Tema 9.

-“ Introducció a la Genètica Bacteriana”:

-“Genètica Bacteriana”: part de la microbiologia que estudia el genoma dels bacteris.

-“Genoma”: conjunt de la informació genètica d'una espècie.
La informació genètica resideix en el cromosoma. Els Procariotes només tenen
un únic cromosoma, que està format per una doble cadena d'ADN circular i tancada. És
una estructura de doble hèlix.
L'ADN està compost per una seqüència de nucleòtids : A( Adenina), T (Timina),
G (Guanina), C (Citosina).
La Grandària mitjana és d'unes 3.000.000 de bases (3 x 106 pb: Parells de bases).
 Característiques de les 2 cadenes d'ADN:
- Són Antiparal·leles 5’ 3’
3’ 5’

- Són Complementàries, la seqüència d'una cadena, determina la seqüència de

l'altre.
A T
G C
Això és important per als mecanismes de replicació i transcripció.
El cromosoma contenen tots els gens del bacteri.
-“Gen”: part de la seqüència de l'ADN del cromosoma que codifica una Proteïna.
-“Genoma”: inclou tots els gens que codifiquen totes les proteïnes d'una cèl·lula.
-“Gen Estructural”: seqüència de bases que codifiquen una proteïna.
-“Seqüències Reguladores”: seqüència de bases no codificants, però que regulen
l'expressió del gen.
PROMOTOR ESTRUCTURAL TERMINADOR
-“Genotip”: és el complement genètic d'un organisme.
“La diferència entre Genoma i Genotip és que Genoma s'aplica a l'espècie i per contra
Genotip s'aplica a una soca concreta”.
Ex.: Genoma E.coli. Genotip E.coli DH5α.
-“Fenotip”: és la manifestació externa del genotip. Són aquelles característiques del
genotip que es poden apreciar o detectar.
Ex.: Fenotip: mobilitat, capacitat d'usar lactosa,…
Genotip: gen que codifica la flagel·lina, operó lactosa…

2
3
-“Soca o Clon”: població bacteriana que procedeix enterament d'una cèl·lula original, en
la qual totes les cèl·lules són genotípicament idèntiques.
Es pot assimilar al concepte de “colònia aïllada”.
 Flux d'informació genètica en les cèl·lules:
L'ADN ha de passar a la descendència, les cèl·lules es divideixen mitjançant un procés
de fissió binària. Són idèntiques. No es diferencia entre cèl·lula filla i cèl·lula mare.
Cadascuna ha de rebre una còpia de l'ADN → Replicació.
La Replicació la duu a terme una sèrie d'enzims, incloent l'ADN-Polimerasa .

ADN ADN

Replicación
ADN Polimerasa

Dins de les cèl·lules, els Gens s'han d'expressar per a la síntesi de Proteïnes. Els
gens s'han de transcriure per a donar lloc a ARNm, i aquest és traduït en els ribosomes
per a donar lloc a la síntesi de Proteïnes:

Replicación
ADN ADN
ADN-Pol.

Transcripción
ARN-Pol.

ARNm
Expressió Gènica
Traducción

PROTEÍNAS

En el Procés de Replicació, l'ADN-Polimerasa utilitza com motle una de les

cadenes d'ADN per a sintetitzar la cadena complementària a través d'un mecanisme
conegut com a “Forquilla de Replicació”. La descendència rep una còpia del cromosoma
que conté una cadena original i una cadena de nova síntesi. És un procés de Replicació
Semiconservativa.

4
5
 Origen
De
Replicació
FORQUILLA DE
REPLICACIÓN

6
El Procés de Transcripció forma part del flux d'informació genètica dins de la cèl·lula
que té com a finalitat la síntesi de Proteïnes. L'ARN polimerasa, juntament amb altres
enzims, és la que sintetitza l'ARN missatger.

ADN ARNm
Transcripció
(ARN-Pol.)

Es transcriuen a cada moment exclusivament els gens que són necessaris.

L'ARN-Pol. Transcriu gens concrets.

5 3
3 5

5 3
3 5

L'ARN-Pol. Utilitza com motle la cadena no codificant per a sintetitzar una cadena
complementària d'ARNm.
La cadena d'ARNm serà “Idèntica” a la cadena codificant, amb l'excepció que en
lloc de Timina la cadena d'ARNm presenta Uracil.
-“Codi Genètic”: la informació continguda en la seqüència de bases de l'ADN està
codificada, i el procés de Traducció, el que fa és convertir el Codi Genètic en una
seqüència d'Aminoàcids.

7
8
 El Codi Genètic és un codi de tres lletres a les quals es denomina “Codons” i
cadascun d'aquests Codons codifica un aminoàcid, un Gen és una seqüència de bases
nitrogenades organitzades en triplets (Codons).
-“Traducció”: lectura dels triplets de la seqüència del missatger, per a donar lloc a la
síntesi de la cadena d'aminoàcids que constitueix la proteïna.
 Característiques del codi genètic:
- És Universal: és compartit per tots els éssers vius.
Ex.: El Codó ATG (AUG en el missatger) en l'ADN codifica sempre Metionina en virus,
bacteris, fongs, plantes i animals.
Existeixen excepcions molt lleugeres.
Ex.: En Mitocondris i Cloroplastos, existeixen Codons que no tenen el mateix significat
per a altres organismes.
- És Degenerat: existeixen un total de 4 bases nitrogenades (ATGC –
AUGC) i el codi genètic aquesta organitzat en triplets, si calculem les combinacions
possibles són 64. És a dir poden codificar a 64 aminoàcids diferents, però en la naturalesa
només existeixen 20 aminoàcids diferents, com a conseqüència hi ha més d'un triplet que
codifica per al mateix Aminoàcid, i a aquest fenomen se'l coneix com “Degeneració”.
Hi ha Triplets amb funcions específiques:
- Triplet d'Iniciació: és el primer triplet del gen és ATG – AUG
(Metionina), però pot haver-hi triplets ATG que no siguen d'iniciació.
- Triplets de terminació: no codifiquen cap aminoàcid, són triplets sense
sentit

TAA; TAG; TGA Estos Tripletes cuando pasan por los Ribosomas, la maquinaria
UAA; UAG; traduccional no es capaz de producir ningún aminoácido,
UGA terminando así la traducción y liberando la cadena terminada.

- “Pauta Oberta de Lectura”: és pràcticament un sinònim de Gen Estructural, és la

seqüència de Triplets que constitueixen un Gen Estructural, que comença amb un Triplet
d'Iniciació i que pot llegir-se ininterrompudament fins a arribar a un Triplet de
Terminació. És la seqüència de Triplets que codifica una Proteïna.
 Característiques Pròpies del Genoma Procariota:
Té una sèrie de característiques que ho diferencien del dels Eucariotes:
1) En els Procariotes el cromosoma és únic, compost per una doble cadena circular
i tancada

9
 2) Manca d'Introns.
INTRONS: són seqüències no codificants, que interrompen la pauta oberta de
lectura (PAL) dels gens Eucariotes.

Terminació
Natural
Iniciació
EXON INTRON EXON INTRON EXON
ATG TAA
TAC ATT
Se interrumpeix la PAL

Zonas Codificants
Eucariotes

No pasa al Genoma de Procariotes.

ATG TAA
TAC ATT
Iniciació Zona Codificant Terminació
Natural

El genoma Procariota és molt més compacte, perquè manca d'Introns, tota la seua
seqüència és codificant. En Procariotes les úniques seqüències no codificants, són les que
coneixem com “reguladores”, promotors i terminadors.
3) Està Organitzat en OPERONS:
OPERÓ: és un conjunt de gens que codifiquen totes aquelles Proteïnes que tenen
una funció relacionada, i que se situen un darrere d'un altre, sota el control tots ells d'una
única regió reguladora, que va per davant del primer d'ells, i d'una única regió
terminadora, que va per darrere de l'últim d'ells.
Ex.: “Operó-Lac d'Escherichia coli”: agrupa els tres gens que necessita E.coli per a la
utilització de la LACTOSA (Disacàrid Glucosa – Galactosa).
E.coli necessita 3 Enzims per a poder utilitzar la Lactosa:
- PERMEASA: transporta la Lactosa des del mitjà de cultiu, fins a l'interior
de la cèl·lula.
- β-GALACTOSIDASA: trenca el disacàrid, alliberant Glucosa i Galactosa.

10
 - TRANSACETILASA: modifica la Galactosa de manera que pot ser
metabolitzada, en una altra ruta metabòlica.
L'OPERÓ-LAC agrupa els 3 gens que codifiquen aquests 3 enzims:

Lac Z (β-Galactosidasa) Lac Y (Permeasa) Lac A (Transacetilasa)

PROMOTOR
ATG TAA-ATG TAA-ATG TAA
TAC ATT-TAC ATT-TAC ATT
Triplet Terminador
Lactosa en el Medi
Triplet iniciació

OPERÓN-LAC

El que tots els gens d'una via metabòlica estiguen junts, i sota el control d'una mateixa
regió reguladora, permet l'expressió simultània i equimolecular de tots els gens que
participen en aquesta via metabòlica.
El PROMOTOR de l'OPERÓ-LAC s'activa solament quan existeix lactosa en el mitjà de
cultiu i quan no existeix glucosa, és a dir, l'expressió d'aquests gens només ocorre quan
és necessari.

ARNm Policistrónico

AUG UAA-AUG UAA-AUG UAA

TRADUCCIÓN

β-Galactosidasa Permeasa Transacetilasa

La presència de Lactosa en el mitjà i l'absència de glucosa, actua sobre el PROMOTOR

que indueix l'expressió dels 3 gens alhora, donant lloc a un únic missatger, que codifica
els 3 Enzims, i que és POLICISTRÓNIC (codifica a més d'1 Proteïna). Aquest missatger

11
és traduït, i dóna lloc a la síntesi de β-Galactosidasa , Permeasa, Transacetilasa, de
manera seqüencial, desprenent-se cadascuna de les proteïnes quan la traducció
aconsegueix el seu corresponent triplet de terminació.

L'Operó garanteix que el grup de gens només s'expresse quan siga necessari, i quan ho
fa, s'expressen tots els gens alhora i en la mateixa proporció, per tant és un sistema molt
eficient de regulació de l'expressió gènica, i és característica de les cèl·lules Procariotes.
La cèl·lula Eucariota no presenta aquesta organització, en el genoma Eucariota
els gens que formen part d'una mateixa via metabòlica no solament no estan junts, sinó
que poden estar en cromosomes diferents, per la qual cosa la regulació de l'expressió
gènica és molt més complexa.

12
 • Tema 9.- “Introduccióna la Genètica Bacteriana”…..........................................3

• Tema 10.-“Mutagénesis”………………………………………………………10

• Tema 11.- “Recombinació genètica en bacteris. Transformació”…...…...23

• Tema 12.- “Transducción”…………………………………………………….27

• Tema 13.- “Conjugació”……………………………………………………...30

• Tema 14.- “Enginyeria Genètica”……………………………………………...39

2
 Tema 10.- “Mutagènesi”:

-“Mutació”: és qualsevol canvi heretable en la seqüència de bases de l'ADN. Es pot

classificar d'acord amb diferents criteris:
-Mutacions Espontànies: són les que ocorren com conseqüència d'errors
de la maquinària de replicació. Errors de l'ADN Polimerasa. Ocorren amb una freqüència
molt baixa i són la base del procés evolutiu.
- Mutacions Induïdes: aquelles que s'originen per l'acció d'un agent Físic
o Químic, al qual es denomina mutagen.
-“Soca Salvatge”: (Soca Silvestre), és el microorganisme tal i com s'aïlla en la naturalesa.
-“Soca Mutant”: és una Soca Salvatge després d'haver patit una mutació:
-“Mutant”: Soques obtinguts en el Laboratori, per un procés de Mutagènesi induïda.
Els Mutants Bacterians són eines per a l'estudi de la Fisiologia i el Metabolisme Bacterià.
La millor manera de conèixer la funció d'una Proteïna en una cèl·lula és danyar aqueixa
Proteïna, causant una mutació en el gen que la codifica, i veure l'efecte Fenotípic que té
sobre la cèl·lula.
Mitjançant Mutagènesi induïda, seguida per uns processos de selecció, es poden
obtindre, diferents tipus de Mutants Bacterians, que podem utilitzar per a l'estudi de
diferents aspectes de la fisiologia i metabolisme microbians:
Veurem solament tres tipus, a tall d'exemple, encara que existeixen molts més.

“Mutants Nutricionals”: són soques que al contrari que les salvatges de les quals
procedeixen, necessiten de la presència d'un factor de creixement en el mitjà de cultiu.
Ex.: Mutacions nutricionals que fan que el cep que les ha patides requerisca la presència
d'un aminoàcid, en el mitjà de cultiu (Leu, Lis, His, Ala).
El cep que no creix, llevat que aquest aminoàcid es trobe en el mitjà de cultiu, es diu que
és una Soca Auxótrofa per a aqueix aminoàcid.
Ex.: La Soca Mutant auxótrofa per a la leucina, mentre que la soca silvestre o salvatge de
la qual procedeix és protrótrofa per a la leucina.

3
Els mutants nutricionals han patit una mutació en un dels gens que codifica una dels
enzims que participen en la via metabòlica de la síntesi del factor de creixement, per
exemple en la via metabòlica de la síntesi de la Leucina”.
El mutant nutricional no sobreviuria en la naturalesa, la majoria de les mutacions d'aquest
tipus no són viables, ja que el factor de creixement no es troba normalment en l'hàbitat
natural, les mutacions solen ser perjudicials (“deletèries”).

 Obtenció de mutants:
Prenem un cultiu i el sotmetem a l'acció d'un mutagen, per exemple radiació
ultravioleta o nitrosoguanidina, un mutagen químic, obtenint-se mutants de tots els tipus
als quals després haurem de sotmetre a un procés de selecció:

U.V.
SOCA SELECCIÓ
SALVATJE MUTANTS

El procés de selecció, varia en funció de la mena de mutant que volem obtindre.

Mètode de rèplica en placa:

Els mutants se sembren en una placa i apareixen una sèrie de colònies. A
continuació fem una rèplica d'aquesta placa en dues plaques, una d'elles, amb mig
complet, i una altra d'elles amb el mitjà mínim, que no conté el factor de creixement. Es
comparen les colònies de l'un i l'altre i la que falta és un mutant auxòtrof per a aqueix
factor de creixement.
Obtenció de la placa rèplica:
S'impregna la placa original en un vellut estèril, i amb ell sembrem les dues
plaques, la de mig complet i la de mig mínim i, després de cultivar 24 hores, es procedeix
a la selecció.

4
 Utilitat dels mutants nutricionals:
són eines bàsiques per a estudiar la
via de biosíntesi d'un determinat
metabòlit, com pot ser un
determinat aminoàcid.

Método de
Réplica en Placa

5
 Mutants resistents a antibiòtics i substàncies químiques:
La Soca Mutant al contrari que la Soca Salvatge, és capaç de resistir l'acció d'un
determinat antibiòtic o substància química. En molts casos la diana dels antibiòtics són
Proteïnes específiques, si una mutació afecta al gen que codifica la proteïna diana,
l'antibiòtic deixarà de ser efectiu, i la soca Mutant serà resistent a aquest antibiòtic.
 Obtenció de mutants resistents:

MEDI COMPLET

Réplica en
Placa

U.V. Sembra en Placa

SOCA SALVATJE MUTANTS

Réplica en
Placa

MEDI COMPLET
+
S'utilitza de nou el Sistema de Rèplica en Placa, es replica la placa amb els mutants en
una placa amb mig complet, i una altra rèplica en una placa amb mig complet i antibiòtic
o agent químic afegit, i després de cultivar, els que cresquen en aquesta segona placa,
seran els mutants resistents a aqueix antibiòtic o agent químic.
 Utilitat dels Mutants Resistents:
Estudiar específicament les dianes, el mecanisme d'acció de l'antibiòtic, i els
mecanismes de resistència enfront de l'antibiòtic o substància química, per part del
microorganisme.
Aquest tipus de mutacions són beneficioses per al microorganisme, ja que li
permet sobreviure a l'acció de Quimioteràpics .

6
 • Mutants Letals Condicionals:
-“Mutants Letals”: són aquells que han patit mutacions en gens que codifiquen Proteïnes
imprescindibles per a la cèl·lula.
Ex.:” Mutant que pateix una modificació en el gen que codifica l'ADN Polimerasa, la
cèl·lula no pot dividir-se i la cèl·lula mor. Aquesta mutació és letal”.
Es poden estudiar processos com la replicació d'ADN, la síntesi de l'ARNm etc
mitjançant Mutants Letals Condicionals.
-“Mutant Letal Condicional”: són mutants que solament expressen el fenotip de
letalidad en unes condicions determinades.
• Condicions Permissives: aquelles en les quals no s'expressa la letalidad.
• Condicions Restrictives: aquelles en les quals sí que s'expressa la letalidad.
Normalment les condicions restrictives i permissives es troben associades a la
Temperatura: -Permissives: 37 °C el microorganisme creix, no expressa letalidad.
.Restrictives: 42 °C el microorganisme no creix, expressa letalidad.
Si es vol estudiar l'efecte de la mutació, passem el cultiu de condicions
permissives, a condicions restrictives, i en aqueix moment s'observa l'efecte de la
mutació.
 Utilitat Mutants Letals Condicionals:
Permet l'estudi de processos imprescindibles per a la cèl·lula.
El que ocorre en un mutant letal condicional és que s'ha produït una mutació, consistent
en el canvi d'1 només aminoàcid, que afecta l'estabilitat de la Proteïna davant la calor,
variant enormement el rang de temperatures a les quals la Proteïna és estable,
desnaturalitzant-se i deixant de ser funcional.

Ex.: SOCA
SOCA U.V MUTANT
SALVATJE LETAL
CONDICIONAL
DNA Polimerasa DNA Polimerasa
Estable a 60ºC Es desnaturalitza a
partir de 42ºC (Pel
canvi d’un aminoácido)

7
  Obtenció de Mutants Letals Condicionals:

Tª 37ºC

Rèplica en
Placa

Sembra en
U.V. Placa
CEPA
SALVAJE MUTANTS
Mutants
Letals
Condicionals
Rèplica en
Placa

Tª 42ºC

• BASES MOLECULARS DE LES MUTACIONS:

En què consisteixen les mutacions, a nivell de la seqüència d'ADN?.
Es poden dividir les mutacions a aquest nivell en:
-Puntuals
-Delecciones i Insercions
-Causades per elements mòbils
 Mutacions Puntuals:
Aquelles que impliquen el canvi d'una base per una altra, en la seqüència de
l'ADN. Aquestes al seu torn poden subdividir-se en 3 subtipus segons l'efecte fenotípic:

8
 • Mutacions Silencioses: canvi d'una base, sense donar lloc al canvi d'un
aminoàcid. Poden ocórrer pel fet que existeix més d'un triplet de bases que codifica el
mateix aminoàcid per la degeneració del codi genètic:
Ex.: …..CGG ATC GGA ATC…. (Original)
Arg Ile Gly Ile
…..CGG ATC GGC ATC…. (Mutat)
Arg Ile Gly Ile
• Canvi de base amb canvi d'aminoàcid en la proteïna Mutada:
Aquest canvi pot tindre una major o menor repercussió, ja que tots els aminoàcids
no són igualment importants. Per exemple , si es canvia un aminoàcid del centre actiu
d'un enzim, l'enzim deixarà de ser funcional. Si per contra l'aminoàcid que canvia no es
troba en una regió important per a la funció de la proteïna, aquesta continuarà sent
funcional. Poden també donar-se casos intermedis, en els quals el canvi d'aminoàcid
provoque un augment de la sensibilitat de la proteïna davant la temperatura, pel canvi
estructural produït, per la qual cosa davant un augment o disminució de la temperatura,
es produiria la seua desnaturalització, es tracta de Mutacions Condicionals.
Ex.: a 37 °C l'enzim funciona, però amb un augment o una disminució significativa de la
temperatura l'enzim deixarà de ser funcional (Mutant Condicional), si a més l'enzim és
imprescindible, donarà lloc a una Mutació Letal Condicional.
CGG ATC GGA ATG
Arg Ile Gly Ile
CGG ATC AGA ATG
Arg Ile Arg Ile

9
 POSSIBLES CONSEQÜÈNCIES D'UNA MUTACIÓ PUNTUAL

• Canvi de base que dóna lloc a un Triplet de Terminació:

La mutació dóna lloc a una Proteïna truncada, la traducció es per a abans d'hora, i
en el 99’9% dels casos la Proteïna no serà funcional, i per tant la mutació tindrà
conseqüències fenotípiques.
Ex.: …..CGG ATC GGA ATC…..
….. Arg Ile Gly Ile …...

Triplet de terminació
….. CGG ATC TGA ATC….
….. Arg Ile STOP………..

 Delecciones o Insercions:
Implica Llevar o Afegir 1 o més bases a la seqüència d'ADN. Les Insercions i les
Delecciones, sempre tenen conseqüències fenotípiques, perquè suposen un corriment de
la pauta oberta de lectura, la qual cosa donarà lloc a una Proteïna aberrant.
Conseqüència: el codi genètic, és un llenguatge que utilitza paraules de tres lletres,
i hi ha una frase que el representa perfectament.
Ex.: UN MES UN SÓN DUES → Proteïna funcional i Correcta
UN MAU ENS OND US → Proteïna aberrant, no té sentit.
Per això les Insercions i Delecciones, sempre tenen conseqüències fenotípiques.

10
  Mutacions Causades per elements mòbils:
Causades per “Transposones”, fragments d'ADN que poden saltar d'una
localització cromosòmica a una altra, gràcies a l'activitat de la TRANSPOSASA, un enzim
que té activitat endonucleasa, de tall, i ligasa, d'unió.
La TRANSPOSASA és codificada pel propi Transposon.
Els Transposones causen mutacions per inserció, i el gen en què s'insereixen
queda totalment interromput (disrupcionado), per la qual cosa sempre tenen un efecte
fenotípic. S'han trobat Transposones en una gran varietat d'organismes. En el cas dels
bacteris els Transposones contenen gens que codifiquen Proteïnes, que estan implicades
en la resistència a antibiòtics.
• REVERSIÓ:
Consisteix en un retorn al fenotip original. La Reversió, ocorre, quan les
mutacions desapareixen. És a dir, quan d'alguna forma s'ha reparat la mutació.
“Com Reverteixen els diferents tipus de mutacions?”:
 Mutació Puntual:
Reverteix mitjançant una altra mutació puntual.
Ex.: …..GGA…… (Cep Salvatge)
…..Gly…….
Mutación
…..GCA…… (Cep Mutant)
……Ala…….
Reversió
…..GGA….. (Cep salvatge)
….. Gly ….. Vuelve al
La Reversió de les mutacions puntuals, pot ocórrer de manera espontània.
 Mutacions per Insercions i Delecciones:
Una Inserció pot revertir mitjançant una Delección, i per contra una Delección pot
revertir mitjançant una Inserció. Però aquest fenomen ocorre estranyes vegades.
 Mutacions per elements mòbils:
Reverteixen de manera espontània, en el moment que el Transposón salta,
s'inutilitza el gen en el qual s'insereix, i quan torna a saltar deixa el gen intacte, tal com
es trobava abans de la inserció del Transposón.

11
 • EXEMPLES DE MUTÀGENS:
“Mutagen”: qualsevol agent físic o químic, capaza de causar un canvi en la seqüència
d'ADN. En éssers superiors Mutagen és equivalent a Carcinogen . Veurem únicament
dos exemples:
-Anàlegs de bases nitrogenades
-Radiació U.V.
 Anàlegs de bases nitrogenades:
Es tracta de compostos químic, la molècula dels quals és molt similar a la d'una
base nitrogenada.
Ex.: “5-BromoUracil”: és un anàleg de la Timina. L'única diferència que existeix és que
en la posició 5 la Timina té un CH3 i el 5-BromoUracil té un Br.
Si afegim al mitjà de cultiu 5-BromoUracil, la maquinària de replicació pot
utilitzar-ho en lloc de la Timina.
Les mutacions ocorren perquè, a diferència de la Timina, el 5-BromoUracilo pot
apariar-se indistintament amb Guanina o amb l'Adenina .

1ºCiclo
GC GC
CG CG
Replicación
GC GC
5BU
AT A5BU
GC GC
2ºCiclo
GC GC
CG CG
Replicación
GC GC
A5BU G5BU
GC GC
3ºCiclo
GC GC
CG CG
Replicación
GC GC
G5BU GC
GC GC

Com conseqüència, el 5-BromoUracilo dóna lloc a mutacions puntuals.

12
  Radiació U.V.:
Actua específicament, sobre Timines adjacents, en la mateixa cadena d'ADN,
creant dímers de Timina .

13
 L'energia de la radiació U.V. és utilitzada per les 2 Timines per a formar
un enllaç covalent addicional, la qual cosa crea rigidesa en la cadena de l'ADN, que
dificulta la separació de les cadenes per a la replicació, i desencadena una sèrie de
mecanismes de Reparació:
El més important és la reposada S.O.S., en el qual participen tres enzims que són
necessaris per a la reparació:
-ENDONUCLEASA: tala l'ADN i el degrada. Degrada tota la zona de
DNA del dímer de Timina , per la qual cosa aqueixa cadena del cromosoma queda
interrompuda.
-ADN POLIMERASA: no és la que participa en la replicació del
cromosoma, actua emplenant ràpidament la zona, la qual cosa augmenta la probabilitat
d'error, donant lloc a mutacions.
-LIGASA: uneix els extrems de la nova seqüència sintetitzada per l'ADN
Polimerasa reparadora.
La Resposta S.O.S. pot haver de reparar milers de Dímers de Timina, ja que la
radiació O.V. pot afectar un gran nombre de les Timines adjacents que puguen existir en
la seqüència del cromosoma. Les mutacions puntuals produïdes per la radiació O.V. són
conseqüència dels mecanismes de reparació. Són mutacions puntuals introduïdes per
l'ADN Polimerasa de reparació, que és capaç d'actuar ràpidament però amb una baixa
fidelitat.
La probabilitat de mutació és molt elevada, pel fet que el sistema S.O.S. ha de
reparar un elevat nombre de Dímers de Timina.
• TEST D'AMES:
És una aplicació pràctica d'un mutant bacterià, i serveix per a determinar el poder
mutagènic d'una substància química. Bàsicament serveix per a determinar si una
substancia problema és un mutagen o no.
Prenent en consideració que Mutagen és sinònim de Carcinogen , és obligatòria la
realització d'aquest test en qualsevol compost químic nou abans de la seua
comercialització.
Cada any s'obtenen nous compostos químics que s'utilitzaran com colorants,
fàrmacs, detergents, additius etc, i abans de la seua comercialització és necessari
confirmar que no són potencialment carcinogénicos.
Fins a la dècada dels 60 del segle passat, els assajos d'activitat mutagènica de
compostos químics es realitzaven per exposició d'animals d'experimentació, en un procés

14
que era llarg i costós. Per a simplificar l'assaig “Bruce Ames” va desenvolupar el Test que
porta el seu nom en la dècada dels 70.
 Fonament del Test d'Ames:
Consisteix a utilitzar un cep mutant de “Salmonel·la typhimurium” que ha patit
una mutació puntual, que la fa AUXÓTROFA per a Histidina . El Test consisteix a
mesurar la Taxa de Reversió de la mutació histidina (-) en aquest mutant, induïda pel
compost químic que s'està assajant. Si el compost químic que s'està assajant és un
mutagen, augmentarà la taxa de reversió espontània.
Per a realitzar l'assaig, se sembra el mutant histidina (-) en dues plaques amb molt
poca histidina, en les quals el mutant no és capaç de créixer. Per tant, l'única cosa que
creixerà en aqueixes plaques són les colònies de revertientes espontanis.
S'afig en l'agar de les plaques, o bé en discos de cartó en la superfície de l'agar, el
compost químic a assajar, de manera que una de les plaques siga el control negatiu i l'altra
continga el compost químic a assajar. Al cap de 24 hores s'observa el nombre de colònies
en cada placa. En la placa control apareixeran cert nombre de colònies, que correspondrà
a revertientes espontànies. Si en la segona placa apareix un número molt major de
revertientes, això ens estarà indicant que el compost químic problema ha incrementat la
taxa de reversió i és un Mutagen.

15
 Avantatges:
-Es pot realitzar en 24 hores.
-Només són necessaris dos discos de cartó, dues plaques i el
cep Histidina (-), és a dir el cost es redueix a una ínfima part del
que suposaria un assaig amb animals.

16
 Tema 11.-“Recombinació genètica en Bacteris”
“Transformació”

-“Recombinació genètica”: és el procés mitjançant el qual un bacteri, adquireix

informació genètica (fragments d'ADN) d'un altre bacteri. En la majoria dels casos, però
no sempre, es tracta de bacteris de la mateixa espècie. Forma part del procés d'evolució.
El fenomen de Recombinació Genètica en bacteris pot ocórrer per tres
mecanismes diferents:
* Transformació: pas d'ADN lliure d'una cèl·lula donadora a una cèl·lula
receptora. Es produeix, per exemple, quan la lisis d'un bacteri allibera al mitjà fragments
d'ADN que són incorporats per un altre bacteri. És el primer procés de recombinació
genètica en bacteris que es va descobrir.
*Transducció: l'ADN passa d'un bacteri a una altra a l'interior d'una
partícula vírica.
*Conjugació Sexual: l'ADN passa d'un bacteri a una altra per contacte
directe entre dos bacteris. Perquè es done aquest fenomen, el bacteri donador ha de
contindre un Plasmidi conjugativo.
El procés de recombinació genètica, sempre implica dos passos:
*1r Entrada de l'ADN: del bacteri donador en el bacteri receptor.
*2n Integració de l'ADN: del bacteri donador en el cromosoma del bacteri
acceptora. Està és l'etapa de recombinació pròpiament dita.
No sempre en 2n pas segueix al 1r. Amb freqüència l'ADN entra el bacteri receptor i no
arriba a integrar-se en el seu cromosoma. Això ocorre perquè existeixen dos factors que
limiten el fenomen de recombinació, de tal forma que només sol produir-se entre bacteris
de la mateixa espècie o, en defecte d'això, d'espècies molt pròximes genèticament:
 1. SISTEMA DE RESTRICCIÓ-MODIFICACIÓ:
Cada espècie bacteriana, té una sèrie d'enzims de restricció de l'ADN, que
reconeixen una determinada seqüència de bases (diana) i la tallen quan apareix.
Ex.: E. coli ----------GAATTC---------
----------CTTAAG----------
Diana reconeguda per l'Enzim de Restricció EcoRI de E.coli.

29
30
 Aquesta és la primera barrera que ha de salvar l'ADN exogen. Les seqüències
reconegudes pels enzims de restricció poden aparèixer també en l'ADN propi. No obstant
això, l'ADN propi no és degradat per l'enzim de restricció perquè les dianes que reconeix
han sigut modificades per un Enzim de Modificació. L'ADN del bacteri està modificat de
tal forma que no pot ser digerit pels Enzims de Restricció propis. La modificació
consisteix en una metilació d'una de les bases que formen part de la diana reconeguda per
l'Enzim de Restricció. L'ADN propi està protegit, mentre que l'ADN exogen no ho està i
per tant és digerit pels Enzims de Restricció. Quan l'ADN prové d'un altre bacteri de la
mateixa espècie, aquest es troba modificat i protegit contra els enzims de restricció
d'aqueixa espècie i no serà degradat. Per això la recombinació és més freqüent entre els
bacteris de la mateixa espècie.
 2. NECESSITAT D'HOMOLOGIA PER A LA INTEGRACIÓ DE
L'ADN DEL BACTERI DONADOR EN EL BACTERI ACCEPTOR:
Perquè es done integració, vertadera recombinació d'ADN exogen en el
cromosoma del bacteri receptor, ha d'haver-hi Homologia entre part de la seqüència de
l'ADN exogen i la seqüència d'una regió de l'ADN del cromosoma del bacteri receptor.
Solament en aquest cas es produeix integració.

Aquests 2 factors fan que el fenomen de recombinació siga molt més freqüent
entre bacteris de la mateixa espècie que entre bacteris d'espècies diferents.

-“Marcador Genètic”: caràcter fenotípic, el canvi del qual ens permet saber que s'ha
produït un fenomen de recombinació.

 TRANSFORMACIÓ:
Consisteix en el pas d'ADN lliure d'una cèl·lula a una altra. Va ser el primer
fenomen de recombinació genètica que es va descobrir en bacteris. Va ser el britànic Fred
Griffith, qui treballant amb Streptococcus pneumoniae, el va descriure per primera
vegada en 1928. En aquella època es coneixia de l'existència de dos tipus de soques de
S.pneumoniae : - L-Llises: Donen lloc a colònies llises, són capsulades i virulentes.
-R-Rugoses: Donen lloc a colònies rugoses, no capsulades i no virulentes.
“Experiment de Griffith”: Consistia a injectar en ratolins una mescla de cèl·lules vives
de S.pneumoniae d'una soca-R i cèl·lules mortes d'una soca-L. Contra el que calia

31
esperar, els ratolins morien i en el cultiu realitzat a partir de mostres dels ratolins morts
es recuperaven únicament cèl·lules de la soca L.

Soca-R (Vives)
+ RATOLINS R.I.P. Soca-L
Soca-L (Mortes)

Arran d'aquest experiment, Griffith publica aquests resultats i diu que les cèl·lules-
R vives havien patit un fenomen de TRANSFORMACIÓ . Griffith va deduir que hi havia
alguna cosa, en les restes de les cèl·lules-L mortes, que era el “Factor de Transformació”.
Hui se sap que eren els fragments d'ADN de les Cèl·lules-L mortes, que contenen la
informació genètica necessària perquè les cèl·lules-R siguen capaces de sintetitzar la
càpsula, i per tant adquirir virulència, però en 1928 ni tan sols se sabia que la informació
genètica es trobava codificada en l'ADN.
Avery, McLeod, i McCarty en 1944 van demostrar que l'ADN era el responsable
de la Transformació en l'experiment de Griffith, demostrant per primera vegada que la
informació genètica resideix en l'ADN. Griffith va tindre una enorme sort ja que
existeixen molt poques espècies bacterianes que patisquen el fenomen de Transformació
de manera natural, entre elles “S.pneumoniae”. A la capacitat d'un microorganisme per a
patir un procés de transformació se'l coneix com a “Competència”. El Marcador Genètic
en l'experiment de Griffith és la virulència, que deriva de la presència o absència de la
càpsula.

 Etapes del procés de Transformació:

1r. Interacció del fragment d'ADN lliure amb Proteïnes específiques
de la superfície del bacteri competent: aquestes proteïnes, només es troben en les cèl·lules
competents.
2n. Internalització: entrada de l'ADN dins de la cèl·lula. Ocorre
simultàniament amb la degradació d'una de les dues cadenes, i el que entra és una dels
dos brins de l'ADN, l'altra és degradada.
3r. Recombinació: pròpiament dita. Consisteix en la integració de
l'ADN monocatenario, en el cromosoma del bacteri receptor. Aquest procés està mediat
per les Proteïnes REC (Recombinació).
Les Proteïnes REC, s'encarreguen de dur a terme la hibridació, i s'encarreguen tant de
tallar i degradar el cromosoma propi, com d'empalmar aquest cromosoma amb el

32
33
ADN exogen. Les Proteïnes REC intervenen en tots els processos de recombinació,
independentment del mecanisme pel qual s'hagen produït.

 Producció de canvis fenotípics:

Ocorre quan la informació present en el fragment d'ADN que ha entrat, o part
d'ella, no estava en el cromosoma de la cèl·lula receptora. És a dir, perquè es produïsca
un canvi fenotípic, el fragment d'ADN extern ha de ser homòleg, però no idèntic; ha
d'aportar una cosa nova. Per exemple, en l'experiment de Griffith, els gens responsables
de la síntesi de la càpsula. En el cas que el fragment d'ADN que entra fóra totalment
idèntic a una regió del cromosoma de la cèl·lula aceptora, ocorreria una recombinació
“silenciosa”, sense que es produïren canvis fenotípics.

34
 Tema 12.- “Transducció”:

 TRANSDUCCIÓ:
-“Transducció”: és el pas d'ADN d'una cèl·lula bacteriana a una altra a l'interior d'una
partícula vírica. Va ser descobert per Zinder i Lederberg en la dècada de 1950.
-“Virus”: partícula submicroscòpica que, en forma lliure, manca d'activitat metabòlica.
Són paràsits intracel·lulars estrictes. Solament poden replicar-se utilitzant la maquinària
biosintética de la cèl·lula hospedadora.
 Composició d'un virus:
-“Càpsida”: coberta Proteica que conté l'àcid nucleic.
-“Àcid Nucleic”: es troba a l'interior de la càpsida i és el genoma del virus.
 Cicle Replicativo Bacteriofag (Virus Bacterià):
1r. Unió de la partícula vírica a la superfície de la cèl·lula.
2n. Injecció de l'àcid nucleic.

CICLE 3r. Multiplicació de la còpia de l'Àcid Nucleic víric.

LÍTIC 4t. Síntesi de Proteïnes que formen la càpsida.
5è. Assemblatge de les còpies d'Àcid Nucleic amb les càpsides.
6è. Partícules víriques madures.
7è. Alliberament per lisis de la cèl·lula bacteriana.

 Mecanisme recombinació genètica a través d'un cicle lític:

Accidentalment pot ocórrer que el que s'introdueix en la càpsida siga un tros del
cromosoma del bacteri hospedadora, donant lloc a una “Partícula Vírica Transductante”.
Aquesta pot unir-se a la superfície d'un altre bacteri hospedadora (Receptora de l'ADN
forà), injectant l'ADN del bacteri donador i aqueix fragment d'ADN s'acaba integrant en
el cromosoma del Bacteri Receptor.
Aquest accident ocorre perquè l'etapa d'assemblatge de l'Àcids Nucleics vírics en
les càpsides és un procés purament mecànic, i només es requereix que el fragment d'ADN
de l'hoste (Bacteri Donador) siga d'una grandària adequada, similar al de l'ADN víric.

35
36
Com les càpsides són específiques d'espècie, el fragment d'ADN serà transportat
(transducido) a un altre bacteri de la mateixa espècie. Aquest procés es coneix com:

-“Procés de Transducció Generalitzada”: es diu així perquè qualsevol gen del

cromosoma de les cèl·lules donadores, té la mateixa probabilitat de ser transduït.

-“Procés de Transducció Especialitzada”: requereix que ocórrega un tipus d'infecció de

Cicle Lisogénic. En aquest cas, l'àcid nucleic víric no desencadena un cicle lític, sinó que
passa a integrar-se, en el cromosoma de la cèl·lula hospedadora (Bacteri Lisogenizat), i
cada cèl·lula filla rebrà una còpia d'aqueix DNA víric en el seu cromosoma. Mitjançant
aquest mecanisme l'ADN víric pot romandre integrat en el cromosoma de manera
indefinida. Solament quan hi ha una acumulació de mutacions en el cromosoma pot
desencadenar-se un cicle lític. Quan el bacteri perd estabilitat, el virus marxa.
 Com es produeix la transducció especialitzada mitjançant un cicle lisogénic?:
L'exemple millor conegut és el del fag  (lambda) en E.coli. L'ADN del virus
s'integra a la regió coneguda com ATT (de l'anglès attachment) del cromosoma de E.coli
que es troba entre els operons GAL, responsable del metabolisme de la galactosa, i BIO,
responsable de la biosíntesi de la biotina. Per diferents raons, en un moment donat, l'ADN
de lambda pot desintegrar-se i es desencadena un cicle replicatiu (lític). La transducció
especialitzada es produeix quan, accidentalment, la desintegració de l'ADN víric ocorre
de manera anòmala, emportant-se aconseguisc l'operó GAL o l'operó BIO i deixant
integrat en el cromosoma parteix de l'ADN del virus. L'encapsidació donarà lloc a
partícules transductants que portaran en el seu interior l'operó GAL (dGAL) o l'operó BIO
(dBIO). Aquestes partícules, quan s'unisquen a una nova cèl·lula de E.coli li hi injectaran
l'operó BIO o l'operó GAL. Si la cèl·lula era gal- passarà a ser gal+ o, en el cas de l'operó
BIO, si era bio- passarà a ser bio+. En cap cas es produirà un cicle lític, ja que les
partícules víriques transductants són defectuoses (d) per haver deixat part de l'ADN víric
en el cromosoma de l'anterior cèl·lula hospedadora.

37
 Att ( lloc d’ integració)
-Desintegració
Anómala

GAL BIO -Desintegració

λ Anómala

-Desintegració
Normal
GAL BIO

38
  Diferències entre Transducción Especialitzada i Transducción
Generalitzada:
En la GENERALITZADA pot transducirse qualsevol gen de la cèl·lula donadora
i, a més, no requereix de l'existència d'un cicle lisogénico previ.
En l'ESPECIALITZADA només es transducen aquells gens que estan pròxims al
lloc d'integració de l'ADN del virus en el cromosoma de la cèl·lula hospedadora.
Requereix un cicle lisogénico previ perquè puga produir-se.

39
 Tema 13.-“Conjugació”:

 CONJUGACIÓ:
-“Conjugació”: és el procés pel qual es transfereix ADN d'un bacteri donador a un de
receptor per contacte directe. Perquè aquest procés siga possible, el bacteri donador ha de
contindre un Plasmidi conjugatiu. La conjugació bacteriana va ser descoberta per
Lederberg i Tatum en 1946.
-“Plasmidi”: molècula d'ADN de doble cadena circular tancada que pot replicar-se
autònomament, independentment del cromosoma. És com un cromosoma en miniatura,
amb una grandària mil vegades més xicotet que el cromosoma de la cèl·lula.
Hi ha diferents tipus de plasmidis:
-Plasmidis conjugatius.
-Plasmidis no conjugatius.
Els implicats en la conjugació són els plasmidis conjugatius.
Una altra classificació és:
-Plasmidis integratius: els que, en un moment donat, poden integrar-se en
el cromosoma del bacteri.
-Plasmidis no integratius: plasmidis que mai s'integren.
Perquè es done el procés de conjugació , el bacteri donador ha de contindre en el
seu citoplasma un Plasmidi conjugatiu.
 Com determinen les plasmidis conjugativos la transferència d'informació
genètica d'una cèl·lula a una altra per un procés de conjugació?
L'exemple millor estudiat és el del “Factor F” en Escherichia coli

F+ F+

X +
F- F+

40
 F+: Cèl·lules de E.coli que contenen el factor F.
F-: Cèl·lules E.coli que no contenen el factor F.
L'encreuament de cèl·lules F+ de E.coli amb cèl·lules F- dóna lloc a dues cèl·lules de
E.coli totes dues F+. Els Plasmidis conjugatius poden transmetre's d'una cèl·lula a una
altra sense que la cèl·lula donadora els perda.
Els “Plasmidis conjugatius” es transmeten de manera “infecciosa” en les poblacions
bacterianes; si introduïm una cèl·lula F+ en un cultiu F- de E.coli , al cap del temps totes
les cèl·lules del cultiu passaran a ser F+.
 Procés de conjugació:
El Plasmidi conjugatiu conté gens que codifiquen proteïnes que són les que intervenen
en el procés de Conjugació . Per exemple, en el cas de E.coli , les cèl·lules F+ són capaces
de formar un apèndix específic que es denomina “Pili sexual”.

El procés consta de quatre etapes:

1r. Etapa: la cèl·lula F+ de E.coli s'uneix a través del Pili sexual a una cèl·lula F-.

Pili
sexual

Conjugació
Bacteriana

2n. Etapa: el Pili sexual es retrau i les dues cèl·lules queden unides a través del que
es coneix amb el nom de pont sexual. Pont sexual

41
 3a Etapa: implica la transferència del Factor F. Aquesta transferència ocorre a
través d'un mecanisme que es coneix com “Mecanisme de cercle rodant”, que comença
amb el trencament d'una de les cadenes del Factor F en un punt específic que es coneix
com “origen de transferència” (ORIT). A partir de l'ORIT, la cadena que s'ha trencat
comença a passar a la cèl·lula receptora. Aquest procés de transferència està facilitat per
l'ADN Polimerasa de la cèl·lula donadora i de la cèl·lula receptora. L'ADN Polimerasa
de la cèl·lula donadora utilitza com motle la cadena intacta del Factor F per a sintetitzar
una cadena complementària i, en avançar, va desplaçant a la cadena trencada feia la
cèl·lula receptora. Quan aquesta cadena entra en la cèl·lula receptora l'ADN Polimerasa
de la cèl·lula receptora la utilitza com motle per a sintetitzar una cadena complementària.
És un mecanisme que facilita la transferència de la cadena d'oberta d'ADN del
factor F, tant per desplaçament de l'ADN Polimerasa de la cèl·lula donadora com per
tracció de l'ADN Polimerasa de la cèl·lula receptora.

ORI T

Al final d'aquesta etapa queda un Factor F intacte en la cèl·lula donadora i dues

cadenes lineals del Plasmidi en la cèl·lula receptora.
4a Etapa: consisteix en la circularització del Factor F en la cèl·lula receptora i separació
de les dues cèl·lules, sent ja les dues F+. És un procés de replicació Semiconservativa,
perquè cadascuna de les cèl·lules té una cadena original i una cadena de nova síntesi en
el seu factor F.

42
 La transmissió d'un plasmidi conjugatiu, com pot ser el factor F en E.coli, no
constitueix en si mateixa un procés de recombinació genètica, ja que no es transmeten
gens del cromosoma de la cèl·lula donadora.

43
44
  Recombinació genètica mediada per un Plasmidi conjugatiu:
Es pot produir perquè molts plasmidis conjugatius són també plasmidis
integratius, per exemple el Factor F també és integratiu. Per tant, el Factor F pot estar
de Manera Normal o Integrat en el cromosoma, en tots dos casos es tractaria de cèl·lules
F+.

Si el Factor F està integrat en el cromosoma, el cromosoma es converteix en un

“enorme plasmidi conjugatiu”, perquè passa a tindre un origen de transferència i a més
té tots els gens que codifiquen les proteïnes necessàries per al procés de conjugació.

La conjugació, en aquest cas, és un procés en el qual, en teoria, seria possible

transferir tot el cromosoma del bacteri donador al bacteri receptor. És un procés idèntic,
però en lloc de transmetre's el Factor F es transferiria el cromosoma complet del bacteri
donador, incloent el Factor F. No obstant això, en la pràctica no ocorre així. El pont
sexual és bastant inestable, i per a la transmissió de tot el cromosoma serien necessaris
més de 70 minuts i el pont sexual només és capaç de mantindre la seua integritat durant
uns pocs minuts, permetent el pas de, únicament, un tros del cromosoma de la cèl·lula
donadora a la cèl·lula receptora.

45
 La cèl·lula donadora reconstrueix la cadena trencada i la cèl·lula receptora, té un
tros de cromosoma del bacteri donador, juntament amb un tros de Factor F, que pot
integrar-se en el seu cromosoma.

En aquest cas Si s'ha produït transferència d'ADN cromosòmic, per la qual cosa
es tracta d'un vertader procés de Recombinació . Passen solament els gens que estan
pròxims al lloc d'integració del Factor F en el cromosoma. La cèl·lula receptora no serà
F+ al final del procés, continuarà sent F-, ja que solament haurà passat un tros de Factor F
amb part del cromosoma de la cèl·lula donadora, i no el Factor F complet.
Als les soques de E.coli en les cèl·lules del qual el Factor F aquesta integrat en el
cromosoma se'ls denomina soques “HFR” (High Frecuency Recombination), soques
d'alta freqüència de recombinació.
* Factor F’ en E.coli:
Com ja hem dit, el Factor F és un plasmidi conjugatiu i integratiu. D'igual forma que es
pot integrar en el cromosoma de la cèl·lula, pot desintegrar-se d'aquest, la qual cosa en el
99% dels casos ocorre de manera neta. No obstant això, en l'1% dels casos el Factor F en
desintegrar-se s'emporta amb si un tros del cromosoma de la cèl·lula, que serà el que més
pròxim es trobe al lloc d'integració.

Cromosoma
Bacteriano
Factor F

A aquest Factor F que en desintegrar-se s'emporta amb si gens del cromosoma,

se'l denomina Factor F’. Aquest Factor F’ pot transmetre's fàcilment d'una cèl·lula a una
altra per conjugació, la qual cosa es coneix com procés de “Sexducción”. La sexducción

46
 recorda remotament a la transducción especialitzada en la qual per exemple l'ADN del
fago  pot també desintegrar-se anòmalament, emportant-se amb si gens del cromosoma

“Proceso de SEXDUCCIÓN”

Conexión entre las células mediante

el Pili sexual

Replicación y transferencia del

Factor F’

 Tipus De Plasmidis:
Una vegada vist el concepte de Plasmidi i com els plasmidis conjugatius
intervenen en la recombinació genètica, parlarem, a tall d'exemple, de tres tipus de
plasmidis (hi ha molts més) classificats d'acord amb les característiques que confereixen
a les cèl·lules que els contenen:

1) Factors R o factors de resistència: confereixen als bacteris que els

contenen resistència a un o diversos antibiòtics. Tenen una enorme importància des del
punt de vista clínic. Són Plasmidis que contenen gens que codifiquen enzims que
destrueixen o modifiquen la molècula que constitueix l'antibiòtic.

47
  Exemples:
a) β-Lactamases: són enzims que degraden específicament l'anell β-lactámic,
que és l'estructura central de penicil·lines i derivats.
Quan un bacteri produeix una β-Lactamasa, aquesta degrada les penicil·lines i els
seus derivats, conferint resistència al bacteri enfront d'aquesta mena d'antibiòtics.
b) CAT cloranfenicol acetil transferasa: és un enzim que acetila la molècula
del cloranfenicol, inactivant-la, per la qual cosa els bacteris que secreten aquest enzim
seran resistents al cloranfenicol.

 Estructura molecular dels Factors R:

Per a explicar l'estructura típica veurem un exemple, el Factor R 222 de E.coli .
Està format per dos components:
a) Factor de transferència de resistència (RTF): és un Plasmidi conjugativo,
responsable que les resistències es propaguen d'un bacteri a una altra. El problema és que
els Plasmidis que confereixen resistència a antibiòtics es transfereixen de manera
“infecciosa”. Si hi ha una sola cèl·lula resistent en un cultiu aquesta transmetrà la
resistència de manera que al cap de cert temps totes les cèl·lules del cultiu seran resistents.
b) Determinants R: són Transposones que es caracteritzen perquè contenen
un o diversos gens que codifiquen proteïnes o enzims que confereixen resistència a un
antibiòtic en particular. Cada determinant R confereix resistència a un antibiòtic en
particular.

Per tant, cada Factor R conté:

a) RTF
b) un o diversos Determinants R.
Per exemple, en el cas de R 222

R1
R1 Resistencia a Sulfamidas
R2 R2 Resistencia a Cloranfenicol
RTF

R222 Determinantes R R3 Resistencia a Eritromicina

R4 Resistencia a Tetraciclina
R3
R4

48
 El Factor R222 de E.coli presenta un RTF i quatre Determinants R. Si una
d'aquestes soques de E.coli produeix una infecció, aquesta infecció serà difícil de tractar,
ja que serà un cep “multiresistente”. De fet, cada vegada és més freqüent l'aparició de
ceps resistents a diversos antibiòtics per efecte de Factors de Resistència. Aquest tipus de
ceps plantegen un problema molt greu des del punt de vista clínic arribant al punt
d'infeccions que no es poden tractar amb cap antibiòtic conegut.
Els Factors R estaven presents en la naturalesa abans que els antibiòtics es
començaren a utilitzar en clínica. El seu origen és probablement evolutiu, apareixent per
primera vegada en bacteris que compartien nínxol ecològic amb fongs productors
d'antibiòtics. Quan fongs i bacteris coincideixen i han d'utilitzar els mateixos nutrients
per a créixer, els bacteris porten sempre les de guanyar perquè es divideixen cada 30
minuts mentre que un fong necessita hores. Evolutivament algunes espècies de fongs van
acabar secretant antibiòtics per a inhibir el creixement dels bacteris i també evolutivament
alguns bacteris van desenvolupar mecanismes, mediats per la presència de plasmidis, que
els permetien secretar enzims que inactivaven els antibiòtics. La pressió selectiva
generada per l'ús massiu i generalitzat dels antibiòtics durant els últims 60 anys ha fet
que, la qual cosa era un fenomen restringit a determinats ceps, de determinades espècies
bacterianes, en determinats nínxols ecològics, siga hui dia un fenomen generalitzat.

2) Factors Bacteriocinogénicos: són Plasmidis que contenen gens que

codifiquen una Bacteriocina, una proteïna de secreció que és tòxica per a altres cèl·lules
de la mateixa espècie que no continguen el mateix factor Bacteriocinogénico. Són
proteïnes tòxiques, produïdes pels bacteris per a competir amb bacteris de la mateixa
espècie. Els Factors Bacteriocinogénicos contenen el gen que codifica la Bacteriocina i,
obligatòriament, han de contindre un gen que codifica el supresor de la Bacteriocina, que
és una proteïna que inhibeix l'acció de la bacteriocina. D'una altra manera les cèl·lules
que produïren la bacteriocina serien les primeres a morir.

3) Plasmidis Toxigénicos:
Són Plasmidis que contenen gens que codifiquen proteïnes de secreció que són
tòxiques per a l'ésser humà. Els Plasmidis Toxigénics són factors de virulència. Dins d'una
mateixa espècie bacteriana, aquells ceps que continguen un Plasmidi Toxigénic seran
virulentes, en cas contrari no ho seran. Un bon exemple d'això són els ceps
enterotoxigénicas de E.coli . E.coli és habitant habitual de l'intestí, per la qual cosa

49
normalment no és un microorganisme virulent, però existeixen ceps que si que ho són,
algunes d'elles a causa de la presència de Plasmidis Toxigénics que contenen gens que
codifiquen una enterotoxina molt potent que quan s'allibera en la mucosa intestinal dona
lloc a un quadre diarreic.

50
 Tema 14.-“Enginyeria Genètica”

L'Enginyeria genètica s'engloba dins de la Biotecnologia, que es pot definir com l'ús
d'organismes vius o els seus derivats per a dur a terme processos químics definits
d'aplicació industrial. Es poden donar dues definicions alternatives del concepte
d'Enginyeria Genètica:
1. Qualsevol manipulació artificial que implique la creació de molècules híbrides d'ADN
a partir d'ADNs d'espècies diferents. Per aquesta raó se li sol dir metodologia de
l'ADN recombinant.
2. La introducció, manteniment i expressió artificial de gens d'una espècie en cèl·lules
d'una altra. L'exemple clàssic d'això seriosa la introducció, manteniment i expressió
del gen de la insulina humana en Escherichia coli per a produir insulina recombinant.

L'Enginyeria genètica ha sigut possible gràcies al desenvolupament o a la purificació de

quatre eines bàsiques al llarg dels anys 70 del segle passat. Aquestes eines són:

1- Els enzims de restricció.

Són enzims que es troben en les cèl·lules bacterianes. Formen part del sistema de
restricció modificació que s'encarrega de degradar ADN exogen. Cada espècie bacteriana
posseeix enzims de restricció característics que reconeixen una seqüència d'ADN
determinada, normalment palindròmica de 6 parells de bases i la tallen. A aquesta
seqüència se'l denomina "diana" de restricció. Els enzims de restricció es denominen
d'acord amb l'espècie de la qual s'aïllen, per exemple EcoRI, de E.coli , o SmaI, de
Serratia marcescens. Els que s'utilitzen en Enginyeria Genètica són de classe II i depenent
de l'enzim poden tallar l'ADN deixant extrems cohesius o extrems roms.

Extrems cohesius, per exemple EcoRI

.....GAATTC..... ......G AATTC.............
.....CTTAAG..... .....CTTAA G.............

Extrems roms, per exemple SmaI

......CCCGGG....... ......CCC GGG........
......GGGCCC....... ......GGG CCC........

51
Els enzims de restricció reconeixen una seqüència concreta, que es troba distribuïda
aleatòriament una sèrie de vegades en els cromosomes i la tallen, independentment que
es trobe en un fragment d'ADN humà o en l'ADN d'un bacteri. Fragments d'ADN que han
sigut tallats amb el mateix enzim de restricció són compatibles entre si, poden lligar-se.
En el cas de fragments d'ADN amb extrems roms, poden sempre lligar-se entre si. Per
tant és possible tallar trossos d'ADN de diferents espècies i posteriorment empalmar-los
entre si per a donar lloc a molècules d'ADN recombinant.

2 - Lligases
Són enzims que s'encarreguen d'unir els extrems de l'ADN digerits pels enzims de
restricció, quan aquests extrems són compatibles. Les que s'utilitzen són d'origen víric
(T4DNA lligasa).

3- Vectors de clonació
Són plasmidis artificials, compostos de fragments d'ADN de diferent origen i que
permeten que el fragment d'ADN exogen que conté el gen que ens interessa siga estable
i s'expresse en les cèl·lules que actuen com hospedadores. Un vector de clonació típic per
a E.coli , per exemple pUC18/pUC19, consta de quatre elements bàsics.
a) Un origen de replicació (ORI R). És el que li confereix al plasmidi la capacitat de
replicació autònoma de manera que cada vegada que la cèl·lula es dividisca,
cadascuna de les cèl·lules resultants reba còpies del plasmidi. L'ORI R més utilitzat
per a E.coli és el del factor colicinogènic Col E1.
b) Un marcador de resistència, és a dir, un gen que conferisca resistència a un determinat
antibiòtic. La resistència a l'antibiòtic ens permetrà diferenciar les cèl·lules de E.coli
que continguen el vector de les quals no el continguen. Normalment s'utilitza el gen
AMP que codifica una -lactamasa que confereix resistència a Ampicil·lina. Aquest
gen s'ha obtingut d'un factor R.

52
53
c) Un marcador de selecció. Normalment el gen LACZ, que s'obté de l'operó lac. Aquest
gen confereix, a les cèl·lules que contenen el vector, activitat -galactosidasa.
d) Un lloc múltiple de clonatge (SMC). És una seqüència d'ADN d'unes 60bp, introduïda
artificialment en el centre del gen LACZ, sense interrompre la seua seqüència
codificant, que consisteix en les dianes de restricció per a una sèrie d'enzims de
restricció. La particularitat del SMC és que aquestes dianes són úniques en el vector.
És a dir tractant el vector amb qualsevol d'aquests enzims de restricció l'única cosa
que es fa és obrir, linealitzar el vector. És en aquest SMC on s'introdueixen els
fragments d'ADN exogen, es digereix el vector amb un enzim de restricció i es lliga
el vector amb un fragment d'ADN exogen digerit amb el mateix enzim perquè tinga
extrems compatibles. La introducció d'aquest ADN exogen en el SMC implica la
inactivació del gen LACZ, per la qual cosa les cèl·lules que continguen un vector amb
inserit no tindran activitat -galactosidasa.

4- Mètodes de transformació artificial

Aquests mètodes permeten la transformació artificial de E.coli i altres organismes que
no són transformables de manera natural. Bàsicament permeten introduir en les cèl·lules
l'ADN recombinant. Els mètodes que s'utilitzen són:
Per a E.coli , tractament de les cèl·lules amb ClCa2 en frio.
Per a Saccharomyces cerevisiae, tractament de les cèl·lules amb ClLi.
Per a qualsevol mena de cèl·lules, Electroporació. Consisteix a posar les cèl·lules i l'ADN
a transformar en una cel·la que es troba en un camp elèctric alternant. El canvi ràpid de
polaritat desorganitza els fosfolípids de la membrana permetent l'entrada de l'ADN.

A manera d'anècdota, es pot dir que l'enginyeria genètica, la metodologia de l'ADN

recombinant, va nàixer en 1972 a partir d'una reunió entre Stanley Cohen, de la
Universitat de Stanford, i Herbert Boyer, de la Universitat de Califòrnia a San Francisco.
El grup de Cohen estudiava els plasmidis bacterians i el de Boyer treballava en la
caracterització dels enzims de restricció. En un congrés en Honolulu, en 1972 tots dos
van coincidir i es van adonar del potencial de combinar l'ús dels enzims de restricció per
a tallar fragments d'ADN, amb els plasmidis bacterians, per a poder introduir aquests
fragments de manera estable en bacteris. La col·laboració entre tots dos grups va donar
lloc al naixement de la metodologia de l'ADN recombinant.

54
Una vegada descrites les eines bàsiques necessàries veurem les etapes de la clonació
d'un gen eucariota en Escherichia coli. L'objectiu últim d'aquest procés és l'aïllament
d'una colònia de E.coli que continga un vector de clonació que porte inserit en el SMC
un gen eucariota concret.

1- Aïllament dels gens eucariotes. Com que els gens estan en l'ADN dels cromosomes,
podria per exemple aïllar-se ADN cromosòmic i trossejar-ho utilitzant enzims de
restricció per a donar lloc a fragments que podrien inserir-se en vectors de clonació
oberts amb el mateix enzim. Aquesta aproximació no pot utilitzar-se en la pràctica
per dues raons: i) l'enzim de restricció reconeix dianes específiques que estan
distribuïdes a l'atzar, per tant pot tallar per la zona codificant dels gens. ii) els gens
eucariotes tenen introns. Perquè un gen eucariota puga expressar-se en una cèl·lula
procariota ha d'estar lliure d'introns. El que es fa en la pràctica és purificar l'ARNm
de les cèl·lules. La transcripció en eucariotes dona lloc a la síntesi d'un pre-ARNm
que conté encara introns, però abans que aquest pre-ARNm abandone el nucli, pateix
un processament per nucleases específiques que eliminen els introns per a donar lloc
a un ARNm madur sense introns. Per tant, es purifica aquest ARNm i es converteix
en ADN de doble cadena en el tub d'assaig afegint-li transcriptasa inversa. A aquestes
molècules d'ADN de doble cadena que procedeixen de molècules d'ARNm se'ls
denomina ADNc (c de còpia). D'aquesta forma s'aconsegueix una col·lecció d'ADNcs
que representen la seqüència codificant, lliure d'introns, dels gens més expressats en
les cèl·lules de les quals s'ha aïllat l'ARNm. Aquests ADNcs tenen extrems roms.
2- El vector de clonació es digereix pel SMC amb un enzim de restricció que deixe
extrems roms (per exemple SmaI). Això dona lloc a una població de molècules de
vector obertes i disposades a lligar-se amb les molècules d'ADNc.
3- Ligación de les molècules de vector amb les molècules d'ADNc en tub d'assaig en una
reacció catalitzada per la ligasa. D'aquesta forma s'obté una col·lecció de milers de
molècules de vector que conté cadascuna d'elles un ADNc (que correspon a un gen
eucariota) diferent inserit en el seu SMC. També, moltes molècules de vector no
atrapen cap ADNc i simplement es tornen a recircularitzar per efecte de la lligasa.
4- Transformació en cèl·lules de E. coli , mitjançant un mètode de transformació
artificial. Generalment tractar les cèl·lules amb CaCl2 en fred i posar-les després en
contacte amb l'ADN. Una part de les cèl·lules seran transformades amb molècules de

55
56
vector que porten un ADNc com a inserit, una altra part ho seran amb molècules de vector
buides (sense inserit) i una altra part no es transformaran.
5- Selecció. La finalitat d'aquesta última etapa és aïllar una colònia de E.coli que
continga un vector que porte com a inserit la molècula d'ADNc corresponent al gen
que ens interessa. Aquesta colònia serà un clon i per tant haurem aconseguit el clonaje
d'un gen eucariota en E.coli. Aquesta etapa té tres fases.
5.1- Seleccionar transformantes de no transformantes. Això s'aconsegueix sembrant en
plaques que continguen Ampicil·lina després de la transformació. Els transformantes
(independentment que el vector que porten dins porte inserit o no) creixeran perquè la
presència del vector confereix resistència a l'Ampicil·lina.
5.2- Seleccionar transformantes que continguen vectors amb inserit dels quals només
continguen el vector relligat. Això s'aconsegueix sembrant en plaques que continguen un
substrat cromogènic de la -galactosidasa. El més popular és el conegut com a X-GAL,
que quan és processat per la -galactosidasa dóna lloc a un producte de color blau que
precipita al voltant de les colònies. Les colònies que continguen un vector amb inserit no
canviaren de color, ja que l'inserit haurà inactivat la -galactosidasa en introduir-se en el
MCS (com és lògic s'utilitzen ceps de E.coli en les quals l'operó Lac aquesta inactivat),
mentre que les colònies que continguen el vector relligat sense inserit seran blaus per
trobar-se el gen de la -galactosidasa intacte. Les colònies que interessen són les blanques
que contenen inserits. Aquestes colònies es passen a altres plaques. Els passos 5.1 i 5.2
es fan conjuntament sembrant en plaques que continguen Ampicil·lina i X-GAL.
5.3- Seleccionar el transformant que continga un vector que porte com a inserit l'ADNc
que correspon al gen que estem buscant. Per a aconseguir això hi ha dues possibilitats.
5.3.1. Utilitzar anticossos específics que reconeguen la proteïna codificada pel gen que
estem buscant. La condició per a això és que el gen s'expresse en E.coli. La tècnica
consisteix a transferir les colònies a nitrocel·lulosa i incubar la replica en nitrocel·lulosa
amb l'anticòs específic marcat colorimétricament o radioactivament. L'anticòs marcarà
específicament la colònia que continga el vector que porte com a inserit el gen que estem
buscant. La colònia, el clon, podrà aïllar-se de la placa original.
5.3.2. Utilitzar un fragment d'ADN (sonda) que corresponga al gen. Aquesta sonda,
marcada colorimétricamente o radioactivament, hibridarà específicament amb la colònia
que continga el gen que estem buscant. Per a això, com en el cas anterior, es transfereixen

57
les colònies a membranes de nitrocel·lulosa i s'incuben amb la sonda. La colònia que siga
marcada podrà recuperar-se en la placa original.

D'aquesta forma s'obtenen colònies (clons) de E.coli que contenen en el seu interior gens
eucariotes concrets, es diu que s'ha "clonat un gen".

Aquest procés que acabem de descriure és un procés “clàssic”, en ús fins a mitjan dècada
dels 90 del segle passat. A partir d'aqueix moment, els programes de seqüenciació
sistemàtica van permetre determinar la seqüència completa dels genomes d'una gran
varietat d'organismes: virus, bacteris, llevats, plantes i animals, incloent la seqüència
completa del genoma humà. La possibilitat de conéixer per endavant la seqüència del gen
que es vol clonar va permetre que, abans d'acabar el segle, la major part dels processos
de clonatge es feren amplificant els gens específics mitjançant reacció en cadena de la
polimerasa (PCR), utilitzant engreixadors sintètics (primers), que hibriden amb les zones
5´i 3´del gen a clonar. Quan es tractava de clonar gens eucariotes (amb introns),
normalment es combinava una etapa de transcripció inversa amb l'amplificació amb PCR
(RTPCR). Finalment, en els últims anys, la tècnica més utilitzada, si es coneix la
seqüència de gen a clonar, consisteix a sintetitzar els gens “in vitro” en un procés
totalment automatitzat que realitzen maquines de síntesi, amb un preu d'uns 30 cèntims
d'euro per base. Està tècnica és molt més flexible en tant que permet modificar la
seqüència original per a “millorar-la”, arribant fins al punt de crear gens híbrids que
codifiquen proteïnes amb una doble funció enzimàtica. La tècnica és tan potent que, en
2010, un grup encapçalat per Craig Venter va ser capaç de sintetitzar un cromosoma
bacterià artificial d'1 milió de bp que era funcional, una vegada introduït en bacteris
(Mycoplasma mycoides) el cromosoma dels quals s'havia destruït prèviament, donant lloc

58
59
a bacteris amb capacitat de replicació. Més recentment (2014) el grup encapçalat per Jef
Boeke va sintetitzar un cromosoma artificial eucariota de 272.871bp i ho va introduir de
manera funcional en Saccharomyces cerevisiae. En aquest cas el cromosoma no era
simplement una còpia sintètica de l'original, sinó que s'havia modificat profundament.

Aplicacions de l'Enginyeria Genètica

1.- Producció de proteïnes d’interès farmacològic en microorganismes

1.1. Hormones
L'exemple més clàssic és la insulina. Fins a 1982 s'extreia de pàncrees de porc. La
insulina de porc difereix tan sols en un aminoàcid de la humana, en alguns casos això era
suficient per a donar lloc a reaccions immunològiques. A partir de 1982 es va començar
a comercialitzar insulina humana recombinant produïda en E.coli. Un altre exemple és
l'hormona del creixement humana. S'utilitza per a tractar xiquets amb nanisme hipofisiari.
Fins a 1985 la poca que podia obtindre's s'extreia de la hipòfisi de cadàvers. Això va fer
que molts xiquets tractats desenvoluparen malaltia de Creutzfeld Jakob, per contaminació
de l'hormona amb prions. A partir d'enguany es comercialitza l'hormona del creixement
humana recombinant obtinguda en E.coli. Desapareix el risc de contaminació per prions
i es poden obtindre quantitats il·limitades. Altres hormones recombinants
comercialitzades són els factors de creixement ossi i epidèrmic.
1.2. Moduladors del sistema immune. Interferons (alfa, beta, gamma) tots els que
s'utilitzen en clínica són recombinants. El mateix ocorre amb les interleucines (IL1, IL2,
IL3) i el factor necrosant dels tumors.
1.3. Proteïnes sanguínies. Per exemple l'activador tissular del plasminogen, que és una
proteïna que dissol trombes i que es pot utilitzar en la prevenció i tractament de l'infart de
miocardi. Es va comercialitzar en 1987. Un altre exemple són els factors de coagulació,
VII, VIII i IX, comercialitzats ja en la seua major part, igual que l'eritropoetina i la
seroalbúmina.

2. Producció de vacunes. Es poden utilitzar com a bovines antígens proteics d'un

microorganisme patogen produïts per la metodologia de l'ADN recombinant. El clàssic
exemple d'això és la vacuna de l'hepatitis B que consisteix en l'HBsAg

60
61
produït en Saccharomyces cerevisiae i que és la vacuna recombinant de major difusió.
Un altre exemple és la vacuna que s'utilitza per a previndre la infecció per virus del
papil·loma (HPV), que està associat amb càncer de coll d'úter. Aquesta vacuna també es
produeix en llevats i forma part dels programes de vacunació infantil en països
desenvolupats.

3. Animals i plantes transgèniques. Encara que clarament fora del camp de la

Microbiologia, són animals o plantes que expressen gens d'altres espècies. S'ha
aconseguit per exemple porcs amb hemoglobina humana. També el cas de "Polly", una
ovella clònica (com Dolly) però a més transgènica que produeix en la seua llet antitripsina
, un enzim humà la manca del qual causa la Fibrosi Quistica, una malaltia mortal.
També, en plantes de tabac s'ha aconseguit expressar anticossos humans, o toxines per a
insectes, per no parlar de la soja o la dacsa transgènics.

4. Teràpia gènica. També lluny del que es pot considerar Microbiologia encara que hi ha
virus que es poden utilitzar com a vectors. Hi ha moltes malalties que es deuen a
mutacions a vegades hereditàries que inactiven determinats gens. La teràpia gènica
consisteix a reemplaçar el gen defectuós per un gen funcional per a curar la malaltia. Per
a això cal aconseguir fer arribar els gens fins a les cèl·lules, poden utilitzar-se per exemple
retrovirus o adenovirus com a vectors. La primera aplicació d'aquest tipus va ocórrer en
1992, aconseguint curar a dues xiquetes deficients en Adenosina Desaminasa, un enzim
la manca del qual produeix immunodeficiència. Des de llavors, uns 20 pacients han sigut
tractats; no obstant això, hi ha risc de desenvolupar leucèmia com a conseqüència de la
integració anòmala del retrovirus modificat que s'utilitza com a vector per a integrar el
gen funcional en el genoma dels pacients. Recentment, la introducció del sistema d'edició
genòmica CRISPR/Cas9, que potencialment permet reemplaçar gens a nivell de cèl·lules
embrionàries, ha reviscut la possibilitat de realitzar teràpia gènica. A part de les
connotacions ètiques que la tècnica pot comportar, els primers intents realitzats per un
grup xinés en 2015 per a corregir la beta-talassèmia, van mostrar que la tècnica està encara
lluny de ser efectiva. Al febrer de 2016 el govern Britànic va aprovar l'ús de la tècnica
per a la modificació d'embrions humans no viables.

62