Determinación de cafeína en bebidas por cromatografía líquida de alta eficiencia

Prof. Yaned Milena Correa Navarro. Departamento de Química, Universidad de Caldas

Introducción

La Cromatografía es un método de separación ampliamente empleada en el análisis químico, esta es,

probablemente, la herramienta más potente y versátil a disposición del analista moderno; en un solo
proceso se puede separar una mezcla en sus componentes individuales y proporcionar al mismo tiempo
la estimación cuantitativa de cada componente. Las muestras pueden ser gaseosas, líquidas
o sólidas y puede variar en complejidad desde una simple mezcla de dos analitos a una mezcla de
múltiples componentes con amplia variabilidad química. Además, el análisis puede llevarse a cabo, en
un instrumento muy costoso y complejo, o sobre una placa de capa fina, simple y de bajo costo.

La cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) es la técnica en la que se utiliza una fase estacionaria
sólida, la cual al interaccionar con la fase móvil líquida, genera diferentes fuerzas que permiten la
separación de los diversos analitos que componen la muestra. Con este tipo de cromatografía se puede
trabajar una gran variedad de muestras, dado que no tiene limitaciones por estabilidad térmica ni
volatilidad de la muestra; por tal razón, se pueden ver aplicaciones diversas, tales como, separaciones
de: macromoléculas, productos naturales, carbohidratos, pesticidas, contaminantes, saborizantes,
colorantes, entre muchos otros. Posterior a la separación, los compuestos pueden ser identificados
comparando los tiempos de retención obtenidos, con sustancias estándar eluídas bajo iguales
condiciones cromatográficas (figura 1). Al igual que en otros métodos, después de la tipificación de los
picos obtenidos en el cromatograma, se pueden cuantificar los compuestos caracterizados; este análisis
se puede realizar mediante la construcción en el software del equipo, de una curva de calibración con
estándar externo o interno (figura 2), y posterior a esto se compara el área del pico del compuesto
problema con la curva de calibración.

Figura 1. a) cromatograma de una muestra; b) cromatograma de un estándar.

Figura 2. Cromatogramas de un estándar a diferente concentración y curva de calibración para el análisis
cuantitativo.

La cafeína es una de las moléculas más consumidas en el mundo, sus efectos estimulantes
son conocidos y esto sin duda contribuye a su popularidad. Es una sustancia presente en muchos
alimentos, como el café, el té y las bebidas colas y/o en diferentes productos farmacéuticos tales como
analgésicos y descongestionantes. Este tipo de analitos son fácilmente detectables por
espectrofotometría de ultravioleta-visible, pero por cromatografía líquida de alta eficiencia se
desarrollan mejores análisis.

OBJETIVOS

➢ Aprender el manejo de un cromatógrafo líquida de alta eficiencia (HPLC).

➢ Determinar la concentración de cafeína en bebidas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales
➢ Balones volumétricos ➢ Plancha de calentamiento
➢ Balanza analítica ➢ Viales
➢ Beacker
➢ Cromatógrafo líquido de alta Reactivos
eficiencia ➢ Agua ultra-pura
➢ Filtros de muestra ➢ Bebidas
➢ Filtros para solvente ➢ Cafeína
➢ Jeringa ➢ Metanol
➢ Pipetas

Requisitos Pre-práctica:
Escribir los cálculos para preparar 100 ml de una solución madre de cafeína 100 mg/l,
comenzando con cafeína sólida. Luego, calcular cada uno de los estándares listados en la sección
de procedimiento de laboratorio, a partir de esta solución madre.

Procedimientos de Laboratorio
Preparación de estándares de calibración de 5 ml
1. Preparar estándares de cafeína de 10, 20, 40, 60, 80 y 100 mg/l en metanol-agua
(70-30).
Preparación de la muestra
1. Calentar 10 ml de la bebida a trabajar, en un Beacker sobre una plancha de calentamiento
durante 5 minutos, esto para expulsar el CO2. (No hervir)
2. Tomar 1 ml de la muestra desgasificada y fría, y llevarlos a un balón volumétrico de 25 ml;
aforar con metanol-agua (70:30)
3. Filtrar la muestra a través de un filtro desechable para muestra de 0,45 µm de poro.
4. Guardar la muestra en un vial apropiado para usar en el HPLC

Elaboración del método de trabajo en el HPLC

1. Encender el detector de ultravioleta-visible, el compartimiento para la columna; el inyector
automático y la bomba, en cualquier orden, presionando el botón de encendido localizado en el
extremo superior izquierdo de cada uno de los módulos mencionados.
2. Encender el computador y abrir el programa Chromeleon para manejar de manera remota el
HPLC, esperar y seleccionar la ventana create, de esta se despliegan una serie de opciones,
eligiendo aquella que dice instrument method para generar el método a trabajar.
3. Abrir la válvula de purga de la bomba, encender la bomba desde el software y seleccionar la
función de purga; posteriormente limpiar las líneas en las que se han depositado los solventes a
trabajar: esto es permitir el paso de solvente de los canales a purgar a un flujo de 5ml/min durante
5 minutos, el objetivo es eliminar burbujas y trazas de otros sistemas que hayan sido usados
previamente; luego se desactiva la función de purga y se cierra la válvula.
4. Escribir los parámetros con los cuales se realizarán la corridas en el cromatógrafo: flujo y
composición del sistema, tiempo de corrida, presión límite de trabajo, temperatura del horno de la
columna, sistema de detección, volumen de inyección, entre otros; si el método ya existe,
seleccionarlo y cargarlo de la lista de métodos guardados.
5. Observar en la ventana en la que se registra el cromatograma si el equipo está estable para
iniciar el trabajo, esto será cuando la línea base no varíe y este cercana a cero. Generalmente se
debe dejar pasar fase móvil durante 10 minutos con el fin de acondicionar la columna y
estabilizar la línea base. Este proceso se verifica haciendo monitoreo de la línea base (monitor
baseline) y ajustando a cero con el botón autozero del software.
6. Crear una secuencia dando clic en la parte superior de la ventando create y seleccionar la
opción sequence. Los parámetros que se deben colocar aquí son: nombre de la muestra, tipo de
muestra, posición del vial, volumen de inyección y se debe cargar el método con el cual se va a
trabajar (el que se creó inicialmente).
7. Dar la orden de inyección cuando el equipo este estable y se tenga seguridad de que todos los
parámetros cromatográficos sean óptimos.

NOTA 1: Tener presente que en los diferentes módulos del equipo hay tres bombillos que con
colores indica el estado del equipo así: Azul: power (encendido-apagado), Amarillo: connected
(equipo con los módulos conectados apropiadamente), Amarillo-Rojo: Status (estado del equipo).

En la práctica a realizar el método será:

Columna: Restek C18 (100 x 2.1 mm; 5um)

Temperatura del horno de la columna: Ambiente
Fase móvil isocrática: Metanol-agua (70:30)
Flujo: 0,2 ml/min
Tiempo de corrida: 10 minutos
 Volumen de inyección: 20 ul
Detector ultravioleta: 260 nm

Para obtener buenos resultados, el análisis debe ser ejecutado por triplicado y luego los datos
deben ser analizados estadísticamente.

NOTA 2: Los solventes a trabajar deben ser grado HPLC y antes de ser depositados en las
botellas respectivas, deben ser filtrados a través de membranas apropiadas.

Cuantificación

Para la cuantificación se realizará una curva de calibración de 5 puntos, en la que cada nivel será
inyectado tres veces. Luego se realizará el procesamiento de los datos en el software del equipo,
quien a partir del área de los picos de cada concentración de cafeína obtendrá la curva de
calibración. Posteriormente, por comparación de los tiempos de retención de la cafeína y de cada
una de las muestras, se identificará el pico de cafeína de las muestras; finalmente el área de este
pico será interpolada en la curva de calibración y se obtendrá la información de la cantidad de
cafeína en las bebidas analizadas.

NOTA 3: Al finalizar el trabajo la columna debe dejarse en metanol para almacenarse.

Preguntas

1. Dibujar los principales componentes de un HPLC y describir la función de cada una de sus
partes.
2. Hallar la concentración de cafeína en su muestra
3. Definir los términos elución isocrática y en gradiente.
4. Escribir algunas ventajas de la cromatografía líquida de alta eficiencia sobre la cromatografía
de columna abierta.
5. ¿Qué pasará si hay burbujas en el equipo de HPLC?.
6. Describir dos análisis llevados a cabo en la industria alimenticia que empleen HPLC.

Bibliografía
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