Universidad Austral de Chile, carrera de Quit Tecnologia farmacéutica de sdlidos y natura de ay Farmacia, a liquidos Laboratorio 1: Integrantes: Nicolés Pizarro y Nicolés Millar Obietivos: © Hacer uso de equipos de espectroscopia IR-TF para analizar una muestra desconocida. © Validar el método de andlisis HPLC mediante el uso de parémetros como linealidad, precision y exactitud. uv Marco tesri En el laboratorio se suelen realizar una gran cantidad de actividades y procedimientos, en los cuales se debe poser un cuantioso cuidado para su elaboracidn, esto es de suma importancia, pues por ejemplo durante la elaboracién de un farmaco existen una considerable cantidad de pasos a ejecutar en los cuales se debe poner un cuidado notable, pues el desarrollo de un mal paso de elaboracién puede llevar a la obtencién de un medicamento que no esté disefiado de acuerdo a los pardmetros y normas establecidas y como consecuencia puede ser un riesgo para la salud de los pacientes. A partir de lo anterior se generaron una serie de directrices denominadas las Buenas Précticas de Manufactura (BPM), las cuales expresan que todos los medicamentos que son elaborados o importados en Chile deben cumplir con una serie de requerimientos que buscan asegurar y acreditar la buena calidad del producto, de esta manera se intenta evitar o disminuir los riesgo en la produccién farmacéutica. Una de las partes mas importantes de las buenas practicas de manufactura es la validacién, la validacién es un programa documentado que tiene como propésito entregar un alto grado de seguridad de que un proceso determinado conduzca correctamente a la obtencién de un producto con las especificaciones y atributos de calidad esperados (2) (1). La espectroscopia infrarroja (FTIR) es un metodo analitico que permite el anal composicién, enlaces y caracteristicas moleculares de las muestras, para lo cual se utiliza un instrumento denominado espectrémetro infrarrojo, dicha técnica se basa en que toda sustancia posee una determinada capacidad de absorber un determinado rango de radiacién, en este caso radiacién o luz infrarroja desarrollando una capa estiramiento y vibracién molecular, a partir de esto se puede obtener un espectrc que se expresa en un interferograma que al ser analizado mediante la transformada de Fourier se puede analizar simultdneamente las frecuencias IR entregadas, cabe destacar que esta tecnica analitica se caracteriza por su considerable sencillez y eficacia del andlisis (3). is deOtro procedimiento que posee una considerable importancia en la elaboracién de medicamentos es el andlisis de muestras en cromatografia liquida de alta eficacia (HPLC), la cual permite realizar un anélisis cuantitativo y cualitativo al separar los componentes que conforman a la muestra analizada por medio de multiples interacciones, ya sean quimicas 0 fisicas con diferentes fases que componen al sistema HPLC, las cuales son fase estacionaria y fase movil, a su vez esta interaccion se puede variar al modificar las fases que componen al sistema de esta forma se puede distinguir la cromatografia por fase normal o cromatografia por fase reversa (3). Materiales, Equipos v Reactivos: Materiales: © Espatula © Toalla nova Reactivos: © Alcohol etilico © Software Omnic Materiales: LY Espétula Vaso precipitado de 50 mt jeringa Filtro Whatman Uniflo 0,43um de nylon Matraz de aforado de 25 mL Bial de HPLC Viok Reactivos: © polvo de amoxicilina trihidrato © Agua destilada (HPLC) Equipo: © Balanza analitica © Sonicador © Cromatégrafo HPLC por arregio de diodos ShimadzuFase movil: buffer fosfato, PH 50mM al 96% y acetonitrilo al 4% Fase estacionaria: columna C18, 150mm ‘Temperatura de horno 30°C tiempo de corrida: 4 min detector: arreglo de diodos Longitud de onda de lectura 230 nm . . . © Flujo 1,5 mi/r . . © volumen de inyeccién 20 ub Procedimiento: 1. FTIR Se inicié por limpiar el diamante del equipo de espectroscopia FTIR con alcohol etilico utilizando la ayuda de una hoja de toalla nova, posteriormente se realizé una linea base utilizando el software Omnic, para lo cual no se le afiadié ningén compuesto al equipo para que este lo analizaré, luego se deposité con ayuda de la espatula una pequefia cantidad de la muestra sobre el diamante, al ser sdlida la muestra esta fue aplastada con la prensa del equipo, por consiguiente se le indico al equipo que recolecta los datos de la muestra (collect sample), seguidamente se cargé en el software una biblioteca virtual que contiene datos de miltiples muestras, posteriormente se seleccioné 1a opcién “search” para comparar los resultados obtenidos en el analisis de la muestra desconocida con lo que indica la biblioteca al, finalmente la muestra se retira cuidadosamente del equipo y se vuelve a limpiar el diamante y la prensa con alcohol ettlico. oa 2. HPLC Se inicié por configurar la balanza analitica en gramos, posteriormente se taro el matraz de aforo sobre el equipo, seguidamente con ayuda de la espatula se agregé 0,0332g de muestra, posterior a ello se registré el pesaje obtenido, por consiguiente se afiadié solvente (agua destilada de HPLC) a la muestra sin llegar al aforo del matraz, en seguida se realizé la ‘olucién de la muestra mediante agitacién manual del matraz que contiene la solucién, posteriormente lo que quedé precipitado en la solucidn se terminé de disolver con ayuda del sonicador en el cual estuvo un tiempo de 5 minutos, luego se terminé de agregar solvente hasta la linea de aforo del matraz, por consiguiente se preparé un equipo de filtrado mediante el uso de una jeringa a la cual se le afiadié el filtro whatman Uniflo, parte de la solucién se deposits dentro del filtro, se depositaron 2 ml aproximadamente de {a solucién en el vaso de precipitados para eliminar impurezas y seguidamente se depositd la solucién dentro del vial de HPLC la solucién restante, finalmente se llevé la solucién a andlisis con el equipo de HPLC con arreglo de diodos. U Galculos y resultados: 1° FTIR: A partir de los resultados obtenidos del andlisis de la muestra en espectroscopia IR-TF, se observa la siguiente comparacién entre el escaneo de la muestra y la base de datosena figura 1: sed fron g ore 9 foray loo 3 Figura 1: Espectroscopia IR-TF del procedimiento realizado(verde) y IR-TF de la biblioteca virtual de dcido salicilico(morado) HPLC: Al trabajar con amoxicilina trihidrato al 120% se obtuvo la masa necesaria en una solucién de 25 ml al 100%: Xgramos de amoxicilina trihidrato = 25mL x 1,11'"9/,,7, X = 27,.75mg al obtener los mg de amoxicilina necesarios al 100% se obtuvo la masa necesaria al 120%: 27.75 mg > 100% x + 120% x = 33.3mg 0,033g corresponde a los gramos de muestra que se deben pesar en la balanza analitica. Tras el pesaje de la muestra se obtuvo una masa de 0,0332 g.Se desarrollé el célculo de concentracién teérica de la muestra pesada: (0.03329 x 25ml 000mg) tg 1,328mg/ml A partir de la concentracién tedrica obtenida se calculé el porcentaje tedrico de la muestra obtenido: 1,328mg *100 ms 9 Tlimg/mil 119,6 > 120% Mediante una recopilacién de datos de las maltiples parejas de analistas que realizaron el mismo experimento a distinta concentracién en un mismo dia donde los datos obtenidos se observa la tabla 1 mostrada a continuaci6n, donde ademés se incluye las concentraciones obtenidas en cada caso, calculadas utilizando la ecuacién de la recta (Fig. 2) y el porcentaje de recobro: ‘cone % |Responsabled Mueswa [cone (mg/mt)| Area de sefial | Concentracién (mg/ml) | %recobro 30 wk af 089 13715163 0953604878 107.3866 = nC ail 089 12297003, 841654038 395900470 ao crit as] 089 12419285 0851490783 955731172 1 _ Promedio (mg/ml) [088231685 100 fa ula 14Asa78 1012807935 912409581, 100 [DWEDR | ase 14590572 1,022586528 52,1049124 {100 RR 16) Aid 14717913 1,032620826 93,0289031 [i00 —__ | Promedio (mg/ml) 102760868 aw wef ass 7oesi2 321757830 91,5472438 NyN zof 133 16830405 1199792601 50709988 0 -ncyat roam 19888979 1.436625774 308,017276 { —_ Promedio (mg/ml) | 1.28466697 Se realizé una curva de calibracién con un aumento gradual de la concentracién de analito de 0,25 hasta llegar a 1,5 mg/mL como se observa en la tabla 2: Concentracién (mg/mL) 0,25 os 0,75 1,25en base a estos datos se obtuvo la curva de calibracién como se observa en la figura 2: Curva de calibracion 22500000 ¥= 12.690:476« + 1.613.463 20000000 R= 0.0991, . 00000 bajo la cur ° 9090000 500000 0 02 8 Oe oe Concentracin mg/m) Para evaluar la precisién del procedimiento se realiz6 la obtencién del promedio, desviacién estndar y desviaci6n estandar relativa a partir de los datos de drea de cada muestra: Icone% __|Responsables |Muestra [Area de sefal| Promedio _|s0 DER WAR 17] 137isiea|__s2esoaea] 7a5857/002| 6,13446302 eve 2i| 12297003 CRIR | 19| 12419286) 7 Promedio so [eR HA ial iaasei7e| vassi6s47| 125720,99|_0.6159516 100) DMR (wia)| 13) 1459057 | 300 RR 6] 14717933 —_— | tT Promedia [so [orn 320] PLM 18| 17065112] 17916498,7| 1673921,51) 9,34790532 120 NyN 20] 16839405| 120} cy BL 12] 19844979] Tras obtener los valores de desviacién estandar (SD) y desviaci6n estndar relativa (DER), de las distintas muestras, se calculé el promedio de SD y DER, estos fueron expresados en la tabla 4: Locorrecto seria cadeular %, sd y CY om base uw la concentrawomes oblenidlas, ho wn elarers de (an musstra>Cone% Promedio [sb DER 80| 12810484] 785857,082| 6,134483925 | 100] 14591654,7| 12572099] _0,861595157, [ 120] 17916498,7| 167392151] 9,342905316) [SD promedio [DER promedio | 861833,193| _5,446328133) Discusi6n de resultados: IR-TF: A partir del espectro IR-TF obtenido de la muestra trabajada durante el practico, se obtuvo una concordancia de! 94,79 con el Acido acetil salicilico, esto en base a la biblioteca virtual del programa OMNIG, el cual se encargé de buscar concordancia entre el espectr obtenido con los espectros que posee en su biblioteca . we HPLC: En base a los resultados obtenidos durante el trabajo practico se obtienen los datos de concentracién y area bajo la curva de cada muestra analizada mediante el sistema HPLC (Tabla 1), a partir de estos valores se logré obtener la desviacién estandar y desviacién estandar relativa, dichos resultados permiten evaluar qué tanto se dispersan los datos entre si, con respecto a una media (tabla 3 y 4), de manera que se puede apreciar que tan preciso y exacto es el sistema o metodologia utilizada. Como se observa en la tabla 3 se realizé una desviacion estandar para cada triplicado de 3 concentraciones distintas de una misma muestra de amoxicilina trihidrato donde: © Al 80%: Se observé una desviacién estandar relativa de 6,134483925 este resultado considerablemente elevado se podria explicar debido a la muestra numero 17 posee un drea bajo fa curva demasiado elevada, ademas su concentracién varia demasiado con respecto a las otras muestras a su misma concentracién, esto pudiese haber ocurrido por variaciones en el sistema HPLC, balanza no calibrada 0 debido a un mal manejo de la muestra de parte de los analistas, lo que genera una baja precision. © Al 100%: La desviacién estindar relativa obtenida en este caso fue de 0,861595157 la cual es bastante baja, lo que quiere decir que los valores obtenidos no se alejan demasiado de la media, lo que permite indicar que el procedimiento realizado por los analistas es preciso. Al 120%: Se obtuvo una desviacién estandar relativa de 9,342905316, dicho resultado es considerablemente elevado y esto se debe principalmente a la muestra 12 que posee un rea bajo la curva que se aleja demasiado de la media, lo que puede estar dado por falta de variaciones en el método o problema de los analistas. A partir de los datos de desviacién estandar relativa de las muestras al 80%, 100% y 120% se obtuvo una desviacién estandar relativa promedio de 5,446328133 lo que es un valor considerablemente alejado de la media lo que indica que en si el método posee una baja precisién. Con respecto a la exactitud del método se evalian los datos de porcentaje de recobro obtenidos a partir de las concentraciones de las muestras (Tabla 1) considerando que el porcentaje de recobro indica buena exactitud si se encuentra entre 95% y 105%: © Al 80%: Se obtuvieron valores de 105% (YV-IR), 95% (EYC) y 96% (CR-LR), los valores de porcentaje de recobro fueron buenos al encontrarse dentro del rango de 95-105%lo que indica en este caso que hay una buena exactitud del método. © Al 100%: Se obtuvieron valores de 91% (EIA), 92% (DM-DR(MIR)) y 93% (RR), los cuales fueron bajos pues no entraban dentro del rango 95-105% lo que indica una baja exactitud de! método. © Al 120%: Se obtuvieron valores de 91% (PI-MM),90% (N y N) y 108% (NC y BL), estos resultados no entraron en el rango de 95-105% e incluso hubieron valores que estaban por debajo (PI-MM y N y N) y otro valor que estaba por sobre el rango (NC y BL) lo que puede indicar problemas en el desarrollo del método o problemas de parte de los analistas, de manera que se debe considerar que se obtuvo una baja exactitud. Con respecto a la linealidad del método se obtuvo un valor de rA2 de 0,99 aproximadamente, lo que es un valor bueno ya que es muy cercano a 1, lo que indica que el método es lineal. Conclusiones; Gracias a todo lo anterior, se logré concluir que el andlisis por espectroscopia infrarroja Permitié evaluar de forma eficiente y répida la identidad de la muestra analizadas que en este caso fue el Acido acetilsalicilico, dado que permitié la obtencién de los datos correspondientes de la muestra los cuales fueron comparados con muestras previamente analizadas que se encontraban en la biblioteca virtual. Con respecto a la validacién del método de HPLC, si bien los resultados obtenidos indicaron que el método presenté una baja exactitud y precisién, obtuvo por otro lado una buena linealidad, a partir de ello se logra llegar a la conclusién de que si bien el los instrumentos de laboratorio pueden presentar problemas de calibracién o alguna otra variable que afecte su funcionamiento, el metodo tambien se puede ver alterado considerablemente por la manera en que trabajan los analistas en el laboratorio, debido a que la buena elaboracién de los procedimientos en el laboratorio resulta ser vital. A partir de Io anterior esta claro que la realizaci6n de la validacién de los métodos utilizados en los laboratorios resultan ser fundamentales para llevar a cabo la correcta elaboracién de los medicamentos, debido a que estos posteriormente serén puestos en el mercado o entregado a instituciones para su administracién en pacientes, de manera que se debe asegurar que el producto fue elaborado con los mejores estdndares de calidad y seguridad, ara lo cual hay que poner énfasis en cumplir con lo establecido por las Buenas Practicas de Manufactura de medicamentos. Bibliograffa: 1.Vila, J. (1997). Tecnologia Farmacéutica Volumen Il Formas Farmacéuticas (pp.22). Madrid: Editorial Sintesis. 2.- Norma técnica N°127 Minsal p.47,2013. 3.-Skoog, D., & West, D. (2014). Fundamentos de Quimica Analitica. Cengage Learning (pp. 498-499 y 816-817),