TAREA. EJERCICIOS DE QPCR.

Técnicas de Biología Molecular 1, Grupo A.

Universidad Autónoma de Ciudad Juarez.

Enrique Muñoz Avila.
Matrícula: 187396.
 1) Problema de QPCR: cuantificación absoluta
Los investigadores del ejercicio anterior decidieron ampliar su investigación ya que
descubrieron que el gen MalB-oro-2 tiene una mayor expresión en mascadores de
tabaco que el MalB en fumadores. Los investigadores realizaron otra qPCR pero
ahora para determinar una cuantificación absoluta de este gen MalB-oro 2. Se
realizó una escala con un fragmento sintético para la cuantificación y se obtuvieron
los siguientes datos:

Ct Log DNA copias

200 1
100 2
67 3
52 4
40 5
33.34 6
28.57 7
25.1 8
22.3 9
20.1 10

Posteriormente, los investigadores corrieron 3 muestras de mascadores de tabaco

y 3 muestras de fumadores de tabaco. Obtuvieron los siguientes Ct:
Mascadores de tabaco: 17.56, 10.55, 11.11.
Fumadores de tabaco: 134, 232, 123.
Realice lo siguiente:
1. Calcular el % eficiencia de la reacción: y mencione una conclusión sobre la
eficiencia de la reacción, ¿es buena o mala?
E=10^(-1/-14.845), E= 10^(0.0673), E= 1.1678.
%E= (1.1678-1)*100, %E= 0.1678*100, %E=16.78%.
En base al resultado obtenido de porcentaje de eficiencia se puede concluir que
esta es mala debido a que resulta menor al 90%, por lo que se cree que se deba a
un diseño deficiente de los primers o por condiciones de reacción no óptimas.
2. Realice una gráfica del fragmento sintético, utilice solo puntos de color
negro en tamaño 7 puntos.

3. Grafique la línea de tendencia usando una línea punteada de color azul y

con grosor de 1.5 puntos.
4. Añada las leyendas del eje de las “Y” y de las “X”.

5. Añada los puntos de Ct de los consumidores de tabaco utilizando

triángulos rojos en tamaño 7 puntos.
6. Añada los puntos de Ct de los no consumidores de tabaco utilizando
rombos verdes en tamaño 7 puntos.

7. ¿Cuál es la media +/- EE de la cantidad del número de copias del gen MalB-
oro-2 en los sujetos mascadores de tabaco y fumadores de tabaco?
Ct Log Cantidad Cant
experimentales Absoluta
17.56 8.280902661 190942524.8
10.55 8.753115527 566389935
11.11 8.715392388 519268990.1
134 0.437184237 2.736429333
232 -6.164365106 6.84912E-07
123 1.17817447 15.07212438
m = -14.845
b = 140.49
Ct (mascadores): 13.073
Ct (fumadores): 163
Qlog (mascadores): (13.073 - 140.49)/ -14.845 = 8.5831
Qlog (fumadores): (163 - 140.49)/ -14.845 = -1.5163
Q (mascadores): 108.5831 = 382,945,401.4
Q (fumadores): 10-1.5163 = 0.030455416
Mascadores de tabaco: 382,945,401.4
Fumadores de tabaco: 0.030455416
8. ¿En qué sujetos se expresa mayormente el gen MalB-oro-2?
Los sujetos mascadores de tabaco expresan más el gen MalB-oro-2 en
comparación a los fumadores de tabaco.
 2) Problema de QPCR: cuantificación relativa
Se realizó un experimento para conocer el nivel de expresión de un gen relacionado
con el consumo de tabaco. Se cree que la expresión de este gen denominado como
MalB está relacionado con cáncer de pulmón en personas fumadoras. Se tomaron
muestras de 10 personas fumadoras (tratamiento) y de 10 no fumadoras (control) y
se realizó una qPCR para saber si existe una relación entre el nivel de expresión y
el cáncer.
Datos extras de la reacción qPCR:
1. Se utilizó el termociclador disponible en el laboratorio, un GeneExP-5 de
BioRad.
2. Se asilaron 500 ng de DNA de la muestra problema, donde están incluidos
el gen de interés y un gen constitutivo de referencia, en este caso el
NAPDH+.
3. La qPCR utiliza el sistema de TaqMan.
4. Las condiciones de reacción de la qPCR fueron las siguientes: 1 ciclo a
95ºC por 5’, 55 ciclos de 5’ a 95ºC seguido de 10’ a 63ºC y finalmente 1
ciclo de incremento de temperatura desde 63ºC a 95ºC.
Conteste lo siguiente:
I. Calcular el nivel de la expresión relativa del gen de interés con respecto al
control. Utilice las metodología de Livak para estimar lo siguiente: ¿en qué
grupo se expresa mayormente el gen MalB?, ¿Cuánta diferencia hay en el
nivel de expresión del gen en los fumadores comparada con el control?
Datos:
NADH MalB

Gen Housekeeping Gen de interes

Muestra Ct Muestra Ct

Control 1 13 Control 1 35

Control 2 13.5 Control 2 32

Control 3 12.4 Control 3 30

Control 4 11.4 Control 4 35

Control 5 11 Control 5 32.5

Control 6 14 Control 6 30.5

Control 7 14.3 Control 7 27.5

Control 8 13 Control 8 33.5

Control 9 12.6 Control 9 40.1

Control 10 12.12 Control 10 35.3

Tratamiento 1 23 Tratamiento 1 25.1

Tratamiento 2 22 Tratamiento 2 20.4

 Tratamiento 3 21.4 Tratamiento 3 22.4

Tratamiento 4 21 Tratamiento 4 20.9

Tratamiento 5 20 Tratamiento 5 21

Tratamiento 6 22.4 Tratamiento 6 21

Tratamiento 7 23.2 Tratamiento 7 22.5

Tratamiento 8 22.5 Tratamiento 8 18.7

Tratamiento 9 25 Tratamiento 9 20.3

Tratamiento Tratamiento
21 20.56
10 10

Método Livak.
Sample Gene
MalB NADH
Control 33.14 12.732
Tratamiento 21.286 22.15
∆Ct(control) = (33.14) – (12.732) = 20.408
∆Ct(Tratamiento) = (21.286) – (22.15) = -0.864
∆∆Ct = -0.864 - 20.408 = -21.272
2-∆∆Ct = 2-(-21.272) = 2, 532,270.337
¿En qué grupo se expresa mayormente el gen MalB? En el grupo de personas
fumadoras.
¿Cuánta diferencia hay en el nivel de expresión del gen en los fumadores
comparada con el control? La diferencia es que el gen MalB se expresa 2,
532,270.337 veces más que el gen control NADH.
3) Realice una gráfica de qPCR, donde Y es el nivlel de fluorescencia y X es el
número de ciclo.
Datos:

Ref Ctl Ref Exp GOI Ctl GOI Exp

Ciclo F Ciclo F Ciclo F Ciclo F

3 1.239 1 1.12 4 3.613 5 1.693

6 1.257 4 1.139 8 3.683 7 1.745

8 1.28 5 1.154 11 3.724 8 1.76

9 1.29 7 1.18 12 3.729 10 1.773

11 1.307 8 1.18 18 3.726 12 1.792

13 1.329 12 1.218 22 3.771 14 1.798

14 1.334 14 1.231 25 3.797 17 1.815

16 1.354 17 1.25 27 3.794 21 1.826

18 1.385 19 1.297 29 3.992 23 1.854

22 1.785 20 1.346 31 4.552 26 2.605

25 4.175 23 2.057 32 5.199 28 4.652

26 5.929 25 4.044 34 7.819 29 6.549

28 10.01 27 7.995 35 9.537 30 8.842

30 13.188 28 10.15 37 12.323 32 12.944

31 14.274 30 13.59 38 13.271 33 14.364

33 15.633 31 14.736 40 14.603 35 16.457

36 16.892 33 16.134 43 15.341 37 17.588

38 17.196 35 17.07 46 15.875 39 18.216

42 17.657 38 17.742 48 16.04 43 18.717

48 17.869 47 17.993 55 16.306 47 18.967

m -3.955 m -4.033 m -3.917 m -3.917

Calcule la eficiencia de cada reacción y calcule cual es el Ct para cada una de las
reacciones de qPCR.
Ref Ctl Ref Exp GOI Ctl GOI Exp
m -3.955 m -4.033 m -3.917 m -3.917
F 7.31915 F 6.6813 F 8.23475 F 7.79785
media media media media
Desv 7.01190008 Desv 6.88824754 Desv 5.24462083 Desv 7.10066175
est. est. est. est.
Ct 42.38 Ct 41.12 Ct 34.46 Ct 43.30
E 1.7900 E 1.7699 E 1.8001 E 1.8001
%E 79.00 %E 76.99 %E 80.01 %E 80.01

Ref Ctl.
Ct = 7.3119 + (5*7.0119) = 42.38
E = 10(-1/-3.955) = 1.7900
%E = (1.7900-1)*100 = 79%
Ref Exp.
Ct = 6.6813 + (5*6.8882) = 41.12
E = 10(-1/-4.033) = 1.7699
%E = (1.7699-1)*100 = 76.99%
GOI Ctl.
Ct = 8.2347 + (5*5.2446) = 34.46
E = 10(-1/-3.917) = 1.8001
%E = (1.7699-1)*100 = 80.01%
GOI Exp.
Ct = 7.7978 + (5*7.1006) = 34.46
E = 10(-1/-3.917) = 1.8001
%E = (1.7699-1)*100 = 80.01%