usp 37 Pruebas Biolégicas / (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 111 Tabla A2.1, Prueba para Detectar Mediclones Atipicas { En ias muestas de una poblacion normal as brechas quales 0 mayores que lo valores squientes de G,, Gy G, ocuren con una probabildad de P| cuando las medicines atipiem pueden ocurinicamente enn extrem acon P02, cuando eta pueden curt ent Casula de os a 4 T _ G 0.987 0.589 - 0637 wf es 10 7 G 681 0.634 0.597 __ S - - Ejemplo: Potencias estimadas de la muestra en escala logaritmica = 1,561; 1,444; 1,517; 1,535 Verificar la potencia mas baja para la medicién atipica: G, =(1,517 ~ 1,444)/(1,561 ~ 1,444) = 0,624 <0,889 Por lo tanto, 1,444 no es una medicin atipica. Verficar a potencia mas alta para la medicién atipica G, = (1,561 ~ 1,535)/(1,561 ~ 1,444) = 0,222 < 0,889 Por lo tanto, 1,561 no es una medicién atipica, Las potencias aipicas deben marcarse como valores atipicos y deben excluirse de los cdlculos de la valoracién. No se puede lexcluir mas de una potencia como medicién atipica (85) PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS *Partes de este capitulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o de la Farmacopea Japonesa. Aquellas partes que no han sido armonizadas estin marcadas con los simbolos (%,) para especificar dicha situacion., La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegati- vas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tackypleustridentatus) Hay tres técnicas para esta prueba: la técnica de coagulacién (gel-clot), la cual est basada en la formacion de gel; la técnica turbidimétrica, basada en la produccién de turbidez después de la ruptura de uniones de un sustrato endogeno; y la técnica cromogénica que se basa en el desarrollo de color después de la ruptura de un complejo sintético péptido-cromogeno. Efec- tuar la prueba con cualquiera de las tes técnicas. En caso de duda o controversia, la decisién final se toma basandase en la prueba de limite de coagulacién, a menos que se indique algo diferente en la monografia del producto en andlisis. La prueba se efectda de forma tal que se evite la contaminacién por endotoxinas. APARATOS Eliminar los pirégenos de todo el material de vidio otros materiales termoestables en un horno de ate caliente, mediante tun proceso validado.*., Habitualmente se usan 30 minutos a 250° como tiempo y temperatura minimos. Si se emplean mate- rales de plstco, tales Como microplacas y puntas de pipetas para pipeteadores automaticos, usar los que han demostrado estar exentos de endotoxinas detectabes y no interfer con la prueba, (NOTA~En este capitulo e término “tubo” incluye cua quier otro receptaculo, como por ejemplo ls pocillos de las placas de micrtitulacion, REACTIVOS Y SOLUCIONES DE PRUEBA Lisado de Amebocitos—Un producto liolizado obtenide a partir de un lisado de amebocitos (leucocites) del cangrejo he- sradura (Limulus polyphemus 0 Tachypleus tridentatus). Este reactivo se refiere s6lo a un producto fabricado de conformidad con las reglamentaciones de la autoridad competente, {NOTA--EI Lisado de Amebocitas reacciona con algunos /-glucanos ademas de reaccionar con las endotoxinas. Existen preparaciones de Lisado ce Amebocitos que no reaccionan con los glucanos: se pre- 3 ara una prueba de valdes del proccsmiento para nactvar endotoxins, er Eeizacin por Color Seo en Exterlaacon y Goran de Este de Aticuos Farmacapoces 1211, Usarun thao stan una sesbidad no menor de 0.15 Unidas de Endotoxin por Mg oe)fortin 112 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biolégicas usp 37 pparan retirando del Lisado de Amebocitos el factor G que reacciona con los glucanos o inhibiendo el sistema de reaccién del factor G del Lisado de Ameboctos, Se pueden usar para pruebas de endotoxinas en presencia de glucanos. ‘Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)—Usar Agua para Inyeccién agua producida por otros procedi- mientos y que no reaccione con el isado empleado, en el limite de deteccin del reactivo. Lisado SR—Disolver con agitacion suave e! Lisado de Amebecitos en Agua para PEB 0 en un amortiguador recomendado por 4 fabricante del lsado, Almacenar el lisado reconsttuido, refrigerado 0 congelado, de acuerdo con las especificaciones del fa bricante. PREPARACION DE LAS SOLUCIONES Solucién Madre del Estandar de Endotoxina—Preparar una Solucién Madre del Estindar de Endotoxina a partir de un Es ‘andar de Referencia de Endotoxina USP que haya sido calibrado con el Estandar Internacional para Endotoxinas vigente de la (OMS. Sequir las especficaciones en el prospecto del empaque y en la etiqueta para la preparacién y almacenamiento de la Solucion Madre del Estandar de Endotaxina. El contenido de endotoxina se expresa en Unidades de Endotoxina (UE). [NOTA— Una Unidad USP de Endotoxina (UE) es igual a una Unidad Intemacional (Ui!) de endotoxina.) Soluciones Estandar de Endotoxina—Después de mezclar vigorosamente la Solucién Madre del Estndar de Endotoxina, preparar las diluciones seriales apropiadas de la Solucién Fstdndar de Endotoxina, usando Aqua para PEB. Usar las diluciones tan pronto como sea posible para evitar la pérdida de actividad por adsorcion, Soluciones Muestra—Preparar las Soluciones Muestra disolviendo o diluyendo los medicamentos, usando Agua para PEB, Algunas sustancias © preparaciones se pueden disolver o diluir adecuadamente en otras soluciones acuosas. Si fuera necesario, ajustar el pH de la soluci6n (0 de la diluci6n) a examinar de modo que el pH de la mezcla del lisado y la Solucion Muestra se tencuentre dentro del intervalo de pH especificado por el fabricante del isado, por lo general entre 6,0-8,0. El pH se puede ajustar con un dcido, una base o una solucién amortiguadora adecuada segtin lo recomiende el fabricante de! lisado. Los act dos y las bases se pueden preparar a partir de concentradas o sélides con Agua para PEB en recipientes exentos de endotoxinas detectables. Las soluciones amartiguadoras se deben validar para garantizar que estan exentas de endotoxinas y otros factores de interferencia detectables. DETERMINACION DE LA MAXIMA DILUCION VALIDA (MDV) La maxima dilucién valida es la dilucién maxima permisible de una muestra a la que se le puede determinar el limite de cendotoxina. Determinar la MDV a partir de la siguiente ecuacion: MDV = (limite de endotoxina x concentracién de la Solucién Muestra/(h) Limite de Endotoxina—€l limite de endotoxina para medicamentos de administracién parenteral, definido segin la dosis, es igual a K/M*2,, donde K es la dosis pirogénica umbral de endotoxina por kg de peso corporal y M es igual a la dosis maxima recomendada del producto, en bolo, por kg de peso corporal. Cuando el producto se va a inyectar a intervalos frecuentes 0 por infusién continua, M es la dosis maxima total administrada durante un periodo de una hora. El limite de endotoxinas para os medicamentos de administracin parenteral se especitica en la monografia individual en unidades como UE/mL, UE/mg, UE/Unidad de Concentracié ‘mg/ml: en el caso del mite de endotoxina espeeificado por peso (UE/mg); Unidades/mL: en el caso del limite de endotoxina especificado por unidad de actividad biol6gica (UE/Unidad); mL/mL: cuando el limite de endotoxina se especifica por volumen (UE/ml). 7 la sensibilidad declarada en la Técnico de Coagulacién (UE/mL) o la concentracién més baja usada en la curva estindar para la Técnica Turbidimétrca o a Técnica Cromogénica TECNICA DE COAGULACION La técnica de coagulacién se usa para detectar o cuantificar endotoxinas basindose en la coagulacién del lisado empleado como reactivo en presencia de endotoxina. La concentracion minima de endotoxina requerida para hacer que el lsado se coa- gule en las condiciones esténdar es la sensibilidad declarada del lsado empleado como reactivo. Para garantizar tanto la preci- si6n como la validez de la prueba, efectuar las pruebas para confirmar la sensibilidad declarada del lisado y para determinar factores de interferencia segtin se describe en Pruebas Preparatorias 3 es 5 UEUSP Ig de peo corporal para culver vi de adminsracin cst de la intraecal (ara la cual Ke 0.2 ULUS/g de peo corpora), Ene cao de Productos rcofomaceuicos que na se admaten por va ntateca el hte de endotoxin se clei como 175 Uk. donde Us i oss mona recomend fen mt Enel caso de aditarmacos adrunistrados pr va nate limite de erdotonna se ebviene meats formua 4 UV. Pra farmulacones (ea > ‘general productos oncleglces) que Se edminsvan per mato uadrade de supetice corpora a formula es Kk, donde K= 100 UEimy M slo dosusp 37 Pruebas Biolégicas / (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 113 Pruebas Preparatorias Prueba de Confirmacién de la Sensibilidad Declarada del Lisado—Confirmar en cuatro determinaciones repetidas la sen- sibilidad declarada, 2, expresada en UE/mL del isado antes de usarlo en la prueba. La prueba de confirmacién de sensibilidad del lisado se debe llevar a cabo cuando se usa una partida nueva de lisado 0 cuando hay alain cambio en las condiciones de la prueba que pueda afectar el resultado. Preparar soluciones esténdar con al menas cuatro concentraciones equivalentes a 2, /, 0,52 0,252, diluyendo el ER Endatoxina USP con Agua para PEB. Mezclar un volumen del Lisado SR con un volumen igual (como por ejemplo alicuotas de 0,1 mL) de una de las Soluciones £EstGndar de Endotoxina en cada tubo de ensayo. Cuando se usen viales 0 ampollas de prueba individuales que contengan lisa do lioflizado, agregar directamente las soluciones al vial o ala ampolla, Incubar la mezcla de reaccién durante un periodo Constante sequin las instrucciones del fabricante del lisado (habitualmente a 37 + 1° durante 60 2 minutos), evitando vibracio nes. Para analiza la integridad del gel, sacar uno a uno los tubos directamente de la incubadora y con un Gnico movimiento suave, invertrlos aproximadamente a 180°. Si se ha formado un gel firme que permanece en su lugar después de invertc los tubos, registrar el resultado como positivo. Un resultado es negativo sino se forma un gel intacto. La prueba se considera vai dda cuando la concentracién mas baja de las soluciones estindar presenta un resultado negativo en todas las pruebas repetidas. I punto final es la concentracién més baja en la serie de concentraciones decrecientes de endotoxina estandar que coagula ¢l lisado. Determinar la media geométrica del punto final calculando la media de los logaritmos de las concentraciones en el punto final de la serie de cuatro determinaciones repetidas y calculando luego el antilogaritmo de la media, segiin se indica en [a siguiente formula: media geométrica de la concentracién en el punto final = antilogaritmo (elf) donde Ze es la suma de los logaritmos de las concentraciones en el punto final de la serie de diluciones utilzadas, y Fes el nGimero de tubos de ensayo repetidos. La media geométrica de la concentracién en el punto final es la sensibilidad medida del lisado (en UE/mL). Sino es menor de 0,52 y no es mayor de 2), se confirma la sensibilidad deciarada y se usa en las pruebas realizadas con este lisado. Prueba de Factores de Interferencia—Por lo general, preparar soluciones (A-D) como se muestra en la Tabla J, y efectuar la prueba de inhibicién o potenciacién en las Soluciones Muestra con una dilucién menor que la maxima dilucién valida (MOV), {que no contenga endotoxinas detectables, procediendo segain se describe en Prueba de Confirmacién de la Sensibilidad Declara- «da del Lisado. La media geométrica de las concentraciones en el punto final de las Soluciones 8 y C se determina usando la férmula descrita en la Prueba de Confirmacién de lo Sensibilidad Declorada del Lisado. La prueba de factores de interferencia de- bberd repetirse siempre que se presenten cambios en alguna de las condiciones que pudieran influ en el resultado de la prue- ba, ‘Tabla 1. Preparacién de Soluciones para la Prueba de Inhibicién/Potenclacion para Técnicas de Coagulacién T Concentracién de Endotoxina/ Soluciom ala que se Agrega Concentracion Nimero de Solucton eeendotoxing Dituyente Repeticiones 1a» | Ninguna/Sotucion Maestro = = 4 Be | 2i/Soteiin Maestro Scion Muesta 2. 4 _—_ - fe - Ti 4 05% 4 0254, 4 | 2isagua para PER 0 para PER 2 2 0. 2 os: 2 0.25% 2 D+ __| NingunavAgva por PES = —— 2 ® Salucin & Ura Solyiin Muestro dela preparacin en ands que estéexenta de endotoxinasdetectables. © Suen: ruc de erteenca Solin 0: Control negutno de Agu pra PCB Esta prueba se considera vilida cuando todas las determinaciones repetidas de las Soluciones A y D no muestran ninguna reaccién y el resultado de la Solucién C confirma la sensibilidad declarada. Sila sensibilidad del isado determinada en presencia de la Solucidn 8 no es menor de 0,52. y no es mayor de 2, la Solucién -Muestra no contiene factores que interfieran en las condiciones experimentales usadas. En caso contrario, a Solucién Muestra a ‘examinar interfiere con la prueba Sila muestra en andlisis no cumple con la prueba a una dilucién menor que la MDV, se debe repetir la prueba empleando una dilucién mayor que no exceda la MDV. El uso de un lisado de mayor sensibilidad permite una dilucién mayor de la mues- ‘ra_a examinar y esto puede contribuir ala eiminacion de la interferencia, eat)114 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biolagicas usp 37 Laiinterferencia se puede resolver mediante un tratamiento adecuado, como fltracién, neutralizacion, didiss 0 calentamien: to. Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, ealizar la val: racién descrta anteriormente, utiizando la preparacién a examinar, ala que se ha agregado Estndar de Endotoxina y se ha sometido al tratamiento seleccionado, Prueba de Limite Procedimiento—Preparar las Solucianes A, 8, Cy O segiin se indica en la Tabla 2 y levar a cabo la prueba en estas solucio- nes siguiendo el procedimiento indicado anteriormente en la Prueba de Confirmacién de la Sensibilidad Declarada de! Lsado en Pruebas Preparatoras. ‘Tabla 2. Preparacién de Soluciones para la Prueba de Limite de Coagulaclén ‘de Endotoxina/ ‘que se Agrega Endotoxina Nimero de Repeticiones ‘Ninguna/ Solan Muestva Dida 22/Salucon Muesra Disida 2i/Aqua para FEB 2 ‘Ninguna/Agua para PER 7 prepara Solin Ayla Slain Bde cone postive del producto uizando una dul wo mayor gue la MDV y vatamietossequn we inica ela Prue ‘efoto de ltterenca en Prebos Peart. Ls Sakcnes By Cd cont postvaconienen a Souci tsdnda de Endatorna une concentra Gus ‘lresponde a dable de laseriiaddecrads de ado, La Saif Ode conl negate conte en Agua para PER Interpretacién—La prueba se considera valida cuando ambas determinaciones repetidas de las Soluciones By Cson posti- vas y las de la Solucién D son negativas. Cuando se obtiene un resultado negativo para ambas determinaciones repetidas de la Solucién A, la preparacién en andlsis cumple con la prueba, Cuando se obstiene un resultado positivo para ambas determinacio- res repetidas de la Solucién A, la preparacion en anélisis no cumple con la prueba. ‘Cuando se obtiene un resultado positivo para una de las determinaciones de la Solucién Ay un resultado negativo para la otra, repetir la prueba. En la repeticin, la preparacion en andlsis cumple con la prueba si se obtiene un resultado negativo en ambas determinaciones repetidas de la Solucién A. La preparacién no cumple con la prueba si se obtiene un resultado positivo para una o ambas determinaciones repetidas de la Solucin A. Sin embargo, sila preparacién no cumple con la prueba a una dilucién menor que la MDV, se puede repetir la prueba empleando una diltucién mayor que no exceda la MDV. Capitulos Prueba Cuantitativa Procedimiento—ta prueba cuantifica endotoxinas bacterianas en las Soluciones Muestra por valoracién volumeétrica hasta un punto final. Preparar Soluciones A, 8, Cy D sequin se indica en la Tabla 3 y analizar siquiendo el procedimiento en la Prueba ‘de Confiemacién de la Sensibilidad Declarada del Lisado en Pruebos Preparatoras ‘Tabla 3. Preparacion de Soluciones para la Prueba de Coagulacién Factor ] Concentracién de Endotoxl ee lucion ala cual se Agrega itu. | Concentracton Numero de Solucton Endotoxina Dituyente, cién_| deEndotoxina | _ Repeticiones ae | Ninguna/sotvcion Muestra ‘Agua por PE 1 = 2 2 | = 2 4 = 2 8 = 2 Be | 2a Solucin Muesta 7 = H 2 2 | 21/Agua para PEB ‘Agua para PEB 1 2 2 — i- - — 2 v 2 4 os 2 | 3 0.281 2 Dt | Ninguna/agua pore PeB = = = 2 * Sli A Saucin Musto en aise clu, que na debe exceder i MON, con acl se complet la Praca de Fotores dented. Las ducanes {ubuguenes dela Solus Hes na debenexcederia MN. User Ag pra FEB para eectat una rave de ducones en cata tubos que contenant Solin hues en anaiss 2 concentracones de 1, J} econ respeco aa coneentaen usa eno Pacba de Factores de Inererenca. Se pueden Us ‘ta lucones hata la MOY, segin ea neces. E Scetn a een A que contengeendotoxna etinds una concentacén de 2 (onto postvo del pod). « Solu Dos seis epeias de uate tos de Agua poo PEB que contengan fa erdtoxha extanda 4 una Concetrain de 2, 0,5 0.25, respect Pesan 0: Agu par PB (conto neato)usp 37 Pruebas Biologicas / (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 115 Caleulo ¢ Interpretacién—La prueba se considera valida cuando se cumplen las tres condiciones siguientes: (1) ambas de- terminaciones repetidas de la Solucién D de control negativo son negativas; (2) ambas determinaciones repelidas de la Solucion de control positivo del producto son positivas; y (3) la media geomeétrica de la concentracin en el punta final de la Solucign Cesta comprendida en el intervalo de 0,53. a 2: Para determinar la concentracion de endotoxinas de la Solucién 4, calcular la concentracién en el punto final para cada repe- ticién multiplicando cada factor de dilucién del punto fina! por ». La concentracién de endotoxinas en la Solucion Muestra es la ‘concentracién en el punto final de las repeticiones. Sa prueba se realza con una Solucién Muestra diluida, calcular la concen. tracion de endotoxinas en la Solucian Muestra original multiplicando por el factor de dilucién. Si ninguna de las diluciones de la Solucién Muestra es positiva en un ensayo valido, informar la concentracién de endotoxina como menor que i. (si se analiz6 la muestra diluida, informar como menor que #. multiplicado por el factor de dilucién mas bajo de la muestra. Si todas las dil Ciones son positivas, la concentracién de endotoxina se informa como igual o mayor que el factor de dilucién mayor por 2 (pee, el factor de dilucién inicial multiplicado por 8 y por en la Tabla 3). La preparacion cumple con los requisitos de la prueba sila concentracién de endotoxinas en ambas determinaciones repeti das es menor que la especificada en la monografia individual TECNICAS FOTOMETRICAS CUANTITATIVAS Técnii at a Turbidii Esta técnica es una valoracién fotométrica que mide los incrementos en turbider del reactante. Dependiendo del principio templeado en la valoracién, esta técnica se puede clasficar como valoracién turbidimétrica de punto final o valoracién turbidt meétrica cinética. La valoracién turbidimétrica de punto final se basa en la relacién cuantitativa entre la concentracién de endo- toxinas y la turbider (absorbancia o transmisién) de la mezcla de reaccién al término de un periodo de incubacién. La valora- cién turbidimetica cinética es un método para medir el tiempo necesario para alcanzar una absorbancia o transmisicn prede- terminada de la mezcla de reacci6n (tiempo de iniciacién) ola velocidad de desarrollo de turbidez. La prueba se efectaa a la temperatura de incubacién recomendada por el fabricante del lsado (por lo general 37 + 1°) Técnica Cromogénica Esta técnica es una valoracién para medir el crométoro liberado de un péptido cromogénico adecuado por la reaccién de las cendotoxinas con el isado. Dependiendo de! principio empleado en la valoracién, esta técnica se puede clasificar como valora cién cromogénica de punto final 0 valoracién cromogénica cinética. La valoracién cromogénica de punto final se basa en la relacién cuantitativa entre la concentracién de endotoxinas y la liberacién del croméforo al término de un periodo de incuba- cién, La valoracién cromogénica cinética es un método para medi el tiempo (tiempo de iniciacién) necesario para alcanzar, tuna absorbancia predeterminada de la mezcla de reaccion o la velocidad de desarrollo de color. La prueba se efectia ala tem- peratura de incubacién recomendada por el fabricante del isado (por lo general 37 + 1°). Pruebas Preparatorias Con el fin de garantizar la precision 0 validez de las técnicas turbidimétricas y cromogénicas, se realzan las pruebas prepara torias para verificar que los criterios para la curva estindar son validos y que la solucién muestra no interfiere con la prueba. Cuando cambian las condiciones que pueden influiren el resultado de la prueba es necesaria la validacion del método de prueba Garantia de los Criterios para la Curva Estandar—La prueba se debe efectuar para cada jote de lisado empleado como reactivo. Utilizando la Solucién Esténdar de Endotoxina, preparar por lo menos tres concentraciones de endotoxina dentro del intervalo indicado por el fabricante del lisado para generar la curva esténdar. Realizar la valoracién usando por lo menos tres determinaciones repetidas de cada concentracién de endotoxina estandar, siguiendo las instrucciones del fabricante del lisado (con respecto a relaciones de volumen, tiempo de incubacién, temperatura, pH, elc.). Si el intervalo deseado en los métodos Cinéticos es mayor de dos logaritmos, se deben incluir estandares adicionales para que cada aumento logaritmico esté com- prendido en el intervalo de la curva estandar. El valor absoluto del coeficiente de correlacion, r, debe ser mayor 0 igual a (0,980 para et intervalo establecido de concentraciones de endotoxina, Prueba para Factores de Interferencia—Seleccionar una concentracién de endotoxina en o cerca del centro de la curva estindar de endotoxina. Preparar las Soluciones 4, 8, Cy D segan se indica en la Tabla 4. Llevar a cabo la prueba en las Solucio- nes A, 8, Cy D al menos por duplicado, de acuerdo con las instrucciones del isado empleado, por ejemplo, en lo que respecta al volumen entre la Solucién Muesta y el Lisado SR, la relacion de volumen de la Solucion Muestray el Lisado SR, el tiempo de incubaci6n, ete Pt)116 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biolégicas use 37 la Prueba de inhibicién/Potenclacién para Técnicas Fotométricas 4. Preparacién de Soluclones pa Solucién ata cual xe Agrega | Solucton Concentracién de Endotoxina ‘Endotoxina Namero de Repeticiones | Ningura Solin Muesta No menos de 2 18° | Concentracin central de a curva estindar | Sotucn mestea No menos de 2 (c= | Almenos 5 concentraciones (a concentacin mis baja se | Agua para PEB "No menos de 2 para cada una ‘denomina 3) BF | Ninguna ‘Bow pore EB ~[Nemenos de? 7 Solu & Selucen Masia se puede lan que oxced Io MOV, » Slim 6 La prepara en ana a a mma divelon quel Souci A, que contenga endotonna agregad uns concentra quo crcana ala oncenzsin central de lr eur extn Slut C: a endtoninaestindar iy concentraciones usados en ls valdacion de metodo deca pare Garant de Cites para a Cane Etna en Preto Peporataras conte postion SSatoon BAe pone EB contal neato) La prueba se considera valida cuando se cumplen las condiciones siguientes, 1. El valor absoluto del coeficiente de correlacion de la curva estandar generada usando la Solucién Ces mayor o igual a 0,980. 2. E resultado de la Soluciin D no excede el limite del valor del blanco requerido en la descripcién del isado empleado co: ‘mo reactivo 0 es menor que el limite de deteccin de endotoxina del lsado empleado como reactivo. CCalcular la recuperacion media de la endotoxina agregada restando la concentracién media de endotoxina en la solucién, si la hubiera (Solucidn A, Tabla 4), de la que contiene la endotoxina agregada (Solucidn 8, Tabla 4). Para considerar que no pre- senta factores que interfieran con la valoracién en las condiciones de la prueba, la concentracién medida de endotoxina agre- gada ala Solucién Muestra debe estar entre 50%-200% de la concentracién conocida de endotoxina agregada después de restar la endotoxina detectada en la solucion sin endotoxina agregada, Cuando la recuperacién de endotoxina se encuentra fuera de los intervalos especicados, se considera que la Solucién Mues {raen andliss contiene factores de interferencia, Luego, repetir la prueba usando una dilucién mayor que no exceda la MDV. ‘Ademés, la interferencia de la Solucién Muestra 0 de la Solucién Muestradiluida que no exceda la MDV se puede eliminar me- dlante un tratamiento validado apropiado, como fillraci6n, neutralizacién, dials 0 calentamiento. Para establecer que el trata- rmiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valoracién descrita anteriormente utilizando la preparacion a examinar, ala que se ha agregado Endotoxina Estandar y se ha sometido posteriormente al trata- rmiento seleccionado, ferrite Procedimiento de Prueba Seguir el procedimiento descrito anteriormente para Prueba de Factores de Intrferencia en Pruebas Preparatoris. Calculo Calcular la concentracién de endotoxina de cada una de las determinaciones repetidas de la Solucién A usando la curva es {andar generada con la Solucién C de control positivo. La prueba se considera vilida cuando se cumplen las tres condiciones siguientes 1. Los resultados dela Solacién C de control cumplen con los requisitos de validacién definidos en Garantia de Criterios para la Curva Esténdar, en Pruebas Preparatorias. 2. La recuperacién de endotoxina, calculada a partir de la concentracién encontrada en la Solucién 8 después de restar la concentracion de endotoxina encontrada en la Solucidn A esta dentro del intervalo de 50%-200%. 3. El resultado de la Solucién D de control negative ne excede el limite del valor del blanco requerido en la descripcién del lisado empleado o es menor que el limite de deteccién de endotoxina del lsado empleado como reactivo, Interpretaci6n En as valoracionesfotométrcas, la preparaci6n en anlisis cumple con la prueba sila concentracién media de endotoxinas de las determinaciones repetidas de la Solucién A, después de la correccién por dilucién y concentracién, es menor que el limi te de endotoxina para el producto.