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REVISIONES DE MICROBIOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR , septiembre de 2005, pág. vol. 69, núm. 3
501–526 1092-2172/05/$08.00 0 doi:10.1128/JMBR.69.3.501–526.2005 Copyright © 2005,
Sociedad Estadounidense de Microbiología. Todos los derechos reservados.

Terminación de la replicación en Escherichia coli: estructura y actividad antihelicasa del

complejo Tus-Ter Cameron Neylon,1,2* Andrew V. Kralicek,2,3 Thomas M. Hill,4 y
Nicholas E. Dixon2 Escuela de Química, Universidad de Southampton, Southampton SO17 1BJ,
Reino Unido1 ; Escuela de Investigación de Química, Universidad Nacional de Australia, ACT 0200, Australia2 ;
Sector de Tecnologías Genéticas, HortResearch, Auckland, Nueva Zelanda3 ; y Departamento de
Microbiología e Inmunología, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de
Dakota del Norte, Grand Forks, Dakota del Norte 58202-90374

INTRODUCCIÓN ................................................. .................................................... .................................................... ..501

Alcance ................................................ .................................................... .................................................... .......................501
Orígenes del Concepto de Terminación de la Replicación .................. .................................................... .....................502
COMPONENTES DEL SISTEMA DE TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN .................. .......................................503 Las secuencias
Terminator (Ter) .... .................................................... .................................................... ....................503 Un factor que actúa en
transacciones .................. .................................................... .................................................... ................504 El gen tus y la proteína
tus ........................... .................. .................................................... ..........................504 MECANISMOS PROPUESTOS DE
DETENCIÓN DE LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN ........... .................................................... .....504 Evidencia de interacciones
proteína-proteína específicas .................................. .................................................... .....505 ESTRUCTURA DEL COMPLEJO
Tus-Ter Y BASES MOLECULARES DE LA DETENCIÓN DE LA REPLICACIÓN....507 La estructura cristalina del complejo Tus-
Ter ........... .................................................... ..............................507 Interacciones de unión proteína-
ADN .................. .................................................... .................................................... ......508 Estudios de modificación y protección
del ADN .................................. .................................................... ...........509 Estudios de sustitución de
nucleótidos ........................... .................................................... ......... .....................................510 Mutantes de
Tus......... .................................................... .................................................... ..........................................511 Un mecanismo paso a
paso para tus- Vinculación y desvinculación de Ter .................................................. .............................515 Comparación de
secuencias Tus .................. .................................................... .................................................... ..........515 PERSPECTIVAS
ESTRUCTURALES SOBRE LAS INTERACCIONES DE Tus CON HELICAS ............................... ..517 Estructuras de DnaB y
Helicasas Hexaméricas Relacionadas .................................. .............................................517 Interacción de Tus con
Helicasas.................................................. .................................................... ......................518 MECANISMOS DE DETENCIÓN DE
LA REPLICACIÓN POLAR ...................... ........................................ .........................519 Perspectivas para el
futuro.................... .................................................... .................................................... ................519
AGRADECIMIENTOS .................................. .................................................... .................................................... .......523
REFERENCIAS ............................................. .................................................... .................................................... ...............523

INTRODUCCIÓN detención del avance de las horquillas de replicación. Se desarrollan algunas

Alcance
La replicación del ADN en Escherichia coli se inicia en oriC, el único origen
de replicación, y procede bidireccionalmente (119). Esto crea dos horquillas
de replicación que invaden el ADN dúplex a ambos lados del origen. Las
horquillas se mueven alrededor del cromosoma circular a una velocidad de
unos 1000 nucleótidos por segundo y se encuentran unos 40 minutos después
de la iniciación en una región opuesta a oriC. En esta región se ubican una
serie de sitios, llamados sitios de terminación o Ter , que bloquean las
horquillas de replicación que se mueven en una dirección pero no en la otra
(Fig. 1). Esto crea una "trampa de bifurcación de replicación" que permite que
las bifurcaciones entren pero no salgan de la región terminal (66, 67).
Aquí ofrecemos una descripción histórica del desarrollo de este modelo
para el proceso de terminación de la replicación en E. coli, y luego examinamos
en detalle molecular las hipótesis actuales sobre el mecanismo por el cual la
interacción de la proteína terminadora de replicación (Tus) en Ter sitios lleva
a polar
ideas nuevas.
Previamente se han revisado varios aspectos de la terminación de la
replicación (7, 13, 19, 26, 58, 67, 78, 108, 120, 145, 153) y la interacción Tus-
Ter (85, 170). Aunque la discusión aquí se limita al sistema tal como ha
evolucionado en E. coli y eubacterias estrechamente relacionadas, la
comprensión de la terminación en E. coli se ha desarrollado en paralelo con
el trabajo sobre el sistema mecanísticamente relacionado en Bacillus subtilis
(26, 169). El sistema de terminación de B. subtilis es el único otro en el que
se conoce la estructura molecular de la proteína terminadora de la replicación
(RTP) en complejo con un sitio Ter afín y el único en el que se conocen las
estructuras tanto de la proteína libre (27, 134) como del ADN- Se han
determinado las formas unidas (172) de la proteína. Aunque inicialmente se
pensó que los sitios Ter en B. subtilis eran similares a los de E. coli (71), las
dos proteínas terminadoras no están relacionadas en secuencia ni en
estructura y se unen a sus respectivos sitios Ter de maneras bastante
diferentes (85, 172). ). RTP se une como un dímero de dímeros a dos medios
sitios simétricos dentro de un sitio Ter completo de B. subtilis (discutido
recientemente en detalle en la referencia 44), mientras que, como se describe
a continuación, Tus se une como un monómero a un sitio completo (asimétrico)

* Autor correspondiente. Dirección postal: School of Chemistry, Uni versity of E. coli sitio Ter.
Southampton, Southampton SO17 1BJ, Reino Unido.
Teléfono: (44) 23 8059 4164. Fax: (44) 23 8059 6805. Correo electrónico: DCNeylon La síntesis de ADN en las horquillas de replicación está mediada por un
@soton.ac.uk. ensamblaje de múltiples proteínas llamado replisoma, que logra

501
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502 NEYLON Y AL. MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.

responsable de la duplicación concertada de ambas hebras de plantilla

(Fig. 2A), junto con un primosoma que sintetiza repetidamente cebadores
de ARN cortos en la hebra rezagada. El primosoma se mueve en la
hebra rezagada en la dirección 5-3, impulsado por la helicasa DnaB
hexámera en forma de anillo, que también es responsable de la
separación de las hebras molde de ADN. Por lo tanto, si tuviéramos que
proponer por el momento que un complejo de Tus con un sitio Ter
proporciona un bloqueo físico para el progreso de una horquilla de
replicación, podríamos esperar que esto se manifieste como una
inhibición de la separación de cadenas por parte de DnaB en el ápice de
la replicación. horquilla de replicación (Fig. 2B). Volveremos más adelante
para examinar estos procesos en detalle.

Orígenes del Concepto de Terminación de la Replicación

El interés en el proceso de terminación de la replicación fue provocado

HIGO. 1. Posiciones de los sitios Ter y el gen tus en el cromosoma de E.
coli . Todos los sitios Ter están orientados de modo que las horquillas de
replicación puedan viajar en la dirección del origen al término, pero no en la
dirección opuesta. El gen tus está justo aguas abajo de TerB.
síntesis concertada de ADN tanto en la cadena principal como en la
retrasada (Fig. 2). Las funciones de los componentes proteicos
individuales del replisoma y las interacciones macromoleculares que
determinan su estructura y función han sido objeto de un estudio intensivo
durante los últimos 25 años, y esto ha dado lugar a modelos sofisticados
de cómo funciona el complejo. Estos han sido objeto de revisiones
recientes (8, 15, 34, 35, 118, 153).
Cada replisoma (Fig. 2B) está compuesto por una holoenzima de ADN
polimerasa III dimérica asimétrica (118), que es re
en gran medida por el descubrimiento de que la replicación en E. coli
procede bidireccionalmente desde oriC, ubicado a los 85 minutos en el
mapa de enlace de 100 minutos del cromosoma circular (17, 146). Estaba
claro, por lo tanto, que dos horquillas de replicación que se movían en
direcciones opuestas se encontrarían en algún punto aproximadamente
a la mitad del cromosoma desde el origen (Fig. 1). Dos informes
anteriores colocaron el sitio de terminación en algún punto cercano al
operón trp a los 28 min (22, 117). Dentro del error del mapeo de Bird et
al. (22), se observó que el sitio de terminación era diametralmente
opuesto a oriC. Esos trabajadores discutieron brevemente dos
mecanismos para la terminación, favoreciendo la simple colisión de las
horquillas de replicación sobre la terminación en un sitio específico.
Señalaron, sin embargo, que no había pruebas sólidas a favor de ninguno
de los dos mecanismos.
La cuestión de si la replicación terminaba en un sitio específico se
examinó en varios sistemas experimentales, y la primera indicación de
la existencia de un término discreto fue

HIGO. 2. Interacciones proteína-proteína en el replisoma de Escherichia coli a medida que se acerca al bloque de terminación Tus-Ter. (A) La holoenzima de
ADN polimerasa III (Pol III) es un dímero asimétrico que contiene 10 subunidades diferentes que incluyen las subunidades gemelas de polimerasa () que replican
simultáneamente las dos hebras de la plantilla de ADN. (B) El replisoma es un complejo multiproteico formado por la helicasa DnaB, la primasa DnaG y la
holoenzima Pol III. Cada hebra replicada comienza con un cebador de ARN corto sintetizado por DnaG primasa reclutada de la solución por interacción con DnaB.
El ADN monocatenario está protegido por SSB. Adaptado de la Fig. 2 de la referencia 153 con permiso de los autores.
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VOLUMEN 69, 2005 Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 503

encontrado en estudios con el plásmido R conjugativo R6K y un mutante por

deleción del mismo, RSF1040 (33, 112). El examen con microscopía electrónica
de los intermedios de replicación RSF1040 mostró dos orígenes ( y ) y un único
término (33). La replicación se inició desde el origen, avanzando primero hacia
la "derecha", deteniéndose en desde
el término y luego
el mismo avanzando
origen hasta elhacia
mismola "izquierda"
término.
La replicación también podría ocurrir desde el origen de la misma manera
asimétrica y bidireccional hasta el mismo término. El terminal es por lo tanto
responsable de convertir la replicación unidireccional en un modo bidireccional
secuencial (33). Estas conclusiones no se ven afectadas por estudios recientes
que muestran que el inicio de la replicación de R6K es más complicado, ya que
involucra interacciones en bucle de la proteína iniciadora de la replicación unida
en un tercer origen ( ) con los orígenes y (1, 2).

Poco después, en 1977, se reportó evidencia de un sitio discreto para la

terminación en el cromosoma de E. coli . Louarn et al. (110) cambiaron la
posición del inicio de la replicación integrando los orígenes del plásmido R en
varios sitios del cromosoma de un mutante sensible a la temperatura con una
mutación en dnaA, el gen que codifica la proteína iniciadora de la replicación
DnaA (119).
Estas cepas no pudieron iniciar la replicación desde oriC a la temperatura no HIGO. 3. Secuencias de nucleótidos de sitios Ter del cromosoma de E. coli y
permisiva, pero la replicación aún podría iniciarse en los orígenes integrados y plásmidos R6K. Los pares de bases que interactúan con la proteína Tus están indicados
por las regiones sombreadas. En la orientación que se muestra para estas secuencias,
proceder bidireccionalmente. Se encontró que terminaba diametralmente
las horquillas de replicación que se acercan desde la izquierda están bloqueadas,
opuesto a oriC (entre att 80 a los 28 min y attP2H a los 45 min) incluso cuando mientras que las que ingresan desde la derecha no tienen obstáculos.
el nuevo origen estaba desplazado 26 min. Usando un sistema similar, Kuempel
et al. (103, 104) ubicaron el término entre aroD y rac a los 38 y 30 min,
respectivamente, y Louarn et al. (111) luego redujo este intervalo a los 6 min
eventualmente se llamaría TerA y TerB (Fig. 3) tenían una gran similitud con las
entre hombre y rac. dos mitades de una repetición invertida imperfecta en el terminal R6K (62, 71,
75). Las dos secuencias R6K (llamadas TerR1 y TerR2) eran idénticas a TerA y
Todavía era una pregunta abierta si los terminales R6K y E. coli funcionaban
TerB en las posiciones 15 y 12, respectivamente (Fig. 3). Tanto en los plásmidos
con el mismo mecanismo. Ambos términos bloquearon la replicación en sitios
R6K como en el cromosoma de E. coli , las secuencias Ter se colocaron para
específicos y ambos parecían funcionar independientemente del sitio de
formar una "trampa de horquilla de replicación" que permitiría que un replisoma
iniciación y el tipo de origen. El terminal de E. coli podría bloquear la replicación
entrara en la región entre los dos sitios Ter pero no saliera. También se
bidireccional iniciada desde oriC o la replicación (simétrica o asimétrica) de
encontraron secuencias Ter en una variedad de otros plásmidos, así como en
varios orígenes de fagos o plásmidos integrados en varias ubicaciones (103, otras bacterias (30), y el número de sitios Ter identificados en el cromosoma de
104, 110), mientras que el terminal R6K podría bloquear la replicación desde los
E. coli también aumentó, primero a 4 (48, 62), luego a 5 (63), y finalmente a 10,
orígenes R6K en RSF1010 (33) y de un origen ColE1 en dos posiciones tras la publicación de la secuencia del genoma completo (23) y un estudio en
diferentes en un plásmido (98). Aparentemente, ambas terminales bloquearon
profundidad de las sustituciones de nucleótidos por parte de Coskun-Ari y Hill
las bifurcaciones de replicación que llegaban a la terminal desde ambas
(30).
direcciones. Sin embargo, como se describió anteriormente, los modos de
replicación son bastante diferentes. Además, mientras que la región terminal
R6K estaba ubicada en un segmento de ADN de 216 pb (12), la continua
dificultad para identificar la ubicación precisa del terminal cromosómico
COMPONENTES DE LA REPLICACIÓN
comenzaba a sugerir que se trataba de una región grande en lugar de un sitio
SISTEMA DE TERMINACIÓN
específico. .

Las secuencias Terminator (Ter)

Este problema se resolvió en 1987 al darse cuenta de que el término de E.
coli estaba formado por loci discretos que bloqueaban por separado las horquillas
de replicación que se movían en direcciones opuestas de manera polar (38, 68,
138). Los primeros dos sitios de terminación identificados estaban situados en
cada extremo de la región terminal (Fig. 1); uno estaba ubicado cerca de trp a
los 28 min y el otro cerca de manA a los 36 min (68, 138). Este bloqueo polar
para el avance de la horquilla, por lo tanto, parecía ser diferente al del terminal
R6K, que se sabía que bloqueaba el movimiento de la horquilla en cualquier
dirección (11, 33, 98).
Las secuencias de los sitios Ter de 23 pb conocidos se muestran en la Fig. 3.
El par de bases GC6 estrictamente conservado va seguido de una región central
de 13 pb muy conservada en la que se permiten algunas sustituciones. La
secuencia es asimétrica, reflejando la asimetría del bloque de horquilla de
replicación. En extremos orientados como en la Fig. 3, las bifurcaciones de
replicación que llegan desde la izquierda están bloqueadas mientras que las de
la derecha pasan sin obstáculos. La secuencia central generalmente se asocia
en el lado de bloqueo de la horquilla con una región anterior rica en AT (30).

La resolución de la similitud de los dos sistemas tuvo que esperar un año Una vez que estuvieron disponibles los pequeños fragmentos de ADN que
más para que las secuencias de nucleótidos de E. coli ter minus estuvieran contenían TerA y TerB , así como los dos sitios TerR , se demostró que podían
disponibles (62, 71). Los terminadores que bloquear las horquillas de replicación en los plásmidos ColE1 in vivo (139,
Machine Translated by Google
504 NEYLON Y AL.
159), y la prueba de que las secuencias mínimas de Ter eran suficientes para
bloquear las horquillas de replicación de manera polar se produjo después de
haber sido insertadas en plásmidos como oligonucleótidos sintéticos (62, 71, 75).
Un factor transaccional
Al mismo tiempo, la atención comenzaba a centrarse en el mecanismo de
terminación. Se sospechaba desde principios de la década de 1980 que podría
estar involucrada una proteína de unión al ADN.
Bastia et al. (12) habían demostrado que el terminal R6K no tenía ninguna
simetría doble significativa, descartando efectivamente el impedimento estérico
debido a la estructura secundaria del ADN como mecanismo para el bloqueo de
la horquilla de replicación. Además, el término del plásmido fue capaz de
bloquear las horquillas de replicación en extractos preparados a partir de células
que no contenían un plásmido derivado de R6K, lo que indica que cualquier
proteína involucrada está codificada por el cromosoma huésped (53).
La segunda línea de evidencia para la participación de un ADN
la proteína de unión surgió de los estudios de deleción utilizados para reducir las
ubicaciones de TerA y TerB. TerB se localizó rápidamente en una región de 4
kb, mientras que TerA fue más difícil de localizar con precisión. Sin embargo, la
eliminación de la región TerB inactivó la actividad de detención en TerA, lo que
implica un factor que actúa en trans codificado cerca del sitio de detención de
TerB (69). Kuempel y colaboradores nombraron el gen tus putativo para
"sustancia de utilización de terminación".
La primera descripción del factor que actúa en trans fue realizada por Hill et
al. (72), quienes aislaron el gen que codifica una proteína de unión al ADN
mediante la selección de mutantes por deleción e inserción con mutaciones en
la región TerB . Informaron sobre las secuencias de genes y la construcción de
tus cepas que eran deficientes en termina
actividad de ción. Estos mutantes se complementaron con copias de tus
transmitidas por plásmidos. Se predijo que el gen codificaría un polipéptido de
36 kDa y dirigió la sobreproducción de una proteína estimada por electroforesis
en gel de este tamaño (72).
Poco después, otros dos grupos aislaron una proteína que se unía al ADN de
R6K Ter . Sista et al. (159) purificaron una proteína de 40 kDa que se unía a la
secuencia de TerR y definía su sitio de unión utilizando huellas de cobre-
fenantrolina. Un sitio Ter mutado con cambios en seis de los residuos protegidos
perdió tanto la capacidad de unirse a la proteína purificada como la capacidad
de detener las horquillas de replicación in vivo. Kobayashi et al. (96) informaron
sobre el aislamiento de un fragmento de ADN que codifica actividad de unión a
terminal, junto con mutantes de inserción que habían perdido la capacidad de
unirse a un sitio Ter , ya sea en un plásmido o en el cromosoma. La actividad
asociada con el gen fue sensible al tratamiento con proteasas y calor pero no al
tratamiento con RNasa (96).
También determinaron la secuencia del gen, sobreprodujeron y purificaron el
producto del gen y demostraron su unión a ambos sitios TerR mediante la huella
de ADNasa I (65).
Pronto se demostró que las tres actividades eran del mismo
proteína, codificada por el gen tus situado justo después de TerB (Fig. 1 y 4). La
proteína Tus se unió a todos los sitios Ter conocidos y, una vez unida, podría
bloquear el progreso de una horquilla de replicación.
Una pregunta pendiente era cómo se bloqueó la horquilla móvil.
¿Interactuó el complejo Tus-Ter específicamente con algún componente del
replisoma en movimiento, o simplemente actuó como una abrazadera en el ADN
impidiendo su paso a través del sitio Ter ? Con el gen, la proteína y las hipótesis
en la mano, varios grupos abordaron el mecanismo de terminación de la
replicación.
MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.
HIGO. 4. Relación entre TerB y el gen tus . Se muestran el gen tus y
su región promotora 10 y el sitio de unión al ribosoma (RBS). La proteína
Tus regula la expresión del gen tus uniéndose a la secuencia TerB y
bloqueando el inicio de la transcripción de tus. La secuencia TerB está
encerrada en el cuadro y los pares de bases que interactúan con Tus
están sombreados como en la Fig. 3.
El gen tus y la proteína tus
El gen tus se encuentra 11 pares de bases aguas abajo del sitio TerB (Fig.
4). Tanto su sitio de unión al ribosoma como la región 10 de su promotor se
superponen a TerB, lo que sugiere que la transcripción del gen está regulada por
la unión de Tus a su secuencia de reconocimiento. Dos informes confirmaron
esto en 1991. Los estudios de extensión de cebadores en plantillas que contenían
TerB mostraron que la presencia de Tus activo reducía la transcripción de tus y
que la adición de más sitios TerB en un plásmido con un alto número de copias
aumentaba su transcripción (144). Además, Natarajan et al. (130) demostraron
que Tus podía bloquear su propia transcripción in vitro y que el complejo proteína-
ADN podía evitar que la ARN polimerasa se uniera al promotor. Roecklein y
Kuempel (143) luego mapearon con precisión el sitio de inicio de la transcripción
in vivo en un sitio dentro de TerB (Fig. 4) y confirmaron que la expresión de Tus
está autorregulada.
El gen codificaba una proteína de 308 aminoácidos (después de eliminar el
residuo de metionina N-terminal) con una masa de 35.652 Da. La secuencia de
la proteína no mostró similitud con ningún motivo de unión al ADN conocido. La
proteína purificada tenía un pI de 7,5, significativamente inferior al valor de 10,5
calculado a partir de su composición de aminoácidos. Dado que no había indicios
de que la proteína estuviera fosforilada, esto sugería que la estructura terciaria
tenía un gran efecto sobre el estado de ionización de varios residuos básicos. La
filtración en gel y la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa
mostraron que Tus era un monómero en solución con un radio de Stokes de 23
Å y una relación axial de dos (31). Esto le permitiría cubrir 13 pb de ADN en la
unión, lo que concordaba con los resultados de los estudios de huellas anteriores
(159).
Tus se demostró por huella con cobre-fenantrolina (159), ADNasa I (65, 130)
y radicales hidroxilo (54, 158) para unirse a varios sitios Ter . Se unió
extremadamente ávidamente al sitio TerB ; el complejo Tus-TerB tenía una
constante de disociación medida (KD) de 3,4 10 M y una vida media de
13
disociación in vitro de 550 min a pH
de 7,5
potasio
en un
150
tampón
mM (54).
que Su
contenía
unión a
glutamato
R6K TerR2
en condiciones idénticas fue más débil; el valor medido de KD fue 30 veces
mayor, principalmente debido a una mayor tasa de disociación (54). Se demostró
que la proteína se une a TerB como un monómero, lo cual es inusual para una
proteína de unión a ADN pero consistente con la asimetría de los sitios Ter y la
detención de la horquilla de replicación (31).
MECANISMOS DE REPLICACIÓN PROPUESTOS
DETENCIÓN DE HORQUILLA
Pronto se establecieron las bases del mecanismo de detención de horquillas.
lizado Se demostró que el complejo Tus-TerB bloquea la acción de
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VOLUMEN 69, 2005
la helicasa de ADN replicativa principal, DnaB in vitro de una manera
dependiente de la orientación (91, 106). La orientación de la
bloque fue el mismo que para la detención del movimiento de la horquilla de
replicación tanto in vivo como in vitro (61, 70, 106, 113).
En el proceso normal de replicación, DnaB está al frente de
el replisoma (Fig. 2B). Es un homohexamérico en forma de anillo.
enzima que se transloca en la dirección 5 a 3 en la plantilla de cadena rezagada
para desenrollar el ADN de doble cadena en el frente
de la holoenzima de la ADN polimerasa III, la replicasa de múltiples subunidades
(118, 153) que sintetiza simultáneamente ambas cadenas
(Fig. 2A). Una hebra (la hebra principal) se replica continuamente, mientras que
la otra hebra (rezagada) se sintetiza de forma discontinua en una serie de
fragmentos (Okazaki). La enzima cebadora de ARN replicante, DnaG primasa
(49), es reclutada por
DnaB para el cebado de cada nuevo fragmento en la hebra discontinua (133).
Las secciones monocatenarias que resultan
de la acción de la helicasa se recubren con una proteína de unión a ADN (SSB)
monocatenaria. DnaB está físicamente asociado con el
replicasa a través de la subunidad de la holoenzima (93).
Cuando el Tus-Ter detuvo el progreso del replisoma
complejo, tanto in vitro (70) como in vivo (126), síntesis de ADN
continuó hasta 4 pares de bases antes del GC6 conservado
par de bases en el sitio TerB (Fig. 3). Este es un resultado sorprendente
dado el tamaño de la holoenzima polimerasa, por no hablar de la
enormidad de todo el replisoma. Dado que se sabe que la plantilla de la cadena
principal está excluida del canal central de
DnaB (80, 87), es concebible que el sitio activo del
la polimerasa de cadena principal está muy cerca del punto de cadena
separación por la helicasa (Fig. 2B). Sin embargo, parece más
probable que la disociación de DnaB del replisoma ocurra como
parte del proceso de detención. En presencia de DnaG primasa,
la distribución de los sitios de parada de la hebra principal cambió, mostrando una
grado de sensibilidad de la síntesis de cadena líder a la proteína
complemento de la hebra retrasada (70).
La síntesis de la cadena retrasada se detuvo 50, 66 u 82 pb antes de la
Sitio TerB (70). La brecha de 50 pb (17 nm) podría contemplarse como una
bucle unido por uno o dos tetrámeros de SSB en el retraso
hebra (Fig. 5). Esto implica que el ciclo es topológicamente
o físicamente restringido de cerrar más lejos para permitir
cebado por DnaG antes de la disociación de DnaB. El de 16 pb
el espacio entre los sitios de cebado de la hebra retrasada puede reflejar
algún aspecto de la organización de proteínas en la hebra rezagada que
afecta el sitio de cebado o la subsiguiente extensión del cebador o
puede deberse simplemente a la especificidad de secuencia del DnaG
primasa (49, 70).
Esta información permite el desarrollo de un análisis bastante detallado.
modelo del proceso de detención de replicación (Fig. 5). Tus obligado a
un sitio de Ter mira en una dirección hacia una bifurcación de replicación que
se aproxima. La helicasa DnaB se aproxima al complejo Tus-Ter
y está bloqueado para continuar. Antes de que se disocie, su interacción con la
primasa conduce a la síntesis de un cebador final de cadena rezagada a una
distancia que puede ser dictada por la fase.
de la unión de los tetrámeros SSB a la plantilla de cadena rezagada.
La disociación de DnaB luego deja una estructura bifurcada en Y que es
monocatenario muy cerca del yacimiento del Ter . Otro tetrámero (o
dos) de SSB luego se une rápidamente al monocatenario expuesto
ADN para protegerlo. Holoenzima de ADN polimerasa III entonces
sintetiza la hebra principal de ADN hasta el sitio Ter
y completa la síntesis del último fragmento de Okazaki cebado
en la hebra rezagada. In vivo el replisoma debe reas
Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 505
ensamblarse y eventualmente pasar a través del bloque o disociarse,
dejando atrás la estructura en Y. En el último caso, el bucle monocatenario
podría persistir (unido por SSB), o la síntesis
podría completarse mediante mecanismos de reparación del ADN o mediante
la elongación de la cadena principal de la otra horquilla de replicación. los
Se sabe que las estructuras de horquilla en Y persisten in vivo en plásmidos
cuya replicación ha sido bloqueada por Ter orientado correctamente
sitios (76). Una cuestión que queda por examinar de forma satisfactoria es la
definición precisa del complemento proteico.
de una horquilla atascada en Tus-TerB y, en particular, en qué punto
la helicasa DnaB se disocia.
¿Qué ocurre cuando se acerca una bifurcación de replicación desde el
otra dirección (permisiva) es mucho menos clara. Khatri et al.
(91) sugirieron que la proteína Tus permanece asociada con
una hebra (la hebra que se muestra en la Fig. 3) del ADN desenrollado
después de que DnaB haya pasado por el sitio Ter desde el permisivo
lado. Sin embargo, Gottlieb et al. (54) encontró que Tus no tenía
afinidad por cualquiera de las cadenas de ADN en la forma monocatenaria,
y Neylon et al. (131) también reportaron que la afinidad de Tus por
cada hebra separada del sitio TerB era la misma que para
un ADN monocatenario no específico en condiciones bajas en sal
donde se pudo observar la unión. Se ha trabajado muy poco
informó sobre el proceso por el cual la helicasa pasa a través de
el complejo Tus-Ter cuando se acerca desde el permisivo
dirección.
Otro tema pendiente es la naturaleza de la interacción.
entre Tus y DnaB. ¿Actúa Tus simplemente como una abrazadera en el
ADN, o existen interacciones específicas proteína-proteína o proteína-proteína
ADN entre Tus y la helicasa que se aproxima
(u otro componente del replisoma)? Estas dos posibilidades
puede describirse en términos generales como el "modelo de sujeción" y el
"modelo de interacción". Estos dos simples mecanismos fueron inicialmente
propuesto con la expectativa de que la pregunta sería
resuelto rápidamente. Sin embargo, sigue siendo controvertido a pesar de
de publicación durante los años siguientes de una alta resolución
estructura cristalina del complejo Tus-TerA (85). Un tercer mecanismo potencial
que se ha sugerido recientemente (131) es uno en
que Tus interactúa con la helicasa (u otros elementos de la
replisoma) a través del ADN. Es decir, que Tus diseña un
estructura en el ADN en el lado no permisivo que previene
el paso posterior de la helicasa. Una cuarta alternativa relacionada,
aparentemente aún por probar experimentalmente, es que el
helicasa genera una estructura en el ADN en el permisivo
cara que promueve activamente la disociación de Tus y/o una estructura en la
cara no permisiva que aumenta la afinidad de Tus
para el yacimiento de Ter . En el resto de esta revisión, examinaremos la
evidencia disponible para estos posibles mecanismos moleculares de la
detención de la horquilla de replicación polar mediada por Tus en Ter .
sitios
Evidencia de interacciones específicas proteína-proteína
Un gran número de publicaciones sobre ensayos de actividad Tus
apareció poco después de que el gen tus y las secuencias Ter se convirtieran en
disponibles, y se informaron los efectos de la proteína Tus en una variedad de
ensayos de replicación, tanto in vitro como in vivo. Estos llevaron
rápidamente a la descripción de las dos primeras clases de modelo
descrito arriba. Los primeros estudios examinaron el efecto de la
Complejo Tus-Ter sobre las actividades de desenrollado del ADN de un rango
de helicasas en sistemas de ensayo in vitro. Lee et al. encontró que el
El rostro no permisivo de Tus-TerB bloqueó las acciones de los cuatro
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506 NEYLON Y AL.
HIGO. 5. Replisoma de E. coli y mecanismo de horquilla de replicación
detención por un complejo Tus-Ter . (A) El replisoma moviéndose a lo largo del
La plantilla de ADN se acerca a Tus, y la helicasa DnaB ayuda a la primasa
para depositar la última imprimación de cadena rezagada. (B) La acción de la helicasa DnaB es
MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.
helicasas que probaron: DnaB, UvrD, Rep y PriA (105, 106).
Por otro lado, Bastia y colaboradores describieron una tendencia
en sus resultados con el complejo Tus-TerR2 en un ensayo diferente
sistema para que el complejo bloquee específicamente el subconjunto de
helicasas de horquilla de replicación (14, 91, 147). A partir de los resultados de otro
estudio, Hiasa y Marians sugirieron que mientras Tus-TerB podría
bloquear la translocación de DnaB, PriA y el primosoma (pero
no UvrD) de manera polar, no inhibió el ADN de buena fe
actividad helicasa (60). La controversia sobre el mecanismo de
por lo tanto, la actividad antihelicasa se puede rastrear a diferentes resultados
obtenido al examinar los efectos de la unión de Tus a diferentes
Ligandos ter en diferentes experimentos. Las dificultades en la interpretación
de la acción de Tus en estas reacciones in vitro han
continuó hasta el día de hoy.
En los experimentos de Bastia y colaboradores, el Tus-TerR
Se observó que el complejo bloquea las helicasas replicativas DnaB
y el antígeno T del virus simio 40 (SV40), pero no pudo bloquear
helicasas implicadas en la reparación del ADN o la replicación del círculo
rodante de plásmidos, incluidas Rep, Dda, TraI y UvrD (14, 91, 147).
Aunque el bloqueo de la acción del antígeno T (una helicasa 3 -5) parecía ser
permisivo a primera vista para DnaB,
favoreció, sin embargo, un mecanismo que implica interacciones específicas
proteína-proteína entre Tus y un dominio de la
helicasas replicativas. En apoyo de esto, citaron la observación (no publicada)
de una interacción directa entre Tus y
ADNB (114). Más recientemente, el mismo grupo ha descrito
experimentos utilizando un sistema de dos híbridos de levadura que
proporciona evidencia de interacción in vivo entre las dos proteínas (127).
También describen la unión de DnaB a un inmovilizado
proteína de fusión glutatión S-transferasa-Tus y aislamiento de
mutantes de Tus que tienen unión reducida a DnaB y actividad de bloqueo de
horquilla reducida similar pero unión a TerR casi normal . Esta es la evidencia
más sólida hasta la fecha de una interacción específica entre Tus-TerR y la
helicasa que se aproxima.
En contraste con los resultados de Bastia y colaboradores, en el
experimentos de Lee et al. y otros grupos que estudian la interacción Tus
TerB , el complejo impidió el progreso de ambos
helicasas replicativas y reparadoras (60, 105, 106). Además,
lo hizo de manera polar. Es decir, la misma cara del Tus-Ter
complejo bloqueó la translocación de DnaB en la dirección 5 -3 pero
también bloqueó el antígeno T SV40 (5, 64), PriA (60, 105), UvrD
(106), y TraI (64) translocándose en la hebra opuesta en el
3 -5 dirección. Esto sugeriría que la acción del complejo es como una
abrazadera o dirigida contra algún aspecto de
helicasa estructura y/o función que es suficientemente general para
ser exhibido por todos los probados. La idea de que una abrazadera podría ser
suficiente está respaldado por un informe de que una endonucleasa de
restricción EcoRI mutante que se une a su secuencia de reconocimiento con un
13
constante de disociación de 2.5 10M, pero no se escinde
ADN (95, 173), fue capaz de bloquear la acción helicasa de
bloqueado por Tus, y DnaB se disocia de la plantilla. (C) ADN
La holoenzima polimerasa III (Pol III) completa la síntesis de la cadena
principal hasta el complejo Tus-Ter y (D) sintetiza el último Okazaki
fragmento en la hebra rezagada, que eventualmente será ligada por
ADN ligasa al penúltimo fragmento después de la eliminación de su ARN
cebador por ADN polimerasa I (no mostrado). (E) La holoenzima entonces
se disocia, dejando una estructura bifurcada en Y que es monocatenaria en el
hebra rezagada cerca del complejo Tus-Ter.
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VOLUMEN 69, 2005
DnaB, UvrD y antígeno T SV40 (14). El bloque era independiente de la
orientación, ya que EcoRI se une al ADN como un bloque simétrico.
dímero Más tarde, se demostró que el represor-operador lac
El complejo puede inhibir sustancialmente la acción de una variedad de helicasas
in vitro, incluida DnaB (175). La efectividad de
estos complejos proteína-ADN no relacionados en el bloqueo de las horquillas
de replicación parecerían indicar que una abrazadera simple es
suficiente para detener las helicasas in vitro.
Los experimentos con sistemas sustitutos no respaldan esto.
vista. En una ingeniosa serie de experimentos, Andersen et al. (6)
compararon la eficacia y la polaridad del complejo Tus-Ter in vivo en E. coli y B.
subtilis. Junto a esto, el sistema de terminación de replicación funcionalmente
similar pero no relacionado de
Se comparó B. subtilis en ambos organismos. Mientras que B. subtilis
RTP-TerI funcionó bien para terminar la replicación en ambos organismos, el
complejo E. coli Tus-TerB fue mucho más efectivo en su huésped natural. En
experimentos similares anteriores, Kaul et al.
Alabama. (90) también había demostrado que el sistema de terminación de B. subtilis era
eficaz en E. coli. Estos datos podrían indicar un problema fundamental
diferencia en el mecanismo entre los dos sistemas y soporte
la existencia de una interacción específica entre Tus-Ter y un
proteína(s) replisómica(s) en E. coli, al menos.
Por otra parte, en términos evolutivos, no es de extrañar
que los sistemas funcionan algo mejor en su contexto natural.
Se esperaría que los sistemas naturales bajo presión de selección
aprovechar las oportunidades para mejorar su eficiencia.
De hecho, sería sorprendente en el caso específico de Tus Ter actuando contra
E. coli DnaB si no hubiera una función
interacción que se había desarrollado para mejorar la eficiencia de
detención de la replicación. Sin embargo, no está claro cuán altamente específico
interacciones podran desarrollarse para desempear un papel general en la antihelicasa
actividad. Quizás la pregunta más pertinente es si las interacciones Tus DnaB
se limitan a pequeñas mejoras en un
interfase proteína-proteína única o si juegan un papel importante en el caso más
general de la actividad de Tus contra el
gama completa de helicasas.
ESTRUCTURA DEL COMPLEJO Tus-Ter Y
BASES MOLECULARES DE LA DETENCIÓN DE LA REPLICACIÓN
Hay disponible una gran cantidad de datos sobre la interacción Tus-Ter ,
incluidos los resultados de huellas de ADN, estudios cinéticos,
efectos de mutaciones tanto en Tus como en la secuencia Ter , y la
secuencias de genes de proteínas Tus de bacterias relacionadas. En esto
sección, analizaremos los datos publicados sobre el Tus-Ter
interacción, comenzando con la estructura cristalina del complejo
(85), seguido de estudios de huella y cinéticos. Esto será
seguido por los datos sobre las mutaciones del ADN Ter y mutacional
estudios de la propia proteína Tus y luego por un análisis de la
secuencias de proteínas de tres especies bacterianas relacionadas, así como
como dos proteínas más con similitud de secuencia con Tus. Ahí
no ha habido un análisis previo de todos los datos disponibles dentro
el marco de la estructura cristalina. Finalmente, resumiremos los resultados y
examinaremos una serie de modelos de proteína-ADN.
y las interacciones proteína-proteína en el sitio de replicación ar
descanso.
La estructura cristalina del complejo Tus-Ter
La primera estructura cristalina de una proteína terminadora de replicación
que se informó fue el del dimérico B. subtilis RTP en 1995
(27). Esto fue seguido rápidamente por modelos para las estructuras de
Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 507
el complejo del dímero y tetrámero RTP con medio y completo
Ter sitios, derivados de la consolidación de la estructura de la
proteína libre con una extensa serie de datos bioquímicos (115,
125, 134, 135). La estructura del complejo de medio sitio determinado
posteriormente por una combinación de resonancia magnética nuclear y estudios
cristalográficos (172) estaba en gran parte de acuerdo
con estos modelos.
El complejo E. coli Tus-TerA fue cristalizado por Kamada et al.
al., y la estructura cristalina de rayos X se informó en 1996 (85,
86). La estructura (código 1ECR del banco de datos de proteínas), que se muestra en
Fig. 6, es un plegamiento proteico único que consta de dos discontinuos
dominios que se extienden a ambos lados de la doble hélice TerA . los dos dominios
están unidas por dos pares de hebras antiparalelas que forman
el dominio de unión al ADN central (IF y GH) y también por el
Bucle L4. Estos dos pares de hebras se encuentran en el surco mayor de
TerA. La estructura de Tus en el complejo es 37% hélice, 28%
hoja, y 35% bucles y vueltas. Las hélices anfipáticas I, II y III forman un haz
antiparalelo que discurre paralelo a
el ADN pero no hace contacto con él. Las hélices IV y V
junto con los bucles L1 y L2 se encuentran en la parte superior de la más grande
dominio (N-terminal). Con la región VI-VII en el menor
Dominio C-terminal, completan la cara de Tus que bloquea
la helicasa progresiva (la no permisiva o que bloquea la horquilla)
rostro). Tres de los cuatro bucles principales (L1 a L3) están en el
final no permisivo del complejo. El bucle restante (L4)
se encuentra en el extremo permisivo del surco menor, haciendo una serie de
contactos de ADN.
Hay tres regiones principales de estructura. El GHON
y las regiones JIFL tienen hebras en el surco mayor del
El ADN TerA y están involucrados en el reconocimiento de bases. El otro
hoja principal (EKDAC) se encuentra en la parte inferior del dominio N
y participa en la estabilización de la región JIFL a través de contactos
hidrofóbicos, así como en la contribución al núcleo hidrofóbico
del dominio N. Los núcleos hidrofóbicos de ambos dominios son
compuesta en gran parte de residuos en las hélices. El núcleo de la N
El dominio consta de residuos de las hélices I a III, así como
la hoja EKDAC, mientras que el núcleo del dominio C más pequeño es
compuesto en su mayor parte por residuos de VI y VII. Contribuciones
de la hoja de GHON constituyen el resto del núcleo hidrofóbico del dominio C.
El TerA bicatenario capturado dentro del complejo es
significativamente deformado de la estructura canónica de la forma B
ADN. El giro helicoidal promedio es de 29,5°, en comparación con el valor
canónico de 34,6° (85). La columna vertebral del ADN también está deformada
entre G17 y A14 (Fig. 7) debido a que está intercalada entre las cadenas F y G
y el bucle L4. los
El ángulo de la hélice del par de bases AT16 es de 24,2°. El ADN es
en consecuencia subenrollado, lo que hace que el surco principal sea más profundo
y expandiendo el surco menor, y se dobla en general a través
unos 20° (85). El fragmento TerA en el cristal no
se extiende más allá de la proteína y, por lo tanto, proporciona poca información
sobre la estructura del ADN en el extremo permisivo de la
complejo; por lo tanto, es posible que el ADN sea más
deformado por los contactos con la proteína más allá de la extremidad de
el fragmento cocristalizado (Fig. 7).
La proteína se pliega sobre el ligando de ADN y el complejo no se puede
romper sin deformar la estructura de la proteína (Fig. 6). Kamada et al. (85)
especuló que Tus puede ser
capaz de unirse a una sola hebra de ADN que se extiende desde el
rostro permisivo del complejo y propuso un modelo para Tus
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508 NEYLON Y AL.
HIGO. 6. La estructura cristalina del complejo Tus-TerA , código
PDB 1ECR (85). Se muestran tres vistas del complejo Tus-Ter. La
vista superior mira hacia abajo el ADN desde la cara no permisiva del
complejo. La vista del medio se gira 90° desde la primera para
mostrar el frente del complejo. La vista inferior, rotada otros 90°, es a
lo largo del ADN desde el extremo permisivo del complejo. Las caras
permisivas y no permisivas se indican en la vista central. Las bolas
indican las (5) hebras que pasarían por el canal central de la helicasa
DnaB. Las imágenes de las estructuras de proteínas en esta y las
siguientes figuras se generaron en SWISS-PDB VIEWER versión 3.7
(http: //ca.expasy.org/spdbv/) (56) y se representaron usando POV-
RAY versión 3.1g.watcom.win32 (www .povray.org).
eliminación por una helicasa que se acerca a la cara permisiva que implica la
asociación de Tus con el producto de ADN monocatenario, lo que lleva a la
deformación de la estructura y su despliegue a partir del ADN. Por el contrario,
también es posible que un
MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.
Tus podría unir una sola cadena de ADN que se extiende desde la cara no
permisiva, lo que lleva a una interacción más estrecha que impide el
desmontaje del complejo Tus-Ter.
Interacciones de unión proteína-ADN
El dominio central de unión al ADN de Tus es la estructura de hoja retorcida
formada por las cadenas IF y GH. Cada una de las cuatro hebras tiene siete
u 8 residuos de largo (Fig. 8). El espacio entre F y G es de un residuo de
longitud, y entre H e I es de dos residuos. El giro en el ligando de ADN se
estabiliza mediante una variedad de interacciones proteicas, tanto con la
columna vertebral del ADN como con las bases (Fig. 7). Dentro de la proteína,
el giro es facilitado por Pro238, que permite que I gire casi 90° y pase por
debajo de F hacia el interior del surco mayor. Enlaces de hidrógeno entre
Asn174 (en el giro F-G) y Tyr280 (en M), entre Lys175 (en G) y Gln252 (en
J), y entre Lys235 (en el giro H-I) y Asn51 (en L1) más estabilizar el giro en el
ADN.
Entre ellos, FG y HIJ contienen cerca de la mitad de los residuos que
hacen contacto con el ADN; los residuos restantes que hacen contactos se
concentran en otras hebras y bucles (85).
Solo ocho de los residuos que contactan con el ADN están en hélices.
Aunque los contactos de ADN están distribuidos a lo largo del fragmento
TerA , exhiben una sorprendente especificidad de hebra en el sentido de que
están concentrados cerca del extremo 5 de cada hebra (Fig. 7).
Hay 17 residuos que hacen contactos específicos de secuencia con el
ADN TerA (Fig. 8). Casi la mitad de estos son hidrofóbicos, y el resto son
principalmente interacciones por enlaces de hidrógeno entre cadenas laterales
de aminoácidos cargados o polares y átomos donantes/aceptores polares de
las bases en el surco principal. Varias de las últimas interacciones están
mediadas por moléculas de agua.
Solo el contacto hidrofóbico entre Thr136 y T8 implica un residuo en una
hélice.
En contraste, no menos de 31 residuos hacen contactos no específicos
con el esqueleto de desoxirribosa fosfato del ADN (Fig. 8). Si bien estos
residuos todavía están concentrados en el motivo central de unión al ADN,
están más ampliamente distribuidos que aquellos que hacen contactos
específicos de secuencia. La mayoría de las interacciones de fosfato implican
cadenas laterales cargadas o polares, en particular grupos guanidina, amina
y amida, y casi la mitad están mediadas por agua. La mayoría de estos
residuos se encuentran en láminas o en regiones de bucle. Por otro lado, casi
todas las interacciones proteína-desoxirribosa son hidrofóbicas, por lo general
implican la participación de los átomos C4 y C5 del azúcar, que sobresalen
en el surco menor del ADN. El único residuo que interactúa con el C1 y C2
de la desoxirribosa en el surco mayor, Ile178, también hace un contacto
hidrófobo específico de secuencia en el surco mayor. Arg198 hace los únicos
contactos de enlace de hidrógeno con un azúcar, desde la cadena lateral
N()H2 hasta el O4 de A5 y G6. Otros residuos que pueden hacer contactos
que no son explícitos en la estructura cristalina son Lys249, His253 e His304,
que podrían hacer contactos mediados por agua, y Gln294, que se puede
rotar para hacer contacto con el 5-fosfato de A14.
En particular, los residuos que hacen contactos no específicos a menudo
se colocan de tal manera que flanquean a los que hacen contactos específicos
de secuencia. Puede ser que las interacciones no específicas sean necesarias
para posicionar correctamente las interacciones de la columna vertebral para
una unión óptima o, por el contrario, que las interacciones no específicas
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VOLUMEN 69, 2005 Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 509

HIGO. 7. Resumen de contactos entre Tus y TerA. Adaptado de la referencia 30 con permiso del editor. Las flechas muestran interacciones
entre cadenas laterales de aminoácidos y grupos en los pares de bases. Residuos en el oligonucleótido TerA utilizado para la determinación de la estructura cristalina
eran de A4 a T18 en una hebra y de T19 a T5 en la otra y se muestran con contornos en negrita. Las líneas discontinuas indican posibles interacciones en el
extremo permisivo que no se vieron en la estructura cristalina (ver el texto para más detalles).

Las funciones proporcionan un medio para permitir que Tus se deslice a lo largo del
ADN en busca de sus contactos de unión específicos.
Estudios de modificación y protección del ADN
La interacción Tus-Ter fue examinada por la huella de ADN
y estudios de protección poco después de que tanto la proteína como el ADN fueran
disponible. Sista et al. (159) utilizaron huellas de cobre-fenantrolina para demostrar
la protección por la unión de Tus de 14 a 16 nucleótidos en ambas cadenas de
TerR1 y TerR2. la huella
no mostró preferencia por unirse a una hebra sobre la otra.
La huella de ADNasa I mostró protección de un similar, pero
región más grande debido a la menor accesibilidad de la enzima en comparación
con el agente de escisión de cobre-fenantrolina. este ensayo
mostró una ligera preferencia por la protección de la hebra superior
se muestra en la Fig. 9 (65). En estudios posteriores con TerB (54) y
TerR1/2 (158), experimentos más detallados que utilizaron huellas de radicales
hidroxilo, protección de metilación e interferencia de etilación dieron resultados
ampliamente consistentes.
Tanto el grupo de Hill como el de Bastia (54, 158) reportaron G10,
G13 y G17 deben protegerse de la metilación mediante la unión de Tus
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510 NEYLON Y AL.
HIGO. 8. Secuencia y estructura secundaria de la proteína Tus (los datos son de la referencia 85). Los 31 residuos que hacen contactos inespecíficos con
la columna vertebral del ADN está en azul. Los 17 residuos que hacen contactos específicos directos o por medio de agua con las bases de ADN están en rojo.
(Fig. 9), como cabría esperar de la estructura cristalina (Fig.
7). El sitio TerR2 también estaba protegido en la guanosina sustituida
por T20 de la secuencia TerB , mientras que la metilación en A16
mejoraba en ambos sitios Ter , en consonancia con su exposición al
disolvente y la distorsión de la forma B en la estructura cristalina. TerB
también mostró una metilación mejorada en A11, nuevamente un reflejo
de la exposición al solvente y la desviación de una estructura de forma B,
mientras que el ADN de TerR2 mostró una metilación mejorada en la
guanosina sustituida en A8, otro residuo expuesto al solvente que puede
distorsionarse aún más como un resultado de la sustitución. La
interferencia de etilación mostró que los fosfatos entre G10 y T14 (en la
hebra superior, como se muestra en la Fig. 9), así como entre A18 y C13
(en la hebra inferior), eran necesarios para la unión de Tus (54, 158). Los
fosfatos de todos estos nucleótidos interactúan con Tus en la estructura
cristalina (Fig. 7).
HIGO. 9. Resumen de los resultados de los estudios de huellas de Sista et al.
(158) y Gottlieb et al. (54). Las flechas indican protección frente a la escisión por
radicales hidroxilo. Los círculos rellenos indican protección contra la metilación
por sulfato de dimetilo. Los círculos abiertos muestran una metilación mejorada.
Los pares de bases que interactúan con Tus están sombreados como en la Fig. 3.
MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.
Aunque la mayoría de los nucleótidos protegidos estaban dentro de la
región unida por Tus en la estructura cristalina, desde G6 a A18 en la
cadena superior y desde T19 a C6 en la cadena inferior (Fig. 3), ambos
grupos reportaron sitios protegidos fuera de esta región. . Sista et al.
(158) encontraron cuatro de estos sitios, entre 1 y 3 pares de bases antes
y 1 después del sitio de unión a Tus en la secuencia TerR2 (Fig. 9).
Mientras que Gottlieb et al. (54) describieron dos sitios protegidos que
preceden a TerB, estos estaban a solo 1 par de bases del sitio de unión
y podrían explicarse por la oclusión por la proteína sobresaliente. Los
sitios de protección de TerR2 son más difíciles de explicar sobre la base
de la estructura cristalina estática.
Se ha estimado que la KD del complejo Tus-TerR2 es 30 veces mayor
que la de Tus-TerB (54). Si esto es en gran parte el resultado de la
pérdida de interacciones específicas de secuencia, entonces los sitios
protegidos en TerR2 pueden reflejar una mayor movilidad de la proteína
en este ADN. Por el contrario, puede ser simplemente el caso de que la
estructura cristalina no represente con precisión la movilidad en solución
de las cadenas laterales de aminoácidos en la vecindad.
Otra explicación es que Tus diseña estructuras en el ADN en cada
extremo del complejo que son resistentes a la escisión por radicales
hidroxilo. En la cara permisiva del complejo (Fig. 6), esto puede ser el
resultado de la separación de las hebras. Esto es sugerido por la
ejecución de cuatro pares de bases AT, las conformaciones retorcidas de
los pares de bases AT16 y TA18 y los datos de sustitución de nucleótidos
que se discutirán a continuación. En la cara no permisiva, la separación
de las hebras puede indicarse por la fuerte torsión inducida en el par de
bases AT5. El alto contenido de AT en el ADN en el extremo no permisivo
de la mayoría de los sitios Ter (Fig. 3), los datos de sustitución de
nucleótidos (abajo) y el acercamiento muy cercano de la ADN polimerasa
inferido de la posición del final de la síntesis de la cadena principal (70)
también puede sugerir que la separación de las hebras se produce en
este punto.
Estudios de sustitución de nucleótidos
Los efectos sobre la unión de Tus de la sustitución de pares de bases
en varios puntos de la secuencia TerB se examinaron mediante una
variedad de enfoques. Duggan et al. (42) investigaron el efecto sobre la
energía libre ( G) de la unión (o una G‡ aparente basada en
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VOLUMEN 69, 2005
constantes de velocidad de disociación) de reemplazar la base en cada uno
de los cuatro residuos de desoxiguanosina conservados (Fig. 9) con 7-deaza
guanina, 2-aminopurina e inosina. Cada una de estas sustituciones elimina
un grupo funcional específico de la base de guanina, y el reemplazo por 2-
aminopurina también altera el emparejamiento de bases con la citosina.
También reemplazaron los pares de bases de GC con pares de bases de 2-
aminopurina · uracilo, que forman una disposición de enlaces de hidrógeno
más estable. Además, para investigar el papel de los grupos metilo de timina
en la interacción de unión, se reemplazaron seis bases de timina con uracilo,
así como con 5-bromo- y 5-yodouracilo (41, 42). Los átomos de bromo y
yodo tienen aproximadamente el mismo tamaño que un grupo metilo y
podrían compensar la pérdida de este grupo. Debido a la mayor
electronegatividad del yodo, un aumento en la unión por la sustitución de
yodo- sobre bromouridina también confirmaría la
presencia cercana de un aminoácido polarizable.
Cuando un grupo metilo de timina está implicado en una interacción
hidrofóbica, se encontró que había una G‡ positiva (es decir, una disociación
más rápida) para la sustitución del uracilo halogenado.
Las dos interacciones principales de metilo de timina se encuentran en los
nucleótidos T12 y T16, y estas son las dos timinas con el G‡ más alto para
la conversión a uracilo y los análogos halogenados. Se observó una G‡
negativa (disociación más lenta) para la sustitución de yodo y bromouracilo
para las modificaciones de T8, T14 y T19 e indica la presencia de un grupo
polarizable en el surco menor (41). Esto se confirma por la estructura
cristalina de T8 (interactúa con Lys89) y T14 (interactúa con Lys175), y se
puede formar un contacto con T19 rotando la cadena lateral de Arg288. En
la mayoría de los casos, se observó que el complejo Tus con TerB
reemplazado con un par de bases 2-aminopurina:uracilo es ligeramente más
estable que un par de bases 2-aminopurina · citosina, lo que indica que el
emparejamiento de bases desfavorable contribuye en parte (GC10) o en la
mayoría (CG17) del aumento de G. Sin embargo, en GC13, donde el N4 de
la citosina interactúa con His176, la sustitución de la citosina por uracilo
frente a la 2-aminopurina desestabilizó en gran medida la interacción Tus-
Ter (42).
Coskun-Ari y Hill (30) eligieron un enfoque alternativo de reemplazo de
pares de bases en TerB con las tres alternativas naturales y produjeron un
conjunto casi completo de todas las sustituciones posibles en la región GC6
a AT21. Esto les permitió identificar tres nuevos sitios Ter en la secuencia
del genoma de E. coli , definir en términos generales qué sitios Ter son sitios
de unión a Tus fuertes o débiles, y especificar con precisión qué residuos
en la secuencia de consenso son importantes para la unión también. en
cuanto a la actividad de detención de la horquilla de replicación in vivo.
Los datos de sustitución de nucleótidos deben interpretarse con cuidado.
Una sola sustitución podría afectar la estabilidad del ADN, el costo entrópico
de eliminar el agua de su capa de hidratación e incluso la estructura interna
de la proteína Tus, además de afectar directamente la unión. Como era de
esperar, los datos de sustitución combinados concuerdan ampliamente con
la estructura cristalina y la conservación de residuos dentro de los sitios
Ter . Se encontró que los pares de bases más importantes para la unión de
Tus se encuentran en las regiones más conservadas (Fig. 3). Por ejemplo,
se encontró que el par de bases TA7, que no está conservado y no está en
contacto con Tus en la estructura cristalina, era prescindible, y el par de
bases AT8 parcialmente conservado mostró tolerancia a la sustitución GC
encontrada en varios sitios Ter naturales ( 30).
En general, hubo una correlación entre la energía de unión y la actividad
de detención de la replicación in vivo. Sin embargo, en el nonper
Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 511
missive, las tres sustituciones en GC6 tuvieron un efecto mucho mayor en
la detención de la replicación de lo esperado sobre la base del cambio en la
energía de enlace, lo que indica que este par de bases es importante para
la detención de la replicación por razones que no están relacionadas
principalmente con la estabilidad de el complejo Tus-TerB (30).
También es difícil correlacionar la estructura cristalina (85) con los efectos
de algunas sustituciones en la cara permisiva (30).
Aunque los cambios en el par de bases AT19 conservado causaron un gran
cambio en G para la actividad de detención de la replicación abolida y
vinculante, la estructura cristalina no muestra una interacción específica de
secuencia explícita en este sitio. La cadena lateral Arg288 puede ponerse
en contacto con O2 y N3 o con N3 y O4 de esta timidina, dependiendo de si
su Nÿ se posiciona simultáneamente para interactuar con adenina o timina
en TA18 (Fig.
7). La interacción N3-O4 también podría fortalecerse si se separaran las
hebras, pero los datos cuantitativos ofrecen poca orientación sobre qué
interacciones son más probables. La sustitución en AT20, que se encuentra
más allá del ADN utilizado para la cristalización, redujo la actividad de
detención mientras que solo tuvo un efecto modesto sobre la unión (30).
Esto puede deberse a interacciones (no vistas en la estructura cristalina)
con Trp243 y Gln248 (Fig. 7) oa cambios estructurales en el ADN requerido
para la actividad de detención de horquilla.
Finalmente, en el sitio AT21 adyacente, ahora bien alejado de la proteína,
también hubo un efecto tanto en la actividad de unión como de detención, lo
que nuevamente sugiere un papel para la estructura del ADN en la reacción
de unión, la reacción de detención o ambas (30). Observamos que Gln248
se puede colocar para posibles interacciones con T21 (Fig. 7).
El papel de los cuatro pares de bases GC6 y AT19 a AT21 bien puede
estar relacionado con la ingeniería de una estructura en el ADN que afecta
el paso de la helicasa a través del complejo Tus-Ter. Esta estructura podría
incluir la separación de las hebras de ADN en uno u otro extremo del
complejo, y esto está respaldado por otros elementos de la estructura
cristalina (85, 170). Los resultados también son consistentes con un complejo
dinámico en el que los procesos de desunión parcial desempeñan un papel
en la actividad antihelicasa. En este caso, estos pares de bases anómalos
estarían involucrados en la unión de intermediarios en la ruta de unión-
desunión, pero no en el complejo Tus-Ter de estado estacionario final.
mutantes de tus
Los mutantes de Tus informados (resumidos en la Tabla 1) se dividen en
dos grupos principales, los aislados mediante detección de actividad de
detención de replicación defectuosa o interacción helicasa reducida y los
generados deliberadamente para probar hipótesis basadas en datos
estructurales o bioquímicos. Al igual que con la sustitución de nucleótidos
datos, la comparación de los efectos de estas mutaciones tanto en la unión
del ADN como en la actividad de detención de la horquilla de replicación
tiene el potencial de identificar factores implicados en la detención de la
horquilla más allá de los que se relacionan simplemente con la unión de Tus
a las secuencias Ter . También es tentador inferir las contribuciones relativas
de los diversos contactos revelados por la estructura cristalina a la
especificidad de la unión Tus-Ter.
Cabe señalar, sin embargo, que muchas de las sustituciones de
aminoácidos que se han estudiado resultaron en una disminución de
carga positiva en la vecindad del residuo cambiado y, por lo tanto, también
podría afectar la interacción no específica de Tus con secuencias de ADN
que no se parecen a los sitios Ter . Tus se une razonablemente con avidez
a dichos sitios; los valores medidos de KD indican
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512 NEYLON Y AL. MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.

TABLA 1. Efectos de las modificaciones de aminoácidos en las actividades de Tus

Efecto sobre la actividad de Tus

tu estructura mutación(es)
Unión de helicasa de ADN y DnaB Detención de la replicación y actividad antihelicasa

Tipo salvaje Ninguno t1/2 150 min,b t1/2 9 100%; sin crecimiento, 13 % de repetición de longitud completa, 2,4 fmolb
L1 P42S min 37 % del peso de la actividad de detencióna
TeR2
P42L KD aumento de tres veces, unión de DnaB reducidac Sin actividad antihelicasac
E43Q Sin crecimiento, 14% repb de longitud completa
V44T Sin crecimiento, 19% repb de longitud completa
K45A t1/2 48 minb 15 Sin crecimiento, 11 % de repeticiones de longitud completa, 2,8 fmolb
K46A t1/2 348 minb
minb t1/2 Crecimiento, 54 % de repetición de longitud completa, 5,0 fmolb
E47Q reducción cuádruple, Crecimiento, 56 % de repetición de longitud completa, 2,4 fmolb
TerR2
KD unión DnaB reducidac Actividad completa de detención de la replicación in vitro y anti-helicasac
D48N t1/2 195 min t1/2 Sin crecimiento, 10 % de repetición de longitud completa, 2,7 fmolb
E49A 274 min Crecimiento, 26 % de repetición de longitud completa, 2,5 fmolb
E49K t1/2 175 min, KD TerB sin cambiosa,b 38% de la actividad de detención de tipo salvajea
TerR2
KD aumento del doble, unión de DnaB reducidac Antihelicasa defectuosa y detención de la replicación in vitro
actividadc
51%, 7,9 fmolb
E47Q/E49A Crecimiento, 39 % de repetición de longitud completa, 3,3 fmolb
E47Q/E49Q t1/2 212 min t1/2 Crecimiento, 30 % de repetición de longitud completa, 4,0 fmolb
H50N 109 min t1/2 26 Sin crecimiento, 13 % de repeticiones de longitud completa, 2,7 fmolb
TerB
H50Y min, KD aumento de seis vecesa 81% de la actividad de detención de tipo salvajea
N51D Sin crecimiento, 17% repb de longitud completa
TerR2
P52L KD aumento del doble, unión de DnaB reducidac Actividad antihelicasa reducidac

L2 E84A Sin crecimientob

N85D Sin crecimientob
ADNns TerB
K89A KD no afectado, KD 200 veces aumentado
TerB TerB
ka disminución de 10 veces, kd 20 veces mayor
R93H Defecto parcial o totalc Crecimientoc

D P95S No detectablea Crecimientoa

P95H Defecto parcial o totalc Crecimientoc
P95L Defecto parcial o totalc Crecimientoc

IV E141A/R145A Sin crecimientob

IV–V L150Q Defecto parcial o total Crecimiento

V Y156C Defecto parcial o total Crecimiento

V-E L159P No detectablea Crecimientoa

F G171D Defecto parcial o completo KD Crecimiento

TerB TerB
A173T aumento de 4000 veces, kd 1000 veces Inactivoa
aumentara
t1/2 0.5 minutos Crecimiento, 182 % de repetición de longitud completa, 10,9 fmolb
ADNns TerB
KD no afectado, KD 4.000 veces aumentado
TerB TerB
ka disminución de 40 veces, kd 100 veces aumentado
TerB TerB
A173V KD aumento de 100 veces, kd aumento de 100 vecesa activoa

GRAMO K175E Crecimiento

ADNns TerB
L3 R198A KD aumento de 10 veces, KD 150 veces aumentado Crecimientob
TerB TerB
ka disminución de 50 veces, kd cuadruplicado
t1/2 2 minutos

VII R205A/E206A Sin crecimientob

R210A/R214A Sin crecimientob

H R232S Defecto parcial o total Crecimiento

I Q237R Defecto parcial o total Crecimiento

P238L No detectable; un defecto parcial o completo Crecimientoa,e
R241L Defecto parcial o total Crecimiento

ADNns TerB
j Q250A KD no afectado, KD 400 veces aumentado
TerB TerB
ka disminución de ocho veces, kd 50 veces mayor
Q252R Defecto parcial o total Crecimiento

Continúa en la página opuesta

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VOLUMEN 69, 2005 Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 513

TABLA 1—Continuación

Efecto sobre la actividad de Tus

tu estructura mutación(es)
Unión de helicasa de ADN y DnaB Detención de la replicación y actividad antihelicasa

A254D 7% de unión al ADN de tipo salvaje Inactivoa

J-K P256L 4% de unión al ADN de tipo salvaje Inactivoa

K-L D266A Sin crecimientob

D266N Sin crecimientob

Skokatas et al. (160, 161) informaron sobre proteínas Tus mutantes seleccionadas de un ensayo de supervivencia en el que el crecimiento celular se asocia con una actividad de detención de replicación defectuosa.
Las constantes de disociación de equilibrio, las constantes de velocidad de disociación y asociación, y la vida media (t1/2) de disociación medida por la unión del filtro de nitrocelulosa también fueron
informado, junto con el porcentaje de actividad de detención de replicación.
B
Henderson et al. (59) informaron un ensayo de crecimiento similar de la actividad de detención de la replicación, así como un ensayo cuantitativo de detención in vivo (porcentaje creciente de actividad de detención de la replicación).
la replicación del plásmido del 13 % para Tus de tipo salvaje al 100 % en ausencia de Tus muestra pérdida de la actividad de detención de la replicación) y un ensayo de helicasa in vitro (aumento de la cantidad
de ADN liberado [hasta un máximo de 10,7 fmol] muestra pérdida de actividad antihelicasa), así como la vida media de disociación de TerB. c Mulugu et al. (127) informaron constantes de
disociación en equilibrio medidas mediante un ensayo de cambio de gel.
D
Neylon et al. (131) informaron constantes de velocidad de equilibrio y disociación y asociación para la unión a TerB y ADN no específico obtenido de un ensayo SPR (en
KCl 250 y 100 mM, respectivamente).
y Kamada et al. (85) informaron proteínas Tus mutantes seleccionadas de un ensayo de supervivencia en el que el crecimiento celular se asocia con una actividad de detención de replicación defectuosa; todo mutante
se informó que las proteínas tenían un defecto parcial o completo en la unión de Ter .

unión a ser 104 - a 105 veces más débil que la de TerB (55,
131). Las interacciones electrostáticas contribuyen claramente a la unión de Tus
a sitios específicos e inespecíficos. En
un estudio del efecto de las concentraciones de KCl en el Tus-TerB
interacción, utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR), Neylon et al.
Alabama. (131) mostró que una gráfica de ln KD versus ln [KCl] tenía una pendiente
de alrededor de 11 y que esta muy sustancial dependencia de la sal es
esencialmente completamente debido a los efectos sobre la tasa de asociación
constante. Kapur et al. (89) mostró además que la disociación
constantes de complejos de TerB con varias formas mutantes de
Tus se correlacionaron con la dependencia de la fuerza iónica de
su disociación, determinada por ionización por electrospray
espectrometría de masas. Por lo tanto, al usar mediciones con Tus
variantes con sustituciones de cambio de carga para comentar sobre la
especificidad, es claramente necesario separar electrostática general
efectos de los debidos a la interrupción de los contactos específicos de la
secuencia. Mientras que el trabajo de Neylon et al. (131) indica que este
podría hacerse comparando la unión de las proteínas variantes a
Secuencias de ADN ter e inespecíficas en función de la actividad iónica.
fuerza, esto aún no se ha hecho para ninguna variante de Tus.
Se han desarrollado métodos genéticos para seleccionar directamente
Mutantes Tus defectuosos en la detención de la replicación (160, 161). En una de
estos, desarrollados por Skokotas et al. (160) y también utilizado por
Kamada et al. (85), se colocó un sitio Ter para interrumpir
replicación del cromosoma de una cepa tus recA , y tus
los mutantes se introdujeron en células en un plásmido. Mar activo
se une al sitio Ter y previene la replicación cromosómica,
mientras que los mutantes Tus defectuosos en la detención de la horquilla permiten la replicación y
supervivencia celular. Los mutantes de este tipo podrían reflejar no sólo la
efectos de las sustituciones en el ADN específico y/o no específico
unión, pero también aspectos de la detención de la horquilla no relacionados con el ADN
unión o incluso el plegado de Tus en una estructura estable.
Por supuesto, estos efectos podrían separarse mediante una mayor investigación
de las propiedades de las proteínas variantes aisladas, pero
esto no siempre se ha hecho.
De los 18 residuos (Cuadro 1; Fig. 10) identificados de esta manera como
siendo importante para la actividad, 11 (His50, Arg93, Tyr156, Ala173,
Lys175, Arg232, Gln237, Arg241, Gln252, Ala254 y Pro256)
están directamente involucrados en la unión al ADN y otros 3 (Glu49,
Leu159 y Pro238) son adyacentes a los residuos que hacen con
tacto con el ADN. Los otros residuos identificados que son
probablemente importante en el mantenimiento de la estructura terciaria incluyen
cuatro prolinas (residuos 42, 95, 238 y 256); 150 leu, que
contribuye al núcleo hidrofóbico de las hélices en el N
dominio; y Gly171, que proporciona la flexibilidad necesaria
para que F gire a medida que se dobla 90° para pasar por debajo de HI a
siga el surco principal de la molécula de ADN unida (Fig. 6).
Por lo tanto, es razonablemente fácil explicar por qué cada residuo afecta
actividad de detención de replicación en términos de efectos sobre la estabilidad de Tus o
Unión Tus-ADN. Si bien estos estudios identifican claramente residuos
importantes, la ausencia de mutaciones en un sitio en particular no
no indicar que el residuo no es importante. solo uno de los
mutantes seleccionados (P238L) se obtuvo en más de un experimento (85, 161),
lo que indica que los procesos de muestreo fueron
No exhaustivo.
De particular interés es la conversión de Glu49 a Lys.
Aunque esta mutación condujo a un aumento en la fuerza de la
interacción Tus-TerB , redujo la actividad de detención de la replicación en
vivos (160). Glu49 se encuentra en la región L1, cerca del no permisivo
cara del complejo (Fig. 10). No está bien situado para directo
interacción con la helicasa que se aproxima, ya que está parcialmente ocluida
por otros residuos en el bucle L1 y el ADN Ter .
Quizá el movimiento de la helicasa hacia la región del
El sitio Ter conduce a alteraciones estructurales que reposicionan a Glu49.
Las características de este mutante impulsaron a Henderson et al.
Alabama. (59) para usar la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para
examinar una gama más amplia de mutantes con mutaciones en el bucle L1
(residuos 41 a 53). Se espera que este bucle sea razonablemente
unidad plegable autónoma, ya que está separada de las contiguas
elementos de estructura secundaria por residuos de prolina en posiciones
42 y 52. Solo His50 interactúa directamente con Ter DNA, pero
otras mutaciones en L1 también pueden desestabilizar las interacciones con
L2; Lys46 tiene interacciones con Asn85 y Ser88 (lo que hace
un contacto con el fosfato de A7), y en solución, Glu47 podría
interactuar con Asn85. El E43Q, V44T, K45A, K46A, E47Q,
Se examinaron los mutantes D48N, E49A, E49K, H50N y N51D
en un ensayo cuantitativo de intermediarios de replicación de plásmidos
detenidos, un ensayo de crecimiento similar al sistema de selección descrito
anterior, y para la unión a TerB y la inhibición de la helicasa DnaB
actividad in vitro (Cuadro 1). De los mutantes que tenían defectos en
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514 NEYLON Y AL. MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.

HIGO. 10. La cara no permisiva del complejo Tus-Ter. Se muestran cuatro vistas equivalentes de esta cara, destacando las características que
podrían entrar en contacto con la helicasa DnaB. (A) Elementos de estructura secundaria que podrían contactar DnaB; (B) residuos en la cara no
permisiva del complejo, incluido Glu49; (C) representación que llena el espacio coloreada por tipo de residuo (rojo, ácido; azul, básico; amarillo, polar;
gris, alifático); (D) distribución de carga en la superficie Tus en la cara no permisiva. La carga se calculó sin el ADN de TerA en su lugar, utilizando
cargas atómicas y el cálculo de Poisson-Boltzman implementado en SWISS-PDB VIEWER versión 3.7 (56).

detención de la replicación (K46A, E47Q, E49K y E49A), todos excepto K46A
mostraron una unión TerB más estable que más débil (59).
Sin embargo, este defecto de detención de la replicación in vivo no se
reflejó con precisión en los ensayos de antihelicasa in vitro. Tanto los mutantes
E47Q como E49A fueron tan efectivos como Tus de tipo salvaje para prevenir
la acción de la helicasa, mientras que los mutantes E49K y K46A fueron menos
efectivos. Estos resultados fueron confirmados por Mulugu et al. (127), quienes
encontraron que la proteína mutante E47Q era un bloqueo efectivo para la
acción de la helicasa DnaB y las horquillas de replicación en ensayos in vitro,
pero que el mutante E49K era defectuoso en ambos. Estos datos
indican un papel para algunos residuos (más especialmente Glu49) en la
detención de la replicación más allá de la simple unión al ADN, y esto refuerza
el caso del papel de las interacciones Tus-DnaB. Las diferencias entre los
resultados obtenidos con los ensayos in vitro y los sistemas in vivo más
complejos presumiblemente reflejan no solo la capacidad de Tus para bloquear
el progreso de la horquilla de replicación, sino también la eficiencia con la que
operan los mecanismos de reinicio de la replicación para restablecer una
horquilla funcional después de su finalización. estancamiento y disociación de
algunos de los componentes replisómicos. Los mecanismos de reinicio de
replicación son de interés actual (32, 120, 148), y estos estudios se han
extendido al caso específico de bifurcaciones bloqueadas por un bloque Tus-
Ter (18–20, 73, 74, 77, 78, 120–122 , 140, 145, 155). Sin embargo, estas
investigaciones están más allá del alcance de esta revisión y no se discuten
más.
Mulugu et al. (127) informaron evidencia mutacional adicional para las
interacciones Tus-helicasa. Una interacción in vivo entre
Tus y DnaB se detectaron utilizando un sistema de dos híbridos de levadura. A
A continuación, la biblioteca de genes tus mutados aleatoriamente se cribó
utilizando un cribado de dos híbridos inversos para reducir la unión a DnaB.
Tres colonias seleccionadas produjeron la misma mutación, una conversión
de Pro42 a Leu. Esta mutación dio como resultado un KD ligeramente
aumentado para el complejo de Tus con un oligonucleótido TerR2 y el complejo
se disoció más rápidamente. También tenía una afinidad in vitro reducida por
DnaB y era incapaz de bloquear la actividad helicasa. Pro42 está en la
superficie de la proteína, muy lejos de la cara del complejo que bloquea la
helicasa. No está claro a partir de la estructura cómo podría afectar
directamente las interacciones de casos de Tus-heli. También se examinó el
efecto de otras tres mutaciones en la región L1 sobre la unión de Tus-DnaB.
Al igual que P42L, el mutante E49K había reducido la unión de Tus-DnaB y
era casi completamente defectuoso en la actividad antihelicasa in vitro. El
mutante P52L tenía una unión Tus-DnaB reducida y una actividad antihelicasa
algo reducida, mientras que el mutante E47Q tenía una unión aumentada y
una actividad normal. La reducción de la actividad antihelicasa se correlacionó
ampliamente con la fuerza medida de unión a DnaB.
A pesar del extenso trabajo con estas proteínas mutantes seleccionadas,
no se ha observado ninguna mutación única o combinación de mutaciones que
elimine completamente la actividad de detención de horquilla de Tus mientras
retiene su fuerte unión al ADN Ter . De hecho, el más defectuoso, el mutante
E49K, seguía mostrando una actividad significativa de detención de la
replicación (59, 160). En conjunto, estos resultados sugieren que parte de la
actividad de Tus reside en la fuerza de la unión al ADN y parte reside en las
interacciones con un componente replisómico que probablemente sea DnaB.
Otro estudio reciente de mutantes Tus se centró en residuos
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VOLUMEN 69, 2005 Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 515

que hacen contactos específicos de unión al ADN. Neylon et al. (131)

utilizaron SPR para medir el efecto de convertir tres de los residuos de
unión al ADN periféricos, Lys89, Arg198 y Gln250, en Ala, además de
examinar el mutante A173T previamente caracterizado. Estas
mediciones se realizaron con condiciones tampón
diferentes de los utilizados anteriormente, lo más importante es que
tienen concentraciones de sal significativamente más altas. La KD
medida del complejo Tus-TerB en estas condiciones (en KCl 250 mM)
fue de aproximadamente 0,5 nM, mientras que los valores para los
mutantes K89A, R198A y Q250A estuvieron en el rango de 90 a 220
nM, y para el A173T mutante fue 2 M. El gran aumento en KD para el
mutante A173T en estas condiciones se comparó bien con el informado
para la misma proteína en un tampón muy diferente (161).
El cambio en la constante de disociación de los complejos de los
mutantes K89A, Q250A y A173T con TerB se debió principalmente a
aumentos muy grandes en la constante de velocidad de disociación
(131), lo que sugiere que estos residuos tienen un papel importante en
el mantenimiento del complejo una vez formado. . Sin embargo, el
efecto de la mutación R198A se debió en gran parte a una disminución
de 50 veces en la tasa de asociación. Esta mutación tuvo sólo un efecto
modesto (4 veces) sobre la tasa de disociación. Además, el mutante
R198A había disminuido notablemente la unión a ADN (no específico)
que no contenía un sitio Ter . La magnitud del cambio en KD para la
unión de R198A-Tus al ADN no específico fue comparable al cambio
HIGO. 11. Unión Tus-DNA y Tus-Ter . La forma de solución de Tus se une de
observado en la unión específica de Ter , lo que sugiere que una gran
manera no específica al ADN y escanea a lo largo de la doble hélice en busca de un
parte del efecto sobre la unión específica se debió a un defecto en la sitio Ter . Al encontrar un sitio Ter , una serie de cambios conformacionales conducen
unión no específica (p. ej., debido a la disminución de la carga positiva). a la formación del complejo Tus-Ter cerrado.
Las otras mutaciones no tuvieron un efecto significativo sobre la unión
al ADN que no contenía un sitio Ter . No se informó el efecto de las
mutaciones en estos residuos sobre la actividad antihelicasa. teniendo un efecto sobre el equilibrio interno entre complejos específicos
e inespecíficos sin reducir la fuerza global de unión. Esto podría ocurrir
si las proteínas se unen más fuertemente al ADN no específico pero
Un mecanismo paso a paso para vincular y desvincular Tus-Ter están desestabilizadas con respecto a la interacción específica con el
ADN Ter . Esto podría esperarse, por ejemplo, para mutaciones que
Los resultados de SPR de Neylon et al. (131), incluida también la aumentan la carga positiva (o disminuyen la carga negativa) cerca del
medición de la dependencia de la concentración de sal de las ADN unido.
constantes de velocidad para el equilibrio de unión de Tus-Ter, se En resumen, las mutaciones aisladas mediante procedimientos de
interpretaron como apoyo a un mecanismo de unión/desunión gradual (Fig. 11).
selección (Tabla 1) identifican varios residuos que son importantes para
El valor de KD dependía en gran medida de la sal, debido casi por la actividad de detención de horquillas in vivo. La mayoría confirma la
completo a un fuerte efecto sobre la constante de velocidad de importancia de residuos particulares en la unión al ADN. Los efectos
asociación, lo que implica la existencia de intermediarios después del del resto pueden explicarse en términos de alteración de la estructura
paso de colisión inicial en el proceso de unión (142). La unión paso a de la proteína que proporciona el andamiaje para los residuos de unión
paso que involucra uno o varios complejos intermedios podría, a su al ADN. Las propiedades de E49K y algunos otros mutantes L1 sugieren
vez, usarse para explicar la polaridad de la detención de la horquilla de fuertemente que hay más en el proceso de detención de la replicación
replicación y varios otros datos sobresalientes (131). que la simple unión del ADN, y hay evidencia de la correlación de la
En este modelo, un paso crucial tanto en la unión como en la unión de Tus-DnaB y la detención de la replicación de un papel en las
eliminación de Tus del ADN es la conversión entre un complejo Tus- interacciones proteína-proteína. , al menos en el caso específico del
ADN no específico y el complejo Tus-Ter específico . El acercamiento complejo Tus-Ter bloqueando la helicasa DnaB. Por otro lado, el efecto
de la helicasa desde el lado permisivo del complejo promovería la diferencial de algunos residuos en la unión específica de Tus-Ter en
formación de un complejo inespecífico de menor afinidad que luego se comparación con la unión no específica de Tus-DNA sugiere un modelo
disociaría rápidamente. El acercamiento de la helicasa desde el otro dinámico del complejo Tus-Ter que también se puede usar para explicar
lado, no permisivo, evitaría la formación del complejo no específico, y una cantidad significativa de datos que de otro modo serían difíciles.
la proteína Tus se bloquearía cinéticamente en el ADN Ter . Este
equilibrio dinámico podría verse afectado por el modo de acción y la
estructura de la helicasa, la fuerza general de la unión de Tus al sitio
Comparación de Tus Secuencias
Ter específico y la identidad de los pares de bases que no forman
enlaces explícitos en la estructura cristalina pero que tendrían un papel Ni la secuencia del gen tus ni la estructura de la proteína tienen
en la formación del complejo inespecífico. Dentro de este modelo, las ninguna similitud significativa con la secuencia o estructura de las
mutaciones en el bucle L1 (59, 127, 160) podrían describirse como proteínas con otras funciones en E. coli o cualquier otra especie para
la que se conoce la secuencia cromosómica. Es más,
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516 NEYLON Y AL. MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.

HIGO. 12. Alineación de secuencias de algunas proteínas Tus y similares a Tus. Una alineación de las secuencias de la proteína Tus de E. coli, Salmonella enterica
serovariedad Typhimurium, Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae y Yersinia pestis, junto con secuencias de proteínas similares a Tus del plásmido R394
de S. enterica serovar Typhimurium y el plásmido Rts-1 de Proteus vulgaris, se llevó a cabo y se coloreó utilizando los parámetros predeterminados en
CLUSTAL_X (64). Esencialmente, los residuos están coloreados cuando más de un porcentaje dado de residuos pertenecen a una clase: cian, alifáticos y
residuos hidrófobos; naranja, residuos básicos; residuos ácidos violetas; residuos de enlaces de hidrógeno neutros y verdes. Todas las glicinas son de color marrón,
y todas las prolinas son de color amarillo. Los elementos de la estructura secundaria de la estructura cristalina de Tus-Ter se muestran encima de la alineación. residuos que
Los contactos de la columna vertebral del ADN en la estructura cristalina se muestran con un bloque azul sobre la alineación. Esos residuos que hacen secuencia específica
los contactos con el ADN Ter se muestran con un bloque rojo. Las proteínas Tus y Tus-like se identificaron utilizando PSI-BLAST (4).

componentes del sistema de terminación de la replicación de B. subtilis,
aunque funcionalmente muy similar a los del sistema Tus-Ter,
tampoco tienen secuencia significativa o similitud estructural (26,
27, 169, 170, 172). Esto parece ser una demostración clásica.
de evolución convergente. Las proteínas de bien caracterizadas
los organismos con una similitud significativa son Tus (o Tus putativo)
proteínas de especies bacterianas relacionadas con E. coli (40, 59, 84,
136) y los productos de genes para lo que parecen ser altamente
proteínas Tus divergentes transportadas en plásmidos, incluido R394 de
Salmonella enterica serovar Typhimurium (97) y R27 de Salmonella
enterica serovar Typhi (156). El plásmido Rts-1 de
Proteus vulgaris (128) porta dos genes relacionados con tus, uno de
que codifica una proteína idéntica a la proteína R394. Reciente
determinación de la secuencia a gran escala del ADN ambiental
Las muestras del Mar de los Sargazos (167) arrojaron (solo) cinco
secuencias de proteínas completas o casi completas con un 25 % de identidad mutantes defectuosos en arresto se conserva en los cuatro estrechamente relacionados
a Tus.
La existencia de un sistema Tus-Ter en S. enterica serovar
Typhimurium fue reportado por Rocklein et al. (144). Las secuencias de
este gen tus y las de Klebsiella pneu
moniae subesp. ozaenae y Yersinia pestis han sido reportadas
y analizado en detalle (59). Las secuencias de proteínas son casi
idénticos en longitud y muestran 78% (S. enterica serovar Typhi murium),
70% (K. pneumoniae) y 53% (Y. pestis) identidad con
E. coli Tus (Fig. 12). El grado de divergencia de la secuencia es
consistente con la colocación de la especie huésped en árboles
filogenéticos. Las búsquedas BLAST (3, 4) identifican ADN múltiple
secuencias similares al núcleo de TerB en los genomas de S.
enterica serovar Typhimurium, Yersinia enterocolitica, Clostrid ium
acetobutylicum, Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi,
una Buchnera sp., y una variedad de plásmidos (C. Neylon, datos no
publicados), lo que sugiere que las secuencias de Ter y, por implicación,
un sistema de terminación relacionado con Tus-Ter podrían conservarse
en un espectro más amplio, pero limitado. gama de especies bacterianas.
Cada residuo identificado como importante mediante la detección de
Tus (es decir, las de E. coli, S. enterica serovar Typhi murium, Y. pestis
y K. pneumoniae), con la única excepción de Ala254 en la proteína
Yersinia (Fig. 12). Ambas cisteínas
se conservan en las cuatro especies, y aparte de Pro295, que
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VOLUMEN 69, 2005
se sustituye en la proteína de Klebsiella , y Pro197, que se sustituye en la
proteína de Yersinia , se conserva toda la prolina.
Casi todos los residuos identificados como contactos de ADN en la
estructura cristalina (Fig. 7 y 8) se conservan en las cuatro proteínas (Fig.
12). Las excepciones son Thr136, Ile177, His253, Ala254, Val285, His287,
Arg288, Tyr289 y Gln294. Thr136, Ile177 y Arg288 hacen (o probablemente
hacen) contactos específicos de secuencia, mientras que los otros hacen
contactos de cadena principal de azúcar-fosfato. Ala254, His287 y Tyr289
interactúan con el ADN a través del esqueleto peptídico. La interacción
Thr136 probablemente no es importante y está sustituida de forma
conservadora en dos de los tres casos. Ile177 y Val285 se sustituyen de
forma conservadora por otros aminoácidos no polares, y Arg288 se
sustituye de forma conservadora por lisina. Las interacciones de His253 y
Gln294 con el esqueleto del ADN, si ocurren en solución, pueden
restaurarse en estructuras modeladas por las sustituciones de tirosina y
lisina observadas, respectivamente.
La interpretación de los patrones de conservación en las proteínas
codificadas por plásmidos más divergentes es menos sencilla. Las
proteínas R394 y Rts-1 están más estrechamente relacionadas entre sí
que con los homólogos codificados cromosómicamente; las secuencias
tienen del 20 al 30% de identidad con las otras secuencias de Tus. El gen
R394 está asociado con uno que codifica una lesión MucAB que pasa por
alto la ADN polimerasa, lo que podría sugerir que mantiene algún papel
en el metabolismo del ADN, y el plásmido contiene varios sitios similares
a Ter, incluido uno que precede al marco de lectura abierto tus pero aguas
arriba del promotor (97). En el gen de E. coli , TerB se encuentra entre el
sitio de unión al ribosoma y la secuencia 10 del promotor tus (Fig. 4). Esta
posición en el gen R394 está ocupada por una caja LexA, colocando a la
proteína bajo el control de la respuesta SOS (97). El gen tus en el plásmido
Rts-1 (128) no está estrechamente asociado con un sitio Ter obvio ,
aunque una búsqueda en el ADN de elementos con similitud con la
secuencia de consenso Ter identifica una serie de sitios similares a Ter
potenciales en otras partes del plásmido. .
En comparación con E. coli Tus, se producen varias inserciones y
deleciones cortas en las proteínas codificadas por plásmidos, principalmente
en puntos correspondientes a bucles en la estructura de Tus (Fig. 12).
Esto, junto con el hecho de que los residuos conservados a menudo se
encuentran en pares que interactúan en una estructura modelada, confirma
que las topologías generales de las proteínas son similares.
Donde se sabe, las secuencias de helicasas DnaB de estas especies
están más conservadas que las de Tus (es decir, 92 % para S. enterica
serovar Typhimurium y 84 % para Y. pestis), y es muy probable que se
requiera la DnaB huésped para la replicación de los plásmidos. Por lo
tanto, si Tus hace contactos específicos con DnaB, se esperaría que los
elementos involucrados se conservaran y que estos fueran distintos de los
residuos requeridos para la unión específica de ADN Ter . Entre las tres
proteínas más estrechamente relacionadas (las de E. coli, Klebsiella y
Salmonella), existen tales regiones conservadas en el extremo no
permisivo del complejo (la cara que entraría en contacto con la helicasa
bloqueada). Por el contrario, los residuos en la cara permisiva se conservan
por completo solo cerca del ligando de ADN (59).
Sin embargo, cuando se considera la proteína Yersinia , esta gran cara
no permisiva conservada no es tan evidente. Hay algunas regiones
específicas que todavía son claras como más conservadas que su entorno
(Fig. 12). El bucle L3 en el dominio C (entre VI y VII) está muy conservado,
al igual que los residuos en una región del dominio N definida por el
extremo N terminal
Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 517
de I y la región alrededor de III. El bucle L3 puede conservarse debido al
requisito de posicionar Arg198. La región en la parte superior del dominio
N no está íntimamente involucrada en la unión al ADN, excepto que
Arg139 hace un estrecho contacto con un fosfato de la columna vertebral.
El Glu141 completamente conservado apunta directamente hacia el
disolvente desde la mitad de IV. El motivo Arg Phe-Glu (residuos 139 a
141) también se conserva en la proteína R394 y se conserva parcialmente
en la proteína Rts-1 (Fig. 12).
En resumen, las secuencias del gen tus de S. enterica serovar
Typhimurium, K. pneumoniae e Y. pestis proporcionan información sobre
residuos que son importantes para la acción de Tus in vivo. En general,
las proteínas son bastante similares y, por lo general, se conservan los
residuos de unión al ADN y los importantes para la estructura secundaria.
Cuando no se han conservado residuos aparentemente importantes, por
lo general es posible presentar un argumento plausible para explicar cómo
se podría acomodar el cambio. La existencia de residuos conservados en
el extremo bloqueador de la bifurcación de la molécula que no están
directamente involucrados en la unión al ADN brinda más apoyo a la
noción de que las funciones de la proteína más allá de la simple unión al
ADN son importantes en la detención de la replicación.
PERSPECTIVAS ESTRUCTURALES DE LAS INTERACCIONES
DE Tus CON HELICAS
Estructuras de DnaB y Helicasas Hexaméricas Relacionadas
Recientemente se han revisado aspectos de las estructuras y funciones
de E. coli DnaB y helicasas hexaméricas relacionadas (24, 28, 36, 37,
116, 137). No existe una estructura de resolución atómica de la molécula
DnaB hexamérica completa disponible. Cada monómero DnaB (471
residuos) está formado por dos dominios unidos por una región que puede
funcionar como una bisagra flexible (129). El dominio N terminal, que
comprende los residuos 24 a 136 (123), experimenta un equilibrio
monómero-dímero en solución (171), es dimérico en estado cristalino (46)
y parece participar en la interacción con la DnaG primasa (21, 29, 133). El
dominio C-terminal más grande (que contiene residuos de alrededor de
170 a 471) es un hexámero y lleva los sitios de unión de ATPasa y ADN
(21, 129). Están disponibles dos estructuras de alta resolución determinadas
de forma independiente del dominio N-terminal (46, 171), pero dado que
se cree que esta parte de la molécula mira hacia el lado contrario de la
horquilla de replicación (80, 82, 83) (Fig. 2), estas estructuras no aportan
información útil sobre la cara de DnaB que puede entrar en contacto con
el complejo Tus-Ter.
Se han obtenido estructuras de baja resolución de DnaB intacto de
longitud completa y su complejo con su compañero de carga DnaC
mediante la reconstrucción de imágenes a partir de micrografías
electrónicas, utilizando preparaciones teñidas negativamente (151, 176,
178) y muestras de proteínas nativas congeladas en hielo ( 9, 150). La
estructura general es un toroide de simetría rotacional triple o séxtuple
(dependiendo de las condiciones) con un canal a través del centro lo
suficientemente ancho para acomodar una o ambas hebras de ADN (Fig.
13). El estado de simetría varía con el pH (39), y se supone que estos
cambios indican una flexibilidad significativa que puede ser necesaria para
los cambios conformacionales que ocurren durante la translocación en las
plantillas de ADN o durante la carga de la helicasa en el ADN en los
orígenes de la replicación o durante el reinicio de la replicación en
horquillas estancadas. Está claro a partir del trabajo sobre DnaB (80, 87) y el distante
Machine Translated by Google
518 NEYLON Y AL.
HIGO. 13. Reconstrucción de modelos de estructuras de resolución atómica de
la helicasa DnaB con triple (A y C) y séxtuple (B y D)
simetrías. La helicasa se acercaría al complejo Tus-Ter con
la cara superior en C y D. Estructuras de resolución atómica del gen T7
4 dominio helicasa (verde) (157) y el dominio N-terminal de DnaB
(azul) (46) se acoplaron en mapas de densidad de electrones determinados por
microscopio de electrones. Las flechas en A indican regiones de la helicasa
estructura que penetran la envoltura de la superficie del microscopio electrónico en
los dominios de helicasa comprimidos, lo que sugiere que son necesarios cambios
conformacionales adicionales en la estructura atómica para ajustarse al mapa de
microscopía electrónica. Tanto en el modelo triple como en el séxtuple, hay
es la densidad adicional sin llenar entre la helicasa y el N-terminal
dominio (D, flecha roja) que probablemente se deba a 51 residuos del enlazador
región no contabilizada en las estructuras atómicas. La figura se reproduce a
partir de la referencia 176 con permiso del Journal of Molec ular Biology.
fago relacionado T7 helicasa (45, 57, 177) que el ADN solo
hebra en la que las enzimas translocan pasa a través de la
canal central, mientras que la otra hebra está excluida. Hay
ahora también hay evidencia clara de que, en algunas circunstancias, DnaB
puede sufrir una translocación dependiente de ATP en el ADN de doble cadena,
y ambas cadenas pasan a través de la central
canal (87, 88). El canal tiene unos 30 Å de ancho y de 60 a 80
Å de profundidad (150, 176) y por lo tanto podría acomodar alrededor de 20
pb de ADN de doble cadena. Se ha estimado de forma independiente que el
canal central se une a un ADN monocatenario
fragmento 20 de 3 nucleótidos de longitud (25, 79, 81, 82).
La otra helicasa hexamérica cuyo progreso se ha informado que está
bloqueado por Tus es el antígeno T de SV40. San Martín y
Alabama. han informado sobre la estructura de baja resolución de esta enzima
(149), y una estructura de alta resolución de una región central
de la proteína que es hexamérica y activa como helicasa (residuos 251 a 627)
ha aparecido recientemente (109). la proteina es
no relacionado en secuencia con DnaB, pero tiene un toroidal similar
estructura a pesar del hecho de que se transloca en el ADN monocatenario en
la dirección opuesta (3 -5).
Se han obtenido imágenes similares de baja resolución para otros
helicasas replicativas hexámeras que aún no se sabe que interactúen (en el
sentido funcional) con Tus. Estos incluyen el
colifago T7 gen 4 helicasa-primasa (45, 177), la B. subtilis
MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.
helicasa del fago SPP1 (10), la helicasa E1 del virus del papiloma (47),
y la proteína RepA codificada por el plásmido RSF1010 (154, 174).
Las similitudes de secuencia entre las helicasas hexaméricas condujeron
a una predicción de que todos ellos poseen regiones hexaméricas que
tienen estructuras similares a la del dominio C-terminal de
DnaB y que este dominio tiene una estructura relacionada con la de
el factor de recombinación de ADN RecA, que forma una hélice
estructura con una repetición hexamérica (28, 162, 163). Esta predicción ha
sido reivindicada por recientes determinaciones del cristal
estructuras de dos helicasas hexaméricas que son parientes lejanos
de DnaB: la proteína RSF1010 RepA (132, 174) y el dominio helicasa C terminal
de la proteína del gen 4 de T7 (152, 157). los
las estructuras generales de estos hexámeros son similares. Son estructuras
en forma de anillo de unos 12 nm de ancho con un canal central
lo suficientemente ancho como para acomodar al menos una sola hebra de ADN.
Por lo tanto, se asemejan a sus reconstrucciones a partir de imágenes de
microscopio electrónico, así como a las de DnaB y las otras
helicasas hexaméricas. Muy recientemente, la estructura atómica del
se informó helicasa-primasa T7 completa (165). Se cristalizó como una partícula
en forma de anillo, sorprendentemente con siete subunidades
formando el toroide.
Modelando las estructuras de rayos X del dominio N-terminal
de DnaB y el dominio C-terminal de la helicasa T7 para
juntos en los mapas de densidad electrónica de baja resolución obtenidos
a partir de micrografías electrónicas, Yang et al. han elaborado un
modelo que ubica los dominios N- y C-terminal de DnaB en
la molécula intacta, tanto en el estado de simetría C3 como en el C6
(176). En la modelo, el rostro que se encuentra por primera vez con el Tus-Ter
El complejo está formado por la red eléctrica C-terminal (ATPasa/helicasa) y
presenta una superficie bastante plana para el bloqueo de la horquilla.
complejo (Fig. 13). No es posible en esta etapa satisfactoriamente
modelar posibles interacciones directas entre la helicasa y
mar.
Interacción de Tus con Helicasas
Hay varias otras formas en las que Tus podría interactuar
funcionalmente con una helicasa hexamérica que se aproxima para facilitar
bloqueo de la horquilla. La cara que presenta Tus a la helicasa es de 4 a
5 nm de ancho en su parte más ancha. En cada una de las helicasas hexaméricas,
el canal interno es por lo tanto más pequeño que el transversal más corto
sección de la proteína terminadora. Por lo tanto, Tus podría actuar como un
conecte la helicasa si la asociación entre las dos moléculas llegara a ser tan
estrecha. También es posible que Tus
diseña una estructura en el ADN que bloquea el progreso de
la helicasa. El pequeño fragmento de ADN utilizado para la cristalización de Tus
no se extiende lo suficiente más allá de la proteína.
para permitir comentarios sobre esto (170). También es concebible que el
helicasa provoca un reordenamiento en la estructura Tus, ya sea por
interacción directa o a través del ADN que une los dos
moléculas. Si este fuera el caso, sería plausible que Tus
encajar parcialmente dentro del canal de DnaB, proporcionando una cinética
bloquear su eliminación del ADN.
La cara que bloquea la horquilla de Tus (Fig. 10) no muestra
característica que podría impedir el paso de la helicasa. los
concentración de carga positiva cerca del ADN TerA unido
(Fig. 10D) es aportado por residuos de unión al ADN y es
neutralizado en la unión al ADN. Los residuos expuestos al solvente
que la helicasa contactaría más de cerca son predominantemente
residuos polares (Fig. 10C), pero no hay un sesgo aparente hacia
Machine Translated by Google
VOLUMEN 69, 2005
polaridad negativa o positiva, y al menos dos de los grupos son alifáticos.
Se ha informado que el bucle L1 está involucrado en las interacciones
Tus-helicasa. En particular, Glu49 cuando se reemplaza por Lys aumenta
la afinidad de unión al ADN pero reduce la actividad de detención de la
replicación en un 62% (59, 160), lo que sugiere que puede tener un papel
en las interacciones Tus-helicasa. Las mutaciones de Pro42 a
Se ha informado que Leu, Glu47 a Gln, Glu49 a Lys y Pro52 a Leu reducen
la interacción Tus-helicasa (127). Sin embargo, ni Pro42 ni Pro52 están
expuestos cerca de la cara no permisiva de la estructura (Fig. 10B), por lo
que sería necesaria una disposición posterior estructural sustancial para
permitir el contacto directo con la helicasa. Glu49 está situado de manera
que podría contactar con DnaB, pero todavía está muy por debajo de la
cara superior del complejo (Fig. 10).
Por lo tanto, es probable que los efectos de estas mutaciones sean a
través de algún mecanismo indirecto o que sean descubiertos por la
acción de la helicasa en el extremo no permisivo del sitio Ter . Sobre la
base de la estructura cristalina, los residuos expuestos en la cara no
permisiva del complejo (p. ej., los de L3 o IV [Fig. 6]) están mejor situados
para interactuar con la helicasa que se aproxima. Es de interés que las
mutaciones en estos residuos no se han seleccionado en la pantalla para
aquellos que
interactuar con DnaB.
Otros residuos que podrían entrar en contacto con la helicasa que se
aproxima se encuentran en las regiones L2, IV, V y VI-L3-VII (Fig.
6). Cada una de estas regiones hace al menos un contacto con el ADN.
De hecho, estos residuos representan casi todos los contactos de ADN
fuera del dominio de unión central. Sin embargo, no es posible determinar
si los elementos de la estructura secundaria se colocan para facilitar la
interacción de los residuos de unión con el ADN o si se requiere la unión
del ADN para colocar los residuos dentro de los elementos de la estructura
secundaria en el lugar correcto para bloquear el paso de la helicasa. Con
la excepción de los residuos en L1 y otros dos (Lys89 en L2 y Arg198 en
L3), los efectos de las mutaciones en el extremo no permisivo del complejo
no se han estudiado en detalle (Tabla 1).
Por lo tanto, en contraste con las expectativas, la estructura del
complejo Tus Ter no ofrece evidencia convincente sobre el mecanismo
de detención de la horquilla de replicación polar. Puede afirmarse en
términos generales que la interacción Tus-Ter tendría que interrumpirse
durante el desenrollado de la doble hélice del ADN y que el complejo es
demasiado grande para permitir el paso de las helicasas.
Estructura de resolución atómica e información mecanística adicional
La información sobre helicasas relevantes debería permitir, en última instancia,
más comentarios sobre la naturaleza de las interacciones Tus-helicasa específicas.
MECANISMOS DE DETENCIÓN DE LA REPLICACIÓN POLAR
A pesar del gran volumen de información disponible sobre Tus y su
participación como antihelicasa en la edad del bloqueo de la horquilla de
replicación, existen muchos aspectos mecánicos del proceso que son
inciertos. En estas circunstancias tiene sentido resumir brevemente los
datos establecidos.
(i) Los detalles de la actividad antihelicasa y la detención de la
replicación parecen depender en gran medida de la identidad del sitio Ter ,
el modo de acción de la helicasa y el complemento de otras proteínas en
el replisoma translocado. Los experimentos in vitro, si bien arrojan luz
sobre la acción del complejo Tus-Ter, probablemente no reflejan
completamente los detalles de la detención de la replicación y los procesos
posteriores de reinicio de la replicación in vivo.
(ii) Una abrazadera molecular simple puede ser un antiheli eficaz
Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 519
caso in vitro. El mutante EcoRI E111Q se une fuertemente a su secuencia
de reconocimiento de ADN e impide el paso de una variedad de helicasas
(14). Esta proteína se une a su secuencia de reconocimiento de ADN con
una KD (95, 173) comparable a la del complejo Tus-TerB (54), y otros
complejos proteína-ADN pueden tener un efecto comparable (175). (iii)
Para una proteína de unión a ADN monomérica como Tus, una abrazadera
termodinámica simple no puede explicar la polaridad de la detención
de la horquilla de replicación. Un modelo de abrazadera plausible debe
incluir detalles cinéticos o estructurales para explicar la polaridad. (iv) Hay
evidencia de estudios de sustitución de nucleótidos y mutantes de
proteínas de que el efecto de algunas sustituciones
en la detención de la replicación no puede explicarse en términos de su
efecto sobre la unión al ADN. En particular, las sustituciones en Pro42,
Glu49, GC6 y AT19 tienen un efecto negativo mucho mayor sobre la
replicación o la detención de helicasa de lo que cabría esperar de su
efecto sobre la unión al ADN. Existe una correlación general pero no
absoluta entre la fuerza de unión de Tus a DnaB y la actividad antihelicasa
in vitro (Tabla 1). (v) En algunas circunstancias, cuando se une a TerB,
Tus parece ser capaz de ejercer una acción antihelicasa frente a una
amplia variedad de helicasas, incluidas 5-3, replicativas y no replicativas.
Por lo tanto, si las interacciones entre Tus, y3 estas
-5 para
helicasas son relevantes
la actividad
antihelicasa general, la interacción debe ser con una parte de la helicasa
que esté suficientemente bien conservada. (vi) Si bien la estructura
cristalina del complejo Tus-TerA está de acuerdo con la mayoría de los
otros datos disponibles, hay algunos que no se explican fácilmente. En
particular, la estructura no proporciona una explicación para la
protección del ADN contra la escisión en los pares de bases más allá del
alcance de la proteína en el complejo, el efecto sobre la unión al ADN de
varias sustituciones de aminoácidos y nucleótidos en posiciones donde no
se observa interacción, y la conservación evolutiva de regiones de la
proteína que no están involucradas en la unión al ADN. En particular, la
cara de bloqueo de horquilla de la proteína parece estar más conservada
que la cara permisiva.
Habiendo aceptado estas generalizaciones, podemos hacer más
afirmaciones. Un mecanismo de abrazadera simple es necesario pero no
suficiente. Esto lleva a la pregunta de qué otros mecanismos podrían
usarse. Dos amplias clases son posibles. El primero invoca un papel para
la dinámica de la estructura proteína-ADN, ya que la hélice compite con
Tus por el ADN. El segundo invoca interacciones proteína-proteína entre
Tus, la helicasa y potencialmente otras proteínas. Esto podría incluir un
papel para los cambios estructurales del ADN diseñados por Tus para
bloquear el progreso de la helicasa o diseñados por la helicasa para
afectar la afinidad de Tus por el ADN Ter . Es probable que operen
aspectos de todos estos mecanismos; la evolución no selecciona
inteligentemente entre mecanismos simples y definidos sino que se
presume aprovecha cualquier efecto físico que afine la función
seleccionada. Cabe señalar en este contexto que ni siquiera es
claro cuál es la ventaja selectiva de mantener el sistema Tus Ter (61, 68,
100, 144).
Perspectivas para el futuro
El mecanismo de detención de la horquilla de replicación polar por Tus
Ter complejo es un problema digno de resolución, porque representa un
sistema modelo bien desarrollado para un tipo inusual
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520 NEYLON Y AL. MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.

de la interacción proteína-ADN. A continuación, describimos algunos de los

experimentos necesarios para definir mejor el proceso. La pregunta más
significativa se reduce a cómo explicar la polaridad del proceso.
Fundamentalmente, y puede parecer obvio, todo lo que se requiere para
explicar la polaridad es que el camino para la disociación de Tus de su
complejo con un sitio Ter debería ser diferente dependiendo de si el
replisoma se acerca desde el permisivo, en oposición a al no permisivo,
cara.

Observamos que la oligomerización de proteínas (p. ej., monómero a

dímero o dímero a tetrámero) durante la unión del ADN ocurre en muchos
sistemas comparables, incluidas muchas interacciones represor-operador,
y que a menudo ocurre de forma escalonada. Un proceso de varios pasos
(cooperativo) es capaz de resolver el problema de lograr una alta afinidad
y especificidad de unión en general al mismo tiempo que permite que la
tasa de disociación sea lo suficientemente alta como para permitir
respuestas fisiológicas rápidas (141). En el caso de una bifurcación de
replicación que se acerque a Tus-TerB desde la dirección permisiva,
también podría resultar una alta tasa de disociación de Tus al dividir el
proceso en una serie de pasos.
La polaridad también se puede lograr de esta manera en el caso de
proteínas multiméricas. Por ejemplo, el sistema de terminación de la
replicación de B. subtilis consiste en una serie de secuencias Ter repetidas
invertidas imperfectas y una proteína, RTP, que se une secuencialmente
como un homodímero a cada uno de los dos medios sitios adyacentes
durante la formación del complejo de detención de horquilla ( 44, 101, 169).
Está claro que en el caso de RTP, la polaridad de la terminación de la
HIGO. 14. Un modelo de “disociación completa” de la acción Tus.
replicación podría explicarse adecuadamente por la cooperatividad en la Como se muestra, la cara permisiva del complejo Tus-Ter está a la
unión del segundo dímero, junto con la afinidad diferencial de unión de la izquierda y la cara no permisiva está a la derecha. DnaB que se acerca
proteína en cada uno de los semisitios (43, 101, 172). a la cara permisiva para la replicación entra en contacto con el complejo
Tus-Ter, lo que lleva a la disociación completa de Tus. El complejo Tus-
Sin embargo, incluso en este caso, esta no es toda la historia (revisada en
Ter impide que DnaB se acerque a la cara no permisiva (que bloquea la
la referencia 44). Bien puede ser que los complejos Tus-Ter y RTP-Ter bifurcación) para que avance más .
compartan aspectos del mecanismo, aunque sus estructuras no lo hagan.

¿Se puede utilizar un mecanismo de sujeción para explicar la polaridad

de acción de un complejo proteína-ADN monomérico, como el que existe
cambios y cambios en la energía de unión resultantes de la eliminación de
entre los sitios Tus y Ter ? Dentro de la clase de mecanismos de abrazadera
cada residuo de unión al ADN a medida que la helicasa avanza desde
hay una variedad de posibilidades. La más simple (Fig. 14) es aquella en la
cualquiera de las caras: un modelo de cremallera (131). Esta podría ser
que el paso de una helicasa por el sitio Ter requiere la disociación completa
una buena analogía porque una cremallera es inherentemente polar.
de Tus en un solo paso. Con este mecanismo, sin embargo, no es posible
Una variante de este modelo implica un cambio progresivo en la afinidad
explicar la polaridad. Una helicasa que se acerque a cualquiera de las caras
de Tus por el ADN como resultado de la presencia o acción de la helicasa.
del complejo tendría que superar la misma barrera energética para pasar.
La interacción directa helicasa-Tus sería una
Es necesario agregar aspectos cinéticos u otros para explicar la polaridad.
manera de lograr esto. Otra sería que Tus se uniera con diferente afinidad
a una estructura de ADN bifurcada intermedia diseñada por acción de
Los mecanismos de abrazadera más complicados implican un proceso
helicasa en el extremo no permisivo o permisivo. Como hemos señalado
gradual concertado mediante el cual la helicasa se mueve hacia el sitio
anteriormente, hay varios datos experimentales que apoyan esta última
Ter , eliminando Tus. La forma más simple de un modelo de disociación
por pasos, un mecanismo de dos pasos, puede explicar la polaridad del posibilidad. También es notable que las interacciones de aminoácidos

complejo Tus-Ter (Fig. 15). Aquí, los residuos de unión se dividen en dos
clases, residuos en el extremo permisivo del complejo y residuos en la cara
no permisiva (que bloquea la horquilla). Una helicasa que llega del lado
permisivo puede competir con éxito con los residuos de Tus que se unen a
este extremo del ADN Ter , lo que provoca un cambio conformacional en
los residuos de unión al ADN restantes que elimina Tus del ADN
directamente o permite que la helicasa siga compitiendo. con éxito para los
sitios de unión restantes. Cuando la helicasa se acerca desde el otro lado,
la competencia entre helicasa y Tus es tal que Tus no puede eliminarse tan
fácilmente. El modelo más complejo de este tipo describiría la conformación
observadas en la estructura cristalina en la cara permisiva son casi en su
totalidad con la hebra que pasaría a través del canal central de la helicasa
(85), y hay un grupo de residuos básicos (es decir, Lys119 , His163, Lys245,
Lys249 e His253) colocados justo fuera del alcance del ADN dúplex en la
estructura de manera que podrían interactuar con la hebra desplazada en
la cara permisiva, impulsando progresivamente una mayor desestabilización
del ADN dúplex (85, 170) . Una explicación alternativa proviene del examen
de residuos básicos ubicados de manera similar en la cara no permisiva (es
decir, Arg145, Lys192, Lys195 y Arg205). La separación de cadenas por la
helicasa podría acercar a los grupos fosfato de ADN
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VOLUMEN 69, 2005 Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 521

papel menor en la determinación de la especificidad, mientras que

Lys89, Ala173 y Gln250 parecen ser importantes para la unión
específica, pero no no específica. Es decir, algunos residuos implicados
en una asociación general no específica con el ADN parecen estar
separados de los implicados en la determinación de la especificidad
de secuencia de la interacción. Además, la fuerte dependencia de la
sal de la tasa de asociación sugiere que los cambios conformacionales
de la proteína tienen lugar después del paso de colisión inicial (142).
La estructura de solución de Tus libre es significativamente diferente
de la estructura ligada. Esto es sugerido por los datos espectroscópicos
de dicroismo circular que indican una menor proporción de estructura
de hoja en la proteína libre (31) que en la estructura cristalina (85).
Los residuos básicos, incluido Arg198, están involucrados en las
etapas iniciales de la unión al ADN, formando un complejo no específico
abierto, presumiblemente capaz de escanear el ADN en busca de
sitios Ter . Al encontrar un sitio Ter , los residuos implicados en la
unión específica de secuencia, incluidos, entre otros, Lys89, Ala173 y
Gln250, están en posición de unirse específicamente a sus sitios de
ligando. Esto conduce secuencialmente a la formación de la estructura
proteica unida, cerrando el complejo y deformando el ADN. Se
esperaría que este proceso dependiera en gran medida de la sal, lo
que daría como resultado una neutralización de carga extensa y el
entierro de una gran parte de las superficies de proteína y ADN
expuestas al solvente.
Este modelo se puede utilizar para explicar algunos de los datos
destacados que parecen contradecir un modelo de abrazadera. Ahora
se predice la presencia de sitios de protección fuera del alcance
HIGO. 15. Un modelo simple de dos pasos de las interacciones Tus-Ter y DnaB.
(Izquierda) El DnaB que se acerca a la cara permisiva del complejo Tus-Ter promueve
aparente de la proteína (Fig. 9) para un complejo que está en equilibrio
la formación de la forma abierta de Tus unida de forma no específica, que puede entre una forma unida específicamente y una forma no unida
disociarse directamente o deslizarse a lo largo del ADN. Si DnaB se traslada al sitio Ter específicamente. Además, esto sugiere que dichos sitios podrían
antes de que Tus pueda volver a la forma cerrada específicamente unida, la actividad extenderse más en los casos en que la unión específica es más débil,
de la helicasa continúa. (Derecha) DnaB que se aproxima desde la cara no permisiva
como con TerR2, como se observa (54, 158). Esto también puede
no puede promover la formación de la forma abierta del complejo, y se bloquea el
desenrollamiento adicional del ADN. explicar una aparente discrepancia entre los resultados sobre los
efectos de la mutación R198A. Neylon et al. (131) informaron solo un
efecto menor de la mutagénesis en la tasa de disociación de Tus de
TerB, mientras que Henderson et al. (59) reportaron un aumento de 75
imity con estos residuos, lo que simplemente fortalece la interacción veces. Esto puede atribuirse a la diferencia en los fragmentos de ADN
Tus-Ter. utilizados en cada caso. Henderson et al. usaron un fragmento de ADN
El requisito fundamental de esta forma de modelo es que la vía para significativamente más largo en sus mediciones, y esto debería
la disociación de Tus del ADN Ter sea limitada. Es decir, hay un aumentar la contribución de la unión no específica a la disociación.
intermedio en la vía de disociación al que solo se puede acceder Neylon et al. (131) informaron, no obstante, de un gran efecto de la
cuando la helicasa se acerca desde la dirección permisiva (o no mutación R198A sobre la unión no específica, lo que condujo a una
permisiva). Una explicación simple para este comportamiento podría constante de velocidad de disociación inmensamente alta en su ensayo
ser que la helicasa, asentada como una taza sobre la cara de Tus que (en KCl 0,1 M). La dependencia de la longitud del ADN de los
bloquea la horquilla, impide físicamente la eliminación de los contactos parámetros cinéticos y termodinámicos para las interacciones ADN-
residuales que normalmente se interrumpirían al principio de la vía de proteína específicas del sitio se ha utilizado en varios casos para comentar sobre la
disociación. Sin embargo, esto no explicaría tan simplemente la importancia de las interacciones no específicas (16, 92, 168). Estos
polaridad de acción del complejo Tus-TerB contra las helicasas estudios han sido especialmente útiles para diseccionar el ensamblaje
diméricas, como Rep (106). o desensamblaje por etapas de complejos de ADN específicos de sitio
Si bien la ruta de disociación es difícil de sondear directamente, al con oligómeros de proteínas, pero no se han informado estudios
examinar la ruta de asociación en detalle puede ser posible definir similares con Tus u otras proteínas monoméricas de unión a ADN.
intermediarios que son desfavorecidos cuando la Los datos de sustitución de aminoácidos y nucleótidos también se pueden
enfoques replicasomas desde el lado no permisivo. Neylon et al. (131) explicado por el modelo de cremallera. Aquellos residuos que tienen
propusieron un modelo de varios pasos (cremallera) para la unión de un efecto mayor o diferente sobre la detención de la replicación de lo
Tus a ADN Ter basado en estudios SPR de Tus y Tus que se espera del cambio en la energía de unión juegan un papel en
mutantes Como mínimo, la proteína primero se une de manera no la cinética de unión o disociación. Un estudio exhaustivo de los efectos
específica al ADN antes de que entren en juego interacciones de las mutaciones en los residuos de unión al ADN proporcionará más
detalles
específicas, cerrando la estructura y provocando la deformación del ADN (Fig. 11). sobre cómo se lleva a cabo la unión/desunión gradual. La
Esto lo sugiere la observación de que Arg198 juega un papel importante estructura de solución de Tus sin ligando también sería muy útil.
en la unión inespecífica del ADN, pero tiene un papel relativamente Si un intermedio inaccesible en la vía de disociación es
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522 NEYLON Y AL.
similar al complejo entre Tus y ADN no específico
secuencias, entonces algunas de las discrepancias en los resultados de
También se pueden explicar los ensayos de helicasa. Una de las principales
diferencias entre los ensayos de diferentes grupos de investigación es el uso
de TerR2 en oposición a TerB. La unión a TerR2 es significativamente
más débil que la unión a TerB (54) y puede estar a medio camino entre
un complejo no específico "abierto" y un complejo Tus TerB específico
"cerrado" . Si este intermedio es más accesible, entonces
helicasas con diferentes modos de acción, como las implicadas
en la replicación en lugar de la reparación, se puede esperar que desplace
Tus más o menos eficientemente.
Dado que parece que bajo algunas condiciones experimentales, el
El complejo Tus-Ter es capaz de detener el progreso de la
helicasas hexaméricas replicativas de manera polar, pero no que
de las helicasas de reparación monoméricas o diméricas (o de círculo rodante)
(14, 91, 147), puede ser esclarecedor considerar las diferencias
en estructura y mecanismo entre estas dos clases de en
enzimas Estudios estructurales, por ejemplo, con el círculo rodante.
helicasas E. coli Rep y Bacillus stearothermophilus PcrA
mostrar que el sitio de separación de la cadena de ADN está dentro de un canal
en las estructuras proteicas (99, 116, 166). En cambio, dado que
Se cree que las enzimas hexaméricas funcionan mediante un mecanismo de
exclusión de cadenas, la separación de cadenas puede ocurrir justo en el
cara de la helicasa que se aproxima. Las interacciones funcionales de
las dos clases de helicasas con Tus-Ter podrían por lo tanto ser
bastante diferente: sólo con las helicasas hexaméricas podría enhebrarse
separación influyen en la interacción Tus-Ter antes de la
el progreso de la helicasa está físicamente bloqueado por colisión directa
de las proteinas Detención de la horquilla de replicación polar por el hexamérica
Entonces, las helicasas podrían explicarse por los efectos diferenciales de la
separación de hebras mediada por helicasa en la tasa de disociación de
el complejo Tus-Ter , dependiendo de si las hebras están siendo
separados en la cara permisiva o no permisiva. Si hebra
la separación era importante para determinar la polaridad, entonces la polaridad
no debe observarse en ensayos que miden la translocación de
helicasas en lugar de auténtico desenrollado del ADN. Tales ensayos
son técnicamente desafiantes.
Por lo tanto, es posible de varias maneras explicar la polaridad de
detención de horquilla de replicación en términos de un mecanismo que no
implica necesariamente cualquier interacción física directa entre
componentes replisómicos y el complejo de terminación. Sin embargo, existen
otros estudios que sugieren que tales
existen interacciones proteína-proteína. La evidencia funcional primaria es de
Andersen et al. (6), quien demostró que el Tus-Ter
complejo es un bloque mucho más eficiente para la bifurcación de replicación
en E. coli que en B. subtilis y que lo contrario es cierto,
en menor medida, de la terminación de la replicación de B. subtilis
sistema. Esto sugiere que un elemento de la detención de replicación
proceso es específico para el complejo Tus-Ter y la E. coli
replico
Además, como se ha descrito anteriormente, existen otros informes recientes
que proporcionan pruebas tanto directas (127) como indirectas (59) de
interacciones proteína-proteína. Los efectos de dos mutaciones L1,
E47Q y E49K, sobre unión al ADN, detención de la replicación y
la unión a DnaB es consistente con un papel para Tus-helicase
interacciones, y la conservación evolutiva preferencial de
Los residuos en la cara de Tus que bloquea la horquilla sugieren interacciones
entre Tus y el replisoma. Más estudios sobre
se requiere la naturaleza y la fuerza de la interacción Tus-DnaB. Observamos
que el par de bases GC6 conservado de sitios Ter ,
MICROBIOLÓGICO. MOL. BIOL. RVDO.
que cuando muta afecta la detención de la horquilla de replicación más
profundamente que la unión al ADN (30), se coloca en la cara no permisiva del
complejo cerca de los residuos en el bucle L1 de
Tus (incluyendo Glu49). Esto puede indicar la existencia de una nueva
tipo de interacción de GC6 y L1 en alguna etapa de un proceso
de la disociación del complejo Tus-Ter promovida por helicasa .
También hay otros componentes replisómicos que podrían ser
involucrado. La subunidad de la holoenzima de la ADN polimerasa III es
el centro organizacional de la replicasa, coordinando y
vinculando físicamente las acciones de las dos polimerasas de horquilla de
replicación y DnaB (50, 51, 94, 107, 118). En ausencia de
estas interacciones, el progreso tanto de la helicasa como de la
la replicasa está retardada (93). Es tentador, simplemente por razones de
elegancia, para sugerir que Tus podría interrumpir la interacción de y DnaB
para desestabilizar el replisoma, lo que lleva a la disociación
de DnaB. La polimerasa podría entonces continuar extendiendo el
hilo principal, deteniéndose cuando entra en contacto con Tus. En
De hecho, Tus podría incluso competir por su sitio vinculante en
ADNB. Interacciones adicionales de Tus con componentes replisómicos, si
existieran, también contribuirían de alguna manera a
explicando las discrepancias tanto entre los ensayos como entre los
resultados vivo e in vitro, así como la especificidad de especie observada por
Andersen et al. (6).
La cuestión de las mediciones de la unión al ADN es un tema importante
una. Varios grupos de investigación han medido las constantes de disociación
de equilibrio y las tasas de asociación y disociación.
constantes en diferentes sistemas experimentales. En la mayoría de los casos sólo
se ha examinado la unión a fragmentos de ADN Ter específicos.
Las longitudes y secuencias de estos fragmentos también varían entre
laboratorios. Si, como se sugiere, vinculante para no específicos y Ter
El ADN involucra diferentes grupos de residuos, y si estos juegan
diferentes roles en el proceso de detención de la replicación, entonces las
diferencias entre estos ensayos crean un problema significativo en
Interpretacion de datos.
Claramente se necesita hacer más trabajo. Las herramientas para examinar
y diseccionar interacciones proteína-proteína o ADN secundario
estructura están disponibles y deben aplicarse a la
problema. Estudios cinéticos detallados de la competencia entre
Tus y DnaB para el ADN, combinados con experimentos de entrecruzamiento,
deberían brindar información sobre el proceso de replicación.
arrestar. Examen detallado y completo de los efectos.
de mutaciones en los procesos de asociación y disociación
proporcionar más pistas sobre los eventos que precedieron a la eliminación de
Tus o la helicasa del ADN. También se debe prestar atención
reenfocado en el enfoque de DnaB desde el extremo permisivo de
el complejo. El proceso por el cual DnaB elimina Tus de
el ADN ha recibido poca o ninguna atención a pesar del hecho
que la comprensión de la polaridad de la acción antihelicasa depende
críticamente en la comprensión de cómo la helicasa supera la
barrera al trasladarse en esta dirección.
Los estudios estructurales de la proteína libre y de los complejos abiertos
de proteína-ADN y Tus-Ter de tamaño completo cerrados proporcionarían una
vista helicasa del complejo a medida que se aproxima. los
La dinámica del complejo Tus-TerB versus el complejo Tus-TerR2 puede
proporcionar pistas importantes sobre los factores que conducen a la
diferencias observadas experimentalmente entre ellos. Las simulaciones
podrían proporcionar pistas sobre la dinámica molecular que se produce
dentro de los distintos complejos. Otro requisito importante
es un examen detallado de los efectos del complemento proteico sobre la
replicación in vitro y los ensayos de helicasa. Está claro que
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VOLUMEN 69, 2005 Tus Y TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN DEL ADN 523

algunos de los elementos del proceso in vivo pueden faltar en los
ensayos in vitro.
Se puede esperar que una mayor disección molecular del
complejo Tus-Ter , el complejo helicasa-ADN, el replisoma y las
interacciones entre ellos finalmente revelen los detalles de este
fascinante proceso. Finalmente, observamos de paso que la
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