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Mapeamento Da Autoincompatibilidade Sexual Do Cacau
Mapeamento Da Autoincompatibilidade Sexual Do Cacau
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ISAMIRE SILVA ANDRADE
iii
DEDICATÓRIA
iv
AGRADECIMENTO
A Deus, pela infinita bondade, constante proteção e por mais esta graça
concedida.
Ao Prof. Ronan Xavier Corrêa, meu orientador, pessoa singular que tive o
prazer de conhecer, pela confiança depositada e amizade durante toda minha vida
acadêmica.
A Profa. Ioná Santos Araújo, uma das principais responsáveis pela realização
deste trabalho, pela atenção, comprometimento e cuidado.
v
A amiga Márcia Cristina da Silva Branco, pela sua dedicação e ajuda nos
trabalhos iniciais desta Dissertação.
Aos meus amigos, Carlos Augusto, Lucas, Lúcio Mauro, Francisca, Ittana,
pela companhia e convivência, e companeirismo.
A minha família e a família de minha esposa, pelo apoio durante todo o curso,
pela segurança e pela força nos momentos difíceis.
Obrigado.
vi
ÍNDICE
EXTRATO ............................................................................................................... ix
ABSTRACT ............................................................................................................ xi
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 4
2.1 Origem e dispersão do cacaueiro .................................................................. 4
2.2 Divergência em populações naturais e autoincompatibilidade ...................... 5
2.3 Panorama geral da cacauicultura .................................................................. 8
2.3.1 Distribuição geográfica ........................................................................ 8
2.3.2 Importância sócio-econômica.............................................................. 9
2.3.4 A cacauicultura baiana e a vassoura-de-bruxa ................................. 10
2.4 Aspectos genéticos e botânicos do cacau ................................................... 11
2.5 Biologia floral e sistemas de cruzamento .................................................... 13
2.6 Incompatibilidade genética em plantas ........................................................ 16
2.6.1 Autoincompatibilidade gametofítica ................................................... 18
2.6.2 Autoincompatibilidade esporofítica .................................................... 18
2.7 Sistema de incompatibilidade sexual em cacaueiro .................................... 20
2.7.1 Determinação da compatibilidade sexual .......................................... 24
2.8 Bancos de germoplasma e certificação genética......................................... 26
2.9 Marcadores moleculares e desenvolvimento de mapas de ligação ............. 28
3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 35
3.1 Material vegetal ........................................................................................... 35
3.2 Caracterização da população quanto à compatibilidade sexual .................. 36
3.3 Caracterização morfo-fisiológica dos frutos ................................................. 37
3.4 Obtenção de dados moleculares ................................................................. 38
3.4.1 Extração de DNA dos genitores e progênies F1 ................................ 38
3.4.2 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51 .................... 39
3.4.2.1 Reações RAPD......................................................................................... 39
vii
3.4.2.2 Reações microssatélites ........................................................................... 40
3.4.3 Genotipagem da população segregante ........................................... 41
3.4.4 Avaliação do polimorfismo da população segregante e de ligação entre
marcadores e características........................................................... 41
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 43
4.1 Determinação da compatibilidade sexual .................................................... 43
4.2. Caracterização morfo-fisiológica dos frutos ................................................ 46
4.2.1 Cor do fruto ....................................................................................... 46
4.2.2 Número de sementes por fruto .......................................................... 48
4.3 Certificação genética dos clones TSH-1188 e CCN-51 ............................... 51
4.4 Segregação e ligação genética .................................................................... 57
5 CONCLUSÕES.................................................................................................. 63
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 64
viii
EXTRATO
Andrade, Isamire Silva, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, julho de
2009. Mapeamento da autoincompatibilidade sexual do cacau e certificação
genética dos clones TSH-1188 e CCN-51 por meio de marcadores
microssatélies. Orientador: Ronan Xavier Corrêa.
ix
fruto maduro e compatibilidade sexual segregaram na proporção de 1:1 e de forma
independente nesta população. A característica número de sementes por fruto
distribui-se de forma contínua na população de acordo com um padrão multigênico e
com segregação transgressiva. Os marcadores microssatélites P23(217) e P10(108)
estão ligados à característica de compatibilidade sexual. A característica cor de fruto
não apresentou ligação genética significativa a nenhum dos microssatélites testados.
A existência da segregação da característica compatibilidade sexual e cor do fruto,
possibilita que esta população seja utilizada em estudos de mapeamento genético
para essas características.
x
ABSTRACT
Andrade, Isamire Silva, M.S., Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, July,
2009. Mapping of the sexual self-incompatible of the cocoa and genetic
certification of the clones TSH-1188 and CCN-51 by microssatélies markers.
Advisor: Ronan Xavier Corrêa.
The different levels of sexual compatibility made by the cocoa may be responsible for
major changes in production levels, because the self compatibility cocoa tend to have
higher fruit production that self-incompatible. The study of traits related to production
(number of seeds per fruit), and few qualitative characteristics influenced by the
environment and with high power to differentiate genotypes (fruit color), it becomes
an indispensable tool for successful breeding program of cocoa. Thus, this study
aimed to characterize the progeny of F1 plants (TSH-1188xCCN-51) on the clonal
purity of their parents, sexual compatibility, fruit color and number of seeds in order to
identify microsatellite markers linked to these characteristics. The segregating nature
of these features was demonstrated in this population. DNA samples from two groups
of accessions of germplasm collection of the Science Center Cocoa (M&MMars) that
were used as parents of the population were amplified with fifteen microsatellite
primers. These accesses of each group appear to be indistinguishable by genotyping
in 15 SSR loci, confirming the genetic purity of these accesses. A sample of 250
plants taken at random were subjected to artificial pollination. Using a rate of success
set the number of artificial pollination were the basis for compatibility testing with the
use of at least 15 per plant pollination. The characteristics of the ripe fruit color and
sexual compatibility segregated in a 1:1 ratio and independently in this population.
The characteristic number of seeds per fruit is distributed continuously in the
population according to a standard multigenic and transgressive segregation. The
xi
microsatellite markers P23 (217) and P10 (108) are linked to the characteristic of sexual
compatibility. The characteristic color of fruit did not show significant linkage to any of
the microsatellites tested. The existence of segregation of the trait sexual
compatibility and color of fruit means that this population to be used in genetic
mapping studies for these characteristics.
xii
1 INTRODUÇÃO
1
trabalhadores rurais e migrações de pessoas da zona rural para a zona urbana
(TREVIZAN, 1996).
Atualmente, vários esforços integrados estão sendo feitos na tentativa
de recuperar a região cacaueira baiana. A estratégia de piramidização de
genes é uma ferramenta muito promissora e possibilita a obtenção de novas
cultivares com diferentes fontes de resistência a M. perniciosa associada a
características de produtividade, que tem sido um dos principais objetivos dos
programas de melhoramento do cacaueiro nos países da América do Sul
(BARTLEY, 2005).
Os diferentes níveis de compatibilidade sexual apresentados pelo
cacaueiro podem ser responsáveis por grandes alterações dos níveis de
produção (CANTALINO, 2006), e se manifestam de forma acentuada,
influenciando diretamente na quantidade de frutos por planta, bem como no
tamanho e número de sementes por fruto (BARTLEY, 2005). O número de
sementes por fruto de cacau tem influência direta na produtividade,
participando diretamente na determinação de diferentes componente de
produção (DIAS, 2001). A coloração dos frutos tem grande importância na
discriminação dos grupos raciais, além de apresentar a possibilidade de ser
utilizado como um ótimo marcador morfológico relacionado a características
relevantes ao melhoramento.
Nesta perspectiva, foi plantada uma progênie oriunda do cruzamento
interclonal entre TSH-1188 e CCN-51, que segrega para diversas
características, dentre elas a compatibilidade sexual e a cor do fruto. Com base
nesta população e no mapa genético a ser construído, espera-se identificar não
só QTLs relacionados a essas características, mas também para
características de resistência à vassoura-de-bruxa, podridão parda e outras
características agronômicas de interesse.
No presente trabalho, objetivou-se avaliar diferentes características na
população segregante de cacaueiros e identificar marcadores microssatélites
para essas características. Os objetivos específicos consistiram em: (i) Avaliar
as características compatibilidade sexual, cor de frutos e numero de sementes
por fruto em uma amostra de plantas F1 derivadas dos clones TSH-1188 e
CCN-51; (ii) Certificar a identidade genética dos acessos de TSH-1188 e CCN-
51 utilizados na obtenção da população segregante e oriundos da coleção de
2
germoplasma da Fazenda Almirante Cacau, com base em 15 marcadores
microssatélites; (iii) Identificar marcadores microssatélites potencialmente
ligados a genes de cor do fruto e autoincompatibilidade sexual em cacau.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
4
o seu interior violeta escuro (SOUZA; DIAS, 2001; MOTAMAYOR et al., 2002).
Nesse grupo se apresenta maior diversidade genética e melhor desempenho
agronômico (BARTLEY, 1967; LOCKWOOD, 1976; MARITA, et al. 2001). Um
terceiro grupo, denominado grupo dos Trinitários, é constituído de híbridos
naturais entre Forasteiros e Crioulos (SORIA, 1966; MOTAMAYOR et al.,
2001), encontrados em plantações devastadas por doenças em Trinidade
(CHEESMAN, 1944). Este grupo apresenta uma ampla variação de
características morfológicas dos dois anteriores. Suas sementes apresentam
coloração interna que varia do amarelo até o roxo e o seu produto final é de
qualidade intermediária (BRAUDEAU, 1969).
5
uma população é controlada, em grande parte, pelo modo de reprodução de
seus indivíduos (STEBINS, 1957).
Em populações naturais, admiti-se que cacaueiros autoincompatíveis
predominam no centro de origem da espécie, enquanto os autocompatíveis
estão dispersos nas áreas marginais da distribuição (POSNETTE, 1945;
COPE, 1962; 1976). O que foi contestado devido à presença de cacaueiros
autoincompatíveis encontrados também nas áreas marginais (SORIA, 1978).
Contudo, essa hipótese especulativa apresenta alguma sustentação, na
medida em que a escassez de polinizadores e a redução na densidade da
população cacaueira nas áreas marginais da distribuição podem ter exercido
forte pressão de seleção em favor da autocompatibilidade. Sabe-se que o
sistema de cruzamento em plantas está sob o controle de poucos genes, os
quais, quando mutados, promovem a necessária flexibilidade capaz de
assegurar a reprodução da espécie. A autocompatibilidade teria, então, grande
valor adaptativo nessa situação (DIAS, 2001).
A predominância da autoincompatibilidade no centro de origem e da
autocompatibilidade nas áreas marginais comporta ainda outra explicação
(COPE, 1962). Assumindo que grande número de diferentes alelos de
autoincompatibilidade estivesse presente na população original de cacau, se
somente alguns poucos frutos tivessem sido transportados no período das
migrações humanas através dos Andes, então o número de alelos de
incompatibilidade seria reduzido a cada estágio. Uma vez que o cacaueiro
fosse plantado em grupos de árvores, a autoincompatibilidade não impediria a
frutificação, desde que árvores de compatibilidade cruzada fossem incluídas
como polinizadoras. Finalmente, um estágio ocorreria em que poucos alelos
diferentes de incompatibilidade restariam na população.
Embora o sistema de incompatibilidade possa, em teoria, ser mantido
em populações com apenas dois indivíduos, De Nettancourt (1977), afirma que
a perda de alelos por deriva genética ou por seleção reduzirá o número de
alelos em populações pequenas a valores abaixo do mínimo requerido para o
adequado funcionamento do sistema. Neste sentido, quando Astecas e Maias
selecionaram os Crioulos com base em suas amêndoas despigmentadas para
um melhor chocolate, eles estavam selecionando indiretamente para
autocompatibilidade (DIAS, 2001). Em outras palavras, a seleção consciente do
6
cacau de sementes brancas resultou em seleção automática, inconsciente para
autocompatibilidade (HARLAN et al., 1973).
Essa pode ter sido a outra razão para o predomínio das populações
autocompatíveis de Crioulos na América Central. Essa idéia encontra suporte
no estudo teórico de populações mistas compostas de cacaueiros
autoincompatíveis e autocompatíveis (COPE, 1962), assumindo ausência de
depressão endogâmica. No estudo, os autocompatíveis tenderam ao
predomínio devido à maior frutificação, enquanto os autoincompatíveis
tenderam à eliminação, demonstrando que genótipos autocompatíveis e
autoincompatíveis de cacau não podem coexistir em equilíbrio em população
isolada. Contrariamente, observações de campo feitas em população
abandonada desde 1950, contendo ambos os cacaueiros Trinitários
autocompatíveis e autoincompatíveis, pareceram indicar que a freqüência das
árvores autoincompatíveis aumentou em uma única geração (WARREN;
KALAI, 1995). Contudo, esse resultado pode também estar indicando que a
redução dos cacaueiros autocompatíveis na população mista seja devido à
depressão por endogamia, expressa como estabelecimento comprometido de
plântulas. Esta é uma questão complexa e que demanda mais pesquisas
(DIAS, 2001).
Sabe-se que nos centros de origem são encontrados numerosos
caracteres varietais endêmicos (VAVILOV, 1951). Seguramente alguns
caracteres encontrados em alta expressão nas populações dos Alto
Amazônicos das regiões do alto Amazonas, em comparação aos das
populações dos outros grupos raciais, como a marcante autoincompatibilidade
(POSNETTE, 1945), o mais alto conteúdo de manteiga (PIRES et al., 1998), a
germinação precoce da semente dentro do fruto tão logo a maturação do fruto
ocorra (SANCHEZ; JAFFÉ, 1992) e a mais alta concentração de genes para
resistência à vassoura-de-bruxa (POUND, 1938; CHEESMAN, 1944) são
alguns dos caracteres ancestrais endêmicos que reforçam a origem do
cacaueiro naquelas regiões e que, conseqüentemente, podem ser utilizados na
identificação de populações silvestres.
7
2.3 Panorama geral da cacauicultura
8
precisamente para o Estado da Bahia; na costa oeste africana, destacando-se
Costa do Marfim, Nigéria, Gana, Libéria e Camarões; e, ultimamente, no
sudeste asiático, uma nova região produtora liderada pela Indonésia, Vietnã e
Filipinas (WCF, 2009).
9
brasileira ocorre basicamente nos estados da Bahia, Pará, Rondônia, Espírito
Santo e Amazonas, com pequena participação em Mato Grosso e São Paulo.
O principal produtor é a Bahia, com 136.155 toneladas de amêndoa, o que
equivale a 69,41% do total produzido no país, seguido do Pará, com 32.804
toneladas (16,73%), Rondônia com 18.592 (9,48%) e Espírito Santo com 6.944
t (3,54%) (ICCO, 2009).
Além de ser um dos principais componentes econômicos nas regiões
onde é cultivada, a cultura do cacaueiro exerce também um papel importante
na preservação ambiental. Seu cultivo associado com árvores nativas tem
auxiliado na preservação de biomas ameaçados, como a Mata Atlântica e a
Floresta Amazônica. Na Bahia, os fragmentos florestais da mata Atlântica não
se restringem apenas às áreas de declividade acentuada, pelo contrário,
atingem boa parte do litoral sulbaiano. Nessa região, a mata possui os seus
mais significativos remanescentes, os quais fornecem sombra à grande maioria
dos 700 mil ha de cacaueiros, preservando o solo e a água (DIAS, 2001). O
cultivo do cacaueiro nessa região foi, na sua maioria, implantado sob mata
raleada, no sistema cabruca, e sua preservação devem ser perseguidas a
qualquer custo (SILVA, 1997).
10
pelo fungo Moniliophtora (=Crinipellis) perniciosa (Stahel) (AIME e PHILLIPS-
MORA, 2005), e se caracteriza por infectar lançamentos foliares novos, frutos
em desenvolvimento e almofadas florais, podendo até provocar a morte da
planta quando afetada por sucessivos ciclos do patógeno associados a fatores
bióticos (ANDEBRHAN, 1984; QUEIROZ et al, 2003). Na Bahia, foi detectada
pela primeira vez em 1989 (PEREIRA et al., 1989) onde tomou proporções
devastadoras, devido à susceptibilidade do hospedeiro e condições climáticas
altamente propícias à introdução do patógeno (LUZ et al., 1997). Plantações
comerciais chegaram a perder 100 % da produção causando um dramático
impacto econômico, ecológico e social na região cacaueira baiana
(ANDEBRHAN, 1998; RIOS-RUIZ et al., 2001), o que resultou na falência de
inúmeros produtores, no desemprego de milhares de trabalhadores rurais que
migraram para outras regiões, na erradicação de lavouras em declínio para
substituição por pastagens e café, na depreciação da infra-estrutura e
desvalorização das propriedades rurais e, ainda mais, na exploração
descontrolada de espécies arbóreas de valor ecológico e econômico como
alternativa de complementação da renda dos produtores descapitalizados pela
crise, o que transformando o Brasil em importador cacau em amêndoas na
década de 1990 (DIAS, 2001).
O melhoramento do cacaueiro no Brasil teve início na década de 50
(VELLO, 1972), e atualmente vários esforços integrados estão sendo feitos na
tentativa de recuperar a região cacaueira baiana (DIAS, 2001). O uso de novas
fontes de resistência a M. perniciosa associada a características de
produtividade é uma das prioridades dos programas de melhoramento genético
do cacaueiro nos países da América do Sul (BARTLEY, 2005). No Brasil, por
exemplo, a sobrevivência da lavoura cacaueira na Bahia está, em grande parte,
na dependência do lançamento de cultivares resistente (DIAS, 2001).
11
condições silvestres, mas em condições de cultivo normalmente alcançam ao
redor de 5 metros. Das 22 espécies que compõem o gênero, apenas o cacau e
o cupuaçu (Theobroma grandiflorum) são explorados comercialmente no Brasil
(BARTLEY, 2005). É uma planta diplóide (2n = 20), com tamanho do genoma
estimado em 0,43 ou 0,415 X 109 picogramas (FIGUEIRA et al., 1994), e
pertence a classe das dicotiledôneas e, assim sendo, as sementes apresentam
dois cotilédones que representam a parte economicamente aproveitável, sendo
descartados a casca e o gérmen (BARTLEY, 2005).
Ainda segundo Bartley (2005), o cacau possui ampla variabilidade
genética para a maioria dos caracteres, especialmente para o tamanho, forma
e cor dos frutos e das sementes, resistência a doenças e pragas, vigor e
tamanho da árvore, etc. A forma dos frutos pode variar de arredondada a
alongada com diversidade no comprimento e peso que varia de 100 a 2000 g.
A cor do fruto vai de verde a vermelho quando jovens e amarelos a
alaranjados quando maduros. A coloração do fruto imaturo tem grande
importância na discriminação dos grupos raciais, além de se apresentar como
um ótimo descritor para diferenciar genótipos, podendo ser utilizado como um
marcador morfológico, uma vez que é pouco influenciada pelo ambiente (DIAS,
2001). Essa característica é descrita como monogênica, sobre o controle do
gene R, com dois alelos (R e r); e em frutos imaturos a pigmentação vermelha
(RR e Rr) é dominante sobre a verde (rr) (SORIA, 1964). O controle
monogênico, contudo, pode ser complementado pela ação de genes
modificadores, uma vez que ocorrem gradações de cores entre o verde e o
vermelho (DIAS, 2001).
A cor das sementes varia de branca ao roxo intenso, passando por
gradientes de coloração conforme a intensidade de antocianina, e seu peso
pode variar de 0,5 a 5,0 gramas, quando secas (BARTLEY, 2005). O número
de sementes por fruto pode chegar até 50, sendo uma característica importante
na determinação de diversos componentes relacionados com a produção
(DIAS, 2001). É um componente muito variável, e depende diretamente do
número de óvulos e do percentual de fertilização destes (ENGELS, 1983).
A incompatibilidade gamética é um mecanismo genético evolutivo, de
certo modo complexo, que favorece a alogamia ou fecundação cruzada (DE
NETTANCOURT, 2000). Desta forma, existem na população de cacaueiros
12
tanto genótipos autocompatíveis (capazes de se autofertilizar com pólen da
própria planta), como genótipos autoincompatíveis, ou seja, incapazes de se
autofertilizar e, por isso, necessitam pólen de flores de outras plantas com as
quais são compatíveis. Esta característica é responsável por grandes
alterações dos níveis de produção, e considerado como um gargalo tecnológico
da cadeia produtiva do cacau no Sul da Bahia, devido em diversas áreas os
clones autoincompatíveis não estão produzindo de acordo com o preconizado
quando foram liberados (CANTALINO, 2006). Estudos indicam que a baixa
produtividade em algumas plantações comerciais de cacau se deve a uma
polinização pouco efetiva (LEAL, 2005), e que esta característica depende de
condições ambientais favoráveis para o seu sucesso (MARTÍN, 1982).
Considerando a genealogia do material híbrido cultivado no sul da Bahia,
que tem como seus progenitores os clones Sca-6, Sca-12 e IMC-67 e outros
acessos Alto Amazônicos que são materiais autoincompatíveis e não possuem
alelos para autocompatibilidade, esperava-se que muitos desses híbridos
selecionados nas fazendas da região sul baiana fossem autoincompatíveis.
Porém um número considerável de seleções com genótipos autocompatíveis
foi identificado nesses cultivos (YAMADA, 2005). A maioria das variedades
clonais em uso pelos produtores é autoincompatível, e testes de
intercompatibilidade necessitam ser realizados para avaliar o grau de
compatibilidade entre elas (BARTLEY, 2005). Mesmo em plantios policlonais, é
necessário que os clones utilizados apresentem um alto grau de
compatibilidade entre eles, caso contrário, os efeitos da incompatibilidade
gamética sobre a produção irão se manifestar de forma acentuada, traduzindo-
se em desuniformidade em tamanho e número de sementes por fruto, como
também na quantidade de frutos por planta. A inclusão de clones
autocompatíveis certamente reduz os efeitos negativos da incompatibilidade
(BARTLEY, 2005).
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As almofadas florais não sendo danificadas por tratos culturais ou doenças
podem produzir frutos por vários anos. As flores são hermafroditas e
pentâmeras, apresentando pétalas, sépalas, estames e estaminódios ou falsos
estames. No pistilo, o ovário apresenta de 30 a 70 óvulos. Os órgãos
reprodutivos (estame e pistilo) encontram-se isolados na flor por duas barreiras
físicas: a coroa de estaminódios e as próprias pétalas que envolvem as
anteras. A presença dessas barreiras favorece a polinização cruzada, mesmo
em cacaueiros autocompatíveis, embora nesses a taxa de autofecundação seja
relativamente alta. Quando a planta é jovem, as flores são produzidas
principalmente no tronco. Em plantas adultas, elas surgem por toda planta, em
maior quantidade nos ramos com mais de 1 cm de diâmetro. Plantas
autocompatíveis apresentam uma menor quantidade de flores que as plantas
autoincompatíveis, porém a porcentagem de frutos nestas plantas é maior e
esses frutos (COPE, 1939). Um cacaueiro adulto pode produzir mais de 100 a
150 mil flores por ano, das quais menos de 5% é polinizada, e somente 0,5 a
5% resulta na produção de frutos (COPE, 1976; ANEJA, et al., 1999). Isto é em
parte devido ao fato de que a taxa efetiva de autofertilização em árvores
autoincompatíveis é baixa, enquanto que árvores autocompativeis pode
alcançar até 43% (YAMADA; GURIES, 1998).
O pólen é pegajoso, formando pequenos grumos o que favorece a sua
aderência à superfície de insetos, que comumente são os agentes
polinizadores das flores. A flor não polinizada nas primeiras 8 a 10 horas após
a emergência cai; esse aborto ocorre normalmente nas 24 a 36 horas
subseqüentes (ANEJA et al., 1999; HASENSTEIN; ZAVADA, 2001). O tempo
que transcorre entre a germinação do pólen no estigma e a fecundação é de
aproximadamente seis horas (CHEESMAN, 1938). Se a polinização é realizada
e a fecundação ocorre, o ovário e o pedicelo aumentam de tamanho, e a coroa
murcha e se deteriora (ANEJA et al, 1999).
Em cacaueiros, a abscisão floral pode ser uma conseqüência da reação
de rejeição com o reconhecimento precedendo as primeiras mudanças
detectáveis no ambiente hormonal que pode conduzir à abscisão floral (ANEJA
et al., 1994; BAKER, et al., 1997). A abscisão é um processo de regulação
hormonal que envolve o órgão da planta e a zona de abscisão. O etileno e o
acido indol acético (AIA), uma auxina, têm um papel primário no controle da
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abscisão. O primeiro é o principal promotor da abscisão e o segundo pode inibir
ou aumentar a produção do primeiro e prevenir ou acelerar a reação de
abscisão (ANEJA et al, 1999; HASENSTEIN; ZAVADA, 2001). O acido
abscísico aumenta nos tecidos em abscisão e participa do processo.
O sistema de reprodução é componente importante da estrutura
genética de populações. A distribuição da variação genética dentro de
progênie, entre indivíduos da população e entre subdivisões da população, é
regulada pelo sistema de reprodução da espécie (HAMRICK, 1982). Apesar de
o cacaueiro apresentar flores hermafroditas e homógamas, sua polinização se
limita quase que exclusivamente ao concurso de algumas espécies de
micromoscas forcipomyia, pois só elas conseguem depositar de 35 a 40 grãos
de pólen viáveis, quantidade mínima para a formação de um fruto
desenvolvido, embora insetos, tais como trips, formigas e afídeos possam
promover polinização acidental (CHAPMAN; SORIA, 1983). Segundo
Kaufmann, (1975) tais micromoscas são supostamente atraídas pelas partes
coloridas da flor, especialmente pelas linhas guias das pétalas e pelos
estaminódios, o que diverge da opinião de Soria et al, (1982), que acreditam
que o comportamento desses insetos independa da coloração das flores. As
anteras das flores dos cacaueiros encontram-se revestidas por um
prolongamento das pétalas, em forma côncava, denominado "cógula" ou
"cuculo" e o ovário é envolvido por um círculo de estaminódios inférteis. Essa
estrutura complexa de flor exige a participação de insetos para proceder à
polinização e representa uma adaptação de T. cacao a atividade de seu
principal agente polinizador (SORIA et al., 1975).
O cacaueiro é considerado uma planta alógama (95% fecundação
cruzada), apesar de que também ocorre uma taxa de autogamia
(autofecundação) relativamente alta. A ocorrência desse elevado grau de
fecundação cruzada é característico dessa espécie, cujas taxas de cruzamento
natural variam de 50 a 100%. Esse fato contribui para que as populações
formadas a partir de sementes obtidas sem controle de polinização apresentem
elevada heterogeneidade (VELLO; NASCIMENTO, 1971; TOXOPEUS, 1972)
ou para que as populações locais, mesmo que tenham evoluído em condição
de isolamento, representem um grupo mais ou menos heterogêneo formado
por indivíduos heterozigóticos (CHEESMAN, 1944). O modo de polinização em
15
cacau contribui para que ocorra, freqüentemente, a deposição da mistura de
pólen da própria planta e das plantas vizinhas sobre o estigma (VOELCKER,
1940). No entanto, a presença de sistemas de incompatibilidade na população
pode limitar a fecundação natural e restringir o fluxo de genes, bem como o
rendimento de plantas autoincompatíveis, embora tais plantas apresentem,
freqüentemente, cruzamento compatível entre si. Esse mecanismo de
incompatibilidade é exclusivo de T. cacao, pois associa durante a
microsporogênese, fatores gametofíticos e esporofíticos no controle do fenótipo
de incompatibilidade do pólen (BARTLEY, 2005).
16
e de amêndoas secas que os auto-incompatíveis (LOCKWOOD, 1977 e
MORERA et al., 1994).
A autoincompatibilidade ocorre em uma ampla gama de famílias e
gêneros de angiospermas, inclusive em várias plantas de interesse econômico
(BREWBAKER, 1957) como em espécies de Nicotiana, Brassica, Medicago,
Trifolium, Secale, Lotus, Helianthus e Theobroma. Os trabalhos publicados
sobre o assunto abrangem desde aspectos morfológicos, fisiológicos, aplicação
no melhoramento até a biologia molecular e genética da autoincompatibilidade
(BREWBAKER, 1957; DE NETTANCOURT, 2000).
Existem dois tipos principais de AI, a gametofítica (AIG), em que a
especificidade do pólen é gerada pelo alelo S do genoma haplóide do grão do
pólen (gametófito), e a esporofítica (AIE), em que a especificidade é gerada
pelo genótipo diplóide da planta adulta (esporófito) que deu origem ao grão de
pólen. A reação da AI engloba desde o impedimento da germinação do pólen
até o rompimento do tubo polínico (HESLOP-HARRISON, 1983; DE
NETTANCOURT, 1977; 2000).
Devido à sua ampla distribuição entre as angiospermas, a AI teria
surgido precocemente, antes que houvesse divergência evolutiva
(WHITEHOUSE, 1951), ou teria havido um surgimento recorrente durante a
evolução (BATEMAN, 1952). A AIG é o sistema mais comum entre as plantas,
e supõe-se que seja o mais primitivo. (HESLOP-HARRISON, 1983; NEWBIGIN
et al., 1993; DE NETTANCOURT, 1997; 2000). Estudos de seqüenciamento
gênico indicam que os locos para AI evoluíram a partir de origens
independentes, diversas vezes, na evolução das plantas com flores
(CHARLESWORTH; AWADALLA, 1998).
Além da AI, existe também o que se chama de pseudo-compatibilidade,
que é a ocorrência de autocompatibilidade em espécies normalmente auto-
incompatíveis. Nesse caso, ocorre formação de sementes sob algumas
condições fisiológicas e ambientais especiais. Sabe-se que está sob controle
genético, mas tem sido pouco estudada (DE NETTANCOURT, 1977; 2000).
17
2.6.1 Autoincompatibilidade gametofítica
18
ou não de AI não será o alelo que o pólen carrega, mas sim os alelos presentes
no tecido diplóide da planta. Por exemplo, nos seguintes cruzamentos,
envolvendo progenitores com diversos genótipos para os alelos S,
considerando S1 dominante em relação a S2 e S3 e S3 dominante em relação a
S 4:
a) S1S2 (feminino) x S1S2 (masculino) grãos de pólen portarão alelos
S1 ou S2, mas expressarão sempre o S1 tubos polínicos não irão
crescer não haverá progênie;
b) S1S2 (feminino) x S1S3 (masculino) grãos de pólen portarão alelos
S1 ou S3, mas expressarão sempre o S1 tubos polínicos não irão
crescer não haverá progênie;
c) S1S2 (feminino) x S3S4 (masculino) grãos de pólen portarão alelos
S3 ou S4, mas expressarão sempre o S3 todos os tubos polínicos irão
crescer progênie será S1S3, S1S4, S2S3 e S2S4.
A reação de AIE ocorre no estigma e as espécies que a apresentam são
aquelas do tipo em que o pólen é liberado na forma trinucleada. Os alelos S
têm como sítio de ação as células das papilas do estigma. A reação de
incompatibilidade é rápida e precoce e a capacidade de discriminar entre o
pólen da mesma planta e um pólen diferente é afetada pelo estádio de
desenvolvimento do estigma. A síntese dos produtos dos alelos-S ocorre
supostamente antes do fim da meiose (NEWBIGIN et al., 1993; DE
NETTANCOURT, 2000).
A AIE pode, às vezes, estar associada a polimorfismos florais. Quando
isto não ocorre, diz-se que a AIE é homomórfica, ou seja, plantas com
diferentes genótipos para incompatibilidade são morfologicamente idênticas.
Quando há ligação entre polimorfismos florais e genótipos para
incompatibilidade, diz-se que a AIE é heteromórfica. Neste caso, as diferenças
na morfologia floral estão associadas a tipos de incompatibilidade. Em geral,
estas diferenças envolvem diferentes comprimentos de estiletes e estames.
Espécies distílicas são aquelas em que uma das formas florais tem estiletes
longos e anteras curtas e a outra forma tem estilete curto e anteras longas. As
polinizações compatíveis ocorrem apenas entre anteras e estigmas do mesmo
comprimento, ou seja, entre diferentes formas florais (DE NETTANCOURT,
1977; 2000; RICHARDS, 1997).
19
A herança da AIE é variável, podendo ser controlada tanto por um único
loco ou até por muitos locos (GOODWILLIE, 1997). A AIE é considerada um
sistema bastante complexo e que pode abranger diversos tipos de mecanismos
fisiológicos e genéticos (HESLOP-HARRISON, 1983; DE NETTANCOURT,
1977; 1997; 2000; RICHARDS, 1997). Os genes-S do sistema de AIE são
superfamílias de genes. O grande polimorfismo existente para o número de
alelos S tanto nos sistemas de AIG e AIE, bem como a manutenção deste
polimorfismo, é explicado pela ação da seleção que favoreceria diferentes
alelos, assegurando a fertilidade da população. Alelos raros teriam uma
vantagem de fertilidade, pois os grãos de pólen que os portassem não seriam
rejeitados pelas plantas receptoras e estes alelos tenderiam a aumentar em
freqüência (CHARLESWORTH; GUTTMAN, 1997).
Muitas questões ainda estão para serem resolvidas, porém os estudos
envolvendo o processo de autoincompatibilidade ao nível molecular em plantas
contribuíram grandemente para o entendimento atual sobre o processo de
reconhecimento e rejeição dos grãos incompatíveis pelo estigma. Apesar de
alguns detalhes ainda serem desconhecidos, o volume de conhecimentos
acumulados para as diferentes espécies, nos permite uma visão bastante
ampla do processo.
A utilização da AI no melhoramento de plantas é feita há bastante
tempo, mas existe uma lacuna entre o conhecimento teórico da AI e a
aplicação destes conhecimentos no melhoramento genético (DE
NETTANCOURT, 1997). A ocorrência de AI em espécies de interesse
econômico pode ter uma importância muito grande, sendo muito positiva em
alguns casos e um empecilho em outros, dependendo da parte da planta que é
colhida e do tipo de reprodução da mesma (DE NETTANCOURT, 1977).
20
no tubo polínico (DE NETTANCOURT, 1977). O tipo de controle genético é
polifatorial gameto-esporofítico e, apesar de este ser o exemplo mais marcante,
existem referências à inibição ovariana em outras espécies (DE
NETTANCOURT, 2000). A auto-incompatibilidade em plantas que produzem
flores, a exemplo do cacau, nada mais é que um processo bioquímico de
reconhecimento e rejeição que impede a autofertilização (singamia). Estão
envolvidas as interações entre o grão de pólen e o pistilo (estigma ou estilete).
E o tubo polínico, que se origina com a germinação do pólen, pode ser inibido
tanto no estigma quanto no estilete.
A primeira vez que se mencionou a existência de incompatibilidade em
cacaueiros foi em 1925, quando Harland, em Trinidad, observando cacaueiros
sadios e de mesmo desenvolvimento vegetativo, notou que havia uma
acentuada diferença entre eles quanto ao número de frutos, e que alguns deles
nem chegavam a produzir. Porém, coube a Pound (1932), realizar os primeiros
estudos sobre a incompatibilidade do cacaueiro, o qual verificou que
determinadas plantas não se autofecundavam, ou seja, eram
autoincompatíveis. Observou ainda que flores de árvores incompatíveis tinham
também a característica de seu pólen não fecundar outras plantas
incompatíveis (POUND, 1935a) e que, o pólen proveniente de uma planta
autocompatível é viável sobre qualquer estigma, porém quando provém de
plantas autoincompatíveis sua viabilidade se restringe aos estigmas de
cacaueiros autocompatíveis (POUND, 1935b).
Cheesman (1938) confirmou a existência de incompatibilidade em
plantações de Trinidad e classificou as plantas em: 1) Plantas autocompatíveis,
que frutificam ao serem polinizadas por pólen de outras plantas
autocompatíveis; 2) plantas autocompatíveis que podem frutificar quando
polinizadas com pólen de plantas autoincompatíveis; 3) plantas
autoincompatíveis que frutificam ao serem polinizadas com pólen de outras
árvores autoincompatíveis; 4) Plantas autoincompatíveis que não frutificam ao
serem polinizadas por pólen de outras plantas autoincompatíveis.
Outros investigadores vieram, posteriormente, a estudar este
mecanismo (KNIGHT; ROGERS 1953; 1955; COPE 1958; 1959; 1962) e
mostraram que uma polinização incompatível não resulta da inibição da
germinação do pólen ou do crescimento do tubo polínico, como foi postulado
21
por Posnette (1938), eles demonstraram que isso ocorre devido a uma falha na
fusão do núcleo espermático do grão-de-pólen com a oosfera numa
percentagem de óvulos após uma polinização incompatível, tendo como
conseqüência o aborto das flores.
Knight & Rogers (1955), propuseram uma hipótese genética para
explicar as incompatibilidades do cacaueiro baseados no fato de que a
fertilização estaria sendo controlada por uma série de alelos múltiplos S, de
natureza esporofítica, em número de cinco com a seguinte ordem: S1 > S2 = S3
> S4 > S5, e que a incompatibilidade ocorre depois que o tubo polínico penetra
no óvulo, sendo a reação esporofítica e determinada pela constituição diplóide
dos genitores.
Cope (1962), demonstrou que as incompatibilidades em T. cacao estaria
controlada pelo sistema genético da fusão e não fusão dos óvulos, repousando
nisto o sucesso ou o fracasso da singamia. Sugeriu ainda que a hipótese
formulada por Knight & Rogers (1955), na qual uma série de alelos “S” de ação
esporofítica estaria governando as incompatibilidades seria inadequada para
explicar os resultados obtidos em seu trabalho. Cope postulou ainda a
existência de um novo alelo S6 na série de alelos múltiplos de
incompatibilidades e de dois locos complementares A e B, independentes,
porém complementares aos genes S. Estes acessórios teriam a função de
produzir um substrato, que ausente, impediria as incompatibilidades de se
manifestarem. Os locos A e B atuariam antes da meiose expressando ação de
dominância e produzindo um precursor inespecífico para os alelos S após a
meiose. Se presentes na forma dominante concorrem para que os alelos atuem
em base esporofítica, porém, se tais locos estivessem na forma recessiva,
todas as formas de S seriam autocompatíveis. Neste mesmo trabalho, Cope
(1962), propôs fórmulas genotípicas de incompatibilidades para a série de
cultivares por ele estudado e estabeleceu que os alelos S teriam a seguinte
ordem de dominância: Sa = Sb = Sc > Sd > Sf. O padrão de segregação dos
locos A, B e S e a distribuição dos fenótipos após cruzamentos entre
cacaueiros auto-incompatíveis e autocompatíveis, em todas as possibilidades,
foram apresentados por Bartley & Cope, (1973).
O crescimento do tubo polínico em polinização incompatível é
comparável ao da polinização compatível normal, com os anterozóides
22
atingindo normalmente o saco embrionário. Entretanto, a anormalidade surge
no saco embrionário e se processa por impedimento da singamia: a fusão dos
gametas masculinos com os femininos carregando o mesmo alelo dominante.
De modo que, em polinizações incompatíveis, podem ocorrer 25%, 50% e até
100% de abortos (Cope, 1958 e 1962), demonstrando que o fenômeno exibe
gradações em sua expressão. Essa gradação na expressão da auto-
incompatibilidade tem sido também confirmada com marcadores bioquímicos.
Lanaud et al., (1987), por exemplo, utilizando marcadores isoenzimáticos,
observaram que a percentagem de sementes autofecundadas, em clones auto-
incompatíveis, variou de 0 a 89%, enquanto Yamada (1991), verificou taxas de
endogamia, em clones autoincompatíveis, que variaram apenas de 3 a 8%.
Levando em consideração resultados encontrados em autofecundações
de clones autocompatíveis, Coral (1970) propôs a hipótese da existência de
clones com diferentes graus de autocompatibilidade, e que tal fenômeno
poderia ser explicado pela introdução de dois pares de genes independentes, X
e Z, complementares e modificadores do gene S de incompatibilidade.
Adicionalmente, o cruzamento entre determinados clones autocompatíveis
pode gerar progênies parcialmente ou totalmente autoincompatíveis. Estudos
mostraram que algumas progênies de clones como PA-150 (YAMADA et al.,
1988), UF-613 (BARTLEY; YAMADA, 1982) e TSH (ICS-1x Sca-6) podem
segregar para autocompatibilidade (DIAS, 2001; YAMADA et al., 2005).
Pandey, 1960, reconheceu a natureza genética do sistema de
incompatibilidade em cacau, porém criticou a interpretação genética
desnecessariamente complexa dada a ele. Para justificar a ocorrência de
híbridos auto-incompatíveis gerados de genitores autocompatíveis, este autor
utilizou-se da interação alélica competitiva, descartando a postulação dos locos
independentes A e B proposta por Cope (1958, 1962). A interação competitiva
entre alelos S, ao impedir a expressão completa de qualquer deles
isoladamente, explicaria o evento. Um cacaueiro tendo dois alelos S
interagindo competitivamente, não produziria a substância específica de
incompatibilidade em quantidade suficiente para crescimento de pólen, para
qualquer dos dois alelos e seria completamente autocompatível. Não obstante,
a progênie do cruzamento entre dois desses cacaueiros poderia ser então
auto-incompatível. De modo que as árvores autocompatíveis e auto-
23
incompatíveis na progênie poderiam surgir nas proporções de 3:1, 1:1 e 1:3 e
esta hipótese de Pandey explicaria bem o evento com base somente nos alelos
S. A ação de dominância de um alelo sobre o outro e a ação de independência
de ambos os alelos já haviam sido adequadamente utilizadas na teoria de
Knight & Rogers (1953, 1955) para explicar o funcionamento dos alelos do loco
S. E, realmente, os estudos de incompatibilidade (CORAL, 1970; CARLETTO;
SORIA, 1973) têm demonstrado que o fenômeno em T. cacao é melhor
explicado pela teoria do loco S de Knight & Rogers (1953, 1955), do que pela
teoria dos locos independentes A, B e S de Cope (1958, 1962).
Existem também estudos mostrando que o reconhecimento da
autocompatibilidade ocorre antes do contato do pólen com óvulo. Aneja et al.,
(1994), verificaram que no clone IMC 30, auto-incompatível, o seu pólen não
germinou. Entretanto, com a aplicação de CO2 a reação de
autoincompatibilidade foi inibida em flores autopolinizadas, indicando que o
sistema de autoincompatibilidade em cacaueiros pode ser um resultado de dois
processos: Primeiramente com um aumento na quantidade de ácido abscísico
em resposta à interação pólen-estigma. A segunda resposta afeta os níveis de
AIA e etileno, após o contato do tubo polínico com o óvulo, estabelecendo as
condições hormonais que determinam o aborto da flor (ANEJA et al., 1994;.
ANEJA et al., 1999; HASENSTEIN; ZAVADA, 2001) Assim, a abscisão parece
ocorrer se altos níveis de etileno e de ácido abscísico estão presentes, o que é
observado em flores incompatíveis polinizadas. Por outro lado, é possível
retardar ou até mesmo inibir a abscisão com a aplicação tanto de CO2 quanto
de auxinas sintéticas ou de outros compostos que aumentem os níveis de
auxinas ou diminuam os níveis de acido abscísico e, ou etileno (ALMEIDA;
VALLE, 2007).
24
terceiro, sétimo e 15º dias após as polinizações (TERREROS et al., 1982;
YAMADA et al., 1982; YAMADA; BARTLEY, 1984; PINTO et al., 1998).
Dois critérios são comumente empregados para se testar a reação de
incompatibilidade de dado genótipo. Pelo primeiro, o número mínimo de flores
retidas nas autopolinizações e nos cruzamentos, com uma ou mais
testemunhas para declarar a compatibilidade, é estimado empregando-se o
qui-quadrado para testar a proporção de 1:1, a 5% de probabilidade com 1 grau
de liberdade (TERREROS et al., 1982). Pelo segundo critério, a
compatibilidade sexual de um material é determinada pela retenção de flores
(índice de pegamento) no 15º dia após as polinizações. López (1982) considera
que um material é autocompatível se este apresentar um índice de pegamento
de no mínimo 2%. Já autores como Bartley & Cope (1973), Terreros et al.,
(1982), Lopes & Carletto (1995) e León (2000), consideram que esse índice de
pegamento deva ser superior a 5%, enquanto que para Pinto et al., (1998) é
necessário um índice de pegamento de pelo menos 10%, pois ocasionalmente
plantas autoincompatíveis podem produzir um ou outro fruto nas polinizações.
Alguns autores ainda recomendam valores como, 14% (LEAL 2005) e até 40%
(CASTILHO, 2005), acreditando que em polinizações artificiais o pólen
colocado diretamente no estigma da flor facilite o pegamento das polinizações.
Segundo Lopes & Carletto (1995), este segundo critério parece superestimar a
autocompatibilidade mais que o primeiro, pois o tamanho amostral reduzido
influencia grandemente os resultados comprometendo assim as inferências.
Os resultados confusos e contraditórios obtidos nos estudos da reação
de incompatibilidade mostram claramente a deficiência dos procedimentos
adotados na abordagem do fenômeno. A abscisão das flores, por exemplo,
pode ser causada tanto pela ineficiência na mecânica de polinização quanto
por reações fisiológicas e sazonais ocorridas no órgão reprodutor. Também os
critérios adotados para declaração de incompatibilidade são discutíveis.
Existem variações, desde oito (LEAL, 2005), 10 e (CARLETTO, 1972) até 15
dias (PINTO et al., 1998), no período pós-polinização para tal declaração, o
que impede a comparação de resultados obtidos por diferentes autores. O
tamanho amostral utilizado nestes estudos é também altamente variável, com
alguns autores realizando apenas 15 (BARTLEY; COPE 1973)
autopolinizações e polinizações cruzadas, enquanto outros empregam até 40
25
(PINTO et al., 1998). Segundo Lopes & Carletto (1995), para cada cacaueiro,
utiliza-se entre 15 e 40 flores para autopolinização e polinizações cruzadas,
sendo 26 o número médio ótimo. Como se não bastasse, as várias teorias
propostas para a reação são complexas, particularizadas por genótipos, e,
portanto, não se aplicam a todas as situações (DIAS, 2001).
26
Centro de Ciências do Cacau (Regina Celle Rebouças Machado, informação
pessoal).
Nestas coleções, cada tipo de cacaueiro (acesso clonal ou seminal) é
individualmente representado por várias plantas (normalmente 10) que são
repetições do mesmo genótipo, o que garante e facilita a sua manutenção,
caracterização e avaliação. Esses bancos nada mais são que depósitos
naturais de genes, representando a variabilidade natural da espécie
Theobroma cacao.
É de fundamental importância à realização da caracterização molecular
e morfológica dos acessos que compõem as coleções visando conhecer as
potencialidades das mesmas, identificando assim a variabilidade entre e dentre
as populações. Essas são as ferramentas indispensáveis aos fitomelhoradores
do programa de melhoramento do cacaueiro, que através de cruzamentos
apropriados, possam explorar a variabilidade genética e promover a criação de
cultivares com características superiores para uso comercial (BARTLEY, 2005).
A presença de erros na identificação de acessos em vários bancos de
germoplasma parece ser mais comum do que se espera e, nesse sentido, visto
a grande importância dos bancos de germoplasma, um esforço internacional é
necessário para a caracterização de todas as coleções de germoplasma de
cacaueiro do mundo (FALEIRO et al., 2002). Dentro do escopo do projeto
Internacional “Conservação e Utilização de Germoplasma de Cacaueiro”,
financiado pela parceria CFC/ICCO/IPGRI, Risterucci et al (2000b) avaliaram
148 indivíduos de 28 clones, amostrados em várias coleções nacionais,
empregando 10 locos de microssatélites, e identificaram cerca de 30% dos
indivíduos com erros de identificação. Figueira (1998) demonstrou por meio de
marcadores RAPD, diferenças na identificação de acessos de cacau entre os
bancos de germoplasma do Brasil e da Malásia. De um estudo com 20
genótipos avaliados com 19 SSRs, Risterucci et al (2001) sugeriu que 15 locos
microssatélites são suficientes para verificação da identidade e Swanson et al
(2003) sugeriu que 11 SSRs podem ser suficientes para a genotipagem de
acessos de cacau. A identificação de acessos por genotipagem molecular, ao
contrário da caracterização morfo-agronômica, independe da idade da planta,
do estádio de desenvolvimento em que ela se encontra e mesmo do ambiente
em que é cultivada.
27
2.9 Marcadores moleculares e desenvolvimento de mapas de ligação
28
marcadores têm sido amplamente utilizados em muitas espécies de plantas por
serem abundantes, com freqüência média de um a cada 50 mil pares de bases,
possuírem alto grau de polimorfismo, serem loco-específicos, apresentarem
reprodutibilidade dos resultados, baixa quantidade de DNA requerida nas
análises, serem detectados facilmente utilizando gel de agarose, poliacrilamida
ou através de sequenciamento automático (PUGH et al., 2004). Atualmente
existem mapeados muitos locos de microssatélites para o cacaueiro
distribuídos ao longo dos 10 cromossomos (LANAUD et al., 1995; PUGH et al.,
2004; BROWN et al., 2005; SCHNELL et al., 2007).
O mapeamento genético teve início após o reconhecimento do
fenômeno da ligação genética (MORGAN, 1910). Ele toma como base a
hipótese de que a co-segregação de dois marcadores indica proximidade entre
eles, e que a probabilidade de ocorrer permutas genéticas entre esses dois
marcadores é menor, quanto menor for à distância entre eles. Dessa forma, é
possível ordenar linearmente a informação genética ao longo dos
cromossomos. A grande disponibilidade de marcadores moleculares e
metodologias estatísticas eficientes fizeram com que, atualmente, estejam
disponíveis mapas genéticos saturados para a maioria das espécies cultivadas,
dentre elas a soja (CORRÊA, 1995), o café (PEARL et al., 2004), o milho
(BRUNELLI et al., 2002), o eucalipto (GRATTAPAGLIA; SEDEROFF, 1994), o
feijão (FALEIRO et al., 2003), além do cacaueiro, onde os diferentes mapas
construídos (LANAUD et al., 1995; CROUZILLAT et al., 1996; RISTERUCCI et
al., 2000; CROUZILLAT et al., 2000; FLAMENT et al., 2001; QUEIROZ et al.,
2003; CLÉMENT, 2003; RISTERUCCI et al., 2003; LANAUD et al., 2004),
culminou com o estabelecimento do primeiro mapa consenso para o cacau
(PUGH et al., 2004), além disso diversos outros mapas foram construídos
visando obter informações relevantes aos diversos programas de
melhoramento do cacaueiro desenvolvidos em todo o mundo (LANAUD et al.,
1995; MOTIAL et al., 2000; ARAÚJO, 2002; BROWN et al., 2005; FALEIRO et
al., 2006; SCHNELL et al., 2007), e pelo menos 13 outros mapas de ligação já
foram desenvolvidos e utilizados principalmente para identificar regiões
genômicas associadas com componentes de produção, vigor e resistência a
várias espécies e isolados de Phytophthora que atacam o cacaueiro em todas
29
as partes do mundo e também para resistência a M. perniciosa (FIGUEIRA;
CASCARDO, 2001; FIGUEIRA; ALLEMANO, 2005).
Segundo Ahnert (2000), a construção de mapa genético saturado é
relevante para obter informações importantes sobre estrutura genética da
espécie, desde a associação com caracteres qualitativos, localização dos
mesmos grupos de ligação e identificação de regiões genômicas associadas a
caracteres quantitativos. A utilização desses mapas favorece um maior estudo
da cultura, pois a cobertura e análise completa de genomas; a decomposição
de características genéticas complexas nos seus componentes mendelianos; a
localização das regiões genômicas que controlam caracteres de importância; a
quantificação do efeito destas regiões genômicas que controlam caracteres de
importância; facilitar o melhoramento assistido por marcadores e clonagem
baseada em mapa (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
Os mapas genéticos são construídos pela análise de co-segregação dos
marcadores genéticos nos produtos da meiose, em progênies originadas de
cruzamentos entre genitores contrastantes para um determinado caráter (LIU,
1998). Os marcadores localizados em diferentes cromossomos devem
segregar independentemente e os marcadores localizados no mesmo
cromossomo são transmitidos conjuntamente, a menos que esta ligação seja
quebrada por uma recombinação no gameta genitor. A construção de mapas
genéticos e posterior localização de QTLs associados a características de
interesse agronômico baseia-se em diferentes metodologias estatísticas que
possibilitam associar as informações da segregação de marcas moleculares às
características fenotípicas que se desejam mapear (LIU, 1998).
O desenvolvimento de mapas genômicos envolve a seleção da
população mais apropriada para mapear; o cálculo das freqüências de
recombinação em pares, usando esta população; o estabelecimento de grupos
de ligação; a estimativa das distâncias no mapa entre marcas e a determinação
da ordem linear por marcadores, de forma a minimizar os eventos de
recombinação (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998). A escolha de genitores
para desenvolvimento de mapas genômicos é crítica em plantas perenes
arbóreas e o tipo de marcador a ser utilizado deve ser considerado. Os
genitores devem ser importantes no programa de melhoramento, apresentar
nível satisfatório de polimorfismo para o tipo de marcador a ser usado, além de
30
segregar para várias características qualitativas e quantitativas de importância
(componentes de produção e resistência à doença, etc.) e de qualidade do
produto, para maximizar a obtenção de informações (FIGUEIRA; CASCARDO,
2001).
Em geral, os mapas genéticos do cacaueiro vêm sendo gerados a partir
de progênies F1, F2, ou pseudo test cross, derivadas de cruzamentos entre
genitores heterozigotos (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1988). Para
construções destes mapas utilizam-se marcadores dominantes, explorando a
configuração de pseudo-testcross e marcadores co-dominantes (LANAUD et
al., 1995; RISTERUCCI et al., 2000; FLAMENT et al., 2001; CLÉMENT et al.,
2003; PUGH et al., 2004; BROWN et al., 2005). São construídos dois mapas,
sendo um para cada genitor, baseado na segregação de marcadores co-
dominantes, como RFLPs, microssatélites e isoenzimas, que permitem a fusão
dos diversos mapas, ou ainda a comparação direta com o mapa de referência
estabelecido para o cacaueiro (PUGH et al., 2004). Os marcadores dominantes
(RAPDs e AFLPs), mais abundantes, foram usados para saturar esses mapas
genéticos. Para o cacaueiro, comumente um genótipo altamente heterozigótico
é cruzado com um genótipo mais homozigoto, tal como o mutante albino
‘Catongo’. Alternativamente, já foi utilizada para mapeamento uma população
de retrocruzamento, derivada de uma única planta F1 retrocruzada com o
genitor mais homozigoto (CROUZILLAT et al., 1996), enquanto que em outros
casos específicos, populações F2 foram especialmente geradas e usadas para
a identificação de regiões genômicas associadas com sabor de chocolate e
qualidade da semente (CROUZILLAT et al., 2001; ARAÚJO, 2002) e
resistência à M. perniciosa (QUEIROZ et al., 2003; BROWN et al., 2005;
FALEIRO et al., 2006).
O primeiro mapa de ligação do cacaueiro foi desenvolvido para a
população F1 de 100 indivíduos do cruzamento entre os clones UPA 402 x UF
676 (LANAUD et al., 1995). Foram formados dez grupos de ligação, cobrindo
759 cM e contendo 193 locos, incluindo cinco de isoenzimas, 160 de RFLPs,
sendo 101 de cDNA, 55 de sondas genômicas e quatro de genes de funções
conhecidas e 28 locos de RAPD. Este mapa foi posteriormente saturado com
marcadores adicionais, tendo sido incluídos mais 18 locos de RFLP (três
sondas de cDNA, dez genômicos, dois genes de funções conhecidas, e três
31
sondas teloméricas); dois locos de RAPD; 191 locos de AFLP e 20 de
microssatélites, totalizando 424 marcadores, englobando 885,4 cM com
espaçamento médio entre marcadores de 2,1 cM (RISTERUCCI et al., 2000).
Pugh et al., (2004) realizaram a mais recente saturação do mapa consensual
do cacaueiro acrescentando mais 35 indivíduos à população F1 originalmente
utilizada por Lanaud et al., (1995). A versão mais atualizada do mapa
consensual do cacaueiro conta com dez grupos de ligação, cobrindo 782,8 cM
e contendo 465 locos, dos quais 268 são de microssatélites, 176 de RFLPs,
cinco de isoenzimas e 16 de Rgenes-RFLP. A média de distância entre cada
marcador é de 1,7 cM.
Para identificação de regiões genômicas associadas à resistência a M.
perniciosa, um mapa genético foi desenvolvido no Brasil para uma população
de 82 indivíduos F2 derivados da autofecundação do genótipo ‘TSH-516’, um
híbrido selecionado do cruzamento de ‘ICS1‘ x ‘Scavina 6’ (QUEIROZ et al.,
2003). O mapa genético continha 124 marcadores RAPD e 69 AFLP em 25
grupos de ligação, cobrindo 1.713 cM, e permitiu a identificação de um loco
principal de QTL, responsável por cerca de 35% da variância fenotípica para
resistência a M. perniciosa, avaliada sob condições de campo por dois anos.
Esse mapa genético foi recentemente saturado para um total de 343
marcadores (232 RAPD; 77 AFLP; e 33 microssatélites), perfazendo 16 grupos
de ligação com um total de 670 cM (FALEIRO et al., 2006). Novas avaliações
de resistência foram conduzidas num período de seis anos, permitindo a
confirmação do QTL descrito por Queiroz et al, (2003). Na saturação do mapa,
três locos de microssatélites (P02, P01 e L09) foram mapeados nessa mesma
região do QTL sendo que esses locos já haviam sido mapeados no
cromossomo 9 do mapa consensual (RISTERUCCI et al., 2000; KUHN et al.,
2003). Um novo mapa para a população F2 de autofecundação de ‘TSH-516’ foi
recentemente construído por Brown et al., (2005). Neste mapa 146 indivíduos
foram genotipados com 182 marcadores sendo 170 microssatélites, oito genes
homólogos de resistência (RGH) e quatro genes candidatos relacionados a
estresse (WRKY). O comprimento total do mapa foi estabelecido em 671,9 cM.
Dois QTLs foram encontrados, um no grupo de ligação 9, como já descrito por
Queiroz et al. (2003) e Faleiro et al. (2006), e outro no grupo I, com
porcentagem de variação fenotípica de 51% e 6%, respectivamente. O QTL do
32
grupo de ligação I foi localizado próximo das marcas mTcCIR22, mTcCIR264 e
RGH11, enquanto que o QTL do grupo IX foi próximo das mTcCIR24,
mTcCIR35 e mTcCIR157. Ambos os QTLs tiveram efeito de dominância para
resistência a M. perniciosa, sendo que o QTL de maior efeito do grupo IX foi
originário do ‘SCA 6’ e o de menor efeito do grupo I foi herdado de ‘ICS 1’.
Clement et al. (2003a) encontrou um conjuntos de QTLs relacionados ao
número de óvulos por ovário, identificados em diversos cromossomos (1, 2, 4,
5 e 6). Três QTLs foram encontrados no grupo de ligação 4 do mapa consenso
(PUGH, et al., 2004) associados aos clones DR 1 (Trinitário), S 52 (Trinitário) e
IMC 78 (Forasteiro) e explicou 23,5%, 15,0% e 24,2% respectivamente, da
variação fenotípica para essa característica. Os QTLs associados aos clones
DR 1 e IMC 78 estão situados em uma mesma região cromossômica do grupo
de ligação 4, enquanto que o associado ao clone S 52 encontra-se na marca
mTcCIR18.
Albuquerque (2006) detectou três QTLs associados à resistência à
vassoura-de-bruxa, um no grupo de ligação 8 de ICS 39 x CAB 0208 e dois no
mapa de ICS 39 x CAB 0214, sendo um no grupo de ligação 4 e outro no grupo
9. A relação genética entre os dois clones CAB genitores das populações
contrastantes e 81 genótipos de cacaueiro utilizados como fontes de
resistência a M. perniciosa foram baseadas nas freqüências alélicas de 20
locos de microssatélites. A não existência de relação de parentesco e a alta
dissimilaridade genética encontrada entre o clone Sca 6 e os CAB 0208 e CAB
0214 reforça a possibilidade destes acessos possuírem diferentes genes de
resistência a M. perniciosa. Três QTLs associados à resistência do cacaueiro a
P. palmivora foram encontrados também no grupo de ligação 4, em regiões
muito próximas de onde foi localizado o QTL associado à resistência M.
perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’ (ALBUQUERQUE, 2006). Um
destes QTLs foi encontrado por Crouzilat et al. (2000) e foi capaz de explicar
13,2% da variação fenotípica da resistência de frutos de ‘Catongo’ (Forasteiro).
Dois QTLs foram encontrados por Clement et al. (2003b) associados aos
clones IMC 78 e DR1. Estes QTLs foram capazes de explicar 22,6% e 10,1%
respectivamente, da variação fenotípica da resistência à podridão em frutos
com base em dados de campo acumulados por mais de seis anos.
33
No mapeamento de genes homólogos de resistência (RGH) realizado
por Lanaud et al. (2004) utilizando as mesmas progênies F1 do mapa de
referência do cacaueiro (PUGH et al., 2004), foram localizados quatro genes
alinhados em seqüência no grupo de ligação 4. Estes genes estavam próximos
dos locos de microssatélites mTcCIR17 e mTcCIR18 na mesma região onde
foram detectados os QTLs associados à resistência a P. palmivora (CLEMENT
et al., 2003b), à M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’
(ALBUQUERQUE, 2006) associados ao número de óvulos por ovário
(CLEMENT et al., 2003a) em cacaueiros.
34
3 MATERIAL E MÉTODOS
35
3.2 Caracterização da população quanto à compatibilidade sexual
36
considerado como ótimo, podendo ser reduzido a 15 polinizações (LOPES;
CARLETTO, 1995). As plantas que alcançaram um tamanho amostral mínimo a
partir de 15 autopolinizações também foram avaliadas quanto à compatibilidade
sexual e a determinação da autocompatibilidade foi feita baseado num IP (%)
ajustado em função do número de flores polinizadas. Desta forma, foram
consideradas autocompatíveis as progênies que apresentaram esse índice
maior ou igual a 20% em plantas com o mínimo de 15 autopolinizações, IP
igual a 15% em plantas que atingiram de 20 a 25 autopolinizações e IP igual a
10% para as plantas com o mínimo de 26 autopolinizações.
A distribuição da freqüência para o número de flores polinizadas foi
analisada em uma amostra de 250 plantas polinizadas. Os coeficientes de
correlação de Pearson foram determinados para as variáveis flores polinizadas
(FP) e índice de pegamento (IP) a partir das 60 plantas que apresentaram
acima de 15 flores polinizadas. A análise de segregação da característica
compatibilidade sexual na amostra de 60 plantas da população foi realizada
com base no teste qui-quadrado a 5% de significância. Todas as análise
estatísticas foram realizadas com o software Bioestat 5.0 (AYRES et al., 2007).
37
As medidas de correlação de Pearson foram calculadas entre a
característica de compatibilidade sexual e as características morfo-fisiológicas
dos frutos para uma amostra de 60 plantas da progênie.
38
A corrida eletroforética foi realizada com 80 V, durante 1 hora. Os géis
foram corados com brometo de etídio a 10 mg.mL-1, fotodocumentados sob luz
ultra violeta (UV). A concentração do DNA de cada amostra dos genitores foi
estimada pelo espectrofotômetro a 260 nm Cary Winv 50, utilizando-se o
software RNA&DNA (SAMBROOK et al., 1989) e, em seguida diluída para 10
ng.µL-1. A qualidade do DNA foi avaliada tanto por gel de agarose 1% como por
espectrofotometria, considerando a razão A260/A280.
39
3.4.2.2 Reações microssatélites
40
3.4.3 Genotipagem da população segregante
41
presentes nos genitores TSH-1188 e CCN-51 tiveram suas origens
determinadas e também puderam ser utilizados nas análises subseqüentes.
Dentre as 60 plantas que atingiram o mínimo de 15 autopolinizações,
somente as 44 foram genotipadas com os primers microssatélites. Cada alelo
SSR exclusivo de TSH-1188 foi analisado quanto à segregação na proporção
1:1 pelo teste qui-quadrado; procedimento idêntico foi realizado com os alelos
exclusivos de CCN-51. A codificação dos dados foi realizada de acordo com
Lander et al. (1987). Portanto, a matriz com os comprimentos de alelos foi
transformada em uma matriz de A e H e os genótipos nos locos contendo
alelos exclusivos para pelo menos um dos genitores foram padronizados.
As características cor do fruto e compatibilidade foram incluídas nessa
análise, codificando-as da seguinte forma: (i) para testar a hipótese de ligação
entre características e alelos exclusivos de TSH-1188, progênies com fruto
roxo foram codificadas como H e fruto amarelo como A, enquanto que
progênies autoincompatíveis como H e autocompatíveis como A; (ii) para testar
a hipótese de ligação entre características e alelos exclusivos de CCN-51,
progênies com fruto amarelo foram codificadas como H e fruto roxo como A,
enquanto que progênies autocompatíveis como H e autoincompatíveis como A.
A análise pelo teste de multipontos, empregando-se LOD > 3,5 e r ≤ 0,5
foi feita com auxílio dos comandos “group”, "Compare" e "Map" do programa
MAPMAKER/EXP 3.0.b. (LANDER et al., 1987; LINCOLN et al., 1992). Além do
comando básico de mapeamento pelo teste multipontos, testes de ligação
adicionais foram utilizados para quantificar os valores de LOD e distancia
genética relativos a hipóteses de ligação das características com o conjunto de
marcadores, utilizando-se o comando "Try" do Mapmaker.
42
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
43
2001). Desta forma, espera-se nos próximos anos de avaliação, alcançar um
maior número de polinizações por planta.
44
polinizações, esse número de polinizações artificiais pode ser reduzido até o
mínimo utilizado neste trabalho.
45
Figura 2. Número de plantas observado e esperado para a característica da
autocompatibilidade (AC) e autoincompatibilidade (AI), em 60 plantas F1 do
cruzamento TSH-1188 x CCN-51.
46
A análise da segregação conjunta das características cor do fruto e
compatibilidade sexual (Figura 3), apresentou uma proporção de 3:3:1:1, para
as classes fenotípicas: 1) plantas autoincompatívels com frutos roxo (21
plantas); 2) plantas autocompatíveis com fruto roxo (22 plantas); 3) plantas
autocompatíveis com fruto verde (7 plantas); e 4) plantas autoincompatíveis e
fruto verde (10 plantas).
Estes resultados esta compatível com o produto das probabilidades de
independência dos dois locos, nos quais se observou a segregação 3:1 para
cor do fruto imaturo e 1:1 para compatibilidade sexual. Essa proporção dos
fenótipos sugere que essa características segregam independentemente uma
da outra, podendo também ser também confirmado pela baixa correlação (r =
0,090; p = 0,494), encontrada em 60 plantas entre essas características.
47
4.2.2 Número de sementes por fruto
A B
48
quais 51,2% (21 plantas) apresentaram média inferior ao genitor de menor
média de sementes chochas (0,7).
Essa tendência de segregação transgressiva, ou seja, o aparecimento,
em gerações segregantes, de indivíduos que estão fora do intervalo dos
genitores no que se refere à dada característica, também foi observado nesta
população quanto ao número de óvulos por ovário (BAHIA, 2006).
As médias das variâncias estimadas para o caráter número de sementes
por fruto mostraram que essa característica tem alta herdabilidade nesta
progênie (Tabela 2). No entanto, a presença de sementes inviáveis mostrou-se
fortemente influenciada pelo ambiente (herdabilidade baixa) e corresponde a
uma baixa percentagem do número total de sementes por fruto. Estudos
posteriores poderão ser realizados no sentido de verificar a performance
desses clones quanto ao peso médio por semente e produção.
49
autoincompatível (BARTLEY, 2005). Pois mesmo tendo um menor número de
sementes por fruto em relação ao TSH-1188, o CCN-51 possui sementes
grandes e mais pesadas, compensando o menor número de sementes por fruto
e a menor taxa de conversão de óvulos em sementes mostrados nesse
trabalho. É relatada na literatura uma correlação negativa entre quantidade e
tamanho de semente por fruto (ENGELS, 1983).
50
ambientais favoráveis para o seu sucesso (MARTÍN, 1982). Segundo Leal
(2005), a baixa produtividade em algumas plantações comerciais se deve em
parte a uma polinização pouco efetiva, tratos culturais inadequados e
condições ambientais desfavoráveis e outros aspectos fisiológicos.
51
12 TSH-1188 P01/L09 0,261 0,820 6,265 106,5
14 TSH-1188 P02/L02 0,324 0,083 7,179 139,7
15 TSH-1188 P02/L03 0,598 0,167 7,952 247,0
16 TSH-1188 P02/L04 1,155 0,775 2,720 303,3
17 TSH-1188 P02/L05 0,870 0,068 8,438 67,7
18 TSH-1188 P02/L06 0,450 0,175 5,825 166,2
19 TSH-1188 P02/L07 1,199 0,708 3,054 368,2
20 TSH-1188 P02/L08 0,262 0,125 4,044 90,5
21 TSH-1188 P02/L09 1,881 0,995 3,375 629,8
22 TSH-1188 P03/L03 0,805 0,492 3,204 228,0
23 TSH-1188 P03/L04 0,598 0,167 7,952 247,1
24 TSH-1188 P03/L05 1,155 0,775 2,720 303,4
25 TSH-1188 P03/L06 0,870 0,068 8,438 67,8
26 TSH-1188 P03/L07 0,450 0,175 5,825 166,2
27 TSH-1188 P04/L06 0,629 0,518 2,067 108,8
52
Como informação, o resultado dos dois primers consistiu em bandas
monomórficas entre todos os indivíduos analisados em cada grupo. Esse
padrão monomórfico evidencia que os indivíduos são geneticamente
homogêneos para esses dois primers utilizados. Embora apenas dois primers
não sejam suficientes para essa finalidade, os marcadores RAPD podem ser
úteis para testar a pureza genética e discriminar cultivares em certas situações.
Figueira et al. (1998), usando marcadores RAPD para analisar a similaridade
genética entre acessos mantidos em duplicatas em coleções do
CEPEC/CEPLAC (CEPEC, 2005) e BAL Plantations (Malásia), considerou
como não-idênticas essas plantas. De acordo com os autores, 3 (27,3%) dos
11 acessos não mostraram a mesma identidade genética nas duas coleções.
53
Nenhum dos 15 primers microssatélites evidenciou diferenças entre os
acessos de mesmo genitor, utilizados nos cruzamentos, como pode ser
ilustrado com bandas evidentes e monomórficas para cada grupo de genitor
(Figura 7). O padrão das amplificações mostrado nessa figura referente a esse
marcador retrata bem os resultados obtidos com os 15 marcadores, onde a
diferença de padrão bandas entre TSH-1188 e CCN-51 revela polimorfismo
entre esses dois clones para esse loco (duas bandas na figura 8A para o TSH-
1188 e uma banda na figura 8B para o CCN-51). A homogeneidade dentro de
cada clone que é representada pela ausência de diferenças alélicas entre os
indivíduos de mesmo clone, indicando uma pureza varietal nos clones
estudados neste trabalho. Portanto, esses resultados indicam que os genótipos
de todos os clones mostram-se indistinguíveis entre si, não existindo mistura
varietal, com base nestes 15 locos microssatélites. No entanto, nas reações de
amplificação utilizando géis de agarose, o tipo de eletroforese pode ter
influenciado na determinação do número de alelos, uma vez que o poder de
resolução de géis de agarose permite distinguir fragmentos que diferem acima
de 3 pb ao passo que o de poliacrilamida permite distinguir fragmentos que
diferem em um pb. Ferreira e Grattapaglia (1998) recomendam o uso de matriz
de alta resolução para a visualização dos fragmentos, pois dependendo do
número de nucleotídeos do elemento repetido no microssatélite, a visualização
em gel de agarose pode não ser possível. Embora as diferenças de até 3 pb
não poderem ser detectadas em gel de agarose, esse tipo de polimorfismo não
compromete este estudo, visto que para estes genitores, dos 36 primers
polimórficos, apenas 4 (11%) apresentaram diferenças alélicas inferiores a 4
nucleotídeos.
54
Figura 7. Padrão de bandas de DNA amplificado com primers microssatélites
separadas em gel de agarose a 3 % e corado com Brometo de Etídio.
Amplificações com o primer microssatélite: UENF/CEPLAC 129 a partir das
amostras de DNA dos 24 indivíduos de TSH-1188 (A) e das amostras dos oito
indivíduos de CCN-51 (B); UENF/CEPLAC 118, 24 indivíduos de TSH-1188 (C)
e oito de CCN-51 (D). M = corresponde ao padrão de tamanho de fragmento de
DNA do fago Lambda 100Kb.
55
baseado na análise das características de diferentes tipos de marcadores de
DNA, propôs o estabelecimento de um protocolo de caracterização molecular
de acessos de cacau usando 15 locos microssatélites. De acordo com Zhang et
al. (2006), trabalhos de diversidade genética utilizando 15 locos SSRs permite
alcançar uma probabilidade de identificação de 1 em 10000 , ou seja, um nível
de confiança de 99,99%, fornecendo um alto rigor estatístico na identificação
de acessos de cacau. Andrade (2006), em estudos de diversidade genética de
cacaueiros, mostrou que a utilização de 15 primers microssatélites eram
suficientes para eliminar incongruências presentes em dendrogramas oriundos
de análises de agrupamento gerados com dados de 8 primers microssatélites.
Em um estudo para diferenciação de cultivares de soja, Priolli et al.
(2002) relataram que 12 locos microssatélites não foram suficientes para
diferenciar os cultivares de soja avaliados, e atribuíram esse impedimento a
estreita base genética dos programas brasileiros de melhoramento de soja.
Além disso, outras regiões do genoma com grande variabilidade podem não ter
sido amostradas. Por outro lado, Garcia et al (2007) relatou que 10 locos SSR
foram suficientes para identificação adequada de cultivares de soja.
Devido à genealogia de TSH-1188 e CCN-51 incluírem clones
geneticamente distintos e com alta heterozigosidade, a utilização de 15 primers
microssatélites mostra-se suficientemente segura para certificação da
identidade genética dos acessos desses clones neste trabalho.
56
L06 2 376 371 371 352 371 2
P9 2 112 114 114 109 114 2
P15 3 - 205 213 205 211 3
L07 3 - 142 153 140 153 3
P13 4 - 191 195 191 191 2
P19 4 175 175 177 175 175 2
L04 4 271 271 281 271 281 2
L05 4 345 116 141 116 130 3
P23 4 220 219 221 217 219 3
P26 4 - 112 145 112 114 3
P10 4 139 120 136 108 136 3
L02 5 208 203 205 203 210 3
P12 5 105 92 102 92 93 3
P27 5 190 189 189 189 189 1
P05 6 - 147 153 133 145 4
L01 6 274 185 187 185 187 2
P16 7 - 209 215 209 215 2
P20 7 288 283 291 281 283 3
P04 7 265 192 202 184 202 3
P06 7 234 231 231 226 231 3
P07 7 354 328 362 352 362 3
P22 8 - 150 152 150 161 3
P25 8 193 192 192 192 192 1
P17 9 - 115 118 113 118 3
P18 9 288 291 291 291 295 2
L09 9 198 184 184 184 192 2
P01 9 182 180 180 171 180 2
P02 9 235 237 237 232 237 2
P08 9 226 235 257 262 262 3
P24 10 307 315 323 309 309 3
P03 10 150 146 176 133 153 4
P11 10 - 185 187 185 187 2
57
genealogia. Os genitores TSH-1188 e CCN-51 apresentaram respectivamente
71,79% e 82,50% dos locos heterozigotos, confirmando sua natureza
heterozigota, sendo, portanto adequados para estudos de mapeamento
genético.
Dos 39 microssatélites analisados, os alelos exclusivos de cada genitor
segregaram de acordo com a proporção mendeliana 1:1 em 28 microssatélites,
sendo 20 desses marcadores comuns para ambos os genitores (Tabela 7).
Essa segregação é típica de retrocruzamentos. Dos 11 locos microssatélites
não utilizados na construção do mapa de ligação, um apresentou problemas e
codificação (P30), três foram monomórficos (L08, P25 e P27) e sete
demonstraram outros padrões de segregação típicos de
intercruzamentos (L04, L05, P11, P12, P16, P28 e P29). Os marcadores com
tais desvios de segregação foram descartados no presente estudo. Tal medida
foi adotada pelo fato de que os mesmos alteraram a construção dos grupos de
ligação, gerando, portanto, grupos desuniformes, o que não retrata a realidade
de um grupo de ligação genético. Nesse caso, os programas utilizados para
calcular a freqüência de recombinação levam em consideração a segregação
1:1. A utilização desses marcadores pode aumentar a probabilidade de erro, ou
seja, assumir como verdadeira uma associação entre dois locos não ligados.
Do total de 28 marcas utilizadas para construção do mapa, 13 não
permaneceram agrupadas e mostraram-se independentes aos grupos de
ligação formados e os demais possibilitaram evidenciar grupos de ligação
correspondentes a regiões genômicas de 5 grupos de ligação do cacau (Figura
8). Os alelos exclusivos de TSH-1188 possibilitaram identificar dois locos
ligados à característica de compatibilidade: P23, cuja banda exclusiva de TSH-
1188 está ligada em repulsão com a autoincompatibilidade; P10, cuja banda
exclusiva do TSH-1188 está ligada em acoplamento com autoincompatibilidade
(Figura 8). De fato, a maioria das progênies auto-incompatíveis possui alelos
de P10 exclusivo de TSH-1188.
58
CCN-51 TSH-1188
Marcador Marcador
X2 P X2 p
L02 0,701 0,402 L02 1,140 0,286
P12 0,972 0,324 P12 0,581 0,446
P14 0,015 0,902 P14 0,220 0,639
P15 2,304 0,129 P15 3,789 0,052
P17 2,833 0,092 P17 0,095 0,758
P20 0,701 0,402 P20 0,022 0,881
P21 0,015 0,904 P21 1,884 0,170
P22 1,457 0,227 P22 1,455 0,228
L07 0,059 0,808 L07 0,095 0,758
P23 0,159 0,690 P23 1,400 0,237
P03 0,505 0,477 P03 0,818 0,366
P04 0,014 0,906 P04 0,364 0,546
P05 0,069 0,793 P05 1,000 0,317
P07 0,368 0,544 P07 0,023 0,879
P10 0,396 0,529 P10 2,077 0,150
L01 2,833 0,092 L01 0,023 0,879
P19 0,130 0,719 P09 0,243 0,622
P13 0,132 0,717 L03 0,095 0,758
P24 0,229 0,632 P18 0,209 0,647
P08 3,409 0,065 L06 1,524 0,217
L09 0,022 0,881
P01 0,000 1,000
P02 0,818 0,366
P06 0,000 1,000
59
Observam-se também pequenas diferenças de distância calculada entre
algumas marcas nos diferentes grupos de ligação, relativamente aqueles
obtidos por Pugh et al. (2004), o que pode ser explicado pelo reduzido número
de indivíduos e marcadores empregados no presente estudo. Além disso, cada
genitor pode ter diferentes taxas de recombinação nas diferentes posições do
genoma. A baixa saturação destes grupos de ligação construídos a partir de
alelos exclusivos de TSH-1188 e CCN-51 dificultou a integração entre eles.
Mesmo assim, quando comparado com o mapa consensual (PUGH et al.,
2004) e havendo locos com bandas informativas simultaneamente entre os dois
genitores, foi possível evidenciar a integração entre grupos de ligação.
Clement et al. (2003a) encontrou um conjuntos de QTLs relacionados ao
número de óvulos por ovário, identificados em diversos cromossomos (1, 2, 4,
5 e 6). Três QTLs foram encontrados no grupo de ligação 4 do mapa consenso
(PUGH, et al., 2004) associados aos clones DR 1(Trinitário), S 52 (Trinitário) e
IMC 78 (Forasteiro) e explicou 23,5%, 15,0% e 24,2% respectivamente, da
variação fenotípica para essa característica. Os QTLs associados aos clones
DR 1 e IMC 78 estão situados em uma mesma região cromossômica do grupo
de ligação 4 e distantes em torno de 61,15 cM da marca mTcCIR76, enquanto
que o associado ao clone S 52 encontra-se na marca mTcCIR18, situado 16,1
cM da marca mTcCIR76.
60
TSH TSH
TSH P01
P21
10,0
L06 L09
CCN TSH
P04 P04
7,5 10,0
P07 P06
7,3 P07
57,5 P20
Cor
GL7
CCN TSH
P23 P23
9,4
P19 21,0
12,8 TSH
Comp.
P10 P10
14,8
Incomp.
GL4
61
Albuquerque (2006) localizou um QTL relacionado à resistência a VB no
grupo de ligação 4, tendo como marcas cofatores o mTcCIR18 a esquerda e
mTcCIR76 a direita, explicando 41,9% da variação fenotípica das progênies
quanto a resistência a M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x CAB 0214’. Três
QTLs associados à resistência do cacaueiro a P. palmivora foram encontrados
também no grupo de ligação 4, em regiões muito próximas de onde foi
localizado o QTL associado à resistência M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39 x
CAB 0214’ (ALBUQUERQUE, 2006). Um destes QTLs foi encontrado por
Crouzilat et al. (2000) e foi capaz de explicar 13,2% da variação fenotípica da
resistência de frutos de ‘Catongo’ (Forasteiro). Dois QTLs foram encontrados
por Clement et al. (2003b) associados aos clones IMC 78 e DR1. Estes QTLs
foram capazes de explicar 22,6% e 10,1% respectivamente, da variação
fenotípica da resistência à podridão em frutos com base em dados de campo
acumulados por mais de seis anos.
No mapeamento de genes homólogos de resistência (RGH) realizado
por Lanaud et al. (2004) utilizando as mesmas progênies F1 do mapa de
referência do cacaueiro (PUGH et al., 2004), foram localizados quatro genes
alinhados em seqüência no grupo de ligação 4. Estes genes estavam próximos
dos locos de microssatélites mTcCIR17 e mTcCIR18 na mesma região onde
foram detectados os QTLs associados à resistência a P. palmivora (CLEMENT
et al., 2003b), QTL associado a resistência à M. perniciosa no mapa de ‘ICS 39
x CAB 0214’ (ALBUQUERQUE, 2006) e QTLs associados ao número de óvulos
por ovário (CLEMENT et al., 2003a) em cacaueiros.
O grupo de ligação 9, apresentou quatro marcas com 30,4 cM,
mostrando apenas pequenas diferenças de posicionamentos em relação ao
mapa consenso (PUGH, 2004). Apesar deste estudo não levar em
consideração aspectos de resistência a vassoura-de-bruxa, este grupo de
ligação é de extremo interesse, pois nele foi localizado o principal QTL para
resistência a essa doença, oriundo do genótipo ‘Scavina 6’ (QUEIROZ, et al.,
2003; FALEIRO et al., 2006), que esta presente na genealogia dos dois
genitores desta população de estudo.
62
5 CONCLUSÕES
63
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