VOL. 114 APRILIE - TUNIE ISSN; 0048-7848 2010 Nr2 REVISTA MEDICO-CHIRURGICALA A SOCIETATII DE MEDICI SI NATURALISTI DIN IASIRev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., lasi ~ 2010 ~ vol. 114, nr. 2 STHNTE FUNDAMENTALE ARTICOLE ORIGINALE TESTAREA PE ANIMALE DE LABORATOR A RASPUNSULUI SISTEMULUI IMUNITAR, A REACTIVITATIL CUTANATE SI HEPATICE, DUPA ADMINISTRAREA TOPICA RETROAURICULARA A DOI COLORANTI REACTIVI TEXTILI C. Gavat!, Cristina Mihaela Ghiciuc?, Carmen Lacrdmioara Zamfir’, R.Y. Lupusoru, Citilina Elena Lupusoru? Universitatea de Medicina si Farmacie "Gr.T. Popa” lagi Facultatea de Bioinginerie Medical 1, Disciplina de Chimie Facultatea de Medicina 2. Disciplina de Farmacologie 3. Disciplina de Histologie 4. Disciplina de Fiziopatologie RESEARCHES ON IMMUNE SYSTEM RESPONSE, SKIN AND HEPATIC REACTIV- ITY IN LABORATORY ANIMALS AFTER RETRO-AURICJLAR TOPICAL ADMINIS- TRATION OF TWO REACTIVE TEXTILE DYES (Abstract) Aim: To evaluate immune system response, skin and hepatic reactivity in Swiss mice after r -o auricular local administra- tion of two textile dyes. Material and methods: On 3 groups of white Swiss mice: group I (Cibacron Yellow F-4G), group II (Cibacron Orange P-2R) ar ! control group (DMSO - dimethylsulfoxide), substances were applied on left retro auricular ear, in dose of 25 uL. solution 10% in DMSO (the dyes were not soluble in water), once a day, for 7 days. After euthanasia, blood samples were taken to assay differential cell count, peripheral neutrophils activity (NBT test), serum opsonic capacity, peritoneal macrophages activity (phagocytic and bactericidal capacity), and activity of splenic T-lymphocytes with rossetting capacity, and spleen cells forming Jerne plaques. There were taken skin from local application of dyes, retro auricular and later cervical nodes from left side and hepatic samples. Results : Retro auricular and later cervical nodes mass increases after administration of textile dyes, compared to control group. Basophiles percentages were increased after administration of two dyes (stronger after, yellow dye). Peripheral neutrophils activity was increased after administration of two dyes, especially after orange dye. Administration of the two dyes decreased serum opsonic capacity and peritoneal macrophages activity, but did not influenced the activity of splenic T-lymphocytes with rossetting capacity and spleen cells forming Jerne plaques. There were significant skin and hepatic changes in microscopy. Conclusion : The studied dyes influenced the activity of immune system, increased skin and hepatic reactivity. Key words: TEXTILE DYES, IM- MUNE SYSTEM RESPONSE, SKIN AND HEPATIC REACTIVITY Colorantii reactivi sunt folositi in fi- datorat prezentei in structura acestora, a nisarea textila, in principal la vopsirea fi- nor grupari reactive, de tip clortriazina brelor celulozice, dar sia lanii sau a fi- sau vinilsulfon’, care sunt capabile si-i brelor poliamidice (1,2). Impunerea lor pri- _fixeze pe fibra, printr-o legatura covalent, oritara, pe piata colorantilor sintetici, s-a imbundtatind calitatea vopsirilor. 510Testarea rispunsului imunitar, a reactivitatii cutanate si hepatice Un aspect negativ, deloc neglijabil, in vopsirile reactive este legat de hidrosolu- bilitatea acestora si de tendinja accentuaté de a da reactii de hidroliz’, competitiv cu fixarea pe fibra. in felul acesta, mari can- titdti de coloranti, mai ales in forma hi- drolizate, se pierd in apele reziduale, din fabricile de productie (intre 10-20%) si din cele de finisare textild (pana la 40%) (3,4, 5). Apele reziduale textile, colorate, pe linga faptul c& imprima culoarea apei bazinelor receptoare, contin numerosi compusi care perturba procesele biologice din aceste ape, afectind flora si fauna (6). in literatura de specialitate sunt mentio- nate date asupra toxicitétii la nivel cutanat, sub forma de dermatite de contact iritative sau alergii locale, pentru colorantii cu cro- mofori azochinonici si antrachinonici (7) Tinand cont de cele prezentate in lite- ratura de specialitate, am considerat c& un studiu privind efectele asupra sistemului imun, a reactivitijii cutanate si hepatice, produse de coloranti reactivi din aceste grupuri, prezinta un interes deosebit. MATERIAL $I METODA S-au utilizat trei loturi a cate 7 soareci Swiss, in greutate de 24-35 g, cu repartitie identicd pe sexe, crora li s-a aplicat topic, in regiunea posterioara a urechii stangi o cantitate de 25 él dintr-o solutie 10%, a colorantilor Cibacron Yellow F-4G la lotul I (galben) si Cibacron Orange P-2R la lotul II (portocaliu). Aplicarea s-a facut zilnic, la aceeasi ora, timp de 7 zile. Lotului martor i s-a aplicat aceeasi cantitate de solutie mar- tor (DMSO, dimetilsulfoxid), in zona poste- rioara a urechii sténgi. Dupa cele 7 zile de administrare a colo- ranilor si a solutiei martor, din plexul retro- orbitar, s-a recoltat snge pentru determi- narea urmatorilor parametri: leucograma, formula leucocitara, capacitate de fagoci- tox’ a polimorfonuclearelor _neutrofile (PMN) din sangele periferic (testul Nitro Blue Tetrazolium ~ NBT), capacitatea opso- nic& a serului (CO) (8). Eutanasierea ani- malelor s-a realizat prin anestezie general’, apoi s-a spalat peritoneul cu solujie Hank diluatd 1/10 in apa distilata, obsinandu-se lichidul peritoneal ce a servit la determi- narea urmatorilor parametri: capacitatea fagocitara (CF) si bactericid’ (CB) a macro- fagelor peritoneale, utilizind o cultura de Staphylococcus aureus 94. S-au determinat si o serie de parametri ai imunitatii spe- cifice: limfocitele T splenice cu capacitate de rozetare si splenocitele formatoare de plaje de hemolizi (plaje Jerne) (9). S-au prelevat, de asemenea, fragmente de jesut cutanat si respectiv de fesut hepatic, de la cele trei loturi. Dup’ examinarea lor macroscopic s-au realizat preparatele mi- croscopice, ce au fost prelucrate dupa tehnica uzuald de includere in parafina, apoi sectionate la microtom (4-5 microni) si in final colorate (HE, PAS, tricromicd Szekely) Rezultatele objinute au fost prelucrate statistic folosind testul 1-Student. REZULTATE $I DISCUTIL Masele ganglionilor retroauriculari si laterocervicali au prezentat scdderi_ sem- nificative statistic, comparativ cu masele ganglionilor recoltati din aceleasi zone, de la soarecii din lotul martor, c&rora li s-a aplicat topic DMSO (p< 0,001) La formula leucocitard s-au constatat modificdri ale procentelor de PMN, sem- nificative statistic fata de martor, numai pentru lotul ciruia i s-a administrat colo- rantul portocaliu (p = 0,02). Totodata, in- tre loturile care au primit cei doi coloranti, diferenta este semnificativa statistic (p = 0,01). Pentru procentele de limfocite si cozinofile nu se constaté diferenje sem- nificative statistic fay de martor. In schimb, pentru procentele de bazofile din singele periferic, se constataé o crestere semnifi cativa statistic, comparativ cu lotul martor sil petC. Gavat et al. 2080 cob Pees PEGE ERE Fig. 1, Formula leucocitara - Bazofile% Fig. 2. Capacitatea de fagocitozi a PMN - testul NBT | FETE Fig. 3. Capacitatea opsonica a serului (col. S.aureus x 1/1000/mL) Fig. 5. Capacitatea bactericida a macrofagelor peritoneale (col. S.aureus x 1/1000/mL) (p< 0,001), cea mai ridicara bazofilie fiind cauzati de colorantul galben (p = 0,05) (fig. 1). Capacitatea de fagocitozé a PMN din sangele periferic (testul NBT), este afectata semnificativ statisticd de cei doi coloranti. Astfel, dupa administrarea topic a fiectruia dintre cei doi coloranti, se constaté o sca- dere semnificativa statistic a acestui para- metru, comparativ cu lotul martor la care s~ a administrat doar DMSO (p< 0,001). intre cei doi coloranti se constat, de asemenea, © diferenta semnificativa statistic (p = 0,01), 512 Fig. 4. Capacitatea de fagocitoza a macrofagelor peritoneale (col. S.aureus x 1/1000/mL) colorantul portocaliu determinand cea mai puternicd scddere a capacitatii de fagocitoza a PMN din sangele periferic (fig. 2). Capacitatea opsonica a serului (CO) a scizut considerabil, dup’ administrarea to- pic, timp de 7 zile a colorantului galben si a celui portocaliu, comparativ cu soarecii din lotul martor, care au primit topic DMSO (p<0,001), colorantul portocaliu determi- nand o sc&dere mai puternic’ a capacit&tii opsonice a serului comparativ cu colorantul galben (fig. 3). Capacitatea de fagocitozd a macrofa- gelor peritoneale (CF) a fost afectaté in sensul scdderii, de aplicarea topic a colo- rangilor testati, prin comparatie cu lotul martor, in maura mai mare pentru colo- rantul portocaliu (p<0,001) comparativ cu cel galben (fig. 4). Capacitatea bactericida a macrofagelor peritoneale (CB) a sc&zut mai putin semni- ficativ statistic in urma aplic&rii topice a colorantului galben (p = 0,02) si mai intens‘Testarea raspunsului imunitar, a reactivitatii cutanate si hepatice semnificativ (p < 0,001) la soarecii carora Ii s-a administrat colorantul portocaliu, com- parativ cu Ictul martor (fig. 5) Dupa acelasi interval de 7 zile de ad- ministrare topic a colorantilor testati, nu s-au constatat modificari semnificative sta- tistic ale procentelor de limfocite T splenice cu capacitate de rozetare si a numérului de splenocite formatoare de plaje de hemoliza, comparativ cu lotul martor. Examindnd macroscopic si apoi micro- scopic fragmentele de piele si tesut hepatic prelevate de la lotul martor, s-a constatat morfologia normal a acestora. in schimb, la fragmentele tisulare prelevate de la lotu- rile c&rora li s-au aplicat topic, retro- auricular, cei doi coloranti Cibacron Yellow F-4G (galben) sau Cibacron Orange P-2R (portocaliu), s-au constatat modificari insemnate ale aspectului lor morfologic. Microscopic, s-au remarcat pe arii intinse procese inflamatorii bine conturate, mai ales in cazul lotului caruia i s-a administrat Cibacron Yellow F-4G (fig. 6). Manunchiuri compacte de fibre conjunctive devin pe alocuri diseminate de procesele inflamatorii locale, condensand intre ele vasele sangvine (fig. 7). S-au constatat de asemenea, extra- vaziri sangvine diseminate, pe arii extinse. Examinarea parenchimului hepatic a subliniat afectarea tisulard, in conditiile in care alinierea hepatocitelor in cordoane ce- lulare simetrice si paralele, este intrerupta de aparitia a mici focare inflamatorii, flan- cate de un dispozitiv vascular care isi pierde integritatea luminal, pe suprafete insem- nate (fig. 8). Eroziunile vasculare sunt evi- dente atat la nivelul vaselor mici de tipul capilarelor sinusoide, cat si a acelora de mare calibru (fig. 9). Fig. 6. Arii extinse inflamatorii diseminate pe intreaga suprafaya dermicd (HE, 200X) Fig. 7. Derm compact, fibrozat, cu reactii inflamatorii marcate (HE, 200X) Fig. 8. Parenchim hepatic : eroziuni sanguine, lumene vasculare discontinue (HE, 200x) Fig. 9. Parenchim hepatic cu arii extinse de sufuziuni sanguine (HE, 200x) 513C. Gavat et al. CONCLUZIT Masele ganglionilor retroauriculari si laterocervicali de la soarecii Swiss cérora li s-au aplicat unul din cei doi coloranti, s-au modificat substantial comparativ cu lotul martor. in cazul formulei leucocitare, procentele de bazofile au crescut considerabil, in spe- cial dup& administrarea colorantului galben Capacitatea de fagocitozi a PMN din sangele periferic a fost afectati in sens ne- gativ de cei doi coloranti studiati. Capa- citatea opsonica a serului a scizut conside- rabil dup’ administrarea celor doi colo- ranti, cel portocaliu dovedindu-se chiar mai activ. Colorantul portocaliu s-a dovedit mai activ in comparagie cu cel galben si asupra capacitijii de fagocitoza a macrofagelor pe- ritoneale. Capacitatea bactericid’ a macro- fagelor peritoneale a fost diminuata in com- BIBLIOGRAFIE paragie cu lotul martor, numai sub influenta colorantului portocaliu. Indicatorii imunitajii specifice (limfo- citele T splenice cu capacitate de rozetare si splenocitele formatoare de plaje de he- molizd) nu au fost modificati semnificatiy statistic comparativ cu lotul martor. ‘Afectarea cea mai insemnati s-a observat Ja nivelul pielii, zona de prim contact cu substanjele colorante. Ariile inflamatorii au fost extinse la nivelul dermului, iar vasele sangvine si-au pierdut integritatea peretilor. Parenchimul hepatic a fost afectat intr-o masura mai mic’, observandu-se un anumit potential agresiv al colorantilor asupra en- doteliilor vasculare, iar procesele inflama- tori fiind relativ reduse Colorantii studiati au determinat un ras- puns din partea sistemului imun, cresterea reactivititii cutanate si a celei hepatice 1, Epolito WJ, Lee YH, Bottomley LA, Pavlostathis SG. Characterization of the textile anthraquinone dye reactive Blue 4. Dyes and Pigments 2005 ; 67: 35-46. 2. Suteu D, Balba D. Equilibrium and kinetic study of reactive dye Brillant Red HE-3B adsorbtion by activated charcoal. Acta Chim Slov 2005 ; 52: 73-79. 3. Senthilkumaar S, Kalaamani P, Porkodi K, Varadarajan PR, Subburam CV. Adsorbtion of dissolved Reactive red dye from aqueous phase onto activated carbon prepared from agricultural waste Bioresource Technol 2006 ; 97: 1618-1625 4. Santhy K, Selvapathy P. Removal of reactive dyes from wastewater by adsorbtion on coir pith activated carbon. Bioresource Technol 2006 ; 97: 1329-1336 5. Messina PV, Schulz PC. Adsorbtion of reactive dyes on titania-silica mesoporous materials. J Colloid Interface Sci 2006 ; 299: 305-320. 6. Ravikumar K, Ramalingam S, Krishnan S, Balu K. Application of response surface methodology to optimise the process variables for reactive Red and Acid Brown dye removal using a novel adsorbent. Dyes and Pigments 2006; 70: 18-26. 7. Klemola K, Honkalampi U, Hamélainen U, Liesvuori J, Pearson J, Lindstrém Sepa P. AUTEX Res J 2006; 6 (3): 182-190. 8. Peacock IE, Thomas D, Russel H. Manual of Laboratory Immunology. Philadelphia: Ed. Lea and Febiger, 1980, 224-226. 9. Shortmann JK, Palmer J. The requirement for macrophage: Immunol 1971; 2 399. the in vitro immune response. Cell 514