1 | PENGANTAR

Ameloblastoma (AB) di seluruh dunia adalah neoplasma jinak odontogenik epitel yang paling umum. AB
biasanya terjadi pada tulang mandibula atau rahang atas dan menunjukkan pertumbuhan invasif yang
lambat tetapi kadang-kadang secara lokal dengan penyerapan tulang. Karena pertumbuhannya yang
invasif secara lokal, reseksi bedah dipilih untuk perawatan utama AB. Ameloblastik karsinoma (AC)
didefinisikan sebagai neoplasma ganas odontogenik epitel primer yang langka dan rekanan ganas AB
berdasarkan klasifikasi WHO.1 Perilaku klinis AC lebih agresif dan invasif daripada AB. AC kadang-kadang
menunjukkan kekambuhan dan metastasis dan memiliki prognosis yang buruk. Sebagian besar AC timbul
secara de novo, tetapi beberapa muncul dalam AB yang sudah ada sebelumnya. 4,5 Namun, mekanisme
onkogenesis AC belum diklarifikasi.

Perkembangan tumor biasanya tergantung pada lingkungan sekitar, yang dikenal sebagai lingkungan
mikro tumor.6,7 Ketika tumor tumbuh dengan cepat, lingkungan mikro sering menyebabkan iskemia
lokal dan hipoksia. Keadaan hipoksia ini memainkan beberapa peran penting dalam perkembangan
tumor. Dalam kondisi ini, faktor yang diinduksi hipoksia-1α (HIF-1α) yang merupakan faktor transkripsi
dan dikenal sebagai sensor molekuler dari ketegangan oksigen memainkan banyak peran sel-sel tumor
untuk mengadaptasi tingkat oksigen yang rendah. Dalam kondisi normoksik, HIF-1α terdegradasi oleh
26S proteasome melalui hidroksilasi dan ubiquitination. Di bawah kondisi hipoksia, level ekspresi HIF-1α
meningkat karena penurunan degradasi oleh proteasome.8 Dalam beberapa penelitian sebelumnya,
HIF-1α menginduksi transisi epitel-mesenkimal (EMT) sel tumor pada karsinoma hepatoseluler. 9,10
EMT memainkan peran penting dalam invasi tumor dan metastasis.11,12 EMT awalnya dikenal sebagai
perubahan fenotipik selama perkembangan embrionik, remodeling jaringan, dan penyembuhan luka.13
Ketika EMT terjadi, sel kehilangan adhesi interselular, mengubah morfologi menjadi spindel Penampilan
berbentuk, dan meningkatkan mobilitas

Dalam penelitian ini, kami melakukan skrining gen yang secara signifikan dan relatif naik atau turun
dalam transformasi maligna AB dengan analisis microarray DNA dan berfokus pada dua gen yang
diregulasi, faktor yang diinduksi hipoksia-faktor 1, subunit alfa (HIF1A), dan seng jari E-box- mengikat
gen homeobox 1 (ZEB1). Kedua gen ini keduanya memainkan peran penting dalam induksi EMT. Hasil
penelitian histopatologis dan uji sel hipoksia in vitro mengklarifikasi bahwa HIF-1α dan ZEB1 yang
diinduksi hipoksia sangat penting untuk transformasi ganas AB melalui EMT yang bergantung TGF-β.

2 | BAHAN DAN METODE

2.1 | Profil pasien dan klinikopatologis

Studi klinis ini menggunakan informasi pasien dilakukan di bawah izin komite etika di Fukuoka Dental
College (nomor ID: 339). Sebelas kasus AB (pria / wanita: 8/3, usia rata-rata: 35,8 tahun (kisaran: 15-66
tahun)) dan 5 kasus AC (pria / wanita: 3/2, usia rata-rata: 44,4 tahun ( kisaran: 16-72 tahun)) diperiksa.
Pasien Jepang ini menjalani operasi di Fukuoka Dental College Hospital, Fukuoka, Jepang, antara 2010
dan 2018. Kemoterapi maupun iradiasi tidak diresepkan untuk pasien sebelum operasi. Klasifikasi
histologis dilakukan sesuai dengan kriteria "Klasifikasi Tumor Kepala dan Leher 2017" WHO 2017. arsip
diagnostik kami, AC # 1 dan # 2 terjadi di masing-masing AB yang sudah ada, # 1 dan # 2, dan AC # 3
berisi komponen AB dan AC ketika diperiksa, sehingga kasus AC # 1 hingga # 3 didiagnosis sebagai
sekunder. AC.

2.2 | Total isolasi RNA dari sampel parafin yang tertanam dengan formalin

Menurut protokol pabrik, total RNA diisolasi dari sampel formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE)
menggunakan ReliaPrep FFPE Total RNA Sistem Miniprep (Promega Corp). Kualitas RNA diperiksa
menggunakan Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies).

2.3 | Mikroarray ekspresi gen

Menurut protokol pabrikan, cRNA diamplifikasi dan diberi label menggunakan Kit Reagen Pico GeneChip
WT (Thermo Fisher Scientific) dan hibridisasi menggunakan Clariom D Array, Manusia (Thermo Fisher
Scientific). Semua slide microarray hibridisasi dipindai menggunakan Affymetrix GeneChip Scanner.
Intensitas hibridisasi relatif dan nilai hibridisasi latar belakang dihitung dan dinormalisasi menggunakan
Affymetrix Expression Consol Software (ver. 1.4.1).

2.4 | Antibodi

Antibodi primer, antibodi monoklonal anti-manusia E-cadherin kelinci manusia (# 3195) dan antibodi
monoklonal anti-manusia β-aktin manusia (# 4967), dibeli dari Cell Signaling Technology Inc. Antibodi
ZEB1 anti-manusia kelinci (HPA027524) dibeli dari Sigma ‐ Aldrich. Antibodi monoklonal anti-manusia
HIF-1α tikus (ab16066), antibodi TGF-β manusia anti-manusia (ab92486), dan antibodi anti-vimentin
tikus (ab8978) dibeli dari abcam. Antibodi sekunder, horseradish peroxidase (HRP) - polimer anti-kelinci
dan antibodi anti-tikus terkonjugasi, dibeli dari DAKO-Agilent Technologies Co. IgG anti-kelinci
terkonjugasi 594 IgG dan antibodi IgG anti-tikus konjugasi Alexa Fluor 488 dibeli dari Thermo Fisher
Scientific.

2.5 | Imunostaining untuk jaringan dan sel

10% netral buffered formalin-fixed dan blok jaringan yang tertanam parafin dipotong menjadi 4 bagian
tebal μm untuk HE dan pewarnaan imunohistokimia. Pengambilan antigen dilakukan untuk semua
bagian dengan perlakuan autoklaf pada 121 ° C selama 5 menit dalam buffer 0,01 mol / L sitrat, pH 6,0.
Immunostaining dilakukan dengan menggunakan kit EnVision / horseradish peroxidase (HRP) (DAKO-
Agilent Technologies Co., Santa Clara, CA, USA). Secara singkat, bagian-bagian tersebut diperlakukan
dengan larutan hidrogen peroksida-metanol 0,1% untuk menghambat aktivitas peroksidase endogen
dan 5% BSA / TBS untuk memblokir ikatan non-spesifik dari antibodi primer. Selanjutnya, setiap bagian
diinkubasi dengan antibodi primer terhadap HIF-1α (pengenceran 1: 100), ZEB1 (pengenceran 1: 500),
atau E-cadherin (pengenceran 1: 200) pada suhu 4 ° C semalam. Bagian-bagian ini kemudian diinkubasi
dengan HRP-conjugated polymer anti-kelinci atau anti-mouse antibody. Aktivitas peroksidase
divisualisasikan menggunakan 0,1% 3, 3′-diaminobenzidine dan 0,01% hidrogen peroksida dalam TBS.
Untuk pewarnaan imunofluoresen, setelah inkubasi dengan masing-masing antibodi primer, bagian
diinkubasi dengan Alexa Fluor 594-terkonjugasi kambing anti-kelinci IgG (1: 1000 pengenceran) atau
Alexa Fluor 488-terkonjugasi kambing anti-mouse IgG (pengenceran 1: 1000) antibodi sekunder, diikuti
oleh counterstaining nuklir dengan DAPI (pengenceran 1: 3000). Kemudian, bagian dipasang
menggunakan VECTASHIELD (Vector Lab.). Gambar HE dan pewarnaan imunohistokimia ditangkap
menggunakan mikroskop (AXIO Vert.A1, Carl Zeiss Inc). Gambar pewarnaan imunofluoresen
divisualisasikan dan ditangkap pada panjang gelombang yang sesuai menggunakan mikroskop
fluoresensi (LSM 710, Carl Zeiss Inc). Gambar diproses menggunakan ZEN 2010B Sp1 Ver. 6.0.0.485
perangkat lunak (Carl Zeiss Inc.). Untuk imunositokimia, prosedur immunostaining yang sama dijelaskan
di atas diterapkan untuk sel setelah fiksasi dengan 4% paraformaldehyde (PFA).

2.6 | Penilaian imunohistokimia

Tingkat kepositifan imunoreaksi pada setiap lesi ditentukan sesuai dengan metode yang dimodifikasi
dari yang asli yang dijelaskan oleh Allred et al.14 Secara singkat, kami secara acak memilih tiga area pada
lesi bagian AB atau AC dan menghitung jumlah sel tumor yang imunoreaktif. untuk HIF ‐ 1α atau ZEB1
dalam sitoplasma dan / atau nukleinya. Persentase sel atipikal imunoreaktif digambarkan sebagai skor
proporsi (PS) [diberi skor pada skala 0-3; 0: 0%, 1: kurang dari 10%, 2: kurang dari 30%, 3: sama dengan
atau lebih dari 30%]. Intensitas pewarnaan juga digambarkan sebagai skor intensitas (IS) (diberi skor
pada skala 0-3; 0: negatif, 1: lemah positif, 2: sedang positif, 3: sangat positif). Proporsi dan skor
intensitas dijumlahkan untuk menghasilkan skor total (TS = PS + IS) [diberi skor pada skala 0, 2–6].
Kemudian, skor rata-rata TS secara statistik dibandingkan untuk menganalisis korelasi antara ekspresi
HIF-1α atau ZEB1 dan fitur histopatologis.

2.7 | Budaya sel

Garis sel ameloblastoma manusia AM-1 didirikan dari ameloblastoma tipe pleksiform yang mewakili fitur
khas sel asli15 dan dengan baik didonasikan oleh Dr Mitsuyasu (Universitas Kyushu) .16 Sel ditanam
dalam medium bebas serum keratinosit yang ditentukan (D-KSFM; Invitrogen) dan diinkubasi pada suhu
37 ° C, 5% CO₂. Sel terkena hipoksia (1,0% O2) dalam ruang hipoksia (Anaelopack Kenki; Perusahaan
Kimia Gas Mitsubisi) untuk periode waktu yang ditunjukkan. Induksi EMT dilakukan seperti yang
dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, sel-sel diperlakukan dengan TGF-β (5 ng / mL) dalam MEM yang
dilengkapi dengan EGF (10 ng / mL), 100 × sel pemindah insulin, dan 50 nmol / L hidro-kortison, selama
72 jam.

2.8 | Western blotting

Sel AM-1 dihomogenisasi dalam buffer lisis dingin dan disentrifugasi selama 30 menit pada suhu 4 ° C.
Supernatan (20 μg) dipisahkan pada gel Bis-Tris Plus 4% -12% (Thermo Fisher Scientific) dan dipindahkan
ke membran polyvinyldifluoride (Millipore). Analisis imunoblot dilakukan dengan menggunakan mouse
anti-HIF-1α, kelinci anti-ZEB1, kelinci anti-manusia E-cadherin, mouse anti-vimentin, dan kelinci anti-
manusia TGF-β antibodi kelinci (semua pengenceran 1000: 1). Antibodi anti-manusia β-aktin manusia
(pengenceran 1: 5000) digunakan sebagai standar internal. Bercak dikembangkan dengan horseradish
peroxidase (HRP) - antibodi sekunder yang terhubung (pengenceran 1: 3000) dan divisualisasikan oleh
sistem chemiluminescence (ECL) yang ditingkatkan menggunakan ImmunoStar Zeta (Wako), dan pita-
pita tersebut terdeteksi oleh LAS ‐ 4000 (GE Healthcare).
2.9 | Uji penyembuhan luka

Luka disiapkan dengan menggunakan Culture ‐ Insert (2 well; ibidi). Sel-sel AM-1 dikultur selama 48 jam
dalam kondisi objektif dan membuang Culture-Insert. Setelah 24 jam kultur berkelanjutan, area luka
yang tersisa ditentukan menggunakan ImageJ (National Institutes of Health). Rasio penutupan (CR) dari
area yang terluka dihitung dengan rumus berikut: CR = (w-rw) / w × 100 (%) (w: area yang terluka pada
titik awal, rw: area yang terluka tersisa). Kemudian, nilai rata-rata CR di setiap kondisi dibandingkan
secara statistik.

2.10 | Analisis statistik

Semua data dinyatakan sebagai mean ± standard error of the mean (SEM). Uji t siswa dan uji Mann-
Whitney U diterapkan untuk perbandingan antara dua kelompok. Tes Kruskal-Wallis dan uji Mann-
Whitney U berturut-turut dengan koreksi Bonferroni diterapkan untuk beberapa perbandingan.
Signifikansi statistik ditetapkan sebagai * P <.05, ** P <.01 dan *** P <.001.

3 | HASIL

3.1 | Gen HIF-1α dan ZEB1 secara representatif dan signifikan diregulasi dalam AC dengan analisis
microarray DNA

Seperti yang dijelaskan dalam bahan dan metode, tiga kasus AC # 1 hingga # 3 didiagnosis sebagai AC
sekunder (Tabel 1). Dalam tiga kasus AC sekunder ini, AC # 1 dan AB # 1 yang sudah ada sebelumnya
yang diperoleh dari pasien yang sama menunjukkan ciri khas histopatologis AC dan AB. Yaitu # 1 AB
menunjukkan pertumbuhan folikel dari dua jenis sel tumor yang terdiri dari sel-sel palisade kolumnar
perifer dan sel-sel stellat sentral yang diatur secara longgar (Gambar 1A; a), dan # 1 AC terdiri dari
pertumbuhan padat sel-sel tumor odontogenik atipikal yang sangat parah yang sebagian menunjukkan
AB- seperti morfologi atau penampilan spindleshaped yang menunjukkan induksi EMT (Gambar 1A; b).
Dengan demikian, kami memilih # 1 AC dan bahan AB # 1 yang sudah ada sebelumnya dan total RNA
yang diperoleh dari sampel diterapkan untuk analisis microarray DNA untuk menyaring gen yang
signifikan dan relatif penting dalam transformasi ganas AB. Kami menyelidiki gen terkait transformasi AB
ganas menggunakan istilah ontologi gen (GO). Meskipun banyak gen diregulasi dalam AC # 1, kami
pertama-tama berfokus pada satu istilah GO, "aktivitas faktor transkripsi, pengikatan DNA spesifik-
urutan" dan mengambil HIF1A sebagai salah satu gen terpenting dalam tujuan kami dengan hasil bahwa
HIF1A sebenarnya gen yang diregulasi ketiga di AC # 1 (Tabel 2). Scatterplots mewakili ekspresi gen di # 1
AB dan # 1 AC juga menunjukkan bahwa HIF1A secara signifikan meningkat di # 1 AC (Gambar 1B;
lingkaran kuning ditunjukkan oleh panah). Dari sudut pandang yang berbeda, karena # 1 AC secara
histofatologis menunjukkan penampilan sel tumor berbentuk spindle yang menyarankan induksi EMT,
kami juga fokus pada faktor transkripsi terkait EMT. Seperti dengan laporan sebelumnya bahwa
beberapa faktor transkripsi terkait EMT diregulasi dalam induksi EMT dalam perkembangan kanker,
dalam AC # 1 ini, ZEB1 adalah gen yang paling banyak dan signifikan diregulasi oleh analisis microarray
DNA dalam faktor transkripsi terkait EMT (Tabel 6). 3). Selain itu, ZEB1 juga merupakan gen tertinggi
kesepuluh dalam gen yang diregulasi dengan GO term ID (Tabel 2). Dari hasil ini, kami berhipotesis
bahwa HIF-1α dan ZEB1 yang diinduksi hipoksia memainkan beberapa peran penting dalam transformasi
maligna AB melalui induksi EMT.

3.2 | Ekspresi imunohistokimia dari HIF-1α dan ZEB1 lebih kuat di AC daripada di AB

Kami memeriksa lokalisasi seluler dan skor total (TS) dari ekspresi protein HIF-1α dan ZEB1 di semua
sebelas AB dan lima kasus AC yang dijelaskan dalam Tabel 1. Secara imunohistokimia, ekspresi HIF-1α
lemah pada AB (Gambar 2A; a) tetapi jelas baik di nukleus dan sitoplasma sel AC (Gambar 2A; b, panah
dan inset). Kasus AB dan AC lainnya juga mengungkapkan kecenderungan imunohistokimia yang sama
(Informasi Pendukung 1). Ekspresi ZEB1 juga lemah atau tidak terlihat pada ABs (Gambar 2A; c) tetapi
berbeda dan tersebar dalam inti sel AC (Gambar 2A; d, panah dan inset). Dalam korelasi nilai rata-rata
HIF-1α atau ZEB1 TS di antara AB dan AC, kedua ekspresi dalam AC secara statistik dan secara signifikan
lebih tinggi daripada di AB (Gambar 2B). Lebih jauh, koekspresi HIF-1α dan ZEB1 dalam inti sel AC
cenderung diamati di daerah yang menunjukkan pertumbuhan sel AC yang invasif atau agresif dengan
hilangnya adhesi sel-sel atau penampilan pertumbuhan individu (Gambar 2C, panah). ). Dari temuan ini,
baik HIF-1α dan ZEB1 dapat berkontribusi dan menjadi biomarker potensial prediktif untuk transformasi
maligna AB.

3.3 | Ekspresi HIF ‐ 1α dan ZEB1 yang diinduksi hipoksia dan perubahan morfologis seperti EMT pada sel
AM-1

Untuk mengklarifikasi peran HIF-1α dalam AB dan AC, kami melakukan kultur in vitro hipoksia
menggunakan garis sel ameloblastoma manusia, AM-1. Dalam kondisi hipoksia, peningkatan ekspresi
HIF-1α diamati pada Western blotting (Gambar 3A). Telah diketahui bahwa CoCl2 menghambat
degradasi HIF-1α. Untuk menjelaskan peran HIF ‐ 1α dalam AM ‐ 1, kami memeriksa keuntungan fungsi
HIF ‐ 1α dengan menambahkan CoCl2 dalam sistem budaya AM ‐ 1. Akibatnya, akumulasi lebih lanjut
dari HIF-1α terlihat dalam pengobatan CoCl2 dalam kondisi hipoksia (Gambar 3A). Dalam kondisi
hipoksia ini, AM-1 mengubah morfologi dari penampilan oval atau bulat (Gambar 3B; a) ke yang
berbentuk spindle (Gambar 3B; b). Menariknya, perubahan morfologis yang sama terlihat pada induksi
EMT in vitro yang distimulasi dengan mentransformasikan faktor pertumbuhan β (TGF-β) (Gambar 3D).
Selain itu, sel AM-1 dengan kultur hipoksik menunjukkan peningkatan ZEB1 dan TGF-β dan penurunan
ekspresi E-cadherin di Western blotting (Gambar 3C). Perubahan ekspresi protein ini mirip dengan yang
diakui dalam percobaan induksi EMT oleh TGF-β (Gambar 3E). Selain itu, ketika kami menekan ekspresi
protein ZEB1 menggunakan siRNA dalam sel AM-1, EMT yang diinduksi TGF-β dihambat, yang
mengungkapkan bahwa ekspresi ZEB1 adalah hilir dari pensinyalan TGF-β (Informasi Pendukung 2). Hasil
ini menunjukkan bahwa ekspresi HIF-1α dan ZEB1 yang diinduksi hipoksia dan mengikuti perubahan
morfologis seperti EMT tergantung pada ekspresi TGF-β dalam sel AM-1.

3.4 | Tranilast menghambat EMT yang diinduksi hipoksia dan kemampuan migrasi sel dalam sel AM-1

Kami menemukan bahwa TGF-β diinduksi oleh induksi HIF-1α dan ZEB1 dalam keadaan hipoksia dan
kemudian memainkan peran penting dalam induksi EMT pada sel AM-1. Berdasarkan temuan ini, kami
selanjutnya mencoba untuk mengkonfirmasi apakah TGF-β yang diinduksi oleh HIF-1α dan ZEB1 dalam
hipoksia memainkan peran penting dalam induksi EMT dengan menghambat jalur ini menggunakan
tranilast. Tranilast; Asam anthranilic N-(3 ′, 4 dim dimethoxycinnamoyl) (N 5 5 ′), salah satu dari
hambatan antialergi, dikenal sebagai inhibitor TGF-β. Dapat diprediksi, tranilast menghambat perubahan
morfologis spindle yang diinduksi hipoksia yang diinduksi (Gambar 5). 4A). Analisis Western blotting juga
menunjukkan bahwa tranilast menghambat induksi ZEB1 dan vimentin dan pengurangan E-cadherin
pada hipoksia (Gambar 4B). Immunocytochemistry mengungkapkan bahwa ekspresi E-cadherin ditekan
dan ditranslokasi dari permukaan sel ke sitosol dalam sel AM-1 dengan pengobatan tranilast di hipoksia
dengan kondisi kultur CoCl2 (Gambar 4C). Dalam tes penyembuhan luka, CR menurun secara signifikan
menghasilkan penghambatan kemampuan migrasi sel AM-1 dengan pengobatan tranilast pada hipoksia
dengan kondisi kultur CoCl2 (Gambar 4D, 4). Hasil ini mengungkapkan bahwa TGF-β yang diinduksi oleh
induksi HIF-1α dan ZEB1 dalam hipoksia memainkan peran penting dalam induksi EMT dan pengobatan
tranilast mungkin merupakan pendekatan terapi yang berpotensi berguna untuk mencegah transformasi
ganas AB atau perkembangan AC pada hipoksia. lingkungan mikro tumor.

4 | DISKUSI

Dalam laporan ini, kami bertujuan untuk mengklarifikasi mekanisme transformasi ganas karsinogenesis
AB atau AC. Pada langkah pertama percobaan ini oleh analisis microarray DNA dan scatterplot terhadap
AC dan AB yang sudah ada, kami fokus pada dua gen, HIF1A dan ZEB1, sebagai gen yang menguntungkan
untuk tujuan kami. Selanjutnya, dengan analisis imunohistokimia semikuantitatif, kami mengungkapkan
bahwa ekspresi kedua protein ini secara signifikan lebih tinggi pada AC daripada pada AB. Selain itu,
kami secara imunohistokimia mengenali kecenderungan koekspresi HIF-1α dan ZEB1 dalam inti sel AC
terutama di daerah yang menunjukkan pertumbuhan sel AC invasif atau agresif yang agresif dengan
hilangnya adhesi sel sel atau penampilan pertumbuhan individu. Akhirnya, kami membuktikan bukti in
vitro bahwa hipoksia yang diinduksi HIF-1α dan ZEB1 ekspresi dan perubahan morfologi seperti EMT
dalam sel AM-1, maka uji penghambatan TGF-β menggunakan tranilast mengungkapkan bahwa
perubahan ini tergantung pada TGF- Ekspresi β yang diinduksi oleh ekspresi HIF ‐ 1α dan ZEB1. Akhirnya,
kami menyimpulkan bahwa HIF-1α dan ZEB1 yang diinduksi hipoksia sangat penting untuk transformasi
maligna AB melalui EMT yang bergantung TGF-β.

AC adalah tumor odontogenik yang jarang dan ganas yang menunjukkan perilaku klinis yang agresif dan
prognosis yang buruk. Meskipun demikian, saat ini belum ada penanda khusus untuk AC selain dari skor
indeks pelabelan Ki-67 yang dilaporkan sebagai indikator potensial AC.19 Dengan demikian, penemuan
beberapa biomarker bermanfaat lainnya untuk AC sangat dibutuhkan tidak hanya untuk membuat
diagnosis patologis yang pasti tetapi juga untuk mengembangkan terapi klinis baru untuk pencegahan
AC. Dalam laporan ini, kami mengungkapkan bahwa HIF-1α dan ZEB1 dalam lingkungan mikro tumor
hipoksik akan menjadi biomarker potensial baru untuk AC dan kemudian TGF-β sekunder yang diinduksi
dimana induksi EMT bergantung akan menjadi target klinis kritis untuk terapi AC.

Dalam karsinogenesis, akumulasi mutasi gen driver dianggap sebagai faktor utama dalam berbagai
karsinoma. 6,20,21 Dalam ameloblastoma, mutasi SMO dan BRAF sering terlihat.22 Menariknya, mutasi
BRAF juga dilaporkan dalam AC.23 Nobusawa et al melaporkan kasus AC yang berkembang pada AB
yang sudah ada sebelumnya dengan mutasi gen p53. Dengan demikian, disarankan bahwa beberapa
mutasi gen driver yang terakumulasi dalam AB berkontribusi pada karsinogenesis AC. Selain mutasi
driver, perubahan lingkungan mikro tumor sangat penting untuk perkembangan kanker.6,7 Dalam
lingkungan ini, HIF-1α dikenal sebagai master regulator untuk beradaptasi dengan kondisi hipoksia.25
Juga diketahui bahwa HIF-1α telah diregulasi ulang. pada banyak jenis kanker.9, 10,26 Dari laporan-
laporan sebelumnya dan hasil kami, HIF-1α dalam kondisi hipoksik lingkungan mikro tumor akan
berperan sebagai salah satu pemicu utama transformasi ganas dari AB ke AC. Namun, detailnya belum
diklarifikasi mutasi driver mana yang meningkatkan proliferasi AB dan menginduksi aktivasi HIF-1α
setelah hipoksia lokal.

Telah diketahui bahwa TGF-β disekresikan oleh fibroblast stroma, makrofag, sel endotel, dan sel tumor
di lingkungan mikro tumor 27-29 dan merupakan penggerak utama EMT baik dalam perkembangan
janin maupun dalam perkembangan kanker.30,31 In Selain itu, TGF-β berkontribusi tidak hanya untuk
invasi sel tumor tetapi juga untuk heterogenitas dalam sel induk kanker.32 McLean-Holden et al baru-
baru ini melaporkan tiga kasus AC dengan fitur EMT.33 Selain itu, TGF-β diregulasi oleh HIF-1α di kanker
lambung, kanker payudara, dan fibrosis kulit.34-36 Bersama-sama dengan laporan-laporan sebelumnya,
data kami dari kultur hipoksik AM-1 mengungkapkan bahwa hipoksia yang diinduksi HIF-1α dan
kemudian ekspresi TGF-β di AB, menghasilkan induksi EMT dan potensiasi perkembangan atau invasi sel
tumor.

Baru-baru ini, banyak perhatian diberikan pada kemampuan sel epitel neoplastik untuk memasuki
kembali sel induk, dan generasi sel induk kanker baru (CSC) dari populasi non-CSC dianggap sebagai
salah satu mekanisme penyebab signifikan untuk sel kanker. untuk mendapatkan banyak agresivitas.
Selain itu, plastisitas sel yang beralih dari keadaan non-CSC ke CSC bergantung pada ZEB1, regulator
penting EMT. Yaitu non-CSC mempertahankan promotor ZEB1 dalam konfigurasi kromatin bivalen agar
siap merespons sinyal lingkungan mikro seperti TGF-β. Promotor ZEB1 merespons sinyal-sinyal tersebut
yang dikonversi dari konfigurasi kromatin bivalen menjadi aktif untuk meningkatkan transkripsi ZEB1 dan
kemudian non-CSC kemudian memasuki keadaan CSC.37 Dalam beberapa laporan, HIF-1
mempromosikan ekspresi ZEB1 dan EMT dalam hipoksia dan HIF-1α / / Sumbu ZEB1 berkontribusi pada
peningkatan agresivitas sel kanker dalam migrasi dan invasi seperti itu atau metastasis jauh pada kanker
kandung kemih dan glioblastoma.38,39 Dalam penelitian kami, HIF-1α dan ZEB1 keduanya secara
signifikan dan relatif diregulasi dalam AC daripada di AB oleh DNA microarray analisis. Dengan demikian,
poros HIF-1α / ZEB1 pada hipoksia juga dapat berkontribusi pada transformasi ganas AB atau
peningkatan agresivitas sel AC dan menjadi target terapi kritis pada AC untuk meningkatkan prognosis.

Tranilast, analog dari metabolit triptofan, pertama kali dilaporkan pada tahun 1976 oleh Koda et al
sebagai agen anti alergi dan digunakan dalam pengobatan penyakit inflamasi seperti asma bronkial,
keloid, dan bekas luka hipertrofik. 18 Pada tahun 1987, dilaporkan bahwa tranilast menghambat
proliferasi fibroblas dan deposisi kolagen yang ditekan secara selektif; kemudian, tranilast dipandang
sebagai agen antiproliferatif baru.40 Selanjutnya, menjadi jelas bahwa selain sel normal, tranilast secara
efektif menghambat proliferasi beberapa sel tumor seperti lambung, 41 pankreas, 42 prostat, 43 dan sel
kanker payudara 44, sel glioma ganas 45, dan karsinoma sel skuamosa. Jadi, tranilast sekarang juga
dianggap sebagai agen antitumor. Baru-baru ini, target utama untuk tranilast dilaporkan adalah
penindasan jalur pensinyalan TGF-β. Dalam karsinogenesis, TGF-β memainkan peran paradoks dalam
setiap tahap yang berbeda. Yaitu TGF-β menekan perkembangan lesi awal, tetapi sel-sel kanker
kemudian menghasilkan TGF-β dan pada tahap ini TGF-β berkontribusi terhadap perkembangan tumor.
Untuk efek yang terakhir ini, juga dilaporkan bahwa tranilast menghambat ekspresi dan / atau sekresi
TGF-β dari sel kanker atau sel stroma. Dalam studi kultur in vitro kami menggunakan sel AM-1, tranilast
menurunkan regulasi aktivitas migrasi dengan menghambat ZEB1 ekspresi dan induksi EMT. Data ini juga
kompatibel dengan orang-orang dalam laporan bahwa tranilast menghambat ekspresi gen yang terkait
dengan EMT oleh penindasan jalur pensinyalan TGF-β. Dengan demikian, tranilast mungkin juga menjadi
agen terapi potensial untuk mencegah transformasi ganas dari AB dan AC. perkembangan.

Singkatnya, kami di sini mengklarifikasi bahwa HIF-1α dan ZEB1 secara signifikan diregulasi dalam AC dan
juga sangat diekspresikan dalam sel AC. Hipoksia menginduksi ekspresi HIF-1α dan ZEB1 dan EMT dalam
sel AM-1. Induksi ini dihambat oleh penghambatan jalur pensinyalan TGF-β menggunakan tranilast.
Kemudian, aktivitas migrasi sel AM-1 juga dihambat oleh penekanan jalur pensinyalan TGF-β dengan
pengobatan tranilast. Akhirnya, kami menyimpulkan bahwa HIF-1α dan ZEB1 yang diinduksi hipoksia
sangat penting untuk transformasi maligna AB melalui EMT yang bergantung TGF-β. Kemudian, tranilast
mungkin efektif untuk mencegah transformasi maligna dari perkembangan AB dan AC.