PRODUCCIÓN DE ENZIMAS

CATEDRA DE BIOINGENIERÍA

PROFESORES: DR. SILVIA ALONSO

LIC. MIRIAM CABANA

ALUMNO: GUTIERREZ, ESTELA ANAHÍ

2016
 PRODUCCIÓN DE ENZIMAS

La constante aplicación de las enzimas en la industria ha conllevado a una producción que

garantice abastecer las necesidades requeridas buscando una producción a menores costos y una
producción más específica lo que garantizaría la pureza considerable de la enzima. La utilización de
enzimas se ha dado desde siglos en la industria de la fermentación como en la cerveza, vino pan y
queso, sin conocerse el porqué de su modo de acción, ni mucho menos el porqué de su actividad
catalítica. En el siglo pasado Takamine patentó la amilasa producida por fermentación de un
hongo y Hasen en 1875 inicio una empresa para la extracción de renina de ternera, iniciando así
una nueva rama de la bioquímica la ingeniería enzimática.
Tradicionalmente las enzimas fueron extraídas de plantas y animales, se estima además que el
75% de las enzimas fueron obtenidas por vía microbiana, y el 25% restante se obtienen de origen
vegetal.

En la actualidad se producen comercialmente los siguientes enzimas:

1.- Enzimas utilizados en la industria como amilasas, proteasas, catalasas, isomerasas y penicilina
acilasas.

2.- Enzimas utilizadas con propósitos analíticos como la glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, alcohol
deshidrogenasa, hexoquinasa, muraminidasa y colesterol oxidasa.

3.- Enzimas utilizadas en medicina como la asparraginasa, proteasas, lipasas y estreptoquinasa.

Estas tres áreas de aplicación requieren niveles variables de calidad y cantidad. En base a
toneladas, las más importantes son las enzimas industriales que se producen en fermentadores de
120 m3, mientras que en las enzimas producidas para propósitos analíticos o médicos se utilizan
fermentadores de planta piloto. Todos los enzimas producidos en grandes cantidades, salvo la
glucosa isomerasa y la invertasa, son extracelulares.

ENZIMAS

Las enzimas, los llamados, catalizadores de la vida, son sustancias de alta especificidad que
permiten que las reacciones biológicas, normalmente poco probable, se realicen y permitan el
continuo movimiento y avance de las reacciones vitales. Podría decirse que son las moléculas
dadoras de vida, que han permitido la evolución de las especies a lo largo de los años.

El nombre de enzima es de origen griego(en: dentro + zymée: fermento), y su uso es relativamente

reciente, apenas desde la primera mitad del siglo XX(2). Básicamente, una enzima es una molécula
de proteica cuya estructura le permite ligarse a una clase específica de compuestos(sustratos)
modificarlos, permaneciendo ella con la misma estructura una vez se ha finalizado la unión con los
sustratos. Por ello, desde el punto de vista estricto, es un catalizador, ya que no se consume
durante la reacción y al final de ella permanece invariable, tal y como se alimento al inicio.
Las enzimas cumplen una gran variedad de funciones biológicas. La formación de proteínas,
carbohidratos y lípidos es un ejemplo. Son a la vez degradados y reconstruidos por otras
reacciones enzimáticas, produciendo energía a una velocidad adecuada para el organismo, sin el
gasto energético que exigen los métodos químicos de laboratorio. Se dividen en diferentes grupos,
mencionados a continuación(1).

1. Oxido-reductasas: Sus funciones están básicamente relacionadas con las reacciones de oxido
reducción de los organismos. Se encuentran muy comúnmente en reacciones metabólicas. Existen
dos subgrupos principales dentro de ellas: Las Deshidrogenasas y las Oxidasas.

2. Transferasas: Las enzimas de este tipo permiten el cambio de grupos específicos de una
molécula a otra. Su nomenclatura se basa en el sustrato que emplean y en el aceptor final.

3. Hidrolasas: Este grupo de enzimas permite romper moléculas de alto peso molecular,
haciéndolas reaccionar con moléculas de agua. Con este método pueden romper enlaces
peptídicos, glicosídicos o estéricos. La mayoría de enzimas gástricas son de este tipo.

4. Isomerasas: Realizan modificaciones en una molécula, cambiando su conformación molecular,

ya sea como isómero óptico, funcional o de otro tipo.

5. Liasas: Estas moléculas rompen enlaces carbono-carbono, carbono-oxígeno, carbono-nitrógeno

y carbono-azufre.

6. Ligasas: Permiten la unión de dos moléculas, valiéndose de la energía obtenida por la

degradación de ATP. Generalmente crean enlaces carbono-carbono, carbono-oxígeno, carbono-
nitrógeno y carbono-azufre.

Son las enzimas que permanecen asociadas con la célula y no son normalmente excretadas al
medio. En algunos casos, como en el caso de lipasa e invertasa, el que la enzima sea intracelular o
extracelular depende del microorganismo utilizado.
Pocas enzimas intracelulares son producidas a gran escala y las ventas de estas enzimas
representan solo un pequeño porcentaje del total de ventas. Sin embargo, la producción de
enzimas intracelulares es de gran interés por varias razones. Con los avances en las técnicas de
inmovilización, el uso de enzimas y células inmovilizadas está en aumento. Por ejemplo, se han
establecido procesos comerciales para la producción de jarabes de fructosa usando glucosa
isomerasa.

Enzimas Extracelulares

Los microorganismos producen una amplia variedad de enzimas potencialmente útiles, muchas de
las cuales son excretadas al medio. La mayoría de las enzimas extracelulares son producidas por
organismos pertenecientes a dos géneros: Bacillus y Aspergillus. y que en su mayoría son del tipo
hidrolítico.
Estabilidad de las Enzimas

La frágil naturaleza proteica de las enzimas, que conlleva a una estabilidad limitada de su
estructura y funcionalidad, constituye un aspecto importante en un contexto tecnológico. Se
considera que una enzima es apropiada para una aplicación comercial, si su estabilidad es
suficiente para dicha aplicación.

Las enzimas se obtienen por fermentación en cultivos semi-sólidos, sumergidos, extracción de

tejidos ya sea en plantas o animales bajo condiciones controladas.
Unas 20 compañías de Europa, Japón y Estados Unidos realizan la producción de enzimas, pero el
mercado es dominado por 3 de ellas: Novo Nordisk (Dinamarca) con el 50% de las ventas a nivel
mundial, seguida por Gist Brocades (Neatherlands) y Rhom and Haas (Alemania). El mercado de las
enzimas ha tenido gran crecimiento desde los años 70 y este ha sido paralelo con el desarrollo de
un gran número de aplicaciones en la industria alimentaria.
En América latina existen empresas productoras de enzimas en México, Brasil, Argentina y
Uruguay, muchas de las cuales son subsidiarias de empresas transnacionales, como es el caso de
Pfizer en México y Brasil y Novo en Brasil.
En Colombia no hay producción de enzimas a escala industrial, siendo importadss de diversos
países de Europa, también de Japón, Estados Unidos, Canadá y México.
La importación de enzimas en Colombia se hace en su mayor parte a través de representantes o
casas comerciales pero algunas industrias de cervecería, molinería y lácteos hacen importación
directa de las enzimas que requieren.

La Elaboración

Uno de los primeros desarrollos que se iniciaron para las enzimas fue su obtención y purificación.
Se conocían especies cuyas estructuras permitían que, al estar en contacto con el sustrato,
lograsen elaborar una amplia variedad de productos, beneficiosos y útiles para el hombre. Con el
descubrimiento de Buchner, se abrió la puerta para la obtención de nuevas tecnologías.
Empleando distintos métodos de purificación es posible obtener altas concentraciones
enzimáticas, que permiten una mejor comercialización de la enzima para usos industriales.

La industria de carnes es la fuente principal de las enzimas derivada del páncreas, estómago e
hígado de los animales. Las enzimas de fuentes microbiológicas (Bacterias, Hongos y levaduras) se
producen en la industria de la fermentación. (3) Tabla 1 ejemplifica algunas de las fuentes de
enzimas.
Fuentes de enzimas diversas

Enzima Fuente
a-amilasa Páncreas bovino-porcino
Lisosima Albúmina de huevo
Fosfolipasa Páncreas porcino
Tripsina Páncreas bovino-porcino
Quimiotripsina Páncreas bovino-porcino
Pepsina Mucosa porcina
Renina Bovinos
b- amilasa Grano de cebada
Peroxidasa Raíz de rábano
Papaina Leche de papaya
Amilasa Bacillus Subtilis, Aspergillus Níger, Aspergillus cryzae
Penicilinasa Bacillus Subtilis
Invertasa S. Cerevisiae, Aspergillus cryzae
Celulasa Aspergillus Níger, Trichoderma sp.
Pectinasa Clostridium sp.

Básicamente, para estas industrias los cultivos celulares son la mejor opción en cuanto a
elaboración de enzimas. Una vez estos cultivos celulares se encuentran maduros, se procede a la
“cosecha” de los mismos. Para la industria de elaboración de enzimas es necesario entonces el
desarrollo de tecnologías y procesos de separación eficientes, que den lugar a enzimas de alta
pureza y que a la vez obtengan mejores rendimientos de enzima por sustrato empleado.

Para extraer las enzimas de las células que las contienen, a menudo es necesario dividir finamente
el tejido, por medio de un homogeneizador o una licuadora; técnicas más modernas tales como el
ultrasonido, auto lisis y congelamiento- descongelamiento se emplean también. Uno de los
métodos de purificación de enzimas es la cristalización de las mismas. Primero se cambia el pH,
con lo que se retiran algunas proteínas, o se emplean solventes orgánicos que separen diversas
proteínas. A veces se emplean también columnas de cromatografía que permiten la obtención de
distintos sueros, con diferentes concentraciones de enzimas. Una vez se obtienen estos licores, se
cristalizan en repetidas ocasiones, lo que da como resultado un cristal enzimático de buena
actividad específica.

OBTENCIONES DE ENZIMAS ESPECÍFICAS

Las enzimas están presentes en las células, por lo cual resulta conveniente la obtención de estas a
partir de tejidos animales y tejidos vegetales, el procedimiento consiste en la trituración de tejidos
especializados, ya sea el páncreas o el hígado, formando así una papilla que se tratará con un
solvente a baja temperatura, agua, acetona (-20°C), glicerina o alguna solución salina, asegurando
así la extracción. (Ver figura 1.)

La tendencia industrial ha variado en las últimas décadas, reemplazando la obtención a partir de

tejidos animales o vegetales por cultivos de microorganismos seleccionados que generan la
enzima específica, para poder considerar el procedimiento industrial es necesario comprender las
diferentes etapas. La selección del microorganismo adecuado para proceso debe cumplir unas
características específicas. Los microorganismos no deben de ser patógenos, ni estar asociado a la
producción de toxinas, por ello existe una reglamentación establecida, FDA (Food and Drug
Administration), que consideran a una enzima producida por un microorganismo generalmente
reconocido como segura (GRAS), si no cumple las medidas establecidas dicha enzima es
catalogada como un aditivo, lo cual se penaliza con retrasar la aplicación de un nuevo desarrollo
de 5 a 8 años.[1]en la tabla 1 se muestran una lista con ejemplos de microorganismos GRAS.
 TABLA 1

Otra característica importante en principio es preferible que la enzima producida sea

extracelularmente, lo que garantiza una producción más específica de la enzima; un extracto de
enzima intracelular, contiene al menos 1500 enzimas y proteínas, mientras que el de una enzima
extracelular contiene solo unas cuantas. Conviene señalar que la aplicación de esta característica
permite tener en cuenta el interés enzimático, evitando también una costosa etapa de
recuperación y purificación. Para la obtención de altos rendimientos de enzimas es necesario
también algún tipo de mutación por rayos UV o agentes nitrogenados, también se debe garantizar
un crecimiento rápido del microorganismo generando así una reducción razonable en los costos.
Está claro además que la selección del microorganismo puede hacerse igualmente en términos de
la enzima deseada.

Mecanismos de Biosíntesis

La síntesis de enzimática puede controlarse según el interés que se tenga. La existencia de diversas
formas de regulación ha permitido el desarrollo de sistemas de alta productividad, no solo a través
de procesos de mutación, sino también mediante el manejo del medio en que se encuentre el
microorganismo; los mecanismos de inducción y de represión representan al manejo del medio de
crecimiento del microorganismo. La mayor parte de las enzimas comerciales son inducibles, es
decir que requieren un sustrato para su síntesis, este sustrato común mente es denominado
iniciador. Según el modelo de Jacob y Monod[5] el inductor permite la síntesis de la enzima al
unirse con el represor que bloquea al gene operador impidiendo su transcripción. En la tabla 2 se
citan algunos ejemplo de enzimas inducibles.

Los mecanismos de represión en la síntesis de enzimas permiten la inhibición de la síntesis de

alguna enzima específica, generalmente inducibles, este proceso es denominado represión
Catabólica, Un mecanismo menos frecuente de inhibición lo constituye la retrorrepresión,
mecanismo mediante el cual la síntesis de enzima se ve reprimida por la presencia de productos
finales de biosíntesis, en la tabal 3 se muestran ejemplos de de enzimas sujetas a represión
catabólica.

La productividad enzimática se puede mejorar también a través de un mejoramiento genético,

para evitar algunos de los problemas mencionados por ejemplo si la enzima que necesitamos es
inducible, y el inductor es de costo elevado, la obtención de organismo mutantes con necesidades
reducidas o nulas de inductor podría ser la solución al problema, si la enzima está sujeta a
retrorrepresión, el evitar la presencia de productos finales en el medio de cultivo garantizaría que
este fenómeno no se presente, la eliminación de los productos finales se puede hacer mediante
diálisis o ultrafiltración, o también la obtención de mutantes no sujetos a represión por productos
finales evitaría la retroprodución.

Características generales de los procesos de fermentación

Como parte fundamental del proceso vital de los microorganismos estos, creces, se reproducen, y
segregan productos bioquímicos complejos, en donde este último proceso es el de mayor interés.
La industria de procesos bioquímicos están relacionadas con la fermentación, desde el punto de
vista bioquímico, fermentación es el nombre dado usualmente a la clase general de cambios
químicos producidos en compuestos orgánicos (sustratos) por actividad de los organismos
vivientes. Los procesos de fermentación típicos se llevan a cabo esencialmente en recipientes
denominados fermentadores, que están controlados por efectores internos y externos, Los
efectores internos están representados por la dotación genética que posee el microorganismo
considerado y por su mecanismo de regulación metabólica, como ya se ha nombrado estos
factores pueden ser modificados genéticamente.

Los efectores externos, están caracterizados por su naturaleza física o química, los efectores
externos físicos están asociados a temperatura, agitación, aireación, presión, etc. Si hay una
variación de alguna de estas condiciones también existirá la existirá una variación notable sobre el
proceso de fermentación. Los efectos externos químicos están representados por pH,
componentes del medio de crecimientos, oxigeno.

Cabe señalar, que la eficiencia de la obtención de la enzima viene dada en función de los
efectores, tanto internos como externos, describamos los externos. El crecimiento del
microorganismo y la producción de la enzima deben regularse con los efectores externos, si
regulamos la temperatura en la cual los microorganismos tienen un máximo de crecimiento
debemos también garantizar que la temperatura sea la adecuada también para la estabilidad de
una cierta enzima, lo conlleva a una optimización con objeto de encontrar la temperatura de
proceso adecuada para una máxima producción y preservación de la enzima durante la
fermentación. Por lo que es común encontrar temperaturas de máxima producción de enzimas
inferiores a las de máximo crecimiento del microorganismo. Por ejemplo podemos citar un caso
interesante como el de la α-amilasa de Bacilluscoagulans: la enzima producida a 55°C es de 9 a 10
veces más estable a 90°C que la enzima producida a 35°C, al final del proceso la temperatura es
disminuida rápidamente, en caso de producción de enzimas termolábiles[6]. En términos de pH es
necesario distinguir entre cuatro valores, que no necesariamente coinciden:

• El pH de máximo crecientito del microorganismo productor

• El pH de máxima producción de enzima
• pH de máxima estabilidad de la enzima
• El pH de máxima actividad enzimática

Además de favorecer el rendimiento de la producción de la enzima estos parámetros de pH

también sirven para evitar cambios que puedan afectar la actividad de la enzima, hay casos donde
no necesariamente estos parámetros puedan coincidir, por ejemplo la subtilisina de
Bacilluslicheniformises estable a un pH de 5 a10 unidades, y tiene una óptima actividad entre 9 y
11 unidades y la máxima producción se obtiene entre 6.5 y 6.8, [6], Por otro lado es interesan ver
que aunque no sea estrictamente un método de purificación, existen tratamientos térmicos y de
pH que son aplicados al final de un proceso fermentativo con el fin de eliminar actividades
enzimáticas contaminantes menos estables que la enzima de interés.

La influencia de los efectores internos y externos sobre el comportamiento de una célula

microbiana se puede representar esquemáticamente como la muestra la figura 2.
Esquema general de los procesos industriales

En la figura 3 se representa gráficamente cada uno de los aspectos que requiere el proceso
industrial, existen 4 etapas: primero está la propagación de cultivos, esta etapa inicia en el
laboratorio y generalmente comienza en un tubo de ensayo que contiene el repique del
microorganismo de interés, en la segunda etapa se inicia la fermentación, con el material obtenido
anteriormente, se siembra en el tanque inocuolo, de este se pasa posteriormente al fermentador,
la tercera etapa comprende las operaciones y procesos de ceración y purificación de los
productos, estas etapas comprenden en forma general y sucesivamente:

a) Separación de insolubles por filtración, centrifugación, o decantación;

b) separacionesprimarias por extracción, absorción, adsorción, ultrafiltración;
c) purificaciónpor extracción líquidolíquido, o extracción a dos fases acuosas,o
cromatografíade afinidad, y finalmente
d) aislamiento del producto.

La etapa cuatro comprende el tratamiento deefluentes: si bien no tiene una relación directa con el
producto, que es la razón de ser de la industria de fermentación, representa una etapa
imprescindible porque es fundamental controlar la calidad del efluente que sale de la fábrica y que
es enviado generalmente a un curso de agua, sea un canal, arroyo, un río o al mar. En la figura 4
también se representa un esquema más detallado.
Algunos ejemplos de producción industrial de enzimas
Amilasas

El almidón, polímero de glucosa, es después de la celulosa el polisacárido más abundante en la

naturaleza y materia prima para una gran diversidad de productos de la industria alimentaria.
Existen diversas enzimas involucradas en su formación y constituyen probablemente el sector
alimentario de mayor desarrollo en los últimos 15 años en lo que a tecnología enzimática para el
sector alimentario de refiere. A continuación se describen las principales características de
amilasas de origen microbiano

• α-amilasa

Son producidas principalmente por bacterias y hongos y pueden ser clasificadas por su actividad:
licuefacción o sacarificación. En el segundo caso se llegan a producir cantidades importantes de
azucares (glucosa, maltosa y maltotriosa), mientas que en el primero se desdobla el almidón,
disminuyendo rápidamente la viscosidad, formando maltohexosa como producto más pequeño.
En e general Bacillus es la fuente bacteriana de mayor importancia comercial de dos de ellos: B.
amyloliquefaciens y B. licheniformis. La enzima del primero fue la primera en aparecer en el
mercado, mientas que la alfa amilasa de b. licheniformis es actualmente la mas empleada por su
alta termoestabilidad.

Pectinasas

Por pectinasas se denominan a un complejo de enzimas que se clasifican de acuerdo con el

sustrato (pectina o ac. Péctico), del tipo de reacción y del mecanismo, incluyéndose además a la
pectinesterasa. Los productos comerciales provienen generalmente de Aspergillus niger.

Celulasas

La celulosa es rápidamente hidrolizada en la naturaleza por organismos aeróbicos del suelo,

particularmente por los hongos que degradan la madera. Los organismos anaeróbicos del rumen y
del intestino son responsables de la digestibilidad de la celulosa en los animales rumiantes y en los
herbívoros.

Invertasa

Hidrolizan el residuo terminal no reductor de b Dfructofuranósidos. El principal sustrato es la

sacarosa,pero también pueden hidrolizar rafinosa para dar fructosay melibiosa. La enzima también
tiene actividadfructotransferasa. El pH óptimo es 4.5, pero se logra un 80% de actividaden el rango
entre 3.5 . 4.5. Tienen actividad máximaentre 50-60 0C. El efecto de la concentración de
sustratoes de particular relevancia, ya que la máxima actividadse logra con concentraciones de
sacarosa del 5-10%. A concentración de sacarosa del 70% la actividad es solo de 25% del máximo.
La invertasa es de gran importancia en la industria dealimentos porque la hidrólisis de la sacarosa
forma jarabesmás dulces, los monosacáridos formados por laacción de la invertasa son más
solubles que la sacarosay por lo tanto no cristaliza en los jarabes concentrados.

PRODUCCION DE ENZIMAS

AMILASA
Elaboración de enzimas de origen microbiano

Actualmente la tendencia industrial es el reemplazo de muchas enzimas provenientes de tejidos

por aquellas que resultan de la aplicación de cultivos de microorganismos seleccionados, que
generan la enzima específica. La producción de enzimas por microorganismos tiene la ventaja de
su costo, generalmente menor, y por realizarse en un periodo relativamente breve: Por ejemplo, 1
a 5 días en el caso de una fermentación discontinua por lotes ("batch"). Además, se puede
incrementar el rendimiento de una enzima especifica por un determinado organismo, recurriendo a
modificar sus condiciones ambientales, o bien, a formar por vía genética cepas mutantes, en las
cuales la producción de la enzima puede ser varias veces superior que en la cepa original.

De este modo procesos de selección, adaptación y mutación han mejorado considerablemente la

producción de enzimas a partir de microorganismos.

Las enzimas elaboradas industrialmente son por lo general del tipo degradativo y extracelular, es
decir, que son excretadas al medio por el microorganismo que las genera; pues entonces no
precisan de la ruptura de las células microbianas para su extracción como es necesario en las
enzimas intracelulares de biosíntesis.

La elaboración de enzimas de origen microbiano comprende diferentes etapas:

1) Selección de microorganismos: Se empieza generalmente por un cultivo de

enriquecimiento de la cepa seleccionada. Cultivos originales pueden obtenerse de la firma
American Tipe Culture Collection (ATCC), del Northern Utilization Research Branch o de
otro organismo o instituto reconocido.

2) Cultivo: Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan utilizarse como
medio de cultivo varían naturalmente según la enzima por elaborar y pueden ser de los
siguientes orígenes.

a) Materias azucaradas o amiláceas, como melaza, jarabe de glucosa, almidones y afrechos de

trigo, arroz o maíz;
b) Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de pescado, caseína, gelatina y afrechos
de extracción de semillas oleaginosas;
c) Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea;
d) Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como, extractos y autolizados de
levadura, sales minerales con inclusión de elementos trazas y eventualmente vitaminas.

Fuera de la composición del medio constituyen parámetros importantes que deben controlarse en
el cultivo, las condiciones óptimas del caso, en cuanto a temperatura, pH, aereación (para
suministrar el oxígeno necesario y evitar exceso de calor de reacción), y velocidad de agitación.
En lo que se refiere a los reactores para realizar la fermentación se distingue entre los cultivos en
superficie de medios líquidos o semisólidos, usándose ya sea sartenes o tambores rotatorios, y
cultivos en profundidad, actualmente más usados, mediante tanques agitados, de lecho fijo o de
lecho fluidizado (partículas suspendidas y agitadas, lo que facilita su mezcla y circulación) (10, 17).

Terminada la incubación del proceso fermentativo se separa la biomasa junto con el resto de las
células y los componentes sólidos del medio de cultivo por filtración o centrifugación. El líquido
resultante, generalmente aún bastante heterogéneo, puede utilizarse directamente como
preparado enzimático; Pero, generalmente, se somete a una purificación y/o aislamiento
posteriores, que comprenden diferentes fases y que pueden aplicarse igualmente en las enzimas
de origen vegetal o animal.

PURIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE ENZIMAS.

Sin perjuicio que un preparado enzimático puede consistir en el mismo extracto o caldo fermentado
que sólo se somete a una clarificación y concentración (preparado liquido) o desecación
(preparado sólido) se recurre también a métodos de aislamiento y purificación de enzimas en gran
escala, lo cual se logra principalmente por los siguientes procesos:

a) Adsorción selectiva con hidróxidos de hierro o aluminio coloidales, a cierto pH, pues no
todas las proteínas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida se lava con
agua o solución salina y luego sé eluye a pH diferente, generalmente alcalino mediante
otra solución salina, por ejemplo, de fosfato.

b) Por precipitación, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad hasta el
punto en que precipitan. Esto se logra por adición de sales a cierto pH y a elevada
concentración iónica o por solventes orgánicos (alcohol, acetona, isopropanol) a baja
temperatura. La sal más usada es el sulfato de amonio por su alta solubilidad, bajo costo,
alta atoxicidad para la enzima y por no afectar mayormente la viscosidad de la solución.

c) Diálisis por gradientes de concentración a través de membranas semipermeables.

d) Ultrafiltración por aspiración o presión a través de membranas de porosidad fina como

tamiz molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas, pues no hay
cambio de fases, ni altos gradientes de temperatura.

e) Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidón, agar o dextrano.

f) Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina, como en

columna con intercambiadores iónicos, geles o tamices moleculares.

Combinando estos procedimientos con otros a base de electroforesis de alta tensión, cataforesis y
electrodiálisis se logran actualmente separaciones de mezclas complejas de enzimas.

El control de todas estas etapas en su forma más rigurosa, es necesario para asegurar el máximo
de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de los productos enzimáticos obtenidos.

A modo de ejemplo se considera la producción de amilasa por el método de bandeja. Donde se

desarrollara el correspondiente cuadro y el sistema del proceso.
También para una mejor comprensión se anexa la producción de α-amilasa per el método de
FERMENTACION PROFUNDA, ya que este es el más utilizado a escala industrial. Los métodos de
Tambor y en bandejas con sustratos líquidos no se tratan, debido a que el primero produce una
destrucción del micelio y el otro es para bacterias.

Fermentación Profunda

Obtención de α-milasa

De origen fúngico: se selecciona cuidadosamente y se mantiene una cepa mutante de Aspergillus

oryzae, hasta alcanzar el pleno desarrollo pasa por tres etapas de transferencia. El medio, cuyo pH
pasa de 6 a 8 durante las 160 horas de fermentación, contiene almidón soluble, productos solubles
de destiladores y nitrato. A lo largo del proceso es airado a fondo, tomando las precauciones
debidas para evitar una infección, ya que en este tipo de operación no existe ninguna “sombrilla
de antibióticos”. El fuerte micelo se separa y lava, y el líquido se pasa por un filtro grosero; una vez
enfriado, se clarifica en un filtro Seitz y luego se concentra bajo vacío, a una temperatura inferior a
55°C, hasta un sexto de su volumen. Por último, la proteína activa se precipita con acetona, se
separa por centrifugación y se seca bajo vacío, después de los cual se muele y mezcla con relleno
de almidón hasta una actividad standard.

CONCLUSION

• Respecto a los procesos de obtención de enzimas, el fermentativo tiene una serie de

ventajas sobre el de extracción de tejidos animales y vegetales; entre estas ventajas se
pueden mencionar, la alta velocidad de síntesis,, el elevado rendimiento de conversión de
sustrato
• Los microorganismos productores de enzimas no pueden ser patógenos y,
preferiblemente, deben excretar la enzima producida al medio de cultivo (enzimas
extracelulares)
• La Purificación de enzimas se puede llevar acabo por una serie de operaciones, entre las
que se pueden mencionar: la precipitación de la enzima por fuerza iónica (salado de
enzimas), precipitación por solvente orgánico miscible (liquidoliquido), separación por
ultra filtración, diálisis, y cromatografía de adsorción.
• Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se lleva a cabo en un
recipiente llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante el cual determinados
sustratos que componen el medio de cultivo son transforma dos por acción microbiana en
metabolitos y biomasa. El microorganismo va aumentando en su concentración en el
transcurso del proceso al mismo tiempo que el medio se va modificando y se forman
productos nuevos como consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas.
 Obtención de una mezcla de Enzimas Amilolíticos del Aspergillus oryzae (origen fúngico). Método de las bandejas

Inoculación con
Se humedece Esterilización una suspensión
una mezcla de Se extiende de esporos de
de la bandeja ENFRIAMIENTO
salvado y 10% sobre bandejas moho Aspergillus
in situ
almidón con vapor oryzae

Corriente de
aire húmedo
Solución de HCl (O2) y INCUBACION
Conteniendo termostatizado BIORREACTOR
trazas de
hierro, zinc y
30°C, 1° día
cobre
26°C, 4 días
restantes
TOTAL=5 días Obtención de
una espesa
masa miceliana

PURIFICACIÓN

Precipitación de la
OBTENCIÓN
enzima (con alcohol Extracción con
DE LA ENZIMA FILTRACIÓN
u otro disolvente agua
hidrófilo)
 METODO DE LAS BANDEJAS

Condiciones de
Clasificación de los reactores
Operación
M.O que
Sustrato Producto
Materia intervienen
de la de la Modo de Operación
Prima en la
Reacción Reacción N° de Presencia Sistema Tipo de Tiempo
reacción Temp pH
Etapas de O2 de Reactor Recirculación (días)
Alimentación
cultivo del producto
Salvado De
de trigo o Enzima Aspergillus Mono- Aeróbicos Suspen- bandeja 30°C 1
Almidón Batch no 6
arroz y Amilasa oryzae fásico obligados ción (medio 26°C 4
almidón solido)
BIBLIOGRAFIA

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D.F. 2004, pág. 577.
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• R. G. STANIER-“Ingeniería Bioquimica”-ENZIMAS COMERCIALES (pág 645)
• W. C. FRAZIER- D. C. WESTHOFF. “Microbiología de los Alimentos” (pag 622)