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MANUAL DE PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA VETERINARIA

DIANA S. RÍOS DÍAZ

diana.rios@unipamplona.edu.co
LADY NIÑO VERA
ladyjohanitaninovera@gmail.com
CANDELARIA MADRID
candelaria.madrid@unipamplona.edu.co

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINARIA
PAMPLONA, NORTE DE SANTANDER, COLOMBIA
2016
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INDICE DE CONTENIDO

Introducción

Normas de seguridad
pag
Practica 1: Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología 4

Práctica 2: Esterilización 12

Práctica 3: Preparación de medios de cultivo 17

Práctica 4: Siembra y características de los cultivos bacterianos 26

Practica 5: Tinciones Simples y Visualización de Bacterias 35

Practica 6: Tinciones Bacterianas Compuestas 46

Practica 7: Medios Selectivos y Diferenciales 56

Practica 8: Metabolismo Microbiano 62

Practica 9: Sensibilidad Bacteriana a los Antibióticos/ Antibiograma 67

Practica 10: Morfología Fúngica 71

INTRODUCCION

Las enfermedades infecciosas asociadas a bacterias y hongos son quizá una de las
más frecuentes patologías en medicina veterinaria y es preciso reconocer el
microorganismo implicado en las mismas.
El aislamiento, identificación y la confrontación antibiótica permiten determinar el
manejo idóneo del paciente infectado.
Con este manual se pretende introducir al estudiante en las técnicas básicas
microbiológicas y que tenga una aproximación al diagnóstico de bacterias y hongos
de relevancia clínica veterinaria, además de brindarle herramientas para la
interpretación de resultados.
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NORMAS DE SEGURIDAD

1. El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado

2. El personal que trabaje en el laboratorio es responsable del cumplimiento de las
normas de bioseguridad
3. Todas la áreas deben estar señalizadas para el riesgo biológico y el nivel de
contención
4. Es obligatorio el uso de bata manga larga, cerrada y limpia.
5. Los libros, abrigos, bolsos y demás elementos en los lugares indicados, NUNCA
deben estar sobre los mesones o bancos.
6. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesión, con el fin
de evitar contaminaciones por corrientes de aire.
7. Al iniciar y terminar la sesión, se deben desinfectar las áreas de trabajo
8. El laboratorio debe permanecer LIMPIO y ORDENADO durante el trabajo y al
término del mismo, colocar los materiales de descarte y el material limpio en los
respectivos sitios. No debe quedar en los mesones
9. Es obligatorio el lavado correcto de las manos al inicio y finalización de cada
práctica, se deben secar con toallas de papel
10. Es obligatorio el uso de guantes, cofia, tapabocas y demás barreras de protec-
ción según el nivel de riesgo. El cabello debe permanecer recogido
11. Está totalmente prohibido comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos en el la-
boratorio (la pestañina puede acelerar el daño a los oculares), no se deben utili-
zar lentes de contacto. El calzado debe ser cerrado y el pantalón largo.
12. Se deben usar pipeteadores, nunca utilizar la boca
13. Hablar en tono bajo y no realizar recorridos innecesarios dentro del laboratorio,
esto con el fin de evitar distracciones y accidentes
14. Emplear los equipos según las instrucciones de los Procedimientos Operativos
Estandarizados POE, emplear las guías de las prácticas. No se deben manejar
los equipos si se desconoce su uso
15. Se debe evitar el derrame de muestras, manipulándolas dentro del laboratorio
en contenedores como neveras o cajas herméticas, estas deben ser resistentes
y con material absorbente en su interior, ser fácilmente desinfectables y no ser
empleadas para otros fines
16. Los guantes deben ser descartados correctamente al finalizar cada jornada,
nunca serán reutilizados. No se deben manipular objetos como teléfonos con
ellos puestos
17. Todo accidente y derrame debe ser informado inmediatamente a la persona en-
cargada del laboratorio
18. Se deben usar gafas y máscaras si existe riesgo de salpicadura y/o aerosoles
19. El personal que presente prueba de mantoux negativa, no puede ingresar a
áreas de diagnóstico de tuberculosis
20. Cada estudiante debe contar con el siguiente equipo de trabajo básico: Láminas
portaobjetos, laminillas, jabón, tijeras, cinta de enmascarar, lápiz o marcador de
vidrio, papel absorbente, algodón, alcohol, frascos para descartar portaobjetos,
asas bacteriológicas y micológicas, guantes y pipeteador.
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PRACTICA 1

Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología

1.Objetivos

- Reconocer los aspectos básicos de bioseguridad y reglas generales del

trabajo diario en un laboratorio de microbiología.
- Preparar soluciones desinfectantes según las concentraciones requeridas en
las diferentes aplicaciones.
- Relacionar la clasificación de los agentes biológicos y los laboratorios, según
el riesgo biológico.
- Hacer correcto uso de los equipos de trabajo, reconocer su fundamento y
manejo.

2.Materiales

Elementos de Bioseguridad

3. Reactivos

No aplica

4.Marco Teórico

El personal de los laboratorios de microbiología trabaja con agentes potencialmente

infecciosos o materiales que pueden contenerlos. Algunos de estos microorganismos
llegan a ser patógenos según las condiciones de exposición, por lo que evitar este
escenario es un elemento primordial de la competencia profesional del personal.
Es el trabajo seguro responsabilidad del laboratorista, no sólo por autocuidado sino
para proteger la salud de los demás y del medio ambiente.
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Agentes desinfectantes de uso común

Agente Mecanismo de acción Uso

Componentes fenólicos:
fenol
Halógenos:
Compuestos clorados:
Hipoclorito de sodio
(NaClO)
Componentes de Yodo:
Tintura de Yodo.
Solución Povidona-yodo.
Germicida, altera proteína
Desinfección: solución al
Surfactante
5%
Es irritante y tóxico
Efecto germicida por la combinación rá-
pida con proteínas. Purificación del agua.
Los clorados reaccionan con el agua Sanitación de utensilios
para formar ácido hipocloroso, el cual en industrias.
es bactericida. Microbicida.
Oxidante, corrosivo para metales, de Para limpieza de
degradación con el tiempo, se reco- superficies se
mienda almacenarlas en frascos color recomienda a una
ámbar, guardar las soluciones en fras- concentración de 1%.
cos herméticamente cerrados, protegi- Las soluciones pueden
dos de la luz, el calor y la humedad; varias entre 1g/L y 10g/L
preparar la cantidad para uso.
Tintura de yodo es
empleada como
No se tiene claro el mecanismo de ac-
antiséptico (de uso en la
ción. Se cree precipita las proteínas.
piel.)
Agente activo de superficies.
Efectivo contra esporas,
hongos y virus.

Una recomendación de concentraciones de hipoclorito de sodio a emplear según el

elemento es usar la siguiente fórmula

Gramos gr o centímetro cúbicos de la sln concentrada = (Volumen en litros de la

solución a preparar) X ppm que se requiere) / (concentración del producto comercial
en % x 10)

Partes por Millón

Elemento a Desinfectar
(ppm)
Agua potable 0.2
Desinfección de manos 50
Desinfección: camillas, mesas, camas, instrumental de acero inoxidable 200
Desinfección de pisos, mesones en baldosín, ropa, útiles de aseo, material
500
plástico.
Material contaminado (VIH,VHB, VHC) 500
Desinfección de material orgánico. 5000

No olvide las siguientes recomendaciones:

Preparar la solución diariamente para su uso

Utilizar recipientes que no sean metálicos
Mantener el producto en un lugar seco y protegido de la luz
Emplear la concentración recomendada
No mezclar con otras sustancias (jabón, yodo, etc.)
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Utilizar guantes para su empleo

Sumergir el material por 30 minutos, posteriormente lavar con agua, jabón, agua,
y posteriormente esterilizar

Agentes biológicos según el grupo de riesgo, niveles de contención y medidas

según el nivel:

Los agentes biológicos se clasifican en 4 grupos de riesgo según la probabilidad de

infección:

Agentes biológicos de grupo de riesgo 1: De escaso o nulo riesgo individual y

comunitario. Microorganismo que tiene pocas probabilidades de causar enfermedad
en humanos o animales.

Agentes biológicos de grupo de riesgo 2: De riesgo individual moderado y riesgo

comunitario bajo. Agentes patógenos que pueden causar enfermedades en humanos
y animales, pero que tiene pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el
personal de laboratorio, la comunidad, el ganado o el medio ambiente. La exposición
puede provocar una infección grave, se disponen de medidas eficaces de
tratamiento y prevención, y el riesgo de propagación es limitado.

Agentes biológicos de grupo de riesgo 3: De riesgo individual elevado y riesgo

comunitario bajo. Agente patógeno que suele provocar enfermedades humanas y
animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo infectado a
otro. Se dispone de medidas eficaces de tratamiento y prevención.

Agentes biológicos de grupo de riesgo 4: De elevado riesgo individual y comunitario.

Agente patógeno que suele provocar enfermedades graves en las personas o en los
animales y que puede propagarse fácilmente de un individuo a otro, directa o
indirectamente. No suele disponerse de medidas eficaces de tratamiento y
prevención.

La seguridad biológica se fundamenta en 3 elementos: técnicas de laboratorio,

equipo de seguridad y diseño de las instalaciones. Se hace referencia a contención a
los métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio.
Se diferencian 4 niveles de contención o seguridad biológica con base a los 3
elementos de seguridad y las operaciones que se realizan, las vías de transmisión
de los agentes infecciosos que allí se manejan y la función o actividad del
laboratorio.

Medidas de contención:

Medidas de contención 2 3 4
1. El lugar de trabajo se encontrará separado de
toda actividad que se desarrolle en el mismo No Aconsejable Sí
edificio
2. El aire introducido y extraído del lugar de trabajo
Sí, para la Sí, para la
se filtrará mediante la utilización de filtros de alta
No salida de entrada y salida
eficacia para partículas en el aire (HEPA) o de
aire de aire
forma similar
3. Solamente se permitirá el acceso al personal Aconsejabl Sí, con esclusa
Sí
designado e de aire
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4. El lugar de trabajo deberá poder precintarse para

No Aconsejable Sí
permitir su desinfección
5. Procedimientos de desinfección específicos Sí Sí Sí
6. El lugar de trabajo se mantendrá con una
No Aconsejable Sí
presión negativa respecto a la presión atmosférica
7. Control eficiente de vectores, por ejemplo, Aconsejabl
Sí Sí
roedores e insectos e
Sí, para
Sí, para
banco de Sí, para banco de
banco de
8. Superficies impermeables al agua y de fácil pruebas, pruebas, mesa de
pruebas y
limpieza mesa de trabajo, suelo,
mesa de
trabajo y paredes y techos
trabajo
suelo
9. Superficies resistentes a ácidos, álcalis, Aconsejabl
Sí Sí
disolventes y desinfectantes e
Sí,
10. Almacenamiento de seguridad para agentes
Sí Sí almacenamiento
biológicos
seguro
11. Se instalará una ventanilla de observación o un
Aconsejabl
dispositivo alternativo en las zonas de manera que Aconsejable Sí
e
se pueda ver a sus ocupantes
12. Laboratorio con equipo propio No Aconsejable Sí
13. El material infectado, animales incluidos, Si, cuando
deberá manejarse en una cabina de seguridad Cuando la infección
Sí
biológica o en un aislador u otra contención proceda se propague
apropiada por el aire
14. Incinerador para destrucción de animales Aconsejabl Sí, Sí, en el mismo
muertos e disponible lugar

Cabinas de Seguridad Biológica (CSB): Son cámaras de circulación forzada que

según sus especificaciones y diseño, proporcionan diferentes niveles de protección.
Son fundamentales en un Laboratorio de Microbiología Clínica y se clasifican según
el nivel y tipo de protección. En principio es necesario distinguir entre las campanas
de extracción de gases, las cabinas de flujo laminar y las cabinas de Seguridad
Biológica.

La campana de gases (o vitrina extractora de gases) es un recinto ventilado que

captura los humos y vapores procedentes de la manipulación de los productos
químicos en el laboratorio. Si bien constituye un equipo muy útil en la contención del
riesgo químico, no ofrece protección alguna frente a riesgos biológicos.

Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el
paso del aire a través de un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) barriendo la
superficie de trabajo. El flujo de aire puede ser vertical u horizontal. Estas cabinas
ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca
al operador, por lo que no son recomendables para el trabajo en un Laboratorio de
Microbiología Clínica. Son, sin embargo, un instrumento de trabajo imprescindible en
las denominadas "zonas limpias".

Las cabinas de Seguridad Biológica son recintos ventilados diseñados para limitar al
máximo el riesgo del personal de laboratorio expuesto a agentes infecciosos. Ello es
especialmente importante si se tiene en cuenta que muchas de las operaciones
realizadas en un laboratorio implican la formación de aerosoles. Estos equipos
tienen como objetivo principal proporcionar una zona de trabajo que minimice la
probabilidad que una partícula transportada por el aire tiene de escapar hacia el
exterior de la cabina y contaminar así al operario y a la zona que le rodea. Además,
algunas de ellas, ofrecen protección al material que se manipula.
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Las CSB disponen de dos sistemas que impiden la salida de contaminación: las
barreras de aire y los filtros. Las barreras de aire se crean permitiendo que éste fluya
en una sola dirección y a una velocidad constante dando lugar a una verdadera
"cortina" de aire que se conoce como flujo de aire laminar. Es, por definición, un flujo
con ausencia de turbulencias. Los filtros tienen como finalidad atrapar las partículas
contenidas en este flujo de aire y los empleados habitualmente son los HEPA, que
retienen con una eficacia del 99,97% partículas de hasta 0,3 micras de diámetro.

Las CSB se dividen en tres categorías: clase I, clase II y clase III.

Figura 1. Cabina de seguridad biológica clase I

Figura 2. Cabina de seguridad biológica clase II

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Figura 3. Cabina de seguridad biológica clase III

Control de Calidad: Para generar un proceso analítico de óptima calidad, con

resultados confiables, oportunos y a bajos costos, es necesaria una evaluación
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sistemática del trabajo. Un programa de control de calidad básico microbiológico

incluye ciertos puntos específicos como: materiales y medios de cultivo, reactivos,
equipos, personal, documentación, buen criterio y constante atención en el proceso.

Monitoreo de Medios de Cultivo: aunque los proveedores realizan una evaluación de

los medios de cultivo, es necesaria una evaluación interna de cada laboratorio con
ayuda de los microorganismos de referencia o cultivos tipo en caso de no contar con
ellos, es posible realizar el control con microorganismos recuperados durante el
trabajo diario. Algunas colecciones de microorganismos para control de calidad son:
ATCC (American Type Culture Collection), DMS, etc.
Monitoreo de equipos de Laboratorio: Es necesario un programa de mantenimiento
preventivo para asegurar el funcionamiento adecuado de todos los equipos de
laboratorio de microbiología. Los equipos deben controlarse en intervalos
establecidos, reemplazando piezas que por su uso hayan cumplido su ciclo de
trabajo óptimo.

Procedimientos de control de calidad de equipos comúnmente empleados en

microbiología:
Equipo Procedimiento Intervalo Límites de tolerancia
Refrigeradores Registro de temperatura Diario. 2-8°C.
Congeladores Registro de temperatura Diario. -8 a -20°C.
Incubadoras Registro de temperatura Diario 35.5 ± 1°C.
Incubadoras de Medición de contenido de Diario o 2
5-10%.
CO2 CO2 veces /día
Baños 36 a 38°C o 55 a 57°C
Registro de temperatura Diario.
termostatados según corresponda.
Subcultivo de esporas,
después del ciclo de
Prueba con esporas de
Autoclaves 1 al mes esterilización, sin
Bacillus stearothermophilus
crecimiento indica corrida
estéril.
Calibración con soluciones
± 0.1 unidad de pH del
Potenciómetro de pH en todos los rangos ( En cada uso.
estándar empleado.
ácido, neutro y básico)
Jarra para Color según el control
Indicador de anaerobiosis. Con cada uso
anaerobiosis. empleado.
Controlar revoluciones con
Centrifugas Mensual 5% de lo indicado.
tacómetro.
Campana de Semestral o Flujo de 50 pies de
Medir la velocidad del aire.
seguridad. trimestral. aire/minuto ± 5 pies/minuto.
Rotador Conteo de r.p.m. Con cada uso. ± 10 r.p.m.
El crecimiento indica una
Cultivo de Clostridium novy
Periódicamente. muy baja tensión de O2.
Cabina de tipo B.
Incolora con baja tensión de
anaerobiosis Solución indicadora de azul
Diario. O2.
de metileno.
Personal: El laboratorio de microbiología debe ser dirigido por un profesional en el
área. Todo el personal debe asistir a programa de educación continuada.

Documentación: es importante la existencia de protocolos de operación, donde se

clarifique los objetivos, métodos, y ejecuciones de las actividades. Los
procedimientos operativos estandarizados o normalizados (POE) son una
herramienta en la cual se consigna paso a paso la operación y el control. Se utiliza
para minimizar errores.
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5.Procedimiento
Revise y discuta la guía en grupo

6.Cuestionario

Desarrolle el siguiente taller:

1. Defina y dé ejemplos de soluciones referentes al término:

a. Antiséptico:
b. Desinfectante:
c. Bacteriostático:
d. Bactericida:
e. Germicida:

2.Complete los datos de la siguiente tabla:

Microorganismos
Nivel de Seguridad
Tipo de Laboratorio procesados (escribe 3 Normas especiales
biológica
nombres)

7. Bibliografías

1. Centers for Disease Control and Prevention CDC, (2012). Pautas para prácticas
laborales seguras en laboratorios de diagnóstico médico para humanos y animales.
Recuperado de:
http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1_ensp.htm
2. Ministerio de Salud, (1997). Manual de Normas técnicas, científicas y
administrativas para laboratorio clínico. Bogotá.
3. Luna, J. (1995). Memorias Curso Taller de Garantía de Calidad en Laboratorios de
Microbiología. Universidad de Pamplona.
4. Escobar, R. Prácticas de Laboratorio, (1998). Fundamentos de Microbiología.
Bogotá. Centro Editorial Javeriano (CEJA)
5. Organización Mundial de la Salud OMS, (2005). Manual de Bioseguridad en el
Laboratorio. Recuperado de:
http://www.who.int/topics/medical_waste/manual_bioseguridad_laboratorio.pdf
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PRACTICA 2

Esterilización

1.Objetivos

- Aplicar algunos métodos utilizados para la esterilización de medios de cultivo,

materiales y accesorios utilizados en el Laboratorio de Microbiología.

- Enumerar los diferentes métodos que existen para realizar los

procedimientos de esterilización usados en microbiología.

- Preparar el material para esterilizar y hacer uso del autoclave para el

procedimiento de esterilización.
-
2.Materiales

1.Cajas de petri
2.Tubos de ensayo
3.Pipetas
4.Erlenmeyer
5.Papel kraft
6.Autoclave
7.Horno de aire caliente.
8.Cinta de enmascarar
9.Gasa
10.Algodón
11.Asa bacteriológica
12.Mechero de Bunsen
13.Hisopos
14.Estufa eléctrica
Bajalenguas

3. Reactivos

No aplica

4.Marco Teórico

Introducción
En un análisis microbiológico es importante identificar en forma precisa el
microorganismo involucrado, siendo entonces indispensable un resultado veraz por
parte del laboratorio. Generalmente se debe obtener un cultivo axénico y evitar la
contaminación de origen ambiental. Es necesario descartar o eliminar falsos
positivos causados por esta clase de microbiota. Para realizar una excelente práctica
es fundamental comprender los principios básicos de la esterilización.
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Esterilización
La esterilización es la eliminación o muerte de todos los microorganismos que
contiene un objeto o sustancia, por lo general se acondicionan de tal forma que no
puedan contaminarse nuevamente. El material que se utiliza para determinación de
microorganismos debe esterilizarse previamente para liberarlo de la microbiota
ambiental. Existen varios métodos de esterilización: los agentes físicos (Calor seco,
calor húmedo, radiaciones) y agentes químicos (cloro y compuestos clorados,
aldehídos, óxido de etileno, compuestos fenólicos, ácidos y álcalis).
El agente más empleado es el calor, ya sea húmedo o seco; la efectividad del calor
depende de la temperatura y el tiempo de exposición. Todos los microorganismos
son susceptibles en distinto grado a la acción del calor.

Esterilización por contacto directo

Acción directa de la llama Flameado
CALOR SECO
Incineración
Acción directa por los generadores de calor Estufa de calor seco
Baño de agua hirviente
Acción del agua caliente Calentamiento repetido
CALOR HÚMEDO
Ebullición directa
Acción del vapor de agua Autoclave
Ionizantes Rayos X y gamma.
RADIACIONES
No Ionizantes Ultravioleta

Métodos Físicos

Calor seco: produce desnaturalización de proteínas, efectos tóxicos por desecación

de la célula alcanzando niveles elevados de solutos, procesos oxidativos
irreversibles, fusión y desorganización de las membranas. Estos efectos se deben a
la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en
contacto con éstos.
El horno de aire caliente es el equipo utilizado en los laboratorios para esterilizar por
calor seco; Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición que los métodos
por calor húmedo. La temperatura varía entre 120 y 180 ºC, requiriéndose distintos
tiempos de exposición. A 140ºC se necesitan por lo menos 5 horas de exposición,
mientras que entre 160ºC a 180ºC se requieren al menos 2 horas de exposición.
Sirve para esterilizar material de vidrio. Se recomienda NO abrir la puerta del horno
inmediatamente después del tiempo de esterilización, pues ello puede ocasionar
rotura del material de vidrio. El papel y algodón no pueden ser esterilizados a más de
160ºC.

Ventajas del calor seco: no es corrosivo para metales e instrumentos, permite la

esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y sustancias viscosas no
volátiles.

Desventajas: Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo,

debido a la baja penetración del calor.
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Incineración: Se utiliza para destruir el material descartable contaminado. Ej. Horno

de incineración a nivel hospitalario, muflas, etc.

Acción directa de la llama: se lleva al rojo el material de metal como asas,

lancetas, agujas de disección etc.

Calor húmedo: produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos

se deben principalmente a dos razones: 1.El agua es una especie química muy
reactiva y muchas estructuras biológicas (ARN, ADN, proteínas, etc.) son producidas
por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto reacciones inversas podrían dañar a
la célula por causar generación de productos tóxicos. Además, las estructuras
secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan mediante puentes de
hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a altas
temperaturas. 2. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor
mucho más elevado que el aire. Por lo que los materiales húmedos conducen el
calor más rápidamente que los materiales secos debido a la energía liberada durante
la condensación.

El Autoclave es el equipo utilizado comúnmente en los laboratorios para esterilizar

cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y no se desnaturalicen a
temperaturas mayores de 100ºC. Una temperatura de 121ºC (Una atmósfera de
sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir
microorganismos formadores de esporas. Es necesaria la acción combinada del
calor, tiempo y presión para conseguir la destrucción celular.

Ventajas del calor Húmedo: rápido calentamiento y penetración, destrucción de

formas vegetativas y esporas en corto tiempo, no deja residuos tóxicos, hay un bajo
deterioro del material expuesto, es posible por este método esterilizar materiales que
no resisten el calor seco (material plástico).

Desventajas: no permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua,

es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.

INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL AUTOCLAVE

1. Colocar agua en la olla hasta cubrir la resistencia (no colocar agua en la ca-
misa), el nivel del agua debe mantenerse en cada ciclo de esterilización.
2. Colocar el material a esterilizar dentro de la camisa, colocando previamente
la rejilla en el fondo.
3. Introducir la camisa.
4. Tapar la olla haciendo coincidir las flechas impresas en la tapa y la olla, inser-
tando el tubo flexible en el canal dispuesto en la pared interior de la camisa.
5. Apretar los tornillos haciendo cierre lateral, simultáneo y uniforme. No use lla-
ves para apretar y mantenga las superficies de contacto de la tapa y el borde
interno de la olla perfectamente limpio y lubricado.
6. Abrir la válvula de seguridad colocándola en posición vertical. El vapor gene-
rado en la base del esterilizador, pasa hacia arriba y por fuera del recipiente y
luego hacia abajo a través de los paquetes, hasta la base del recipiente, em-
pujando hacia afuera desde la base a través del tubo flexible de escape y la
válvula de seguridad; es muy importante que la corriente de vapor elimine por
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completo el aire de la cámara de lo contrario la temperatura alcanzada es

mucho menor.
7. Cuando el vapor escapa vigorosamente se debe colocar la válvula en posi-
ción horizontal.
8. A partir de entonces la presión y la temperatura empezarán a aumentar, lo
cual se verá indicado en la aguja del manómetro.
9. Permitir que la aguja llegue a 121 grados centígrados y 15 libras de presión,
es a partir de este momento que se empieza a cronometrar el tiempo de este-
rilización.
10. De 10 a 15 minutos para material limpio.
11. De 30 a 40 minutos para material contaminado.
12. Al finalizar el periodo de esterilización, apagar el autoclave y permitir que el
manómetro baje a cero, levante la válvula para que escape el vapor restante
y proceda a destapar la olla desenroscando los tornillos de manera enfrenta-
da.

Radiaciones: La energía se transmite a través del espacio en gran variedad de

formas, generalmente llamadas radiaciones. Su acción depende del tipo de
radiación, el tiempo de exposición y las dosis de radiación.

Radiaciones no Ionizantes: La luz ultravioleta (UV) tiene como limitante no

penetrar el vidrio, la suciedad, el papel, la pus, etc. Su efecto destructor se cumple
cuando los rayos UV tienen contacto directo con los microorganismos. Se usa para
reducir la población microbiana del aire de los quirófanos, pabellones hospitalarios,
laboratorios, etc. En microbiología es usada en cámaras de repiques de cultivos y
proceso de muestras. Su mecanismo de acción es el daño al ADN, siendo entonces
bactericida. Las radiaciones ultravioletas afectan a las moléculas de ADN de los
microorganismos debido a que forman dímeros adyacentes que inducen a errores en
la duplicación y por lo tanto la pérdida de la viabilidad de las células.

Radiaciones Ionizantes: producen iones y radicales libres que alteran las bases de
los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas y componentes esenciales para
la viabilidad de los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se utilizan para
esterilizar materiales termolábiles (termosensibles), como jeringas descartables,
sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos. No se utilizan para medios
de cultivo o soluciones proteicas por que producen alteraciones de los componentes.

Filtración: en algunas ocasiones es necesario esterilizar soluciones como medios

de cultivo líquidos, soluciones de sustancias sensibles al calor como azúcares,
aminoácidos, antibióticos, sales y similares, sin someterlos a temperaturas de
esterilización. Para esto se utiliza la técnica de filtración, esta consiste en pasar las
soluciones por filtros con poros de diámetros a escala de micras reteniendo por
tamaño a los microorganismos. Este método permite obtener productos solubles
como toxinas, antígenos, antibióticos, etc. La siguiente tabla resume algunos tipos
de filtros.
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Constituidos por tierra de Diatomeas. Poros: Intermedio(N), fino (W) y

FILTROS BERKEFELD ordinario (V). Después de utilizado se cepilla y se hierve en agua
estéril.

FILTROS Constituidos de porcelana sin vidrio. Varios tamaños de poro. El poro

CHAMBERLAND más fino retiene los virus de mayor tamaño.

Constituido por filtros de Asbesto insertados en un recipiente metálico

FILTROS SEITZ
conectado a un erlenmeyer. Retienen bacterias.

Constituidos por filtros de vidrio insertados en un recipiente metálico

FILTROS DE VIDRIO
conectado a un erlenmeyer.
Constituidos de nitrato de celulosa, acetato de celulosa y
FILTROS DE
politetrafluoretileno. Los poros varían de 8 a 0,01 micras. Normalmente
MEMBRANA
se trabaja con presión positiva o negativa a 100 o 200 mm de Hg.

Preparación del material de vidrio

Cristalería nueva: Puede contaminarse con esporas del mismo ambiente por lo
tanto debe hervirse con detergente, enjuagarse con agua corriente y luego agua
destilada para después esterilizar en horno de aire caliente.

Cristalería usada no contaminada: Debe descartarse en solución desinfectante

(hipoclorito o cresol al 3%) para destruir los microorganismos, lavarse con
detergente y esterilizarse en horno de aire caliente.

5.Procedimiento

Dada una lista de materiales, usted debe indicar que método de esterilización es
adecuado en cada caso.
Siguiendo la demostración práctica dada por el profesor, Usted preparará el material
para su posterior esterilización: cajas de petri, pipetas, erlenmeyer, tubos de ensayo,
asas etc. Lleve a esterilizar de acuerdo con el agente físico adecuado.

Procedimiento 1

1. Recorte el papel para envolver material, de acuerdo a las necesidades.

2. Tome el material correspondiente y envuélvalos según las instrucciones del
tutor; por último colóquele un trozo pequeño de cinta control de esterilización.
3. Llévelos al horno de aire caliente y encienda en la temperatura adecuada
(180ºC), una vez alcance los 180°C empiece a contabilizar el tiempo de
esterilización (2 horas).
4. Finalizado el proceso y luego de bajar la temperatura, verifique la cinta
control.

Procedimiento 2

1. Asegúrese de que el nivel del agua sea el adecuado para el proceso, coloque
la rejilla y sobre ella la canasta y dentro de ella el material a esterilizar
(Medios de cultivo, cultivos bacterianos, material biológico).
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2. Cierre correctamente la olla, encienda y controle las condiciones de

esterilización. Observe los colores del manómetro y NO deje que la aguja
llegue a el rojo pues ocurriría una explosión, esto lo puede controlar con el
botón giratorio.
3. Una vez finalizado el tiempo proceda según las instrucciones del uso del
autoclave.

6.Cuestionario

1. ¿Qué es esterilización?
2. Dibuje un autoclave con sus partes y describa su función.
3. ¿Qué medidas podría tomar usted para verificar la efectividad de la
esterilización por autoclavado?
4. ¿Qué es liofilización?
5. ¿Qué es sonicación?
6. ¿Qué otros procesos físicos permiten disminuir la carga microbiana?
7. ¿Qué otros tipos de rayos a diferentes longitudes de onda se emplean para
esterilización?

7.Bibliografías

1. Organización Panamericana de la Salud, (2008). Manual de Esterilización para

Centros de Salud. Recuperado de:
http://www1.paho.org/PAHO-USAID/dmdocuments/AMR-
Manual_Esterilizacion_Centros_Salud_2008.pdf
2. Universidad Nacional de Colombia, (2012). Manual de Bioseguridad y
Esterilización, Facultad de Odontología, Sede Bogotá. Recuperado de:
http://www.laboratorios.bogota.unal.edu.co/userfiles/files/manual_bioseguridad%20y
%20esterilizacion_abril_2013.pdf
3. CDC, (2008). Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities.
Recuperado de:
http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/guidelines/Disinfection_Nov_2008.pdf

PRACTICA 3

Preparación de medios de cultivo

1.Objetivos

Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de

microorganismos aplicando los conceptos básicos de nutrición de los mismos.

Preparar en pequeños grupos los medios de cultivo, líquido o sólido asignados por el
docente; siguiendo las instrucciones dadas en la etiqueta del medio respectivo.
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Almacenar los medios de cultivo (preparados o sintéticos) en el lugar adecuado.

2.Materiales

- Cajas de petri
- Tubos de ensayo
- Pipetas
- Erlenmeyers
- Autoclave
- Cinta de enmascarar
- Gasa
- Algodón
- Mechero de Bunsen
- Estufa eléctrica
- Balanza
- Espátulas
- Frascos tapa azul de 250 ml
- Probetas
- Papel filtro

3. Reactivos

- Medios de cultivo deshidratados

- Agua destilada

4.Marco Teórico

Como todos los organismos vivos, los microorganismos requieren ciertos nutrientes
básicos y factores físicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades
varían según el tipo de microorganismo y es necesario conocerlas para cultivarlos en
el laboratorio.
Las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio por la
variedad de medios de cultivo; estos en general suministran:

 Una fuente de carbono: el carbono es un componente esencial y central para

conformar la estructura celular y permitir a la célula realizar todas sus funciones.
Según la fuente de carbono los microorganismos se encuentran en dos grupo:
autótrofos y heterótrofos. Los organismos autótrofos pueden cultivarse en medios
que contengan únicamente compuestos inorgánicos; usan principalmente dióxido
de carbono como carbono inorgánico. Los organismos heterótrofos en su lugar
necesitan un suministro de carbono orgánico por ejemplo glucosa.
 Una fuente de Nitrógeno: elemento esencial para que la célula construya
macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Algunos microorganismos
usan nitrógeno atmosférico, otros emplean sales de nitrato o de amonio como
compuestos inorgánicos así como otras requieren compuestos orgánicos que
contengan nitrógeno como aminoácidos.
 Elementos no metálicos: iones no metálicos como el Azufre y el Fósforo. El Azufre
puede encontrarse en proteínas, sulfatos o Azufre elemental, mientras el fósforo
está formando sales.
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 Elementos metálicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe +2 y Fe+3): Llamados también
micronutrientes, oligoelementos o elementos traza. Encontrados en sales
inorgánicas y tomados en bajas concentraciones.
 Vitaminas: los microorganismos puede tomarlas del medio, elaboradas o
sintetizarlas. Algunos poseen una variedad de vías para sintetizar vitaminas,
mientras otros sintetizan un número muy limitado de ellas a partir de
componentes del medio; otros las requieren como suministro.
 Agua.
 Energía: Existen dos tipos bioenergéticos de microorganismos, fotótrofos y
quimiótrofos. Los fotótrofos emplean la energía radiante (luz solar) como única
fuente de energía. Los quimiótrofos obtienen la energía por oxidación de
compuestos químicos los cuales pueden ser moléculas orgánicas o inorgánicas

Las necesidades físicas involucran factores como: temperatura, pH y gases, los

cuales se encuentran en un rango óptimo específicos para cada microorganismo, por
lo tanto su variación puede acelerar o disminuir su crecimiento.

El microbiólogo busca satisfacer las necesidades nutricionales para recuperar y

crecer los microorganismos; de manera general estos medios pueden ser medios
naturales o medios químicamente definidos. Para los químicamente definidos se
conocen las cantidades exactas de compuestos químicos puros que los conforman
ya sean de tipo orgánico como inorgánico. Los medios naturales están compuestos
de un número limitado de sustancias complejas, extractos de plantas, de animales,
cuya composición química exacta no se conoce.

Los microorganismos en general pueden tomar los requerimientos nutricionales de

los medios de cultivo, ya sean sustancias naturales o artificiales para multiplicarse.

MEDIOS DE CULTIVO

El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos

en el Laboratorio. Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien
incorporada a un coloide en estado de gel) en las que están presentes todas las
sustancias necesarias para el crecimiento de un (os) determinado(s)
microorganismo(s).

PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Humedad: Indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia

(desecación) puede llevar a la muerte del microorganismo.
Fertilidad: Se refieren a los elementos o compuestos básicos que permiten el
crecimiento bacteriano.
pH: Se refiere al pH óptimo para el desarrollo bacteriano, indispensable para su
aislamiento; variaciones ácidas o alcalinas, pueden inhibir su crecimiento.
Transparencia: Permite la observación bacteriológica, evidenciar morfológica y
físicamente su crecimiento en medios de cultivo adecuado.
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CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Sólidos 1.5 a 2.0 % de agar – agar

Según su estado Semisólidos 0.5 % de agar – agar
físico Líquidos No contienen agar
Bifásico Contiene fase sólida y fase liquida (listos para utilizar)
Utilizados para cultivar microorganismos tal y como se encuentran
Naturales en la naturaleza. Se usan con base a la experiencia y no a su
Según su composición. Ej: Sangre diluida, leche, jugos vegetales.
naturaleza o De composición exactamente conocida. Los más utilizados son los
Sintéticos
composición medios comerciales deshidratados.
Contienen células u organismos vivos, como las células de riñón de
Vivos
mono o huevos embrionados.
Con adición de sangre, suero o extractos
de tejidos de animales o plantas al caldo o
Asilamiento de Medios enriquecidos agar, proporcionando sustancias nutritivas
microorganismos complementarias para el crecimiento de
microorganismos exigentes
Con adición de algunas sustancias que no
permiten el desarrollo de un grupo de
microorganismos sin afectar el desarrollo
Medios selectivos* de los grupos de interés. En principio se
pueden seleccionar los microorganismos
que se desarrollan en medios orgánicos
poco comunes, caso en el cual se omiten
Según su propósito
otros compuestos de carbono.
Contienen reactivos químicos que traen
como resultado determinado tipo de
Medios diferenciales*
crecimiento bacteriano después de la
incubación (observación de hemólisis y
coloraciones de las colonias).
Para determinar el tipo de crecimiento
producido por los microorganismos, así
Medios para como la capacidad para producir cambias
identificación químicos, se utiliza de manera
convencional una amplia variedad de
medios de cultivo.

* Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas es decir permiten aislar
organismos y muestran una reacción o cambio químico especifico de metabolismo
como coloraciones de colonias o cambios de color del medio, es decir selectivos y
diferenciales al tiempo.

La presentación comercial de los medios sintéticos y deshidratados puede ser en

polvo o granulados. En el mercado se pueden encontrar medios listos para fundir o
medios servidos en placas petri o tubos.

4.1 Medios de cultivo granulados

Son medios de cultivo elaborados a partir de materias primas sometidas a molienda,

mezclado, pulverización y granulación (Aglutinación de la mezcla polvorienta) Este
tipo de medios tienen algunas ventajas frente a los medios tradicionales en polvo,
como lo es:
 Reduce alergización o respiración de sustancias tóxicas por producción de polvo.
 Menor adherencia a las paredes de los recipientes
 Mayor facilidad de pesaje.
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 Mejor humectabilidad (grumos fácilmente solubles)

 No se produce disociación de todos los componentes, en el almacenamiento
prolongado.
 Mejor conservación.

ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN

Los medios de cultivo deshidratados se deben conservar en lugar seco, protegidos

contra la luz, a una temperatura entre 15 a 30ºC y en envases bien cerrados.
Después de haber sido retirada una cantidad de medio de los envases, estos deben
cerrarse firmemente.
Los medios de cultivo preparados y esterilizados listos para su uso son utilizables
por tiempos cortos, máximo de una semana y lo más conveniente es almacenarlos a
temperatura de refrigeración (máximo 4ºC), aunque algunos medios que contienen
tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente y protegidos de la luz por un
tiempo máximo de 4 días. Bajo condiciones óptimas de almacenamiento los medios
deshidratados conservan sus cualidades durante el tiempo indicado y hasta la
caducidad impresa en la etiqueta del recipiente.
A los medio de cultivos se les realiza Test de esterilidad, ya sea cuando están
deshidratado (Ecométrico), o preparados. En el último caso se toma del lote una
muestra no inferior al 5%, incubándose estas muestra a 37ºC/24h. Finalizado el
tiempo de incubación se observa si presenta crecimiento microbiano con el fin de
descartar los medios contaminados.

PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Es un proceso clave en el trabajo de rutina e investigación bacteriológica. Para

obtener un producto final bien terminado (medio de cultivo) deberá contarse con la
habilidad, destreza, conocimientos básicos en fisicoquímica y bacteriología.

1. Disolución del medio de cultivo deshidratado: Se debe emplear agua limpia, recién
destilada o desmineralizada y con pH lo más cercano posible al neutro. Los
recipientes a usar deben ser lo suficientemente grandes para que el medio sea
agitado con facilidad.
Inicialmente se añade la mitad de agua y se agita suficientemente para conseguir
una suspensión homogénea; después se incorpora la cantidad de agua restante.
Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento, no debe calentarse más
de lo estrictamente necesario. Leer siempre la etiqueta del envase, en caso de que
no deba ser sometido a ulterior esterilización en autoclave, es imprescindible prestar
atención en su disolución completa, esto se confirma cuando al agitar no se adhiere
a la pared interna del recipiente ninguna partícula de agar o medio y la solución
resbala libremente.

Si la preparación es de más de 2 litros, se recomienda disolver el medio de cultivo en

una décima aproximada a la cantidad prevista de agua y dejarla irrigar durante 15
minutos; calentar a ebullición el agua restante, agregar ésta agua con constante
agitación al medio humedecido, y calentar hasta su completa disolución.
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2. Esterilización: Antes de su esterilización y después de su completa disolución se

debe repartir el medio de cultivo en los recipientes definitivos o en los que
ulteriormente se lleve a cabo el trabajo de investigación, Excepto si corresponde a
cajas de petri.
La esterilización, si así lo indica la etiqueta, se lleva a cabo en el autoclave a 121ºC
a 15 libras de presión por 15 minutos.
Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones
(válvula abierta) y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, este debe
sacarse enseguida del autoclave y enfriar los recipientes rápidamente a temperatura
de vertido entre 45 y 50º C, así se evitará alterar el medio de cultivo.

3. Vertido en placa: Previamente remover el medio de cultivo oscilando el recipiente

en sentido circular para entremezclarlo de manera uniforme. Verter el medio a las
cajas de petri a la temperatura de vertido evitando la formación de humedad en la
tapa de la caja de petri.
Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente
con la llama no luminosa de un mechero de bunsen.

4. Tubos de agar inclinado y sin inclinación: Los tubos llenos de medio de cultivo
esterilizado, todavía líquido, se colocan en una posición inclinada de tal forma que se
forme una placa de aproximadamente 3 cm. y una superficie inclinada de iguales
dimensiones. (Agar inclinado en pico de flauta). En los casos en los cuales se
requiere el medio sin inclinar, estos deben dejarse solidificar en posición vertical
sobre una gradilla.

POSIIBLES DEFECTOS EN LA MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE

MEDIOS DE CULTIVO

 Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una

conservación en ambiente exclusivamente húmedo, puede ser la causa de
envase abierto por tiempo prolongado o dejar mal cerrado el envase después de
su uso o por último que el medio de cultivo este pasado de fecha. Se recomienda
después de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en posición horizontal.
 Desviación del pH. Causado por utilización de agua no neutra, envase mal
cerrado, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación o medio
pasado de fecha.
 Turbidez. Precipitación causada por uso de recipientes incorrectamente limpios,
sobrecalentamiento, pérdida de agua por evaporación del medio.
 Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporción inadecuada del medio de
cultivo deshidratado, mala disolución, ineficiencia en la agitación.
 Medios de cultivo contaminados: por esterilización deficiente o contaminación
ulterior a su preparación.
 Colonias inconcretas o desleídas. Causada por superficie del medio húmeda y por
demasiado inóculo en la siembra.
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CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO

Medios simples:

 Agar Nutritivo: Contiene extracto de carne, peptona, agar.

 Caldo Nutritivo: Contiene extracto acuoso de carne adicionado de peptona al 1%
y cloruro de sodio al 0.5%. Por ejemplo, BHI (Brain Heart Infusion), TSB (caldo se
soya tripticasa), Nutrient broth.
 Blood Agar Base o Trypticasa Soya Agar: Medio sólido que contiene peptona,
enriquecido con sangre desfibrinada de conejo al 7%. Usado para el desarrollo de
todo tipo de bacterias y especialmente para observar la actividad hemolítica.

MEDIOS ENRIQUECIDOS:

 Agar Sangre: Al medio agar sangre se le añade sangre de conejo desfibrinada al

7% estéril cuando este tenga una temperatura de 45º C luego de su esterilización.
 Agar Chocolate: Consiste en un agar sangre que antes de su solidificación se
lleva a 100º C por 1 minuto (ebullición), así se rompen los glóbulos rojos tomando
un color marrón. Se usa para el aislamiento de Haemophilus y Neisseria sp.

 Medio Tioglicolato: Permite el aislamiento de aerobios tolerante y anaerobios.

Debe conservarse en la oscuridad, en tubos tapa rosca, de manera que la
anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en la superficie.

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES:

 Agar Mac Conkey: Medio selectivo para el crecimiento de enterobacterias.

Contiene peptona, sales biliares, lactosa, y rojo neutro.
 Agar SS: Contiene sales biliares en mayor concentración que el agar Mac Conkey
y verde brillante que impide el crecimiento de bacterias coliformes pero permite el
crecimiento de Salmonella y Shigella sp.

 Agar EMB (Eosina Azul de Metileno): Contiene colorante que impide el

crecimiento de bacterias Gram positivas. E. coli crece dando colonias con brillo
metálico característico.
 Medio Telurito: Permite el crecimiento de Corinebacterias, Staphylococcus,
Listerias. El telurito de potasio al 2% es reducido por las Corinebacterias
reductoras apareciendo colonias de color gris-negro.
 Medio Sabouraud: Contiene dextrosa peptona o maltosa agar, pH entre 5 - 5.5
inhibiendo el desarrollo de microorganismos que no sean hongos.

MEDIOS DE TRANSPORTE

 Mantienen viables los microorganismos de una muestra antes de que se

procesen, los conserva evitando su multiplicación y su muerte.
 Medio de Stuart: Se utiliza para transportar muestras de materiales purulentos
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recogidos con escobillón estéril.

 Medio de Buffer Glicerinado: Permite el transporte de muestras de materia fecal
para coprocultivos manteniendo la viabilidad de la Shigella.

MEDIOS BIOQUÍMICOS DIVERSOS:

Son aquellos que demuestran características bioquímicas particulares de las

bacterias. Son: medios para fermentación de azucares, algunos como: TSI, Citrato,
SIM, Caldo MR-VP, caldo malonato, etc.
Comercialmente pueden encontrarse sistemas multipruebas bioquímicas con 10 o
más parámetros que permiten una más rápida y precisa identificación de las
propiedades metabólicas del microorganismo y su consiguiente identificación.
También existen sistemas automatizados para la identificación bacteriana.

5.Procedimiento

Procedimiento para preparación medios de cultivo

1. Haga el cálculo correspondiente para la preparación del medio de acuerdo

con las indicaciones del profesor.
2. Mida el volumen de agua destilada según sus cálculos.
3. Teniendo en cuenta el volumen de agua que debe utilizar, haga la relación de
medio a pesar de acuerdo a lo especificado por la etiqueta del medio.
4. Pese la cantidad de medio necesaria de acuerdo a sus cálculos
5. Mezcle el medio deshidratado con la mitad del agua, agite suficientemente y
agregue el agua restante. Lleve a ebullición si es necesario (en el caso de
agares.)
6. Esterilice en autoclave según las indicaciones que mencione la casa
comercial.
7. Finalizada la esterilización sirva asépticamente aproximadamente 15 o 20 ml.
del agar en la caja de petri o el volumen adecuado según el tamaño de los
tubos.

6.Cuestionario

Complete la información del siguiente cuadro

MEDIO DE
COMPOSICIÓN PREPARACIÓN USO INTERPRETACIÓN
CULTIVO

CALDO
TETRATIONATO

BISMUTO
SULFITO
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MEDIO
LOWESTEIN –
JENSEN

MEDIO THAYER-
MARTIN

BAIRD PARKER

LMX/
FLUOROCULT

READYCULT

CHROMOCULT

AGAR/CALDO
BHI

7.Bibliografías

Prats, G. (2008). Microbiología Clínica. Madrid, Panamericana. Pg. 24-32

Disponible en:
https://books.google.com.co/books?
id=TdsoWPEYaoUC&pg=PA24&dq=medios+de+cultivo&hl=en&sa=X&ved=0ahUKE
wjX1JeOjZLPAhXJJB4KHe6nDF4Q6AEIKzAC#v=onepage&q=medios%20de
%20cultivo&f=false

López T., Torres C. Trabajo Práctico 4, Medios de Cultivo. Universidad Nacional del
Nordeste, 2006. Disponible en:
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf

PRACTICA 4

Siembra y características de los cultivos bacterianos

1.Objetivos

- Practicar las diferentes técnicas de siembra para el cultivo de

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microorganismos.

- Identificar los diferentes aspectos morfológicos en los cultivos de las

bacterias como una de las herramientas guía para la identificación.

2.Materiales

- Asas bacteriológicas.
- Hisopos esterilizados

3. Reactivos

- Tubo con agar nutritivo inclinado.

- Tubo con agar nutritivo sin inclinar
- Tubo con caldo tioglicolato.
- Cajas de agar nutritivo
- Cultivos de 24 horas en caldo nutritivo, en agar nutritivo inclinado y en caja de
petri de: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli,
Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, y Bacillus sp.

4.Marco Teórico

El proceso de colocar las bacterias en medios de cultivo recibe el nombre de

siembra, esta la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pus
secreciones, etc.), de análisis para control de calidad (alimentos, aguas, cosméticos,
medicamentos, etc.) o de un cultivo bacteriano a otro; si la realizamos de un cultivo a
otro la denominamos subcultivo o repique.

Para el estudio de las bacterias es necesario además de conocer su morfología

microscópica conocer su morfología macroscópica a partir de su crecimiento en
medios de cultivo; esta se observa en las colonias bacterianas; adicionalmente es
posible evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos
nutritivos o proporcionarles aquellos nutrientes adecuados para favorecer su
desarrollo.

Existen técnicas adecuadas para realizar estos cultivos. Algunos elementos

importantes para realizar siembras son: el mechero (de alcohol o de bunsen), el asa
bacteriológica y los medios de cultivo ya preparados y atemperados a 37ªC en la
incubadora; contando con estos implementos podemos realizar la siembra.

SISTEMAS DE SIEMBRA

La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la

transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de
cultivarlos. Para determinar los caracteres de cultivo de las bacterias, es preciso
obtenerlas en cultivo puro. Existen varios métodos para aislar las bacterias en cultivo
puro con el fin de evaluar sus características en estos medios.
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Se entiende por cultivo puro (axénico) una población de células, las cuales todas
proceden de una misma célula. Existe gran variedad de técnicas por medio de las
cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas en cultivo
puro.

TIPOS DE SIEMBRA

1. Siembras en cajas de Petri:

AGOTAMIENTO

Siembra por Agotamiento: Es un buen método para el aislamiento de colonias,

mediante ella buscamos obtener colonias separadas a partir de un inóculo. Para su
realización se toma la caja de petri en la palma de la mano (aquella que utilice con
mayor frecuencia) ligeramente inclinada; con la mano contraria se manipula el asa
de argolla previamente esterilizada por flameado directo a la llama del mechero y
con ella se recoge el material de cultivo para colocarla en un área periférica de la
caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inóculo, en caso de
utilizar escobillón se inocula con este el material, posteriormente se trazan estrías
paralelas con mayor separación hasta la mitad o tercera parte de la caja, se
esteriliza el asa y se hace girar la caja en sentido contrario a las manecillas del reloj,
se procede ahora en la superficie libre a trazar estrías en la misma forma ocupando
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la mitad de este espacio; se esteriliza nuevamente el asa y se gira la caja

nuevamente, trazando estrías perpendiculares con mayor separación a las
realizadas previamente en el cuadrante libre. Finalmente se esteriliza el asa antes de
descartarla (Ver esquema).

Siembra masiva: Este método es muy utilizado para obtener un gran número de
microorganismos. Esta técnica de siembra utiliza un hisopo el cual se pasa por toda
la superficie de la placa en distintas direcciones y finalmente por el borde para que el
crecimiento de los microorganismos sea total en la superficie de la placa.

Siembra por punción: Método de siembra utilizado para observar el crecimiento de

hongos y así más adelante establecer su morfología. Consiste en tomar parte de
micelio con un asa micológica y por una punción suave en el centro de la caja
inocular el microorganismo a estudiar.

Siembra masiva Siembra por

punción

2. Siembra en tubos:

La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado puesto que un

solo organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al
microorganismo de interés, por lo tanto se deben tener las siguientes precauciones:

 Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo

que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en
la boca de éste.
 Los tapones se deben mantener en la mano contraría a aquella que contiene el
tubo, sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el dedo del corazón.
Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar.
 Flamear la boca del tubo.
 Esterilizar el asa.
 Sumergirla en el medio sin tocar las paredes del tubo.
 Enfriarla en una parte del medio.
 Tomar el inóculo con el asa.
 Después de practicar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca
del tubo.
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CLASES DE SIEMBRA EN TUBO

Estría Mixta Picadura

Siembra en estría: Se realiza en un tubo, con medio sólido inclinado en bisel y

deslizando el asa sobre la superficie de manera que se marquen surcos o estrías.

Siembra en picadura: Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con
asa recta en tubos con medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se
realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el
centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo.

Siembra mixta: se realiza igualmente siembra en picadura hasta el fondo del tubo y
luego siembra en estría, deslizando el asa por la superficie en bisel marcando
estrías.

Siembra en tubo en medio líquido: Para transferir material a partir de un medio

líquido o sólido a otro líquido, puede usar el asa bacteriológica o en algunos casos
pipetas estériles o en otros escobillones. Si usted utiliza asas bacteriológicas inocule
el asa en el medio líquido haciéndola rotar.

NOTA: en cualquier siembra que usted realice debe marcar previamente las cajas de
Petri o los tubos de manera clara, completa, legible, con la identificación respectiva y
la fecha.

Para análisis clínico marcar siempre las cajas en la base de la placa petri y para
análisis de control de calidad de alimentos u otros materias primas, marcar las cajas
en la tapa de la placa o caja petri. Luego de realizada la siembra, usted debe
proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado para la proliferación o crecimiento
bacteriano, para ello dispone de la incubadora o en dado caso, un lugar adecuado a
temperatura ambiente. RECUERDE QUE LAS CAJAS DE PETRI SE INCUBAN
INVERTIDAS, SI EL INOCULO NO SE HA ADSORBIDO ESPERE 10 MINUTOS, SI
ESTE TIEMPO NO ES SUFICIENTE, INCUBE LAS PLACAS CON LA TAPA HACIA
ARRIBA POR 30 MINUTOS ANTES DE INVERTIRLAS. Para impedir que el agua
de condensación que pueda formarse en la tapa de la caja y caiga sobre el medio
dispersando el crecimiento bacteriano y evitando la formación clara de las colonias.
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MORFOLOGIA MACROSCÓPICA

Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivo exhiben diferencias en

la apariencia macroscópica de su crecimiento, estas diferencias llamadas
características culturales son la base para la separación de ellos en grupos
taxonómicos. Las características culturales de los microorganismos conocidos son
consignadas en Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology y determinadas por el
cultivo de los microorganismos en agar nutritivo inclinado y en placas de petri, en
caldo nutritivo y en gelatina nutriente.

 Agar Nutritivo Inclinado: Los cultivos en este medio se inoculan en una sola
línea recta y se evalúan de la siguiente manera

1. Abundancia de crecimiento: la cantidad de crecimiento es designada como

ninguna, leve, moderada o abundante.
2. Pigmentación: Los microorganismos cromogénicos pueden producir pigmentos
intracelulares que son responsables de la coloración de las colonias; otros
microorganismos producen pigmentos solubles extracelulares que son
excretados en el medio y también producen un color; sin embargo la mayoría de
los microorganismos son no cromogénicos y aparecerán desde el blanco al gris.
3. Las características ópticas pueden evaluarse con base en la cantidad de luz
transmitida a través del crecimiento, estas características con descritas como
opaca (ninguna transmisión de luz), translúcida (transmisión parcial) o
transparente (transmisión total de la luz).
4. Forma: la apariencia del crecimiento de la siembra en una sola línea sobre la
superficie del agar inclinado se designa así:

a. Filiforme: crecimiento en forma de hilo con bordes lisos continuos.

b. Equinulado: crecimiento en forma de hilo con bordes irregulares
continuos.
c. Barbado: colonias semiconfluentes o no confluentes.
d. Difuso: Crecimiento difuso y reducido.
e. Arborescente: crecimiento en forma de árbol.
f. Rizoide: crecimiento en forma de raíz.
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 Cultivos En Caldo Nutritivo: Son evaluados según su distribución y apariencia

del crecimiento como sigue,

A. Turbidez fina uniforme: Crecimiento fino y totalmente disperso.

B. Floculante: crecimiento en agregados escamosos totalmente disperso.
C. Película: crecimiento en la superficie como plataforma, grueso.
D. Sedimento: Concentración del crecimiento en el fondo del caldo; puede ser
granular, escamoso o floculante.

 Placas de Agar Nutritivo: Su descripción se realiza de colonias (agrupamiento

bacteriano originado por su crecimiento y observable macroscópicamente)
aisladas, se evalúa de la siguiente manera,

a. Tamaño: Grande, mediano, pequeño y puntiforme.

b. Forma:
Borde: * De borde regular: continuo.
* De borde irregular: lobulado, ondulado, dentado, filamentoso,
festoneado y arborescente.
Elevación: * No elevada: plana.
* Elevada: convexa, mamelonada, umbilicada y papilar.
c. Superficie: Lisa o Rugosa.
d. Consistencia: Blanda, dura o mucoide.
e. Aspecto: brillante u opaco y mate o translúcido.
f. Pigmento: amarillo, rojo, verde, etc.
g. Hemólisis: parcial o alfa; total o beta y no hemólisis o gamma.

La morfología de las colonias es un parámetro importante en el proceso de

identificación bacteriana siendo las características comunes entre cada género
bacteriano. Sin embargo la morfología puede alterarse por el tiempo de incubación,
composición del medio de cultivo (excesiva desecación o humedad), etc.
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5. Procedimiento

Procedimiento para siembras:

1. Siembre por picadura en un tubo de agar nutritivo sin inclinar.
2. Siembre por estría en un tubo de agar nutritivo inclinado.
3. Siembre de manera mixta en un tubo de agar nutritivo inclinado.
4. Siembre por agotamiento en una caja de agar nutritivo.
5. Siembre en forma masiva en una caja de agar nutritivo.
6. Siembre en un tubo de caldo tioglicolato o caldo nutritivo.

Procedimiento para características de las bacterias en los diferentes medios: escriba

cada una de las bacterias dada de acuerdo a las figuras.

6. Cuestionario

1. ¿Cuál es el objetivo o finalidad de una siembra por agotamiento?

2. ¿Cuáles son las condiciones que deben tenerse en cuenta para hacer una
siembra?
3. Describa de manera ordenada los pasos a seguir para realizar una siembra.
4. En que agar realizó la siembra y cuál es su composición?
5. Qué es un inóculo?
6. Según los requerimientos de O2 como se clasifican los organismos? Explique
cada una de estas clases.
7. El medio de tioglicolato permite el crecimiento de microorganismos aerobios,
facultativos y anaerobios. Explique cómo se observa el crecimiento de cada uno
de ellos en el caldo de tioglicolato.
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7. Bibliografías

Aquiahualt M., Volke T., Manual de Prácticas de laboratorio de Microbiología

General, Universidad Autónoma Metropolitana, 2012, México. Disponible en:
http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/
manual_microbiologia_general.pdf

Quiroz A., (2015). Microbiología 3-G Equipo #2. Disponible en:

http://microbiologia3g128.blogspot.com.co/2015/11/patrones-de-crecimiento-en-
agar.html

8. Anexos

ANEXO A. Morfología Celular (forma, tamaño y disposición bacteriana)

COCOS: Son células esféricas, generalmente de 1 de tamaño. La división celular

da lugar a una distribución característica de las células hijas. En el caso más simple
las células hijas se separan resultando células aisladas.
DIPLOCOCOS: Son pares de células que no se separan.
ESTREPTOCOCOS: Cadenas de células esféricas que no se separan.
TÉTRADAS: En las células aisladas se presentan divisiones en ángulo recto (como
el género Gaffkya sp), formando cuadros de cuatro células.
ESTAFILOCOCOS: Las células presentan un eje de división al azar, dando como
resultado la agrupación de las bacterias en racimos.
SARCINA: Las células presentan tres planos de división en ángulos rectos,
produciéndose paquetes regulares de 8 a 16 bacterias cada uno. Esto solo ocurre en
el género Sarcina sp.
BACILOS: Bacterias cilíndricas en forma de varilla. Estas células presentan tamaños
aproximadamente de 0,5 a 1 de ancho por 2 a 3 de largo. Se pueden
encontrar aislados, en cadenas cortas y largas o en pares paralelos lo que en
algunos casos facilita su clasificación.
BACTERIAS EN FORMA DE COMA Y ESPIRAL: Se encuentran como células
aisladas de variedad de tamaños, número de espiras y rigidez de la pared. Ejemplo:
Campylobacter sp. Vibrio sp. Borrelia sp. y Treponema sp.
 Las espiroquetas presentan forma de sacacorchos, son flexibles y pueden
llegar a medir hasta
250 µ de largo.
 Los espirilos son microorganismos gram negativos, móviles y flagelados.
 Los vibrios o vibriones se presentan como bacilos curvos en forma de
coma.

BACTERIAS FILAMENTOSAS Y RAMIFICADAS: Los actinomicetos en un principio

se consideraron hongos por su tipo de crecimiento, pero en realidad difieren en la
composición de su pared y en el núcleo. Nocardia sp. (de importancia médica e
industrial), presenta un crecimiento de filamentos compactos; Streptomyces sp. (de
igual importancia), forma filamentos ramificados que dan origen a un micelio de
dimensiones bacterianas.
BACTERIAS CON YEMAS y/o APÉNDICES (PROSTECADAS): Presentan un
crecimiento y división celular característico, al darse de una manera desigual en la
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célula, originándose una célula hija sin que la célula madre pierda su identidad.
Como Rhodomicrobium sp. Pirella sp y Blastobacter sp.
FORMAS DE INVOLUCIÓN: Es una morfología anormal que se encuentra a
menudo en cultivos viejos (Típicos en Pasteurella pestis y Neisseria sp.). Estos tipos
de células suelen no ser viables, pero sí lo son, al ser transferidas a un medio
favorable, se dividen dando origen a células de morfología normal.

Dentro de la morfología debe tenerse en cuenta la presencia de cápsula y

endosporas, así como su posición dentro de la célula (terminal, subterminal, central).

PRACTICA 5

Tinciones Simples y Visualización de Bacterias

1.Objetivos

- Reconocer el microscopio óptico, su funcionamiento y las recomendaciones

necesarias para lograr un mayor tiempo de vida útil del equipo.

- Diferenciar e identificar aspectos morfológicos microscópicos de los

microorganismos con el empleo de algunas tinciones simples.

- Realizar algunas técnicas de tinción simple utilizadas en microbiología, su

fundamento y aplicación.

2.Materiales

Microscopio óptico.
Portaobjetos y cubreobjetos.
Solución salina estéril.
Aceite de inmersión.
Mechero de Bunsen.

3. Reactivos

Soluciones colorantes: Cristal violeta, safranina, azul de metileno y carbol-fuschina.

Cultivos bacterianos.

4.Marco Teórico

MICROSCOPÍA
Para todos los investigadores, estudiantes, y personal interesado en las ciencias
biológicas es fundamental el conocimiento y manejo adecuado de equipos de
magnificación como microscopios simples, compuestos, binoculares, electrónicos,
microscopios estereoscópicos, entre otros, ya que estos instrumentos son parte
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fundamental del trabajo de campo y laboratorio de la Biología y ciencias afines.

Principios de microscopía: El poder de resolución y el aumento (magnificación) son

dos de las características del microscopio.

Resolución: Es la capacidad que posee el microscopio de separar dos objetos

adyacentes, es decir, es la capacidad que tiene un microscopio de poder distinguir
dos objetos que se encuentran muy cercanos uno al otro, y depende de la longitud
de onda de luz empleada, la densidad del medio circundante, y las aperturas
numéricas de los lentes empleados en los objetivos y condensador, esto último hace
referencia a la capacidad que tienen estos lentes para recibir el cono de luz que
pasa a través de la muestra y proveniente de la fuente.
Mientras menor sea la distancia que puede medirse entre dos puntos en un campo
microscópico, mayor es el poder de resolución.
La capacidad de aumento y resolución del microscopio depende del tipo de luz que
se emplea. Los microscopios de luz permiten la resolución de objetos de tamaño
mayor a la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada, por tanto los microscopios
ópticos que utilizan luz visible (La luz visible va del violeta 390 nm al rojo 780 nm) de
500 nm no permiten resolver objetos separados por distancias inferiores a 250 nm =
0,25 micras. Entre menor sea la longitud de onda de luz empleada, mayor poder de
resolución logra un microscopio, entre mayor apertura numérica tenga, mayo será el
poder de resolución. El ojo humano, en comparación, sólo puede resolver puntos
separados por 25 a 100 micras que en promedio daría resoluciones 250 veces
menores que el microscopio de óptico.

El poder de resolución (d) de un microscopio se calcula a partir de la siguiente

fórmula:

d=

En donde: λ= longitud de onda de luz empleada.

AN = apertura numérica del objetivo.
an = apertura numérica del condensador.

En la práctica la AN es igual a an, y por lo tanto la fórmula se resume así:

d=

La apertura numérica se obtiene de la fórmula siguiente:

AN = i senθ
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En donde: i = índice de refracción del medio que rodea la lente.

Θ = mitad del ángulo de entrada del cono de luz que llega

al condensador.

Entre mayor sea el índice de refracción del medio circundante (aire, vidrio, aceite de
inmersión, etc.), mayor será el cono de luz originando un mayor poder de resolución.
Si el medio circundante es el aire i = 1; si es el aceite de inmersión i = 1.56.
Cuando se utiliza aceite de inmersión entre el portaobjetos y el objetivo, la apertura
numérica puede aumentarse desde 0.65 (cuando el aire es el medio circundante y se
emplea un objetivo de 40) hasta 1.25 (cuando se emplea aceite de inmersión y
objetivo de 100), aumentando de esta manera el poder de resolución. Lo anterior lo
podemos comprobar mediante un ejemplo sencillo:

Observación sin aceite de inmersión. Observación con aceite de inmersión.

 = 500 nm.  = 500 nm.

AN = 0,8. AN = 1,3.
d=

d= d=

d= 312,5 nm. d= 192,3 nm.

Mientras más pequeños sean los valores números de d, más grande será el poder
de resolución de un microscopio, en el ejemplo anterior cuando se emplea aceite de
inmersión d = 192,3 nm; es posible ver, como dos puntos separados, objetos entre
los cuales existe una distancia mayor o igual a 192,3 nm los cuales no son resueltos
como puntos separados en la observación sin aceite de inmersión, en donde solo se
pueden resolver objetos distantes 312,5 nm o más.

El aumento o magnificación: Es la capacidad que posee un microscopio de amplificar

una imagen resuelta varias veces su tamaño original, esta propiedad es
independiente del poder de resolución de un microscopio y está ligada con el poder
de aumento de los lentes objetivos y oculares. El aumento de cualquier combinación
de objetivo y ocular es el producto de los aumentos de estos componentes por
separado, es decir, multiplicando el aumento de cada uno por el valor del otro. Este
aumento es expresado generalmente en diámetros.

Ej.: Una observación a través de un ocular de 10X y un objetivo de 40X pueden dar
un aumento total de 400 diámetros (veces).
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Figura 1. Objetivos A = 60 indicando sus características.

Partes de un microscopio óptico compuesto: La mayoría de los microscopios

compuestos tienen los mismos componentes básicos. Sin embargo, la disposición
de muchos de esos componentes varía según el modelo y la marca, así como la
posibilidad de presentar otras piezas que son opcionales. La mayoría de
microscopios actuales están constituidos por tres componentes fundamentales, La
óptica (Conjunto de lentes), la mecánica (Soportes del sistema óptico, iluminación y
otras funciones) y el sistema de iluminación. Veamos cada uno de ellos:

COMPONENTE ÓPTICO
Partes Función
El papel de los oculares consiste en aumentar, a manera de lupa, la imagen real
proyectada por el objetivo tantas veces como indique el número inscrito en ellos.
Posee dos lentes: la que queda cerca del ojo se llama ocular, la que queda en e!
Oculares
extremo inferior se llama colectora. Hay oculares de diferentes aumentos.
En uno de los oculares (generalmente el izquierdo) se encuentra un anillo de
Dioptrías, que sirve para ajustar la visión binocular.
Son un conjunto de lentes que producen imágenes de la muestra aumentadas 4,
10, 40 o 100 veces, según se indique en los mismos. Constan de dos lentes, la
que queda más cerca de la preparación se llama lente frontal y la que queda en
la parte superior se llama lente posterior. La denominación de los objetivos se
efectúa indicando su aumento propio, el cual se halla grabado en cada pieza.
Objetivos Se distinguen dos clases de objetivos los secos y el de inmersión; al primer tipo
pertenecen los objetivos de aumento débil o mediano (5. 10, y 40). Los de
inmersión son los de mayor aumento (100) con mayor poder de resolución.
El poder de resolución está condicionado por la apertura numérica (AN). El
objetivo de inmersión tiene una distancia focal muy corta y una AN muy limitada.
Actúa a una distancia de solo 1 a 2 mm del objetivo

COMPONENTE MECÁNICO
Partes Función
Base Parte inferior en la cual se apoya el microscopio.
Brazo o columna Es la porción central de la cual se debe tomar el microscopio
Es la parte donde se ubican los objetivos. Está construido de manera que un
Revólver sistema rotatorio engrane automáticamente. Se pueden rotar los objetivos
simplemente girando el revólver.
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Placa cuadrada firmemente montada sobre el microscopio en forma horizontal.

Platina Presenta un orificio central para permitir el paso de la luz y sobre la cual se
coloca la muestra que se va a observar.
Sistema de 2 pinzas, ubicado encima de la platina, que sirve para desplazar la
muestra en el eje X y el eje Y (izquierda – derecha y adelante – atrás
Carro mecánico
respectivamente) mediante una serie de perillas ubicadas en el costado de la
platina.
Cilindro que soporta los oculares en la parte superior y en la parte inferior se
ubica el revólver. El cabezal puede ser monocular o binocular. En estos últimos
Tubo o cabezal se encuentra una escala de ajuste interpupilar, que permite mover los oculares
hacia los lados y hacia el centro, con el fin de ajustar a la distancia de los ojos de
quien usa el microscopio.
Tornillo Sirve para localizar la imagen, se acciona por medio de dos tornillos de
macrométrico cremallera que se encuentran a ambos lados del microscopio.
Se utiliza para dar el enfoque adecuado a la imagen localizada con el tornillo
macrométrico. Lleva un tambor graduado que se desplaza sobre un Índice fijo
Tornillo que sirve para indicar su posición. Es de extraordinaria precisión y por lo tanto
micrométrico muy delicado. Una vez enfocada la imagen con el lente de menor aumento solo
se debe usar el tomillo micrométrico para cambiar de aumentos y dar la nitidez
necesaria a la imagen.

SISTEMA DE ILUMINACIÓN
Partes Función
Es un sistema de lentes convergentes entre la fuente de luz y la platina. Estos
lentes concentran los rayos luminosos sobre la preparación (condensador de
Condensador abertura). El condensador de campo está ubicado en la base del microscopio y
su función es concentrar la luz proveniente de la fuente hacia el condensador
de abertura,
Está formado por un conjunto de láminas falciformes las cuales por medio de
una palanca lateral se pueden cerrar concéntricamente regulando la cantidad
de luz proveniente del condensador. El diafragma se estrecha en preparaciones
no coloreadas para aumentar la profundidad de enfoque, en tanto que en
preparaciones coloreadas que absorben luz, tiene que dilatarse. Usualmente
Diafragma (iris)
los rayos luminosos emergen de la cara superior del condensador como un
cono de luz con el vértice hada abajo. Los rayos no muy divergentes pasan a
través del objetivo y cuanto más amplio es el alcance de la apertura numérica
más amplio es el ángulo que puede investigarse pues mayor es el número de
rayos divergentes que puede recoger.
Es un disco de vidrio mate o de diferente color que se puede ubicar en la parte
Filtro inferior del diafragma sobre un anillo transportable, este filtro permite
seleccionar la longitud de onda de luz a emplear.
Proporciona la luz necesaria para la observación de la muestra. Esta puede ser
Foco o fuente o bien espejos, Lámparas o bombillas. Si emplea espejos los cóncavos se usan
emisora de luz cuando la luz requerida es menor (con lentes de 4, 10 y 40) y el espejo plano
para mayor iluminación.

Unidades de medida utilizadas en microscopia simple:

Las unidades de medida que utilizará normalmente son el milímetro (mm), el

micrómetro (m) y el nanómetro (nm).
1mm = 1000 m = 1000000 nm.
1 m = 0.001 mm = 1000 nm.
1 nm = 0.001m = 0.000001 mm.

Cuidados con el microscopio: Para que este valioso equipo funcione adecuadamente
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y podamos sacar el mayor provecho de él, debemos tener en cuenta algunas

medidas antes, durante y después de su uso. Solo de esta forma conservamos este
instrumento para nuestro posterior uso y el de futuras generaciones.

 Cuando transporte el microscopio, sujételo siempre con las dos manos (por la
base y por la columna).
 Sitúe el microscopio a unos 10 cm de la orilla de la mesa.
 Para cambiar de objetivo, utilice la rosca estriada del revólver, no lo haga tirando
de los objetivos, pues de esta manera se desajusta los sistemas de lentes y la
propiedad parafocal (propiedad de mantener más o menos enfocada y en el
mismo campo focal al cambiar de objetivo).
 No use demasiado aceite de inmersión. Solo bastará una pequeña gota para
realizar la observación.
 Asegúrese siempre de haber limpiado el lente de inmersión después de usarlo,
con papel especial para lentes. Si no se limpia el lente, después del uso del
aceite, queda un residuo pegajoso que reduce la eficiencia del lente y puede
permitir el crecimiento de mohos.
 Cuando ya no se vaya a utilizar el microscopio o se desee cambiar de muestra,
debe colocarse en el objetivo de menor aumento en posición de enfoque, y con la
platina abajo.
 Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de enfoque.
 Aprenda a mirar por el microscopio con los dos ojos abiertos.
 No desarme ninguna parte del microscopio para limpiarlo, solo lo debe hacer
personal capacitado.
 Evite tocar con los dedos las lentes del microscopio. Evite emplear el microscopio
si usted tiene pestañina ya que esta se acumula en los oculares reduciendo su
eficacia, en cuyo caso deberá emplear los capuchones protectores de oculares.
 No deje placas montadas en el microscopio
 Prenda la bombilla únicamente en el momento de hacer las observaciones.
 Al momento de apagar definitivamente el microscopio: Coloque el objetivo de
menor aumento en posición de enfoque, retire la muestra, limpie el objetivo de
inmersión con papel especial o gasa y alcohol isopropílico sin frotar el lente,
seque de inmediato el lente con otro papel, baje completamente la platina, ubique
en 0 (cero) la perilla de intensidad de luz, apague el interruptor de la fuente y
desconecte del toma corriente. Deje enfriar el bombillo dejando el microscopio en
la mesa, para que el responsable del equipo lo revise y lo guarde en el sitio
adecuado y NUNCA enrolle el cable sobre el microscopio.
 Cubra el microscopio con el forro protector.

RECUERDE seguir todas las recomendaciones dadas por el instructor de la

práctica.
Observando los microorganismos a través de un microscopio podemos apreciar su
morfología (tamaño, forma y disposición). Si observamos con mayor número de
aumentos podemos apreciar, tanto en la superficie como dentro de la célula, un
mayor número de estructuras. La ausencia o presencia de ciertas estructuras nos
van a servir para clasificar los microorganismos.
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Figura 2. Partes del microscopio compuesto binocular.

MORFOLOGÍA MICROSCOPICA DE LAS BACTERIAS

Tamaño: Las bacterias, Invisibles al ojo humano, se miden en µm que equivale a 10 -3

mm. El tamaño de las bacterias varía dependiendo de las especies entre menos de
1µm y 250 µm; siendo lel promedio entre 1 y 10µm. Una característica de las células
bacterianas es la alta proporción que existe entre el área de la superficie y el
volumen de la célula. Esto significa que poseen una gran superficie a través de la
cual pueden entrar nutrientes para alimentar a un pequeño volumen; con lo cual
pueden realizar muchas reacciones metabólicas y crecer rápidamente. Así, por
ejemplo Escherichia coli tarda 20 minutos en dividirse mientras que una célula de
mamífero en laboratorio tarda de 13 a 24 horas.

Forma: La forma de una bacteria viene determinada por la rigidez de su pared

celular. Las bacterias poseen una de tres formas fundamentales: esférica, cilíndrica
o espiral. Las células esféricas se denominan cocos y suelen ser redondeadas
aunque pueden ser ovoides o elípticas. A las de forma cilíndrica se les denomina
bacilos. Los extremos de estas células suelen ser redondeados, rectos, en forma de
huso o cuerno. Las de forma espiral o helicoidal se las denomina espirilos y se
caracterizan por su forma de sacacorchos. Existen modificaciones a estas tres
formas fundamentales y aunque la mayor parte de las bacterias mantienen su forma
constante, algunas especies pueden variar la forma, por lo que se les llama
pleomorficas. Arthrobacter es un ejemplo de pleomorfismo debido a que su forma
cambia en función de la edad del cultivo.
También exhiben pleomorfismo aquellas bacterias que no poseen pared celular
como es el caso de los micoplasmas. Otro ejemplo son las formas de L, ellas
corresponden a bacterias que carecen de pared celular debido a una situación de
estrés (choque térmico u osmótico, antibióticos, etc.), pero cuando cesa el estrés
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sintetizan de nuevo la pared celular. Debido a que la forma es un carácter

taxonómico, el pleomorfismo puede inducirnos a confusión ya que podemos pensar
que un cultivo está contaminado con otro tipo de bacteria. Sin embargo el
pleomorfismo no suele ser lo más frecuente.

Disposición: Muchas veces al mirar al microscopio se observan células unidas unas

a otras. Mientras que las bacterias de forma espiral (espirilos) suelen ser células
separadas, otras especies suelen crecer en una disposición característica,
disposición que va a depender del plano en el que se realice la división celular y si la
célula hija permanece junto a la madre una vez realizada la división celular. Cada
una de estas disposiciones es típica de una especie particular y puede usarse en
identificación. Hay que tener en cuenta que raramente todas las células de una
especie se disponen exactamente de la misma manera, por lo cual se toma en
cuenta la disposición predominante cuando se describe esta cualidad en las
bacterias.

Cuando un coco se divide en un plano forma un diplococo o dos células juntas

(Neisseria). Cuando un coco se divide en un plano y permanece unido después de
varias divisiones formando una cadena se denomina estreptococo (Streptococcus).
Si las células se dividen en más de un plano o dimensión, la disposición es más
complicada. Cuando un coco se divide en ángulo recto al primer plano de división
forma tétradas (Pediococcus). Una posterior división en el tercer plano puede
resultar de un paquete cúbico de ocho células conocido como sarcinas (Sarcina). Si
la división en los dos planos es de forma irregular se forman racimos de uva
(Staphylococcus).

Los bacilos generalmente no se agrupan en disposiciones características, aunque

hay excepciones. Por ejemplo, el bacilo de la difteria tiende a agruparse en
empalizada. Dentro del género Bacillus algunas especies forman cadenas y se
llaman estreptobacilos.

METODOS DE TINCIÓN

Debido al tamaño de los microorganismos y su protoplasma, el cual posee un índice

de refracción cercano al agua, se requiere generalmente de tinciones biológicas para
visualizarlos adecuadamente. Las tinciones se preparan en soluciones acuosas y
orgánicas de colorantes o grupos de colorantes que confieren una variedad de
colores a los microorganismos. Los colorantes no solo sirven para la tinción directa
de materiales biológicos, sino que también se pueden emplear a fin de demostrar las
funciones fisiológicas de los microorganismos con el empleo de tinciones
supravitales.

Así mismo los colorantes sirven como indicadores de cambio de pH y como

indicadores redox para demostrar la presencia o ausencia de condiciones
anaerobias. Casi todos los colorantes biológicos son derivados del alquitrán. La
estructura fundamental alrededor de la cual están construidos químicamente la
mayoría de los colorantes es el anillo bencénico.

En términos generales la clasificación de los colorantes es convencional y se basa

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en la presencia de grupos cromóforos. Son ácidos o básicos no necesariamente

ligados con el pH, sino más bien, si un parte de la molécula es iónica, o catiónica; así
los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina
nuclear; los ácido por su parte reaccionan con sustancias básicas como las
estructuras del citoplasma y poseen además una elevada afinidad por el hidrógeno.
Cuando todos los sitios moleculares aceptores de hidrógeno están ocupados, el
colorante se halla en su estado reducido y es generalmente incoloro y se denomina
"Leucocompuesto". Teniendo en cuenta este concepto desde un criterio opuesto, un
colorante retiene su color en tanto sus afinidades por el hidrógeno no estén
completamente satisfechas. Dado que el oxígeno posee generalmente mayor
afinidad por el hidrógeno que muchos colorantes, el aire retiene el color. Esta es la
razón por la cual ciertos colorantes como el azul de metileno, se utilizan como
indicadores aerobios, ya que el indicador se vuelve incoloro en ausencia de oxígeno.

5. Procedimiento

Preparación de frotis para tinción

1. Limpie las láminas. Esta es esencial ya que grasa o aceite de los dedos no
permiten una buena elaboración de frotis.
2. identifique su lámina con nombre o numeración de la muestra.
3. Si la muestra es de cultivo en caldo:
 tome una o dos asadas de células suspendidas y aplíquelas directamente sobre
la lámina con un asa de inoculación previamente esterilizada y extienda el
volumen allí aplicándolo de forma circular.
Si la muestra de cultivo sólido:
 Coloque una gota de solución salina estéril sobre la lámina o portaobjetos.
 Transfiera una pequeña cantidad de células de desde el cultivo a la lámina con el
asa de inoculación estéril, emulsionando con la solución salina estéril obteniendo
así una suspensión semitransparente de forma circular.
 Permita que el extendido se seque al aire. NO SOPLE U ONDULE LA
PREPARACIÓN EN EL AIRE.
 Fije la preparación al calor para evitar lavar el frotis durante la tinción. Realizar
esta fijación pasando el extendido seco dos o tres veces sobre la llama de un
mechero de Bunsen.
Si la muestra proviene de un raspado con escobillón:
 Tome uno de los hisopos estériles y realice un raspado de las diferentes
superficies que le indique su profesor.
 Coloque una pequeña gota de solución salina estéril.
 Homogenice uniformemente el contenido del hisopo con la gota de agua.
 Permita que el extendido se seque al aire.
 Fije la preparación al calor para evitar lavar el frotis durante la tinción. Realizar
esta fijación pasando el extendido seco dos o tres veces sobre la llama de un
mechero de Bunsen.
Procedimiento para tinciones simples
1. Realice el frotis con la técnica adecuada y fíjelo al calor con la llama del mechero
de bunsen.
2. Coloque la lámina en la rejilla de coloración y vierta sobre el frotis uno de los
siguiente colorantes usando el tiempo de exposición adecuados en cada caso
según la coloración que desee:
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*carbol-fuschina, 15 a 30 segundos
*cristal violeta, 20 a 60 segundos.
*azul de metileno, 1 a 2 minutos.
3. Lave el frotis con agua de la llave y remueva el exceso de colorante.
4. Permita que se seque al aire dejando la lámina en posición inclinada.
5. Observe al microscopio.

Observación al microscopio
1. Coloque siempre el objetivo de menor aumento; ponga la preparación fijándola
por medio de las pinzas del carro sobre la abertura de la platina, ajuste la fuente
hasta que el haz de luz este en el centro del campo.
2. Asegúrese de que el diafragma esté abierto y subido contra la platina. Súbalo tan
alto como se pueda.
3. Para enfocar el objeto pase al objetivo de 10X y suba primero la platina tan cerca
del objetivo como se pueda con ayuda del tornillo macrométrico, mirando de
lado. Tenga cuidado de no “clavar” el objetivo sobre la lámina ya que se corre el
riesgo de dañar el lente como la preparación. Luego mirando por el ocular vaya
bajando y/o subiendo muy lentamente la platina hasta que el objeto se haga
visible (enfoque grueso). Si es necesario ajuste la iluminación. Mueva los
oculares, para ajustar la visión a su distancia interpupilar.
4. Ajuste la visión binocular con el anillo de dioptrías de la siguiente manera:
5. Mire con el ojo derecho por el ocular respectivo, cubriendo el ocular izquierdo, y
enfoque con la perilla micrométrica lo mejor posible (enfoque fino). Ahora
proceda a ajustar el izquierdo así: Cubra el ocular derecho, mire con el ojo
izquierdo por el respectivo ocular y enfoque con el anillo de dioptrías hasta
obtener una imagen lo más clara posible.
6. Luego cambie el lente, por el siguiente de mayor aumento seco (40X) esta
quedará casi en el foco, suba ligeramente el condensador. Para enfocar
definitivamente la imagen, use el tomillo micrométrico muy despacio. Si la
imagen no queda enfocada devuélvase al lente de 10X y repita la operación.
Tenga cuidado de no “clavar” el objetivo sobre la preparación, ya que el lente de
40X trabaja muy cerca de la misma.
7. Para la observación en lente de mayor aumento (Lente de inmersión 100X), gire
el revólver medianamente hasta que el lente de 100X quede a mitad de camino,
coloque una pequeña gota de aceite de inmersión en el sitio de la lámina que se
va a examinar sobre el punto de luz. Evite colocar un exceso de aceite. Gire el
resto del revólver hasta que el objetivo de inmersión toque el aceite y se enfoque
el campo total (la preparación debería estar prácticamente enfocada si se ha
realizado un enfoque cuidadoso y correcto con el lente de 40X, de no ser así es
preferible realizar de nuevo el enfoque en otro campo y partiendo desde el lente
de 10X). Gire muy lentamente el tomillo micrométrico ya que debido a la corta
distancia que hay entre la lámina y el lente el objeto podría salir del foco muy
fácilmente y se podría estropear la preparación.

RECUERDE: Una vez haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no

puede volver a enfocar el objetivo de 40X sobre el mismo campo, ya que
impregnaría el lente de aceite estropeándolo. En este caso es preferible emplear otro
campo de enfoque.
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6. Cuestionario

1. ¿Cuál es la utilidad de los colorantes en microbiología?

2. ¿Qué son químicamente los colorantes?
3. ¿Cuál es el propósito de la fijación de un frotis bacteriano?
4. ¿Según su morfología, cuantas clases de bacterias se conocen? ¿Qué nombre
reciben? Dibújelas.
5. Nombre todos los tipos de agrupación bacteriana de manera sistemática.
6. Completa el siguiente cuadro dibujando la morfología y/o agrupación
correspondiente, recuerda emplear el color respectivo según la tinción

COCOS ESTREPTOBACILOS

DIPLOCOCOS BACILOS

ESTREPTOCOCOS ESPIRILOS

TÉTRADAS ESPIROQUETAS

SARCINAS VIBRIOS

YEMAS Y/O
ESTAFILOCOCOS
APÉNDICES

BACTERIAS BACILOS EN
FILAMENTOSAS EMPALIZADA

7. Bibliografía
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1. Narváez J., La Microscopía, herramienta para estudiar células y tejidos.

Universidad de los Andes, Venezuela. Recuperado de:
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/
introduccion.htm

Sánchez R., Oliva N. (2015). Historia del microscopio y su repercusión en la

Microbiología, Rev Hum Med vol.15 no.2 Ciudad de Camaguey. Recuperado de:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1727-81202015000200010

PRACTICA 6

Tinciones Bacterianas Compuestas

1.Objetivos

- Aplicar algunos de los métodos de coloración, basándose en las propiedades

estructurales de las bacterias para observación de estructuras internas y
externas de los microorganismos.

- Familiarizarse con las bases químicas y teóricas de la técnica de coloración

diferencial de Gram.

- Describir las características morfológicas y tintoriales de las estructuras

observadas.

- Adquirir destreza en la preparación de frotis bacterianos.

2.Materiales

Microscopio.
Papel para limpiar lentes.
Láminas o portaobjetos.
Asas bacteriológicas.
Mechero de bunsen.
Bandeja de coloración.
Baño serológico.
Pinzas de madera.
Papel absorbente.
Solución Salina estéril.
Hisopos.
Goteros.
Aceite de inmersión.
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3. Reactivos

Reactivos de coloración de Gram.

Reactivos para coloración de Ziehl-Neelsen.
Reactivos para coloración de esporas.
Reactivos para coloración de cápsula.
Reactivos para coloración de flagelos.
Reactivos para coloración de gránulos.
Cultivos bacterianos de 24 horas.
Vacuna de BCG.

4. Marco Teórico

La morfología de los microorganismos puede ser observada a partir de preparados

frescos o fijados y teñidos por algunos de los métodos de tinción conocidas, ya que
por su misma estructura son difíciles de visualizar en su estado natural. Las tinciones
biológicas y los procedimientos de tinción en unión con la microscopía de luz son
una herramienta básica importante en microbiología, permitiendo estudiar las
propiedades de los microorganismos y su división en grupos específicos para
propósitos diagnósticos.
En algunas ocasiones se hace necesario fijar los microorganismos y durante este
proceso se produce la muerte celular debido a la coagulación del protoplasma,
preservándose la morfología celular además de adherirlos a la lámina. El agente
más utilizado para fijar es el calor, aunque puede también utilizarse alcohol y otros
compuestos químicos que frecuentemente permiten una mejor diferenciación de los
detalles como las soluciones de etanol-éter, alcohol sublimado (Cloruro de Mercurio
II, Etanol absoluto y agua destilada), y solución de ácido Ósmico (vapores).

En el laboratorio de microbiología se utilizan diversos métodos de tinción o

coloración para visualizar los detalles morfológicos de las bacterias, algunas de las
coloraciones más empleadas en microbiología son: coloración de Gram, coloración
de Ziehl-Neelsen, coloración de Alberth, Coloración de Stoltemberg, coloración de
Hiss, coloración de Dorner, etc.

Químicamente un colorante se define como un compuesto orgánico que contiene un

grupo benceno más un grupo cromóforo y un auxocromo. Un cromóforo es un grupo
químico que imparte color al benceno (solvente orgánico) mientras un auxocromo es
un grupo químico que le confiere la propiedad de ionización al cromógeno,
capacitándolo para formar sales y unirse a fibras o tejidos. La habilidad de un
colorante para unirse a macromoléculas de componentes celulares (proteínas,
ácidos nucleicos, etc.) radica en la carga eléctrica tanto de la porción cromogénica
como del componente celular a teñir.

Los colorantes ácidos son aniónicos, es decir que en forma ionizada la porción
cromogénica exhibe una carga negativa que tendrá afinidad por los constituyentes
de la célula cargados positivamente. Las proteínas, componentes celulares cargados
positivamente se unirán y aceptarán el color de un cromógeno aniónico cargado
negativamente de una tinción ácida.
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Los colorantes básicos son catiónicos, es decir la ionización de la porción

cromogénica exhibe una carga positiva lo cual permite una fuerte afinidad por los
constituyentes de la célula cargados negativamente. Los ácidos nucleícos,
componentes celulares cargados negativamente, se unirán y aceptarán cromógenos
catiónicos cargados positivamente; un ejemplo es el azul de metileno.

Los colorantes básicos son los más comúnmente empleados para tinciones
bacterianas, la presencia de carga negativa en el exterior celular, repele los
colorantes ácidos y evita su penetración en la célula. La siguiente tabla resume
algunas técnicas de tinción y los propósitos de cada una:

TIPOS DE TÉCNICAS DE TINCIÓN

Tinciones Diferenciales Tinciones Simples
Emplea dos colorantes: tinción y contraste Usa un solo colorante
Separación en Grupos Visualización de Estructuras Para visualización de:
Tinción de flagelos. Morfología microscópica (cocos,
Tinción de Gram. Tinción de cápsula. bacilos, espirales) y arreglos o
Tinción ácida-rápida. Tinción de esporas. agrupaciones (cadenas, pares,
Tinción nuclear. tétradas, etc.)

TINCIÓN DE GRAM

Nombrada así en honor al bacteriólogo Christian Gram. Clasifica y diferencia las

bacterias en dos grupos principales: Gram positivas y Gram negativas. La tinción
emplea 4 reactivos diferentes:

1. Cristal Violeta: Colorante primario de color violeta, su función es dar color a todas
las células.
2. Yodo de Gram (Lugol): Reactivo que sirve como mordiente, formando un
complejo cristal violeta-yodo (CV-I) insoluble por unión al colorante primario.
Sirve para intensificar el color en la tinción. En este punto todas las células
permanecerán violeta oscuro. Solo en células Gram positivas, el complejo se une
al componente ácido ribonucléico-magnesio de la pared celular (Mg-ARN-CV-I),
este complejo resultante es más difícil de remover que el complejo más pequeño
cristal violeta-yodo.
3. Alcohol etílico al 95% o Alcohol-acetona (etanol 95% y acetona 70:30) : Agente
decolorante. Un agente decolorante puede o no remover el colorante primario de
la célula entera o solo de ciertas estructuras celulares.
Tiene doble función, como solvente de lípidos y como agente deshidratante de
proteínas. Su acción en el procedimiento está determinada por la cantidad de
lípidos de la envoltura celular. En células Gram positivas, la baja concentración
de lípidos es importante para retener el complejo Mg-ARN-CV-I, siendo los
lípidos disueltos por el agente decolorante, formándose pequeños poros de
pared celular que son cerrados por la acción deshidratante del alcohol. Como
consecuencia la tinción primaria se une fuertemente y es difícil de remover,
permaneciendo las células de color púrpura. En células Gram negativas, la alta
concentración de lípidos en la capa externa es disuelta por el alcohol formándose
grandes poros que no cierran a causa también de la deshidratación de las
proteínas. Así se facilita la liberación del complejo CV-I dejando a las células
decoloradas o desteñidas.
4. Safranina: reactivo de contratinción. Tiene un color de contraste al colorante
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primario (rojo). Si después de la decoloración el colorante primario ha sido

lavado los componentes decolorados de la célula tomarán el color del colorante
de contraste. Solo las células Gram negativas, que se decoloran, absorben el
color rojo del colorante de contraste, mientras las células Gram positivas retienen
el color púrpura del colorante primario.

Recuerde:
 Lo más crítico del procedimiento es el paso de decoloración, si el este paso no se
remueve completamente los complejos CV-I, organismos Gram negativos
aparecerán falsamente como Gram- positivos.
 Es imperativo remover completamente con agua el reactivo anterior de manera
que se preparare la lámina para el subsiguiente reactivo.
 Preparaciones teñidas con Gram se realizan con cultivos frescos, es decir hasta
con 24 horas de cultivo. Cultivos viejos y especialmente de bacterias Gram
positivas tienden a perder la habilidad para retener el colorante primario
apareciendo “Gram variables”, es decir algunas células púrpura y otras rojas.
 Un frotis grueso causa decoloración inadecuada.
 Un tiempo excesivo de decoloración puede llevar a la observación errónea del
color tomado por las bacterias.
 La remoción de frotis durante el secado puede eliminar la muestra de la lámina.

Procedimiento Para Tinción De Gram:

1. Realice el frotis con la técnica adecuada y fíjelo al calor.

2. Vierta sobre el frotis cristal violeta y déjelo actuar por 1 minuto.
3. Lave con agua de la llave y escurra.
4. Cubra ahora el frotis con Lugol (iodo de Gram) y deje actuar por 1 minuto.
5. Lave con agua de la llave y escurra.
6. Cubra ahora con solución decolorante (alcohol-acetona) por 30 segundos.
7. Lave con agua de la llave y escurra.
8. Cubra ahora con colorante de contraste (Safranina o fuschina) y deje actuar por
45 segundos.
9. Lave con agua de la llave y escurra
10. Permita que se seque al aire dejando la lámina en posición inclinada.
11. Observe al microscopio.

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (ZN)

Se usa para bacterias que no se tiñen fácilmente por los colorantes corrientes debido
a su alto contenido de lípidos en la pared celular (Mycobacterium). Se fundamenta
en que las bacterias ácido-alcohol resistentes, en especial las Mycobacterias por su
composición de pared, difícilmente toman los colorante, pero una vez teñidas,
retienen el color y no lo pierden aún por la acción energética de los ácidos. Los
bacilos ácido alcohol resistentes se tiñen de rojo por la carbol-fuscina y los
microorganismos restantes se tiñen de azul por el colorante de contraste.

Técnica De Coloración de Z-N:

1. Cubrir la preparación con fuschina y calentar hasta la emisión de vapores.
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Mantener así por 10 minutos evitando el secado del colorante sobre la preparación.
2. Lavar con agua.
3. Decolorar completamente con alcohol-ácido.
4. Lavar con agua.
5. Cubrir con azul de metileno por 2 minutos.
6. Lavar con agua y colocar en posición vertical, dejar secar y observar al
microscopio con el objetivo de 100X.
NOTA: la coloración de KENYOU es igual que la coloración de Ziehl-Neelsen, sólo
difiere en que no es necesario calentar la fuschina la cual es más concentrada, los
demás colorantes son exactamente iguales

TINCIÓN DE ESPORAS

Cuando el medio ambiente de las bacterias se torna desfavorable, muchas de ellas

entran en latencia, algunas especies bacterianas forman esporas, para contrarrestar
la adversidad del medio con la deshidratación, el calor, el frío, o la escasez de
nutrientes. Si las condiciones ambientales retornan a la normalidad, la espora
absorbe agua, rompe la pared interna y la célula bacteriana viva vuelve a surgir por
el proceso de germinación.

Las esporas están formadas por una cubierta alrededor del ADN y una pequeña
porción de citoplasma dentro de ella; esta estructura posee una mayor resistencia a
los agentes físicos y químicos que la célula vegetativa. El diámetro de la espora con
respecto a la célula bacteriana y la posición que ocupa dentro de ella son
características distintivas de las especies.

Las esporas no se colorean por métodos corrientes por consiguiente se recurre a

métodos de coloración especiales para su observación. Algunas coloraciones para
esporas son: Coloración de Möller y de Schaeffer-Fulton.

Schaeffer Fulton: En este tipo de tinción se utiliza como colorante primario el Verde
de Malaquita y uno de contraste (Safranina o Fucsina).
Por medio de esta técnica se pueden diferenciar las endosporas producidas por
algunos géneros de bacterias y la célula vegetativa. De acuerdo con ella, se aplica el
colorante primario en solución acuosa al espécimen y se le hace vaporizar para
incrementar la penetración de los recubrimientos relativamente impermeables de las
esporas. Las esporas sometidas correctamente al método resistirán la sustitución
por el colorante de contraste y a menudo se podrán observar ESPORAS VERDES
DENTRO DE CÉLULAS ROJAS. En esta forma se puede determinar la ubicación
intracelular (terminal, subterminal y central), de la endospora de ciertos
microorganismos y usarse también con fines taxonómicos.

Técnica de coloración de Schaeffer Fulton:

1. Prepare el frotis y fíjelo al calor
2. Agregue unas gotas de Verde de malaquita hasta cubrir totalmente la
preparación; caliente por 5 minutos hasta que se observe la emisión de vapores
pero sin dejar hervir ni secar el colorante. La placa puede ser cubierta con papel
filtro para evitar salpicaduras y siempre tenga en cuenta que el montaje debe
estar lo suficientemente húmedo.
3. Deje enfriar y lave con agua destilada
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4. Contracolorear con Safranina al 0,5 % por 1 minuto

5. Retire el exceso de colorante lavando con agua destilada
6. Deje secar al aire
7. Realice la observación al microscopio con objetivo de inmersión y dibuje lo
observado.

Técnica De De Coloración De Método De Möller:

1. Realice un frotis de la muestra en estudio, déjelo secar al aire y fíjelo
2. Cubra el frotis con fuschina carbólica de ZN y caliéntelo hasta que desprenda
vapores. Tenga cuidado de no dejar secar ni hervir el colorante. Continúe este
proceso por 5 minutos.
3. Lave con agua
4. Decolore con ácido sulfúrico al 1%.
5. Lave con agua.
6. Cubra con azul de metileno de Löeffler durante 2 minutos.
7. Lave con agua, deje secar y observe al microscopio en objetivo de inmersión.

Las esporas aparecen rojas y las células vegetativas de color azul

TINCIÓN DE CÁPSULA

Tinción negativa: En esta tinción se puede identificar la estructura externa que

envuelve a algunas bacterias como Klebsiella sp, Streptococcus pneumoniae y
Clostridium perfringens. Utiliza como colorante primario tinta china o nigrosina

La técnica de tinción negativa incorpora materiales como la tinta china, que se

compone de partículas demasiado grandes para penetrar en la célula; después de
haber utilizado el colorante primario se adiciona el de contraste que penetra
fácilmente a la célula bacteriana. Al examinar la preparación, la cápsula aparecerá
como una zona transparente que rodea a la pared celular. No se puede afirmar con
certeza absoluta que todas las regiones claras observadas sean cápsulas, debido a
que el encogimiento de las células o la recesión o separación de la tinta china
pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general, cuando un frotis
tratado presenta muchas zonas transparentes con siluetas uniformes, es posible que
sean reales y no artificiales.

Técnica de tinción de Negativa:

1. Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado deposite en un extremo una gota
de tinta china.
2. Tome una gota del cultivo y mezcle a lo largo del portaobjetos (técnica del frotis
sanguíneo). También puede mezclar en un tubo, partes iguales de cultivo y tinta
china.
3. Tome la muestra, suspéndala sobre la lámina y realice el extendido.
4. Deje que el extendido seque naturalmente (nunca fije al calor).
5. Cubra con Safranina por 10 segundos y luego retire el exceso de colorante con
agua destilada muy cuidadosamente para no eliminar el frotis.
6. Deje secar al ambiente.
7. Realice la observación bajo el microscopio con objetivo de inmersión y dibuje lo
observado.
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Tinción de Hiss: Se emplea para coloración de cápsula en las bacterias. Las

células se ven teñidas intensamente y la cápsula de azul o rosado según se use
violeta o fuscina.

Técnica De Coloración de Hiss:

1. Previamente se cultivan las bacterias para el desarrollo máximo de cápsula.
2. Fijar los frotis con vapores de ácido ósmico durante 10 a 20 seg.
3. Dejar secar sin calentar.
4. Fijar con alcohol flameándolo.
5. Cubrir son una solución de fucsina básica o cristal violeta calentando ligeramente
hasta la emisión de vapores.
6. Retirar el colorante mediante solución al 20% de sulfato de cobre en agua.
7. Secar con papel filtro y examinar al microscopio. Si emplea cristal violeta la
cápsula aparecerá azul claro en contraste con el color púrpura oscuro de la
célula.

Tinción de Rojo Congo: Se emplea para coloración de cápsula en las bacterias.

Técnica de tinción de Rojo Congo:

 En un tubo de ensayo coloque 0.5 de colorante de rojo congo.
 Con el asa previamente esterilizada tome una colonia y emulsiónela en el
colorante.
 Deje actuar por 20 minutos.
 Con el asa esterilizada emulsione de nuevo y tome una gota, extendiéndola sobre
la lámina y deje secar a temperatura ambiente.
 NO FIJE AL CALOR, y observe luego del secado bajo el objetivo de inmersión.

TINCIÓN DE FLAGELOS

Los flagelos son órganos de locomoción delgados, de naturaleza proteica que se

originan en la región protoplásmica inmediatamente debajo de la pared celular. No
todos las bacterias poseen estas estructuras y en consecuencia, la presencia de
flagelos, al igual que la distribución y las cantidades en que están presentes en ellas
son características útiles para su clasificación (patrones de flagelación: polar,
peritricos, monotricos, lofotricos, anfítricos). La observación de flagelos se realiza
comúnmente en microscopios electrónicos, sin embargo, con la técnica adecuada se
pueden observar en microscopios ópticos, cuando se aplican mordientes y
colorantes alrededor de ellas, ya que estas incrementan el diámetro de los flagelos
(Los flagelos se observan de color rosado y la célula de color rojo).

Técnica de Tinción de Flagelos modificada de Loeffer:

1. Coloque una gota de un cultivo bacteriano de 18 horas cerca de un extremo de la
lámina.
2. Incline el portaobjetos para que la muestra se deslice a lo largo de él.
3. Deje secar al aire.
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4. Cubra la extensión con el mordiente de Loeffer para flagelos por un tiempo de 5

minutos.
5. Lave cuidadosamente con agua destilada.
6. Adicione colorante de Loeffer en caliente y deje actuar por 30 minutos. Durante
este tiempo mantenga la preparación sobre un baño serológico para que el vapor
de agua actúe calentando el montaje.
7. Lave con agua destilada cuidadosamente y deje secar al ambiente.
8. Realice el montaje al microscopio y esquematice lo observado.

TINCIÓN DE GRÁNULOS

Tinción de Alberth: Se usa para teñir gránulos metacromáticos de Babest-Ernst los

cuales se tiñen de color rojizo mientras el cuerpo de la célula se tiñe de color azul-
verdoso, es una técnica de tinción útil para observar los gránulos de las
Corynebacterias.

Técnica de Coloración de Alberth:

Se cubre la preparación con el colorante y se deja obrar por 15 a 20 minutos; si se
desea acelerar el proceso se calienta por 5 minutos, se lava y se le adiciona lugol
por 30 seg.

Tinción de Stoltemberg: Tiene el mismo fundamento que la coloración de Alberth.

REACTIVOS PARA COLORACIÓN

COLORACIÓN DE GRAM
1. Cristal Violeta (Hucker’s)
Solución A
Cristal violeta (90% de contenido seco) 2.0gr
Alcohol etílico (95%) 20mL
Solución B
Oxalato de amonio 0.8gr
Agua destilada 80mL.

Solución de Trabajo: diluir la solución A en proporción 1:3 con agua destilada y

mezclarla con 4 partes de solución B. Guardar en un frasco ámbar y conservar por
24 horas antes de utilizarse. Filtrar cuando se observe formación de precipitado.

2. Yodo de Gram (Lugol)

Yodo 1gr.
Yoduro de Potasio 2gr.
Agua destilada 300mL
Colocar el yoduro de potasio en un mortero, agregar yodo y triturarlo perfectamente.
Agregar el agua en poca cantidad, mezclar y envasar en frasco ámbar. Lavar cada
vez el mortero con poca cantidad de agua hasta completar el volumen de 300mL.

3. Alcohol etílico (95%)

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Alcohol etílico (100%) 95mL

Agua destilada 5mL

4. Safranina
Safranina O 0.25mL
Alcohol etílico (95%) 10mL
Agua destilada 100 mL (completar a este volumen).

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN

1. Fucshina
Solución Madre de Fucshina fenicada de Ziehl:
Fucshina básica para microscopía C22H24CIN3 10gr.
Etanol 95° 100mL.
Triture la fucshina en un mortero con el alcohol, agregándolo poco a poco; trasvase
a un frasco ámbar. En caso que no disponga de un mortero, coloque directamente la
fucshina y el alcohol en el frasco ámbar y agite hasta su completa disolución.
Coloque la solución madre de fucshina a 37°C por 8 días, para su maduración: agite
diariamente para extraer la mayor cantidad de colorante procedente del polvo de
fucshina. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegida de la luz. Filtre con
papel filtro antes de usar.
Solución de fenol al 5%:
Fenol 5mL.
Agua destilada 95mL.
Funda los cristales de fenol en baño maría; utilice cámara de extracción; mida en
probeta los 5 ml y complete con agua destilada a 100mL. Envase, rotule y almacene
a temperatura ambiente protegida de la luz.
Solución de trabajo de fucshina fenicada:
Solución de fucshina filtrada 10mL.
Solución de fenol al 5% 90mL.
Envase en frasco ámbar. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegido de la
luz.

2. Alcohol ácido al 3%
Ácido clorhídrico 37% 3mL
Etanol 95° 97mL.
Agregue lentamente el ácido sobre el alcohol. Envase, rotule y almacene a
temperatura ambiente.

3. Azul de Metileno
Solución Madre de azul de metileno:
Azul de metileno para microscopía C16H18CIN3S.2H2O 10gr.
Etanol 95° 100mL.
Coloque la solución madre de azul de metileno a 37°C por 8 días, para su
maduración; agite diariamente para extraer la mayor cantidad del colorante
procedente del polvo de azul de metileno. Rotule y almacene a temperatura
ambiente protegida de la luz. Filtre con papel filtro antes de usar.
Solución de trabajo de azul de metileno:
Solución madre filtrada 30mL.
Agua destilada 70mL.
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COLORACIÓN DE SCHEFFER-FULTON
1. Verde de Malaquita:
Verde de Malaquita 5.0gr.
Agua Destilada 100mL.
2. Safranina: la misma de la tinción de Gram

COLORACIÓN DE MÖELLER
Fuschina carbólica de Zeehl-Neelsen, ácido sulfúrico al 1%, azul de metileno de
Zeehl-Neelsen.

COLORACIÓN DE HISS
1. Fuscina
Fuscina básica 0.15-0.30gr.
Agua destilada 100ml.
2. Sulfato de cobre al 20% en agua destilada.
3. Cristal violeta
Cristal violeta 0.05-0.1gr.
Agua destilada 100ml.

COLORACIÓN DE ROJO CONGO

En un frasco color ámbar adicione:
Rojo congo. 1gr.
Etanol 10ml.
Agua destilada 90ml.
Antes de usar mezcle y filtre.

COLORACIÓN DE FLAGELOS MODIFICADA DE LOEFFER

1. Fascina básica al 1.2% en Etanol al 95%.
2. Ácido tánico al 3% en agua destilada. La suspensión debe tener un color amarillo
para ser satisfactoria, se agrega fenol en una proporción 1 a 2000 para evitar la
aparición de mohos durante el almacenamiento.
3. Cloruro de sodio al 1.5% en agua destilada.
4. Para preparar la solución colorante se mezclan volúmenes iguales de los tres
stocks anteriores. El colorante está listo para ser usado después de la
preparación y debe almacenarse en frascos bien cerrados. La vida útil de la
solución tintorial es de una semana a temperatura ambiente, un mes en el
refrigerador e indefinida si se congela.

COLORACIÓN DE ALBERTH

Azul de toluidina 0.15gr.

Verde de malaquita 0.02gr.
Ácido acético glacial 1ml.
Alcohol etílico (95%) 2ml.
Agua destilada 100ml.

COLORACIÓN DE STOLTEMBERG

1. Verde de malaquita 1.25gr.

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Agua destilada 500ml.

2. Azul de toluidina 0.25gr.
Ácido acético 15ml.
3. Hematoxilina 0.05gr.
Alcohol etílico 15ml.
Cada colorante se macera en morteros diferentes, se mezclan y se filtran.

5. Procedimiento

A partir de las muestra y/o cultivos bacterianos indicados por el tutor realice una
cloración para visualización de: bacterias Gram positivas y Gram negativas, bacilos
ácido-alcohol-resistentes, esporas, cápsula y para gránulos metacromáticos.
Observe cada una al microscopio con el objetivo de 100X detallando cada una de las
estructuras que desea resaltar con la coloración, así como el color que estas toman
con la técnica respectiva.

6. Cuestionario

- Realice dibujos sobre las coloraciones observadas

-Indique ejemplos de microorganismos característicos de cada coloración realizada

7. Bibliografía

López L., Hernández M. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de

microbiología. Laboratorio de Infectología, Centro Nacional de Investigación y
Atención a Quemados (CENIAQ), Vol. 3. Recuperado de:
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf

Olivas E. (2001). Manual de prácticas de Microbiología. Juárez, Universidad

Autónoma de Ciudad Juárez. Pg. 14. Disponible en:
https://books.google.com.co/books?
id=pWQQxlTIPIsC&pg=PA12&dq=coloraciones+simples+y+compuestas+microbiolog
ia&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwiP3Kb4_ZLPAhWHXB4KHYyHDXYQ6AEIKzAC#v=o
nepage&q&f=false

PRACTICA 7

Medios Selectivos y Diferenciales

1.Objetivos

- Familiarizarse con el uso y función de medios especializados para la

selección y diferenciación de microorganismos.

- Identificar los componentes de cada uno de los medios de cultivo ensayados

que permiten la selección y diferenciación de microorganismos.

- Interpretar las reacciones bioquímicas asociadas a los componentes

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selectivos y diferenciales durante el crecimiento bacteriano.

- Reconocer las características metabólicas (carácter fenotípico clásico) que

permiten una identificación microbiológica preliminar.

2.Materiales

Asas microbiológicas
Mechero de Busen

3. Reactivos

Agar Salado Manitol en caja de Petri

Agar Mac Conkey en caja
Agar Eosina Azul de Metileno EMB en caja
Agar Fluorocult en caja
Agar XLD en caja
Cultivos de diversos microorganismos

4. Marco Teórico

Las bacterias son microorganismos muy versátiles que poseen una enorme
capacidad de utilización de diversos compuestos nutritivos como moléculas
inorgánicas sencillas hasta compuestos orgánicos complejos. La diferencia en la
capacidad de empleo de los nutrientes constituye parte de la base para la
identificación tradicional de los microorganismos.
Existen numerosos medios que tienen diferentes propósitos:

 Aislar tipos bacterianos de una población mixta de microorganismos

 Diferenciar grupos bacterianos relacionados, con base en la apariencia
microscópica de las colonias y las reacciones bioquímicas con el medio.
 Identificar microorganismos en alimentos, aguas, lodo, o productos de uso
diario.
 Ensayar el efecto de sustancias sobre microorganismos
 Caracterizar o identificar los microorganismos según su habilidad para
producir cambios químicos en diferentes medios.

Además de permitir al microorganismo su nutrición, y crecimiento, un medio de

cultivo puede estar constituido químicamente para obtener un solo propósito o
cambiar varios aspectos en un solo medio, aislando microorganismos y
diferenciándolos de otros morfológica y bioquímicamente semejantes.
Algunos medios empleados para seleccionar y/o diferenciar grupos de bacterias son:

Agar Manitol Salado: Este medio de cultivo contiene altas concentraciones de sal
(7,5% de NaCl), lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias diferentes
de estafilococos. El manitol incorporado en el medio realiza una función diferencial
pues solo algunos estafilococos pueden fermentarlo. La adición de rojo de fenol
como indicador de pH permite detectar la producción de ácido como resultado de la
vía fermentativa para el metabolismo del manitol, estos microorganismos forman una
zona amarilla periférica a su crecimiento. Estafilococos que no fermenten el manitol
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no producirán este cambio de color. Control positivo S. aureus

Agar Mac Conkey: es un medio de diferenciación selectivo para el aislamiento y la

diferenciación de enterobacteriasy diversos otros bacilos gram negativos.
A partir de muestras clínicas.
La presencia de cristal violeta en su composición permite una inhibición del
crecimiento de organismos gram positivos. La inclusión de lactosa, sales
biliares y rojo neutro como indicador de pH, permite la diferenciación de
bacterias entéricas con base en su habilidad para fermentar la lactosa en dos
grandes grupos fermentadores (bacilos coliformes) y no fermentadores
(bacilos disentéricos, tifoideo y paratifoideo) de lactosa. Los estéricos
fermentadores de lactosa generan ácido como producto final de su
metabolismo, creciendo con formación de colonias de color rojo-rosado, si la
cantidad de ácido es producida en grandes cantidades aparecerá en la zona
periférica una zona roja causada por las precipitaciones biliares y absorción
del rojo neutro. Las bacterias no fermentadoras de lactosa no producen ácido,
s verán colonias incoloras y transparentes.
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Agar Eosina Azul de Metileno EMB: Este medio genera aislamiento selectivo de
enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre
organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son
incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos
ejercen un efecto inhibitorio sobre bacterias Gram positivas. Muchas cepas de
Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo metálico. Las
cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada,
mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento
de Candida spp. Como colonias rosadas y puntiformes. Enterococcus spp. Crece en
este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter
spp. Y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto
puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al
0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En
este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y
Shigella.
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Agar Fluorocult ECD: Mezcla de sales biliares dentro de sus componentes, permite
el aislamiento de E. coli e inhibe la microbiota acompañante. Las colonias de E. coli
se detectan por fluorescencia azul claro bajo la luz ultravioleta directamente sobre la
caja y confirmado con la prueba de indol.

Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato de Sodio XLD: es un medio moderadamente

selectivo y de diferenciación para patógenos entéricos gram negativos (Salmonella y
Shigella) especialmente. Utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo que
inhibe los microorganismos Gram positivos. La xilosa se incorpora en el medio dado
que la fermentan prácticamente todos los entéricos, excepto Shigella, y esta
propiedad hace posible la diferenciación de dicha especie. La lisina se incluye para
permitir la diferenciación del grupo Salmonella de los organismos no patógenos,
dado que, sin lisina, Salmonella fermentaría rápidamente la xilosa y no se distinguiría
de las especies no patógenas. Cuando la Salmonella agota el suministro de xilosa, la
lisina es atacada por la enzima lisina descarboxilasa, lo que genera un cambio a un
pH alcalino que imita la reacción de Shigella. Para aumentar la capacidad de
diferenciación de la fórmula, se incluye un sistema indicador de H2S.
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5. Procedimiento

1. Reconozca e identifique la composición, apariencia y color de cada uno de los

medios de cultivo a emplear.
2. Divida imaginariamente cada uno de los medios de cultivo en cuatro
3. Marque cada una de las zonas con el nombre del microorganismo a inocular
4. Siembre realizando una línea como se muestra en el diagrama.
5. Incube a 37°C por 24 horas en aerobiosis.
6. Lea los resultados, analizar el crecimiento observado tomando como referencia el
catálogo del proveedor.

Diagrama de Siembra

6. Cuestionario

De los medios empleados en la práctica indique:

a. Clase de medio de cultivo

b. Indicador de pH
c. Otros indicadores de reacciones bioquímicas (si los hay)
d. Fuentes de carbono del medio
e. Inhibidor
f. Uso
g. Tipo de bacteria que puede crecer en él.
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h. Reacciones bioquímicas que suceden (fermentación, deaminación,

descarboxilación, etc.)

7. Bibliografías

Prats, G. (2008). Microbiología Clínica. Madrid, Panamericana.

Rodríguez E. (2007). Bacteriología General, Principios y Prácticas de Laboratorio.

San Juan de Costa Rica. Universidad de Costa Rica. Pg 133

Washington C. Allen D. Koneman E. (2008). Koneman: Diagnóstico Microbiológico.

Buenos Aires. Panamericana. Pg 211

PRACTICA 8

Metabolismo Microbiano

1.Objetivos

- Evidenciar la diversidad metabólica de los microorganismos como

parámetros básicos para su identificación preliminar.

- Distinguir las principales pruebas bioquímicas utilizadas para su identificación

presuntiva de microorganismos.

- Reconocer el fundamento bioquímico de cada una de las pruebas para su

correcta interpretación.

2.Materiales

- Asa Recta
- Asa redonda
- Tubos de ensayo medios líquidos

3. Reactivos

- Fermentación de carbohidratos, Rojo de metilo, Voges-Proskauer, urea,

nitratos, coagulasa
- Tubos de ensayo con agar recto para motilidad e indol.
- Tubos de ensayo con agar inclinado para: TSI, citrato, descarboxilación de
lisina (LIA)
- Cajas de Petri con agar para: almidón, caseína, DNAsa, agar nutritivo
(antibiograma), agar sangre.
- Tiras de oxidasa
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- Peróxido de hidrogeno al 3%
- KOH al 40%
- α-naftol, 5% en etanol absoluto
- Rojo de metilo al 0.033% en etanol absoluto
- Reactivo de indol según Kovac’s
- Reactivos de Griess
- Polvo de zinc
- Solución de lugol
- HCl 1M
- Plasma de conejo o humano
- Sensidiscos estériles
- Soluciones de antibióticos

Microorganismos: Bacillus sp. Streptococcus sp. Micrococcus sp. Staphylococcus

sp. Escherichia coli. Pseudomonas sp. Klebsiella sp. Salmonella sp.
Enterobacter sp. Proteus sp.

4. Marco Teórico

La identificación inicial bacteriana puede hacerse mediante la observación de

características de las colonias y morfología con tinción de Gram, sin embargo la
caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido a nivel de género y
especie habitualmente se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que
son únicos para cada especie y sirven como marcadores de identificación.

La actividad más importante del microbiólogo/bacteriólogo clínico es el aislamiento e

identificación de agentes de interés infecciosos. Esta área principal de la
microbiología se denomina microbiología clínica o diagnóstica. Cada vez resulta más
patente la trascendencia que tiene la identificación exacta del patógeno para tratar
correctamente una infección, y constantemente se están desarrollando nuevos
métodos mucho más sofisticados.

El metabolismo denota todas las actividades químicas organizadas de una célula, las
cuales comprenden aspectos generales que involucran proceso de degradación de
moléculas complejas para la producción de energía así como de precursores para
todos sus procesos de síntesis de enzimas, ácidos nucleicos, polisacáridos y otros
componentes celulares.

Estas reacciones son de dos tipos:

Anabólicas: Proceso de síntesis de los constituyentes celulares a partir de

moléculas simples y que generalmente requieren energía.

Catabólicas: Rompimiento de moléculas orgánicas para obtener energía.

La mayor parte de las pruebas usadas para evaluar la actividad bioquímica o
metabólica de las bacterias, por medio de la cual puede hacerse una identificación
presuntiva adecuada de una especie, se lleva a cabo mediante el subcultivo o
siembra del aislamiento primario en una serie de medios diferenciales, cuyos
resultados pueden interpretarse después de un periodo de incubación.
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Las diferencias de la forma como procesan los nutrientes y los desechos que
producen y liberan los microorganismos son el resultado de las enzimas que poseen
y pueden ser utilizadas para su clasificación.
Estas enzimas participan en proceso de oxidación, y fermentación de azucares y de
otros compuestos, liberando metabolitos característicos para identificar cada grupo
taxonómico.

FUNDAMENTOS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

PRUEBA FINALIDAD INTERPRETACIÓN

Utilizando como base el caldo rojo
de fenol, determinar la capacidad de
Fermentación de
fermentar un carbohidrato con
carbohidratos
producción de ácido (ácido pirúvico
y otros ácidos) y eventualmente gas.
KLIGGER. Utilización Determinar la capacidad de usar
de carbohidratos, lactosa y/o glucosa producción de
lactosa y glucosa. gas y producción de H2S
TSI – Agar Hierro triple
Determinar la utilización de glucosa,
azúcar
lactosa y/o sacarosa, con
glucosa, lactosa,
producción de gas o no y H2S.
sacarosa.
Determinar la capacidad para utilizar
el citrato como fuente única de
carbono. Esta capacidad se mide
Citrato
por la utilización de sales de amono
como la única fuente de nitrógeno,
liberándose amoníaco.
Determinar la capacidad de producir
ácido y de mantener estables estos
Rojo de Metilo (RM) productos de la fermentación de la
glucosa, y vencer la amortiguación
del sistema.
Determinar la capacidad para
producir un compuesto final neutro
Voges – Proskauer (VP)
acetoína/acetil, metilcarbinol de la
fermentación de la glucosa.
Determinar la capacidad de
Hidrólisis de Gelatina
producción de gealatinasas.
Determinar la presencia de la
enzima triptofanasa que hidroliza el
Indol
triptófano con formación de indol,
ácido pirúvico y amoníaco.
Determinar la capacidad de
hidrolizar la urea con producción de
Ureasa
NH3 o (NH4)2 CO3 los cuales
alcalinizan el medio.
Determinar la movilidad o
inmovilidad, presencia o ausencia
Movilidad
de flagelos, puede leerse en medio
SIM o medio MOTILITH.
Descarboxilación de En Agar lisina hierro “LIA”, detecta la
Los tubos inoculados de 18 a 24 horas
a la temperatura adecuada.
Positivo: Amarillo
Negativo: Rojo
Eventualmente gas en las campanas
DURHAM
Los tubos se incuban 18-24 horas a la
temperatura adecuada.
K/A. Rojo/Amarillo: LAC(-) Glu(+)
K/K. Amarillo/Amar: glu(+) LAC(+)
Parte interior amarilla, intermedia y
superior roja: GLU(+) LAC-SAC(-).
Reporte K/A.
Todo amarillo: Glu-Lac-Sac(+). Reporte
A/A.
Todo rojo: Glu-Lac-Sac(-). Reporte
K/K.
Ennegrecimiento: H2S(+) o H2S(-).
Burbujas: Gas(+) o Gas(-)
Positivo: Azul intenso o crecimiento
Visible sobre el medio
Negativo: Verde
Adicionar 4 gotas de rojo de metilo.
Positivo: medio rojo.
Negativo: medio amarillo.
Adicionar 3 ml de reactivo de barrit (α-
naftol). 1ml de KOH. Se deja el tubo en
reposo por 30 minutos y se realiza la
lectura:
Positivo: superficie roja – rosada.
Negativo: sin cambio
Antes de leer los tubos, estos se deben
poner en refrigerador por 10-15min.
Positivo: medio líquido
Negativo: no cambia de estado
Adicionar gotas de reactivo de kovac’s
(o-Dimetilaminobenzaldehido en
alcohol isoamilico.)
Positivo: anillo cereza en la superficie.
Negativo: anillo amarillo (escatol)
Positivo: tubo fucsia
Negativo: tubo amarillo
Se deben sembrar dos tubos e incubar
a diferente temperatura.
Positivo: desplazamiento del
crecimiento alrededor del inóculo.
Positivo: tubo morado
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capacidad para descarboxiliar la

Lisina lisina junto con producción H2S.
Indicdor: purpura de bromocresol
Detectar la presencia de la enzima,
Catalasa
la cual degrada el H2O2 en H2O y O2
Determinar la capacidad de reducir
los nitratos a nitritos, a nitrógeno
Reducción de Nitratos
elemental o a hidrolamina.
NO3 → NO2 → N
Identificar bacterias que carecen de
la enzima citocromooxidasa, la cual
transfiere electrones al oxígeno en
Oxidasa
la cadena de respiración aeróbica, o
son anaeróbicas estrictas. El
reactivo sustituye al oxigeno como
aceptor (reducido es incoloro)
Detectar la presencia de coagulasa
ligada a la pared o de forma libre
Coagulasa presente en el filtrado del cultivo,
que actúa sobre el plasma humano
o de conejo.
Determinar la capacidad de producir
DESOXIRIBONUCLEA DNAsa que hidroliza las moléculas
SA (Dnasa) de ADN. El ADN no hidrolizado
precipita en presencia de HCl 1M.
Se deben sembrar por cada prueba
Hidrólisis De Almidón cuatro cajas que se revelan a las 24
horas, 2, 3 y 10 días.
Determinar HCl la capacidad de
producir alfa o Beta Hemolisinas
Hemólisis que actúan sobre los eritrocitos de la
sangre, usándolos parcial o
totalmente
Determinar la sensibilidad o
resistencia del microorganismo a la
Antibiograma
concentración de un antibiótico
impregnado en el sensidisco.
Determinar la presencia de
proteasas que actúan sobre la
Caseína caseína presente en el medio
generando polipéptidos y/o
aminoácidos.
Ennegrecimiento: H2S(+) Tonalidades
café-rojizas = Deaminación.
Colocar sobre una lámina una colonia
de un cultivo de 24 horas en Agar
nutritivo adicionar dos gotas de
peróxido de Hidrogeno al 3%.
Positivo: efervescencia antes de
20seg., liberación de O2.
Se revela adicionando después de la
incubación unas gotas de reactivo de
Griess.
Positivo: Rojo
Si el tubo permanece sin cambios se
adiciona un poco de polvo de Zinc,
Positivo: Amarillo
Negativo: Roj
Frotar una muestra de la colonia sobre
una tira de prueba para oxidasa.
Positivo: Color azul
Negativo: Incoloro
Se mezclan 0.3ml, de plasma con
0.3ml, de un cultivo de 18-24 horas del
microorganismo. se incuba 4 horas.
Positivo: coágulo visible
Negativo: medio líquido totalmente.
Revelar inundando la caja con HCl 1M.
Positivo: Halo claro acreedor de las
colonias.
Negativo: ausencia de halos.
Inundar la caja con solución de lugol.
Positivo: halo café alrededor de la
colonia
Negativo: Azul violeta
Positivo:
α – Hemólisis: zona circundante verde
β – Hemólisis: zona circundante clara
Positivo: halo de inhibición del
crecimiento alrededor del sensidisco.
Negativo: crecimiento masivo de
microorganismos.
Positivo: halos claros alrededor de la
colonia (digestión o coagulación de la
caseína).
Negativa: ausencia de halo.

5. Procedimiento

Realice la inoculación de cada una de las pruebas con el microorganismo

suministrado, de la siguiente forma, incube de acuerdo con las recomendaciones
del instructor y revele la prueba siguiendo las indicaciones de interpretación
presentadas en el marco teórico.

PRUEBA MEDIO / REACTIVO PROCEDIMIENTO

INDOL SIM Siembra por picadura
MOTILIDAD SIM Siembra por picadura
FERMENTACIÓN DE TSI Siembra mixta
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Caldo rojo de fenol +

CARBOHIDRATOS Inoculación del medio con asa de redonda
carbohidrato
CUTRATO Agar citrato Siembra mixta
ROJO DE METILO Caldo RM - VP Inoculación del medio con asa de redonda
VOGES PROSKAVER Caldo RM – VP Inoculación del medio con asa de redonda
UREASA Caldo UREA Inoculación del medio con asa de redonda
DESCARBOXILACIÓN
Agar Lía Siembra mixta
DE LISINA
REDUCCIÓN DE
Caldo mixto Inoculación del medio con asa de redonda
INITRATOS
Sobre un portaobjetos limpio realice el frotis de
Peróxido de nitrógeno
CATALASA una colonia del microorganismo y adicione 2
3%
gotas del reactivo. Escriba las observaciones
Tiras prueba de Frote una colonia del microorganismo sobre el
OXIDASA
oxidasa (o ampollas) reactivo y realice las observaciones
HIDRÓLISIS DE
Gelatina Siembra por picadura
GELATINA
Inocule el microorganismo en los 0.3ml de
caldo BHI e incube a 37°C/16-24hrs.
Caldo BHI plasma Pasada la incubación adicione a este tubo
COAGULASA
humano/conejo 0.3ml de plasma e incube a 37°C/4hr.
(Observe hasta las 18-24hrs), realice la lectura
de la prueba.
Realice una siembra por agotamiento e incube
HIDRÓLISIS DE Agar almidón Lugol a 37°C/24hrs. Pasada la incubación inunde las
ALMIDÓN de GRAM cajas con Lugol de GRAM, realice lectura de la
prueba.
Siembre el microorganismo por agotamiento e
HEMOLISIS Agar sangre incube a 37°C/24 grs. Pasada incubación
realice la lectura de la prueba.
Realice una siembra por agotamiento e incube
Agar nutritivo con
GASEINA a 37°C/24 hrs. Pasada la incubación realice la
SKIM MILK
lectura de la prueba
Realice la siembra por agotamiento e incube a
DESOXIRRIBONUCLE
Agar DNAsa 37°C/24 hrs. Inunde la caja con HCl 1M y
ASA
realice lectura de la prueba.
Siembre masivamente con el hisopo el
microorganismo impregne cada sensidisco con
Agar Mueller Hinton, un antibiótico diferente y repártalos
ANTIBIOGRAMA sensidiscos, equitativamente en la superficie de la caja,
antibióticos señalando en la parte posterior la porción de
cada antibiótico. Incube a 37°C/24hrs. Y
realice lectura.

6. Cuestionario

De las pruebas bioquímicas realizadas identifique en cuales se presenta oxidación y

en cuales reducción además la vía por la cual se llevó su metabolismo y sus
productos de desecho.

De los microorganismos utilizados haga una comparación con los datos de los otros
grupos y desarrollen un cuadro anotando diferencias entre los microorganismos
fermentadores y los microorganismos no fermentadores.

Mencione el fundamento y la utilidad de los sistemas “API” y “CRISTAL”

¿Qué tipos de coágulos se pueden presentar al realizar la prueba de coagulasa.?

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Explique cada una de ellas.

Explique los mecanismos por medio de los cuales los antibióticos causan daño a los
microorganismos sensibles a ellos.

7. Bibliografías

Cercenado E., Cantón R. (2010). Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica. EIMC, Disponible en:
https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/
procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf

PRACTICA 9

Sensibilidad Bacteriana/Antibiograma

1.Objetivos

- Reconocer Los Diferentes Métodos Utilizados Para La Realización De Un

Antibiograma.

- Interpretar Correctamente Los Resultados De Una Prueba De Sensibilidad

2.Materiales

- Asas
- Hisopos Estériles
- Pinzas Estériles

3. Reactivos

- Placas Petri Con Agar Muller Hinton

- Sensidiscos
- Cepas Bacterianas

4. Marco Teórico

Los Antibiogramas Son Métodos In Vitro Que Determinan La Susceptibilidad De Los

Microorganismos A Una Variedad De Agentes Antimicrobianos, Bajo Condiciones De
Laboratorio Específicas Y Estandarizadas. La Meta Principal Del Estudio De
Susceptibilidad Es Proveer Al Clínico Algunas Recomendaciones Sobre La Terapia
Que Puede Ser Más Apropiada En Pacientes Con Una Infección Específica.
En El Laboratorio De Microbiología Ayuda Al Clínico Haciéndole Conocer La
Sensibilidad O Resistencia De Una Determinada Bacteria Por Medio Del
Antibiograma.
El Antibiograma Puede Realizarse Por Métodos De Dilución O De Disco Difusión.
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Método Dilución
Se Prepara 10 Tubos De Prueba De Caldo Nutritivo, A Cada Tubo Se Le Agrega
Una Cantidad De Antibióticos Diluidos En Serie, Desde 100 µg/Ml Hasta 0.05 µg/Ml,
El Último Tubo No Contiene Antibiótico Y Sirve Como Control De Crecimiento. Se
Inocula Cada Tubo Con Una Suspensión Calibrada De Microorganismos En Estudio
Y Se Incuba A 37°C Por 18 Horas.
A Partir De Algún Tubo Empezará La Inhibición Del Crecimiento, Este Punto De
Ruptura Representa La MIC, Definida Como La Concentración Mínima De Antibiótico
En µg/Ml Que Impide El Crecimiento Bacteriano In Vitro.

Método De Difusión
El Método De Prueba De Susceptibilidad Por Difusión En Discos Incluye El
Agregado De Una Cantidad Conocida De Agente Microbiana Un Pequeño Disco De
Papel Absorbente Que Miden 6 Mm De Diámetro.
La Colocación De Este Disco Sobre Una Superficie De Agar Previamente Sembrada
Con El Microorganismo Susceptible. La Zona Concéntrica De Inhibición Que Resulta
Cuando El Microorganismo A Prueba Se Siembra Sobre La Superficie De La Placa
De Agar Antes De La Aplicación Del Disco Tiene Una Relación Lineal Demostrada
Con La MIC Para La Mayoría De Los Antimicrobianos, Medidas Por Pruebas De
Susceptibilidad Por Dilución.
El Método De Disco-Difusión En Agar Es Una Manera Práctica, Fácil Y Rápida De
Realizar El Antibiograma.
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El Recomendado, El Bauer-Kirby, Con El Que Se Ha Logrado Uniformizar Criterios

Que Toman En Cuenta Los Conceptos De Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) Y
De La Concentración Promedio En Sangre De Los Medicamentos Frecuentemente
Usados.

5. Procedimiento

 Tomar Una Porción De Cepa Bacteriana, Extender Uniformemente En La

Superficie De La Placa De Agar Muller-Hinton
 Colocar Con Ayuda De Pinzas Los Discos Impregnados Con Diferentes
Antibióticos Sobre La Superficie De Agar. Escoger Los Antibióticos De
Acuerdo Al Tipo De Gérmenes Y La Localización De La Infección.
 Los Discos Deben Quedar A Una Distancia Mínima 20 Mm Entre Ellos.
 Incubar A 37C, Durante 24 Horas.

Lectura E Interpretación

 El Diámetro De La Zona De Inhibición Se Mide Con Una Regla Milimetrada

Colocada Debajo De La Placa Petri.
 El Límite Del Área De Inhibición Está Dado Por La Inhibición Completa Del
Desarrollo Que Se Puede Apreciar A Simple Vista.
 Los Milímetros De La Lectura Serán Llevados A La Tabla Para Traducir Su
Interpretación A Los Términos SUSCEPTIBLE, INTERMEDIO Y
RESISTENTE.

GUIA PARA INTERPRETAR EL HALO DE INHIBICIÓN

CARGA DEL
ANTIBIOTICO RESISTENTE INTERMEDIO SUSCEPTIBLE
DISCO
AMPICILINA 10ug 11 Ó - 12-13 14 Ó +
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CEFACLOR 30ug 14 Ó - 15-17 18 Ó +

CLORANFENICOL 30ug 12 Ó - 13-17 18 Ó +
ERITROMICINA 15ug 13 Ó - 14-17 18 Ó +
GENTAMICINA 10ug 12 Ó - 13-14 15 Ó +
AC NALIDIXICO 30ug 13 Ó - 14-18 19 Ó +
TETRACICLINA 30ug 14 Ó - 15-18 19 Ó +
*Diámetro Del Halo (Mm)

6. Cuestionario

1. ¿Para Qué Es Útil Un Antibiograma?

2. ¿Cuándo Decimos Que Un Fármaco Es Sensible Al Desarrollo Bacteriano?
3. ¿Cuál Es El Medio De Cultivo Más Utilizado Para Realizar Un Antibiograma?
4. Complete La Tabla Según Sus Resultados

Microorganismo: ___________________________________________

Diámetro De La
Antibiótico Concentración Interpretación
Zona De Inhibición

Observación: Compare Los Resultados Obtenidos Por Usted Con Los De Algunos
De Sus Compañeros. Anote Sus Conclusiones.

7. Bibliografías

Prats, G. (2008). Microbiología Clínica. Madrid, Panamericana.

Rodríguez E. (2007). Bacteriología General, Principios Y Prácticas De Laboratorio.

San Juan De Costa Rica. Universidad De Costa Rica.

Washington C. Allen D. Koneman E. (2008). Koneman: Diagnóstico Microbiológico.

Buenos Aires. Panamericana.

8. Anexos

Antibióticos que deben ser considerados para pruebas de antibiograma

ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONAS ESTAFILOCOCOS ENTEROCOCOS ESTREPTOCOCOS

Primario Amikacilina Cefalotina Penicilina G
Azlocilina Clindamicina
Amikacina Carbenicilina Eriromicina Penicilina G
Ampicilina Gentamicina Oxacilina Ampicilina
Cefazolina Netilmicina Dicloxacilina Vancomicina
Cefalotina Tobramicina Penicilina G
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Cloranfenicol
Gentamicina
Tetraciclina
Tetraciclina
Tobramicina

Secundario
Ceftazidna Amikacina Cefalotina
Ceftriaxona Gentamicina Cloranfenicol
Amoxicilina
Cefotaxina Amoxicilina Clindamicina
Ceftazidina
Cloranfenicol Cloranfenicol Eritromicina
Ceftriaxona
Imipen TMP-SMX Tetraciclina
Carbenicilina
TMP - SMX

PRACTICA 10

Morfología Fúngica

1.Objetivos

- Realizar observaciones macro y microscópicamente de una muestra de

cultivos de hongos: Penicillium spp., Rhizopus spp., Cladosporium spp.,
Trichoderma spp., Mucor spp., Saccharomyces spp., Candida spp.,
Geotrichum spp.

- Identificar las estructuras micóticas macro y microscópicamente.

- Realizar un cultivo micótico

2.Materiales

Microscopio
Cajas de Petri
Papel filtro
Portaobjetos y cubreobjetos (a cargo del estudiante)
Cinta
Asas micológicas
Pitillos

3. Reactivos

Azul de lactofenol
Glicerina 10%
Cepas de Penicillium spp., Rhizopus spp., Cladosporium spp., Trichoderma spp.,
Mucor spp., Saccharomyces spp., Candida spp., Geotrichum spp., Aspergillus spp.

4. Marco Teórico
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Los hongos pertenecen al reino Fungi, son células eucariotas, con presentación
celular filamentosa (Mohos) y levarudiforme (levaduras).
Por su amplia distribución en el ambiente como parásitos de plantas, animales y el
hombre, son también de gran importancia clínica al generar varias enfermedades.
Es necesario identificar los agentes causales de las micosis en el laboratorio
microbiológico:

Diagnóstico microbiológico de los hongos:

Para el estudio microbiológico de una muestra, se debe realizar la observación

directa al microscopio y obtener aislamiento del microorganismo en medio de cultivo.

Identificación de hongos por microscopía

a. Montaje en portaobjetos: Colocar 1 gota de azul de lactofenol sobre una lámina,

tomar la muestra del hongo con un asa, emulsionar y desbridar la muestra con
ayuda de otra asa, poner un cubreobjetos encima y observar con objeto de 10 y 40x.
A menudo, el rastrillado de la colonia rompe las delicadas estructuras de
fructificación de los mohos, lo que puede dificultar su identificación definitiva.
b. Preparación en cinta engomada: Colocar una gota de colorante azul de lactofenol
sobre la superficie de un portaobjetos. Utilizando cinta engomada transparente,
presionar con la parte del pegamento suave pero firmemente la colonia,
recolectando el micelio aéreo. Pegar la cinta sobre el portaobjeto intentando que el
micelio se impregne con el colorante. Se debe evitar la formación de burbujas.
Observar en 10x y 40x.
c. Técnica de cultivo en microplaca: Se coloca un trozo de 1 cm2 de agar PDA
(Papa-Dextrosa-Agar) sobre la superficie de un portaobjeto estéril. Inocular cada
ángulo del bloque con una pequeña porción de la colonia estudiada usando asa
recta. Calentar suavemente un cubreobjeto con la llama del mechero y colóquelo
sobre el agar inoculado. El leve derretimiento del agar permite que se selle.
Colocar en una caja de Petri sobre pitillos con el fin que quede elevado sobre un
disco de papel humedecido con glicerina.
Tapar e incubar a 30°C de 3 a 5 días. Cuando el cultivo esté maduro, se levanta con
suavidad el cubreobjeto, se coloca una gota de azul de lactofenol sobre un segundo
portaobjetos y se cubre con el cubreobjeto retirado del cultivo.
Observar a 10 y 40x.
d. A partir de muestras problema los hongos pueden ser identificados al examen
directo usando hidróxido de potasio (KOH), este permite digerir el material proteico,
observando con mayor nitidez los elementos fúngicos. Adicionalmente, se puede
emplear colorantes para pigmentar la pared de los hongos y mejorar la visualización.
- Tinta China: Permite visualizar la cápsula de polisacárido de Cryptococcus
neoformans
- Coloración Giemsa para el diagnóstico de histoplasmosis, neumocistosis y
otras micosis. Permite visualizar blastoconidias intracelulares al
polimorfonuclear, como la fase tisular del H. capsulatum.
- Coloración Gram: Es útil para observar blastoconidias y pseudomicelios de
las especies del género Candida, Malassezia y Cryptococcus, las cuales son
Gram positivas con variaciones en la intensidad de la coloración.
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Características generales de hongos importantes en microbiología:

Mucor spp.: Las colonias se desarrollan rápidamente a 25°C, cubriendo la superficie

del medio de cultivo; crecen pobremente a 37°C.
El color de las colonias es blanquecino al inicio, con el tiempo cambia a marrón. El
reverso de la colonia es blanquecino. La textura es algodonosa. Microscópicamente
presentan hifas aseptadas y gruesas. Se caracteriza por presentar esporangióforos,
esporangios Carecen de apófisis, estolón y rizoides. Las columnelas son hialinas,
siendo visibles si el esporangio se encuentra intacto. Los esporangios son esféricos
o redondos (50–300 mm de diámetro) y de color gris a negro, estando llenos de
esporas.

Rhizopus spp.: Colonias de crecimiento rápido a 37°C, a los cuatro días llegan a
ocupar totalmente la placa Petri. Inicialmente son blancas pero luego cambian
a gris parduscas. El micelio carece de septos. Presentan estolones y rizoides. Los
esporangióforos no son ramificados, tienen una longitud de 2 mm, generalmente
están en grupos, formando verticilios en cuya base se sitúan los rizoides. Las
apófisis pueden estar presentes pero son poco evidentes. Presentan esporangios
esféricos cuyo ancho es de 50 a 300 mm, los cuales son de color gris pardusco a
negro. La columela es su esférica abarcando entre 50 a 70% del esporangio. Las
esporangiosporas son angulares y con estrías longitudinales, grisáceas,
subesféricas o elipsoidales con dimensiones de 6 a 8 x 4 a 5 mm.

Aspergillus spp.: Las colonias desarrollan con rapidez sobre a 25°C, la textura es
aterciopelada, afelpada, vellosa o algo plegada, con margen blanquecino o beige.
El color inicialmente es blanco virando en aproximadamente siete días a un verde
azulado por la producción de conidias. El reverso de la colonia es incoloro.
Presentan conidióforo corto, liso de hasta 300 mm de longitud y de 5 a 8 mm de
diámetro, vesícula de 20 a 30 mm de diámetro con fiálides (6 a 8 mm de largo),
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uniseriada, ocupando 2/3 de la vesícula. Los conidios en cadenas forman una

compacta columna sobre la vesícula, son de color verde, finamente rugosos,
globosos o subglobosos y de 2 a 3 mm de diámetro.

Penicillium spp.: Colonias de crecimiento rápido, pulverulentas de color verde.

microscópicamente presentan conidióforos rectos, hialinos o levemente
pigmentados, con fialides que nacen directamente de la hifa o sobre métulas.
Conidias producidas en cadena, de forma esféricas o elipsoidales, a menudo con
una base trunca, hialinas, de pared delgada y en ocasiones ornamentadas.

Trichoderma spp.: La mayoría de las en su inicio tienen color blanco, que se tornan
a verde oscuro o amarillento, con esporulación densa. El micelio es raro en su
mayoría, y visto al microscopio es fino, los conidióforos son ramificados, parecen un
árbol pequeño. Los mismos se presentan como penachos compactados que forman
anillos con un sistema de ramas irregular de manera piramidal.

Fusarium spp.: las colonias se obtienen en Sabouraud después de 1 a 5 días.

Pueden ser algodonosas de color blanco, con diversos pigmentos según la especie
(crema, rosado, salmón, amarillo, rojo o morado). Microscópicamente posee células
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conidiógenas tipo fialides formadas en la hifa aérea. Poseen 2 tipos de conidia:

macroconidias y microconidias, que varían en forma y número según la especie:
- Macroconidias fusiformes, con septos transversales, producidas por sucesión
basipétala en los monofialides y acumuladas en pequeñas masas en la punta de la
fialide.
- Microconidias elipsoidales, ovales, subesféricas, piriformes o en forma de clava,
producidas por sucesión basipétala en mono y polifialides y acumuladas formando
falsas cabezas o en cadenas.

Candida spp.: Crecimiento de colonias levaduriformes, de bordes enteros, limitadas,

poco elevadas y de color blanco. Crecen en un promedio de 3 a 5 días a
temperatura ambiente. Al microscopio se identifica como levaduras mitospóricas
alargadas o ligeramente redondas de 2 - 6 x 3 - 9 µm que se reproducen por
gemación (blastoconidios). A excepción de C. glabrata, el resto de las especies
asociadas a candidosis pueden formar pseudomicelios; C. albicans y C. dubliniensis
además son formadoras de hifas.

7. Bibliografías:

Ministerio de Salud del Perú, Instituto Nacional de Salud. (2010). Manual de

procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales
hongos oportunistas causantes de micosis humanas. Medicina & Laboratorio,
Volumen 16, Números 9-10. Disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2010/myl109-10e.pdf

Universidad de Antioquia. Aprende en línea. Dermatomicosis y onicomicosis por

hongos ambientales. Disponible en:
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http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/course/view.php?id=743&section=6