritation Test (SIT)
- epiCS Skin Corrosion Test (SCT)

o D440/2008/CE à Ensayos de corrosion dérmica:
- OECD TG 430 à Rat Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER) à Ex vivo.
Como hemos dicho anteriormente, en estos casos se sacrifica al anima y se
recoge la piel (sana y permeable) y al aplicar la sustancia a testar se observa la
integridad y permeabilidad de dicha piel. En este caso, se realiza la medida de
un parámetro de resistencia eléctrica para saber si la permabilidad o integridad
de la piel ha varido.
- EpiSkin Corrosion Test (SCT)
- EpiDerm Skin Corrosion Test (SCT)
- SkinEthic Skin Corrosion Test (SCT)
- epiCS Skin Corrosion Test (SCT)

- Corrositex

1.2 ENSAYOS DE SENSIBILIZACIÓN CUTÁNEA
Los ensayos de sensibilización cutánea tienen como objetivo determinar la capacidad de un
producto de producir o no reacciones de hipersensibilidad (sensibilización).

Ensayo in vivo
o OCDE 406 (1992) à Estudio de alérgenos y alergia de contacto:
- Animales:
• 10 cobayas o ratones/dosis (5 control)
• Machos y/o hembras (nulíparas y no grávidas)
- 2 métodos:
• Test de maximización de cobaya (GPMT: guinea pig maximisation test)
à Se administra con un coadyuvante, denominado de FREUND, (por
vía IV) para potenciar la reacción de sensibilización cutánea (con el fin
de obtener un resultado más rápido), lo que implica cierto sufrimiento
por parte del animal.
• Test Buehler (sin coadyuvante).
- Procedimiento:
1) Fase de inducción: se utiliza el producto con (14 días) o sin el
coadyuvante (25-30 días). Durante esta fase, se producto se aplica de 2
formas distintas: inicialmente por vía intradérmica y, el día 7, por vía
tópica, en la misma zona de la piel.
2) Fase desencadenante: 7 días después (a los 21 días, si se utiliza
coadyuvante) de terminar la fase de inducción se aplica la sustancia
durante 24 horas por vía tópica en otro lugar al de la inducción.
3) Observación: se realiza la lectura (se valora la aparición o no de edema)
tras retirar el apósito a las 24, 48 y 72 horas (importante comparar con
un grupo control)

o La OCDE 442a y 442b à Método LLNA (n.ódulos linfáticos) à Estudio de la alergia de
contacto.

Se trata de un método alternativo al anterior, que trata de aplicar los conceptos de
reducción (menos animales en el estudio) y refinamiento (menor sufrimiento).
- Reducción: de los animales de experimentación (de 10 à 4)
- Refinamiento: se reduce el dolor y el estrés del animal (no se utiliza coadyuvante
y se pueden utilizar analgésicos)

Es un estudio en el que se determina la capacidad de un determinado producto de
inducir la proliferación de linfocitos en los nódulos linfáticos que drenan el área donde
se aplica el producto. Se realiza en ratones de cepas específicas (CBA).
- Animales:
• 4 ratones/dosis de las cepas CBA/Ca o CBA/J nulíparas y no grávidas.

- Procedimiento:
1) Aplicación de la sustancia durante 3 días consecutivos (3 dosis/grupo +
control)
2) El día 6, se inyecta de 3H-timidina (nucleótido marcado
radioactivamente que se une al DNA y nos permitirá observar la
proliferación de linfocitos).
3) Sacrificio del animal y extracción de los nódulos linfáticos.
4) Determinación de 3H-timidina (”luciferasa”) à Se determina la
relación entre la proliferación y el efecto que produce la sustancia sobre
la sensibilidad de la piel del animal. Se considera que una sustancia
produce alergia de contacto, cuando el nivel de DNA encontrado en los
nódulos es 3 veces superior al habitual.

1.3 ENSAYOS DE FOTOTOXICIDAD CUTÁNEA
La fototoxicidad es la respuesta tóxica producida por una sustancia aplicada al cuerpo en dosis
bajas después de la exposición posterior a luz. O, la respuesta tóxica que es inducida por
irradiación de la piel tras la administración sistémica de una sustancia.

Es decir, es un tipo de reacción cutánea inflamatoria que se produce como consecuencia de la
exposición a una sustancia química en combinación con la exposición a radiaciones lumínicas.
La irradación se produce en la zona del UV-A (l=320-400 nm).

De este modo, la fototoxicidad va tener diversos efectos:
o Inhibición de la reparación de las células de la piel.
o Alteración de la función protectora epidérmica.
o Supresión del sistema inmune.

Asimismo, en función del tipo de fototoxicidad se van a producir unos
síntomas o manifestaciones característicos: Fotosensibilidad en pacientes
o Toxicidad aguda: vesículas y enrojecimiento tratados con amiodarona
o Toxicidad crónica: hiperpigmentación y engrosamiento de la zona (antiarrítmico).
afectada

Además, puede causar fotosensibilidad, que se define como una reacción cutánea patológica a
la luz, generalmente a la radiación ultraviolada (UV) que se manifiesta como una quemadura
solar o erupción.

Ensayos clásicos
El proceso de los ensayos consiste en:
1. El animal de experimentación se expone a la sustancia.
2. Se aplica la radiación UV.
3. El compuesto químico sufre una excitación (cargándose de energía). *En caso de que
vaya a producir fototoxicidad.
4. Al volver a su estado normal, la energía liberada causa un daño en la piel.
5. Finalmente se observa si se producen los distintos efectos o manifestaciones
mencionadas con anterioridad, para poder determinar que el compuesto es fototóxico.

Alternativa “in vitro” à R 440/2008/CE OCDE 432 (2004) à Ensayo de Rojo Neutro
o Se trata de un ensayo de fototoxicidad aguda.
o Evalúa la irritación de la piel inducida por una
sustancia química que requiere luz para iniciar los efectos tóxicos.
o Reemplazo: reemplaza los animales de ensayo, por alternativas “in vitro”

Es un ensayo in vitro en cultivo celular que utiliza células 3T3. La citotoxicidad se evalúa por
medio de la captación de rojo neutro después de la exposición a la sustancia de ensayo (y luz

o no).

El método se basa en la comparación de la citotoxicidad de una sustancia química cuando se
prueba en presencia o ausencia de exposición a una dosis no citotóxica de luz solar simulada
(es decir, luz ultravioleta). La citotoxicidad en este ensayo se expresa como una reducción
dependiente de la concentración de la captación del colorante vital rojo neutro cuando se mide
24 horas después del tratamiento con el producto químico de ensayo y la irradiación de la luz.

La sustancia química expuesta a la irradiación puede alterar la superficie celular y causar una
disminución de la captación y la fijación del colorante rojo neutro. Las diferencias en esta
captación (medida con espectrofotómetro) permite distinguir y cuantificar entre células
viables, dañadas o muertas.



PIF: Compara la IC50 células expuestas a oscuridad y IC50 células expuestas a la luz (se necesita
en 2 casos obtener IC50).

MPE: Compara la respuesta a la dosis en un intervalo de concentraciones.

2. ENSAYOS SOBRE OJOS
Los ensayos en ojos se realizar para determinar si los productos son irritantes o corrosivos.
Debemos tener en cuenta, que estos ensayos no se realizan si los ensayos en la piel resultan
positivos (ya que se asume que causarán, también, irritación o corrosión en los ojos).

Podemos distinguir entre:
o Irritación ocular: alteraciones en el ojo, después de la aplicación de una sustancia de
ensayo en la superficie anterior del ojo, completamente reversibles en los 21 días
siguientes a la aplicación (es decir, a los 21 días, las alteraciones han desaparecido).
o Corrosión ocular: lesión tisular en el ojo o grave reducción física de la vista, tras la
aplicación de una sustancia de ensayo en la superficie anterior del ojo, que no son
completamente reversibles en los 21 días siguientes a la aplicación (es decir, a los 21
días, aún existe lesión tisular).

Asimismo, los ensayos sobre ojos también tienen como objetivos:
o Determinar lesiones en la conjuntiva, córnea y el iris
o Evaluar la estructura y función de los ojos
o Aplicación vía sistémica: examen ocular

Cabe detacar, las lesiones oculares, al tratarse de fenómenos complejos, requieren la realización
de más de 1 ensayo.

Ensayos in vivo

OCDE 405 (2012): Irritación/corrosión aguda en ojo
Se realiza un ensayo alternativo, en el que se aplican los conceptos de reducción y refinamiento
al test de Draize (que estudia la irritación ocular).

Este ensayo se caracteriza:
o Animal: conejo albino
- Se utilizan 3 animales
o Procedimiento:
1. Aplicación de la sustancia a un ojo (mientras que el otro ojo ejerce de
control), subiendo los párpados 1-2 segundos.

2. Evaluación microscópica a distintos tiempos de exposición: 1, 24, 48 y 72 h
según la clasificación numérica.
3. A las 72 h:
• Si existe irritación à observación hasta 21 días (para ver si revierte el
efecto)
• Si no hay irritación à se finaliza el estudio.

o Parámetros a observar:
- Se evaluará el grado de reacción ocular (conjuntiva, córnea e iris).
- Observaremos si se produce hinchazón, inflamación del iris, ulceración,
sangrado, deterioro masivo y ceguera.
- Otras lesiones oculares (pannus, manchas, efectos sistémicos adversos)

Debemos destacar, que se trata de un ensayo alternativo, hecho observable en las siguientes
modificaciones:
o Reducción: se reduce el número de animales de experimentación (ahora se utilizan 3 o
1, mientras que antes se realizaban con 9).
o Refinamiento (evitar el sufrimiento):
- Aplicación de la sustancia a menor concentración.
- Tratamiento previo con anestésicos.
- Lavado después de la aplicación de la sustancia potencialmente tóxica.


Ahora bien, debemos tener en cuenta en la realización del ensayo:
o Nos debemos asegurar de que no existen datos previos.
o Primero se deben realizar ensayos de irritación y corrosión in vivo (OCDE 404) e in vitro
en piel. Porque en caso que sean positivos, se descartará la realización de los mismos
en los ojos (ya que se asumirán las sustancias como irritantes o corrosivas oculares.
o Refinamiento: uso de anestésicos (propacaína, tetracaína) y analgésicos (bupermorfina;
si los ensayos in vivo son necesarios)
o Utilizar solo 1 animal (severidad y reversibilidad) si es posible.
o Si la sustancia es corrosiva o irritante severa: parar el ensayo. Si no, continuar con
ensayos de confirmación.

Ensayos de corrosión e irritantes severos oculares (in vitro)

OCDE 460 (2012): Fluorescein Leakage Test Method for Identifying Ocular corrosiva and Severe
Irritantes
El test de la fluoresceína es un método in vitro en que se sustituye al animal de
experimentación (reemplazo).

El ensayo identifica sustancias corrosivas oculares solubles en agua e irritantes severos
clasificados en categoría 1 por las NU, GHS, UE y la EPA. En esta categoría se incluyen sustancias
que producen corrosión irreversible en el tejido ocular o que presenta irritación persistente en
córnea más de 21 días.

El proceso consiste en utilizar un cultivo celular en monocapa en placas transwel: separación
entre dos cámaras, apical (A) y basal (B).

La base del cultivo tiene una matriz permeable, donde se disponen y se siembran las células.
Las células utilizadas son células caninas de riñón (MDCK = Madin-Darby Canine Kidney), ya que
simulan el epitelio corneal (poseen el mismo tipo de unión = uniones epiteliales).



De este modo, se dispone una monocapa en la parte apical del pocillo y se adiciona la sustancia
a testar. A continuación, se bombardea con un marcador fluorescente (fluoresceína). Así:
o Si la sustancia daña las uniones entre las células MDCK
à Aumenta la permeabilidad de la monocapa y la
fluoresceína pasa a través de la monocapa (aumenta
fuga de A→B) llegando al compartimento o cámara
basal. En este caso, se tratará de un irritante ocular.
o Si la sustancia no daña de las uniones entre las células
MDCK à La membrana estará perfectamente
constituida y la fluoresceína no atravesará la
monocapa.


Así, analizaremos la parte basal de la cámara, para observar si la fluoresceína ha atravesado la
monocapa.

OCDE 437 (2013): Ensayo de permeabilidad y opacidad de la córnea bovina (BCOP) y OCDE 438
(2013): Ensayo en ojo de pollo aislado (ICE).
o Ambos protocolos son aplicables a sustancias de categorías 1 para el GHS y la EPA, y
R41 según la UE.
o Si da positivo se clasifica la sustancia como "Sustancia corrosiva o irritante severa" y no
se continuó con animales. Si el resultado es negativo continuar con conejos.

*Classif SAM=GHS. SAM= sistema harmonizado mundial; GHS= Globally Harmonised System R41
Riesgo de lesiones oculares graves

El ensayo de opacidad y permeabilidad en cornea de bovino (BCOP), es un método validado por
la OECD que emplea como equipos de lectura un opacímetro y un fotómetro para evaluar la
opacidad y la permeabilidad respectivamente, evitando así una evaluación subjetiva y
clasificando correctamente el nivel de toxicidad de la sustancia evaluada. Para realizar este
ensayo se requieren ojos frescos de ganado entre 12 y 60 meses de edad.

La técnica BCOP permite la evaluación de muestras líquidas y sólidas, que serán diluidas a una
concentración previamente establecida y aplicadas sobre el globo ocular, la sustancia a evaluar
permanecerá en contacto con la córnea por un tiempo de entre 5 a 10 minutos y se retirará
lavando con agua para finalmente realizar la lectura de opacidad y permeabilidad (la
permeabilidad se analiza con una sustancia fluorescente). Un cambio en la medida de la
opacidad del globo ocular indicará daños a nivel proteico.

Los efectos tóxicos para la córnea se miden mediante:
a) El descenso de la transmisión luminosa (opacidad)
b) El aumento del paso del pigmento fluoresceína sódica (permeabilidad).

Los resultados de la evaluación de la opacidad y de la permeabilidad de la córnea tras su
exposición a la sustancia problema se combinan para obtener una puntuación de la capacidad
de irritación in vitro (conocida por sus siglas en inglés, IVIS), que se utiliza para clasificar el nivel
de capacidad de irritación de la sustancia problema.



En cuanto, al ensayo de pollo aislado (ICE), su objetivo es describir los procedimientos utilizados
para evaluar la posible corrosividad o capacidad de irritación intensa para los ojos de una
sustancia problema en función de su capacidad para causar toxicidad en un ojo enucleado de
pollo. Para ello, también, se utilizan opacímetros y fotómetros.

Los efectos tóxicos sobre la córnea se miden mediante
a) Una evaluación cualitativa de la opacidad.
b) Una evaluación cualitativa de las lesiones provocadas al epitelio sobre la base de una
aplicación de fluoresceína en el ojo (retención de fluoresceína)

c) Una medición cuantitativa del aumento del espesor (inflamación).
d) Una evaluación cualitativa de las lesiones morfológicas macroscópicas de la superficie

Las evaluaciones de la opacidad, la inflamación y las lesiones de la córnea tras la exposición de
esta a una sustancia problema se efectúan por separado y después se combinan para llegar a
una clasificación de la capacidad de irritación ocular.

3. ENSAYOS DE PIRÓGENOS
Los ensayos de pirógenos son métodos validado por la Farmacopea Europea, Japonesa y
Americana.

La principal causa es la contaminación por bacterias gram -, cuyos mucopolisacáridos de
membrana (LPS à endotoxina) producen el efecto pirógeno. Ahora bien, también se puede
producir por endotoxinas gram + o micotoxinas (hongos).

Se utilizan para:
o Son los principales ensayos en el control de calidad de la fabricación de inyectables por
su repercusión en la salud humana.
o Además, todos los fármacos biológicos deben estar evaluados mediante estos métodos,
ya que deben carecer de actividad pirógena.
o Asimismo, algunos procedimientos pueden contaminarse por bacterias (normalmente
gram -) y producir un efecto pirógeno (debido a los mucopolisacáridos de las bacterias).
Entre ellos encontramos:
- Catéteres intravenosos, tubos, espinales, transfusión, de fertilización in vitro.
- Prótesis cardiacas y balones de angioplastia
- Marcapasos / desfibriladores
- Implantes de lentes intraoculares
- Simulacros craneales
- Tubos de perfusión, de diálisis y filtros
- Injertos vasculares

Ensayos in vivo
Los ensayos tradicionales se realizan in vivo con conejos. Consisten
en observar la reacción febril del animal.

De este modo, el proceso consiste en:
1. Inocular la sustancia pirógena en el animal por vía IV.
2. El pirógeno va a generar leucocitos.
3. A continuación, se produce IL-6 y otras citocinas mediadoras de la inflamación.
4. Finalmente, se produce la reacción febril.

Se considera estado febril cuando la temperatura del conejo aumenta 0,6ºC. Es decir, en este
caso, la sustancia será pirógena. Cabe destacar, que se mide la temperatura rectal del conejo.
Ensayos in vitro
Los métodos alternativos que existen han sido validados por la Comisión de la
Farmacopea Europea.

En la mayoría de los ensayos in vitro se determinan, principalmente, citoquinas
en sangre, implicadas en la producción de fiebre (normalmente mediante
métodos de ELISA). Podemos detectar:
1. Detección en sangre humana de citosinas 1 y 6 (IL-1, IL-6)
2. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC IL-6)
3. Línea celular monocitos humanos (MM6 IL-6)

LAL (lisado de amebocitos de Limulus = cangrejo de herradura)
Se trata de un método alternativo in vitro que reemplaza el 80% ensayos animales, pero
400.000 animales (conejos) se utilizan al año para estudios de pirógenos, porque el método LAL,
únicamente, determina endotoxinas gram negativas, pero no determina endotoxinas gram
positivas ni toxinas de hongos.

El ensayo de pirógenos LAL facilita una reacción natural entre las endotoxinas y una enzima
llamada Limulus Amebocyte Lysate (una enzima derivada del cangrejo herradura Limulus
polyphemus). Lo que se hace es recoger el líquido del cangrejo para realizar este tipo de ensayos.

La reacción entre la enzima y las endotoxinas produce turbidez, precipitación o gelificación de
la mezcla, identificando la presencia de endotoxinas o pirógenos. La velocidad de reacción
depende de la concentración de endotoxina, el pH y la temperatura.


3.2 ENSAYOS DE NEUROTOXICIDAD
Su objetivo es determinar el posible efecto neurotóxico de fármacos y otro tipo de sustancias.
Podemos encontrar distintos ensayos in vivo:

R (CE) 440/2008 OCDE 424 (1997)
Este ensayo se caracteriza por:
o 10 ratas/sexo/dosis oral
o Dosis: 1000 mg/kg pc/día
o Duración: ensayo de 28, 90 días o 1 año
o Evaluación de efectos electrofisiológicos, neuroquímicos, neuropatológicos y
neurocomportamentales.
o Proceso:
1. Perfusión de la sustancia y observación de nervios periféricos, médula espinal
y cerebro.
2. Tras la finalización del ensayo y el sacrificio del animal à Análisis bioquímico,
hematológico, histopatológico, toxicidad sistémica.
3. Evaluación del comportamiento neurológico.

OCDE 419 (1995): neurotoxicidad retardada de sustancias organofosforadas (28 días)
Los organofosforados son sustancias que inhiben la acetilcolinesterasa (aumentan la actividad
colinérgica). Se utilizan normalmente como plaguicidas.


El ensayo se caracteriza por:
o Animales: > o igual 12 gallinas/dosis oral (cápsulas de gelatina)
o Dosis: 1000 mg/kg pc/día (cápsulas de gelatinas)
o Duración: ensayo dura 28 días + 14 días de observación después de la última dosis
o Determinación de la presencia de esterasas y acetilcolinesterasa
o Tras el sacrificio del animal se realiza un ánálisis bioquímico, histopatológico y
comportamiento neurológico

En las siguientes imágenes encontramos distintos métodos para evaluar el comportamiento de
los animales de experimentación:
o Rueda giratoria
o Jaula normal o doméstica
o Laberinto residencial
o Campo abierto
o Analgesímetro
o Ensayos específicos



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11: FACTORES QUE AFECTAN A LA TOXICIDAD

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Está formado por una superfamila de genes constituida a su vez

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2.2 FACTORES PSICOSOCIALES

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TOXICOLOGÍA EXPERIMENTAL-ESTUDIOS TOXICOLÓGICOS

Evaluación de la seguridad requiere de la identificación de los efectos tóxicos potenciales,

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Aguda: única exposición con dosis elevada

Talidomida, fármaco antiemético que alrededor de los años 60-70 provocó

Se había ensayado en animales de experimentación en los cuales no presentaba

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EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD O EFECTOS ADVERSOS

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En el programa la estructura química de la molécula a investigar va a adoptar su forma

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Los ensayos de toxicidad en animales se apoyan en dos principios fundamentales (Eaton y

2) La exposición de animales de experimentación a dosis altas de agentes tóxicos es un método

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Presión de las protectoras de animales

Reducción del número de animales de experimentación siempre que sea posible

Garantizar que el número de animales utilizados se reduzca al mínimo y se evite al

Reglament CE 1223/2009 productes cosmètics (11/07/2013) Ningún producto

Se deben comenzar los estudios de toxicidad con m todos alternativos, confirmarlos y

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CONSIDERACIONES EN EL DISEÑO DE UN ESTUDIO TOXICOLÓGICO CON ANIMALES

1. Propiedades físico-químicas de la sustancia a estudiar

2. Especie animal de experimentación

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Dependiendo del tipo de estudio hay una especie de elección y especies

TIPO DE ESTUDIO ESPECIE DE ELECCIÓN ESPECIE ALTERNATIVA

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