UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA Th te as ae FISIOLOGIA VEGETAL PRINCIPIOS Y APLICACIONES e- P Abert Age is Gumerinds ele in Gems ‘han rode Ot Note age Via ae Ye onl andj Pia owl Volts er Send on ne creda thie La Pv ere Tame! goer yl aid to eee Seve Serge Camacho Montiel Ligh Rivera Diana Herrera ojos cor Harve Soler ojos César Aljendro Order SaUniversidad Nacional Auténoma de México Facultad de Estudios Superiore itacal, Principios y aplicaciones Alberto Arciaga Frias « Gumercindo H. De a Cruz Guzmin «Juan Gerardo Ortiz Montel + Hugo Virgilio Perales Vela » Manuel Mandujano Pifa » Oswaldo Valdés open » Sandra Laz Gomer. Acevedo «Elvia Lucia Pavén Meza «Ismael Aguilar Ayala ‘+ Maria del Rocio Reyero Saavedra» Yolanda Pozos Ruts» Miguel Angel Veristegul Vidal « Sergio Camacho Montiel « Ligia Rivera de la Parra + Diana Herrera Rojas» Victor Manuel Salazar Rojas» César Alejandro OrdoriezSalanueva £1 TineLUsimrid NasoalAtnara de Waxco Freutadae Grucos Spore aca Filet Yegett Prine Apcaioes/ Aerts Aug Flas Gurecindo H, Dla Gre Guam. Gero Pe eBeatt age Beco as ane! nor aa = Gave ve ober aL. Gina Aer eeu Pac cn net Agia Ayla a. da Rae eyo Senda Yoonsa Poses Rul get ‘esta van «Sous Camacho Morel pa from de Para» Dana Hora Rs = ior Morus Saar Fons: Blau Aang Ononer Suanana ‘Toponta de Bar Ese de nko: Facitad de Coates Supronts aka, Urvesis Nacoat Anon Secs, ‘629p: 1823 em; Bisel, genes Be, vsax.o7e-607- 206569 1. Poeninneico, 2. Plena cumin 9, Proce de bbe. stapes, oc uj, 0 Con dofatds Romie, 7 cee esomsten bees eo, 8 Detrcas narenises 10, Srbosn bated, i ioiepone decide Acad fotnten 1, Anordoas, a Eecreace, 1. Mereprepapotn Fisiologia Vegetal Pcp y pains Primera econ: ago de 2018 DR ©2018 Unverlded NactonalAutdoma de Mico ‘Cua Universi, Déegaien Coyoacin, CP O40, ‘Gna de México, Méxen Facultad de Estados Superiore eae ‘vena de fos Haein I Los Reyes fac ‘Tlalpepana de Bae CP 4050, Estado de Msc, Mica sata. anam se ISON 978.607 30-06569 Exod y sus carats on propiedad dea Unive Noclnsl Auten de Mico. riba a repel otal paca por clgler ‘medias ouortzctn seta dl ul de los derechos - trims, ‘MC Jo Joime vila Valveso (MC Laura Susana Rule Luna PLE Jorge Artaro fila Gimora 1G Bhi Gamboa Mijangos DDResO De POREADNY EOD DEANS BG Hictor Antonio Calders Roldan Impres yhechoen México iiiindice 1 [MEDICION DE POTENCIAL HIDRICO EN PAPA. 2 INFLUENCIA DEL POTENCIAL OSMOTICO SOBRE LA GERMINACION 3 FACTORES QUE AFECTAN EL PROCESO DE IMBIBICION Y SU EFECTO SOBRE 1A GERMINACION DE FRLIOL Phaseolus vulgaris L) 4 DETERWINACION DE LA TRANSPIRACION Y VELOCIDAD DE FLUIO EN TALLOS FLORALES DE Rosa hybrida L. 5 ‘TRANSPIRACION Y CONDUCTANCIA ESTOMATICA EN PLANTAS DE FRUOL (Phaseolus vulgaris L) BAJO DIFERENTES CONDICIONES AMBIENTALES 6 InbIce ESTOMATICO EN PLANTAS DE SOL Y SORA, 7 EFECTO DEL ESTR#S HIDRICO EN Phaseolus vulgaris. 8 SINTOMAS DE DEFICIENCIAS NUTRIMENTALES EN PLANTAS DE TOMATE (Solanum fycopersicum Mil) 2 31 7 a9 SIMBIOSIS CON BACTERIAS FUADORAS DDE NITROGENO EN PLANTAS DE FRIOL CON DEFICIENCIA DE NITROGEN 10 (CUANTIFICACION DE CLOROFILAS (ay bY CAROTENOIDES TOTALES EN HOIAS DE JTTOMATE (Solanum Iycopersicum Mil) " ‘TRANSPORTE ELECTRONIC EN TILACOIDES AISLADOS DE ESPIUACA (Spinacea oleracea L). 2 [ACTIVIDAD FOTOSINTETICA EN Solanum lycopersicum Mil. POR EMISION DE FLUORESCENCIA DEL FOTOSISTEMA I: INETICA DE TRANSPORTE ELECTRONICO 8 IDENTIFICACION DE PLANTAS C3, C4Y MAC 4 ANAEROBIOSIS EN PLANTULAS DE FRUOL, 15 INDUCCION DE LAACTVIDAD ‘LAMILASA EN SEMILLAS DE Phaseolus vulgaris 16 'SOLUCIONES PARA INCREMENTAR LA VIDA EN FLORES DE CORTE ” EFECTO DE LA ESCARIFCACION SOBRE LA GERMINVACION DE SEMILLAS DETAMARINDO (Tammarindus indica L) 8 MICROPROPAGACION VEGETAL 9 EFECTO DE EXTRACTO ACUOSO (DE RAIZ HOIA DEALFALFA SOBRE LA GERMINACION DE LENTEIA Y TRIGO. 20 DDETERMINACION DE PROLINA EN JTTOMATE {Solanum lycopersicum Mill) SOMIETIDO A ESTRES HIDRICO a DETERMINACION DE FENOLES EN PETALOSY HOIAS DETALLOS FLORALES DE Rosa hybrida L -APENDICE 5 7 a a a toa 19 us us nsMEDICION DE POTENCIAL HIDRICO EN PAPA. INTRODUCCION ‘no de los conceptos més utilizados en la actualidad para entender [ Ta relacidn de las plantas con el agua, tanto en la absorcién y trans- porte como en la pérdida de agua por transpiracién, es el poten- cial hidrico (y), que se basa en la ciencia della termodindmica, aplicandose los conceptos de energia libre y potencial quimico. El movimiento del agua en las plantas depende del y de sus teji- os, que al estar determinados por las caracteristicas érgano-funcionales de raices,tallo, hojas o sus subcomponentes, adoptan, dependiendo de su ‘metabolismo y relaciones con el entorno, distintos valores de v. Para medir el y existen métodos como la medicién de las vatiacio- nes de peso o volumen en un tejido u érgano determinado al colocarlos ‘en soluciones con diferentes concentraciones de sacarosa, manitol 0 po- lietilenglicol, entre otros (Salisbury y Ross, 1991). La finalidad consiste en establecer condiciones de hipertonicidad, isotonicidad e hipotonicidad, lo que se busca es una condicién isoténica, es decir, aquella solucién donde las concentraciones externa e interna sean iguales corresponderd al y del tejido, en esta condicién no hay flujo de agua. Las concentraciones de cada solucisn se transformarén a valores de y con la ecuacién de van't Hoff queFisiologia Vegetal races apexes se describe y explica en la metodologfa. En la figura 1.1, la flecha punteada indica el punto de isotonicidad, es decir, donde no hay ganancia ni pérdida neta de peso (Azcén-Bieto y Talén, 2008). Punto isoténico Ganancia de | #20 7 o — Pérdidade | -10 ae fontea |”? | Mpa Figura 1.1. Punto isoténico del tejido dentro de soluciones osmaticas con valores diferentes de potencial hidrico Métodos para determinar el yw 1a) Gravimétrico. Se basa en los cambios de peso que experimentan trozos de tejido al colocarse en soluciones de distinta concentracién de saca- rosa. Ely de la solucién en la cual no cambie de peso corresponders al ‘y del tefido. b) Refractométrico, Consiste en sumergir fragmentos de tefidos en solu- ciones de potencial osmético variable, dejar reposar por 2 h y leer la densidad éptica de la solucién con un refractémetro. ©) Chardakov, Consiste en depositar una gota de solucién coloreada y concentracién conocida en la parte media de la solucién equivalente donde estuvieron reposando los teidos. Por el flujo de agua entre el tejido y la solucién, la densidad puede disminuir, mantenerse sin cam- bios o aumentar. En la primera situacién la gota se ird al fondo del tubo, cen la segunda permanecera en la parte media y en la tercera subira, El ‘y del tejido corresponderd al y de la solucién en la cual permanecié en la parte media (Taiz y Zeiger, 2010), 4Capitl f. MEICIN OF POFENCIA ORC EM PRES OBJETIVO Medir el y de fracciones de papa (Solanum tuberosum L.) mediante los métodos de: cambio de peso, refractométrico y Chardakov. MATERIALES Y METODOS Aportado por el equipo + 2 papas grandes + L navaja de doble filo + 6 hojas de servitoallas Proporcionado por el laboratorio +7 frascos de 100 mL de boca ancha + 14 tubos de ensayo de 25 mL + gradilla +1 pipeta Pasteur +1 pipeta de 10 mL +1 propipeta «+ | balanza (precision de 0.01 g) + | refractémetro para aziicares en grados Brix + 25 mL de sacarosa (concentraciones: 0.0, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50, 0.60 molal) + | piseta con agua destilada + 1 gotero con azul de metileno 0.1% Procedimiento 1. Separe los tubos de ensayo en dos series y agregue las cantidades de solucién que se indican en el cuadro 1.1.Fsologa Vegeta -rnopiosyelcacenes Cuatro 1.1 Series de tubos Cancentatones sara sine Seb at) (ei Primera see Segunda eve 00 a 5 oa B 5 a2 5 5 0a = 5 a a5 5 es S 5 os 3s 5 2, Con el sacabocadas o navaja obtenga 21 fracciones de 3 cm de largo x 1 cm de diémetro. Separelas en grupos de tres, registre su peso ¢ intro- diizcalas en cada tubo de la primera serie, 3. Inciibelas por 2 horas. 4. Mientras transcurre el tiempo de espera, utilice el refractémetro para ela~ borar, con los tubos de la segunda serie, una curva de calibracién, en el je de las ordenadas coloque la densidad dptica en grados Brix y en el de Jas abscisas, los valores de y, en MPa, de cada solucién, 5. Después de realizar la curva de calibracién (NO SE DEBE colocar colo- rante en el refract6metro),a cada tubo de la segunda serie agregue dos gotas de colorante, agite y deje reposar. 6 Transcurrido el tiempo de incubacién (2 h), saque las fracciones de papa de cada solucién, séquelas ligeramente con una servitoalla y pése- las otra ver. Repita este procedimiento con todas las fracciones incuba- das, en el orden en que las colocé al inicio, No deseche las soluciones de donde las extrajo. Calcule el porcentaje de cambio de peso con la ecuacién siguiente: peso final ~ peso intclat ‘x 100 ‘peso inictal % cambio de peso = 7. Construya una grafica con el porcentaje de cambio peso, en el eje de las ordenadas, y los valores de y en MPa en el eje de las abscisas.Captus | MEDICION DE POTENCAL HRICO Eh aA La ecuacién de van’t Hoff para calcular el potencial osmético de la solucién (ys) es: ps = —miRT Donde: ‘m= concentracién molal de la solucién constante de ionizacién, 1.0 para sacarosa R= constante de los gases (0.00831 MPa kg! molK"') ‘T= temperatura absoluta (K), 8. Determine, por interpolacién grifica, la concentracién en la cual no haya ocurrido un cambio de peso en las fracciones de papa. 9, Método de refractometria, En la ventana del refractémetro coloque una gota, a la ver, de cada una de las soluciones que contuvieron las fraccio- nes de papa (primera serie), obtenga los valores de densidad éptica en Grados Brix e interpole en la curva de calibracién que realizé previa- mente, 10.Método de Chardakoy. Ordene la segunda serie de tubos (soluciones teiiidas) con las soluciones de la primera serie (donde se incubaron las fracciones de papa) como se muestra en el cuadro 1.2. Cuatro 1.2. Ordenamiento de las series de tubos ‘Tubos que contienen las soluciones tefiidas com | o1m | o2m | 03m | 04m | 05m | 06m “Tubos donde se incubaron ls fracclones de papa oom | oam | o2m | 03m | oam | osm | o6m 11.Con una pipeta Pasteur tome un pequefio volumen de cada solucién te- ffida, introduzca la punta de la pipeta, sin liberar la gota, hasta la milad del tubo que contuvo la fraccién de papa y libere una gota sin “empu- jarla”, Anote si su desplazamiento es ascendente, descendente o estitico (Figura 1.2). Capture imagenes fotogrificas. Escriba los resultados en el cuadro 1.3.Fislologla Vegetal Frncipory apizccnes Introductr al centro dela solueién LUberar gota de colorante Yretiarsuavemente Lagota Sube Baja No cambia 1 OI nee Figura 1.2. Posibles movimientos de la gata de colorante al medir el y por el método de Chardakov. Cuadro 1.3. Captura de resultsdos Tg eriene | Carsios nical | nat | : 00 tt_| 2.05 [4.03] sube oa 2.25 | 2.4b|10.22, puke 02 a.62| ota [7.26] sube 03 333 [3.8 [ate 0 Caynbid oa 2.4 | 164 [3.58 bays os: 3.02 | 2.64 [10.94 baa 06 2.1] 24h fsa bao Analisis y procesamiento de datos Los resultados de su equipo constituyen una repetic promedios es necesario que obtenga los datos de los demés equipos. Elaboreaul | MEDION DE POTENCAL HDRICOEN FPA sgrificas de cambio de peso y refractometria recuerde incluir los errores Lindar. Para el caso del método de Chardakov,elabore un mosaico fotografi- co donde se observe el comportamiento de la gota por cada dela solucién. Discuta respectoa las diferencias o coincidencias entre estos métodos. CUESTIONARIO. 1, sCual es el fundamento de los métodos de medicién de ¥ utilizados en ésta practica? 2, sCémo mediria el W de un exudado de xilema y otro de floema? Describa una metodologia para la medicién de Yen epidermis de cebolla. 4, La expresidn siguiente: “Y solucién de sacarosa = Ws solucién de saca- rosa” jes correcta o incorrecta? Justifique su respuesta, REFERENCIAS ‘Aacén-Bieto |, Telén M. 2008, Fundamentos de fsiologia vegetal, McGraw-Hill Inte- americana, Madrid, 681 p. Salisbury EB, Ross C.W, 1991, Plant physiology. Wadsworth Publishing. California. 682 p. Talz L, Zeiger E. 2010. Plant physiology. 6® Ed, Sunderland Massachusetts, US.A:Sin- ater associates, ine, publishers. 782 p.INFLUENCIA DEL POTENCIAL OSMOTICO SOBRE LA GERMINACION INTRODUCCION esde el punto de vista ecolégico y fisiolégico, la semilla representa el estado mas resistente a la deshidratacién en el ciclo de vida de Uno de los primeros eventos asocindos a la germina- cidn es la imbibici6n, la cual es de cardcter fisico y consistente en la incor- poracién de agua a la semilla como resultado de la diferencia de potencial hidrico o y, (entre ésta y su entorno, La disponibilidad de agua para la semilla puede ser limitante tanto en condiciones de escasa precipitacién como de alta concentracién de sales, donde el potencial de matriz y el po- tencial osmético, son los componentes determinantes del y en el suelo, Es posible simular en el laboratorio condiciones tanto de déficit de agua como de estrés salino. Por ejemplo, para el primer caso, se puede im- poner una condicién de tensién hidrica (sequia) haciendo crecer semillas en soluciones con potenciales osméticos variables. Entre los solutos sus- ceptibles de usarse se cuentan el polietilenglicol (PEG con diferente peso molecular), glucosa, sacarosa, manitol. Los criterios de eleccién incluyen cl que sean estables osméticamente, quimicamente inertes, no t6xicos, y que no penetren la cubierta seminal. De todas las sustancias indicadas solo el PEG6000 cumple con todos los requerimientos indicados. (Cordero y una plantFisiologia Vegetal Pinos) ali Stéfano, 1991). De esta manera, a utilizacién de concentraciones de solu- tos emulan un estrés hidrico (tensién hidrica) Bl estrés salino se refiere al potencial osmstico (concentracién de so- lutos) que puede abatir la germinacidn de las semillas (Taiz y Zeiger, 2010). En este contexto, Argentel, Gonzilez y Plana (2006) indican que Ia afec- tacién del cloruro de sodio sobre el crecimiento de plintulas en estadios tempranos de la germinacién de semillas de trigo se explican, tanto por una reduccién en la absorcién de agua, el abatimiento del transporte de carbo- hidratos al endospermo y ejes embrionarios, como por la toxicidad de esta sal sobre el proceso de divisin, expansion y diferenciaci6n celular. La respuesta a la salinidad varia dependiendo de la especie, Por ejemplo, Hordeum vulgare es més tolerante que Medicago sativa, Avena sa- tiva y Cicer arietinum al lograr germinar incluso a 400 mM de NaCl (24%), en comparacién de las especies aludidas que germinan a un maximo de 200 mM con 27, 17.33 y 24.33%, respectivamente. Los autores discuten {que concentraciones elevadas de NaC] provocan una baja movilidad de agua y, en consecuencia, de imbibicidn de las semillas, aspectos que en su conjunto reducen la germinacién. Las diferencias entre especies pudieran deberse a que cada genotipo requiere de un porcentaje de agua critico para Ia germinacién, Ademés, la salinidad afecta las funciones de la membrana del embrién donde sucede conjuntamente un incremento del influjo de jones externos y un eflujo de solutos citosélicos (Lastii et al, 2017). OBJETIVO. Evaluar el efecto del potencial osmético de soluciones de sacarosa y cloru- ro de sodio en la germinacién de las semillas de trigo (Triticum vulgare L.) y lenteja (Lens culinaris Medik). MATERIALES Y METODOS Aportado por el equipo + 20 cajas de Petri no estériles + 2mlineales de papel aluminio + Lrollo de servitoallasodo 2 PFLUENCIR DL PoTETCAL OSMOTIC Proporcionado por el laboratorio + 2pipetas de 5 mL. + 2 propipetas + 200 semillas de trigo + 200 semillas de lenteja Procedimiento L. Recorte 3 circulos de servitoalla del tamafio de la parte inferior de cada caja de Petri y coléquelos sobrepuestos dentro de ellas (Figura 2.1). Agregue 5 mL. de cada una de las soluciones indicadas. < Be Tame Fauniento 2. Una vez listas todas las cajas de Petri con los tratamientos indicados, coloque de forma equidistante 20 semillas de trigo por caja, con el hilio orientado hacia la superficie del papel. El total de cajas de Petri con semillas de trigo sera de 10. servitoalla “<9 Figura 2.2. Hilio hacia la servitoallaFisiologla Vegetal Pingo apcaciones 3. Coloque 20 semillas de lenteja de manera equidistante en cada caja de Petri, En este caso no es importante la superficie de las semillas que es- tard en contacto con la servitoalla. El total de cajas de Petri con semillas de lenteja sera de 10, La unidad experimental (UE) en ambas esp. tuna caja de Petri con 20 semillas. 4, Elexperimento constari de cinco tratamientos. Ftiquete las cajas con el soluto y concentracién correspondiente, como se muestra en a figura 2.3, Hecho lo anterior, agregue 5 mL de la solucién correspond cada tratamiento, corresponderiia Naci ‘scarosa 00m 01m O2m 04m oan Gm 02m 02m atm Oe Figura 2.3. Etiquetado de cajas de Petri. 5, Envuelva las cajas de Petri con papel aluminio, cuidando de no olvidar anotar los datos de su equipo y grupo. Coloque los paquetes de cajas de Petri en oscuridad y a temperatura ambiente (20-24 °C), 6. Durante 3 dias consecutivos, revise las cajas de Petri cada 24 h, ano- tando el niimero de semillas germinadas, considerindose germinadas cuando la radicula tenga una longitud de 5.0 mm. Registre los datos en los formatos correspondientes. Es importante que no cuente dos veces una misma semilla (Figura 2. 4). 2opt 2 INFLUENCE DEL POTENEIL OSMOTIC inovecoia cet a) (rosecuentata deli} Figura 2.4. Conteo de semmillas germinadas. 7. El ntimero de repeticiones de UE sera igual al numero de equipos de cada grupo por lo que debers obtener los resultados para poder proce- sar los datos y entregar su reporte. Analisis y procesamiento de datos 1, Con Ia ecuacién de Van't-Hoff (¥¥n= -miRT), convierta la concentra- cin molal de las soluciones a valores de en megapascales. 2. Calcule los porcentajes de germinacién para cada dia y para cada tra- tamiento, obtenga los datos de los otros equipos y elabore grificas para cada semilla y solucién utilizada. 3. Caleule el indice de velocidad de germinacién (IVG) para cada tra- tamientp, de acuerdo a la ecuacién propuesta por Maguire (1962): W6=%%, donde n, es el nimero de semillas germinadas en el i-ésimo dia (semillas germinadas en cada dia) y tes el tiempo transcurrido (en das) desde la siembra. 4, Sabiendo que los porcentajes de germinacién no observan una distribu- ‘eu Figura 4.2. Dispositivo para evaluar la tasa transpiratoria en tallos lorales de Rosa hybrida t. 11.Cada 30 min registre Ja disminucién del volumen de agua en la pipeta ‘Capture sus resultados en el cuadro 4.2. Cuadro 4.2. Captura de resultados Tienips (mia) “Tratamientos z 30, 0 30 [20 ‘control 2BMeO DE LA TRANSPRACION yELOCIDED coptulDEE 12.Desmonte los dispositivos, tome fotograffas de cada hoja y obtenga el fea foliar por tallo floral (Véase apéndice, A2). 13.Con los valores del cuadro, calcule la transpiracién en cada tiempo de eva- Juacién, para ello divida el volumen de agua consumido entre el area foliar. ‘Analisis y procesamiento de datos 1. Contos resultados de velocidad de flujo construya una grifica de barras ‘con promedios y error estindar, acompaiielas con una fotografia del ta- llo floral que represente a cada tratamiento. Aplique una prueba de “t” e indique si hubo diferencias en la velocidad de flujo, entre tratamientos. 2, Con los valores de transpiracién construya una gréfica poligonal que muestre los promedios y el error estindar en cada tiempo de evaluacién. Acompaiielos de una fotografia representativa de cada tratamiento. CUESTIONARIO 1. Explique de qué manera influyen las corrientes de aire sobre la tasa transpiratoria. 3Qué relacién guarda el flujo de aire con el grosor de la capa limitrofe de las hojas? 3. Explique por qué el recorte de un tallo floral puede modificar el flujo de agua a través del xilema, 4, {Cémo se relaciona el déficit hidrico con la transpiracién? 5. {Qué esla conductancia estomatica y que relacién tiene con la transpiracién? REFERENCIAS Arviaga-Frias A., De la Cruz Guzmdn G.H., Mandujano PM. 2016, Conductividad hidraulica en tallos florales de rosa ev Polo con diferente longitud. Revista Fitotecnla Mexicana 39(3):20-30, Azcdn-Bieto J, Talin M, 2008, Fundamentos de ‘Graw-Hill Interamericana de Espafia 651 p. Drezeta L., Lang A., Hall A, Volz R, Jameson P. 2004, Causes and effects of changes in xylem functionality in apple fruit. Annals af Botany 93:275-282. fologia vegetal. Madrid: Me- crFisologa Vegetal - izciosypleiones Golberg A. 2010, El viento y la vida de as plantas. Revista de la Facultad de Ciencias Agecolas Agrarias 42(1):221-243, Judret-Léper P, Sandoval VIM, Gonzilez H.V Colinas LM, 2011. Comportamiento fisiol6gico postosecha de tallos locales de osa (Rosa hybrid Len respues ta al fsforo aplicado en precosecha. Biociencias 1(2):3-16. Squeo FA. Leén ME 2007, Transpiracién. En Squeo BL. y CardemilL (Ed), Fisiolo iia Vegetal. La Serena, Chile: Ediciones Universidad dela Serena 67-8. pp, 30TRANSPIRACION Y CONDUCTANCIA ESTOMATICA EN PLANTAS DE FRUJOL (Phaseolus vulgaris L.) BAJO DIFERENTES CONDICIONES AMBIENTALES INTRODUCCION 1 los vegetales, la transpiracién es la pérdida de agua en forma de Ee a través de los estomas. Se conoce que el 60% de la Iluvia que e en los ecosistemas terrestres es incorporada por las plantas y transpirada a través de los estomas (Katul et al, 2012). La importancia de la transpiracién radica en que permite el flujo de agua a través de la planta, al intercambio gaseoso (CO, yO), el ascenso de la savia, el movimiento de elementos minerales y la disipaci6n de la energia radiante (Beck, 2010). Durante la transpiracién, un intercambio desproporcionado de CO, y.agua conlleva a una paradoja: entre mayor es la apertura del estoma, m: ficil es la entrada de CO, a las hojas; sin embargo, una gran apertura per- mitiré también la pérdida de grandes cantidades de agua, con los conse cuentes riesgos de deshidratacién o estrés hidrico para la planta (Buckley y Mott, 2013). Por lo tanto, la variacién en Ia apertura estomética y el niimero de estomas presentes en una planta determinarén, en parte, a pérdida de agua que pueda existir por medio de la transpiracién (Angeles-Alvare7, 2013), el resto de los factores que influyen en las tasas de transpiracién son factoresFisotogta Vegetal - inci y planes ambientales capaces de modificar las condiciones intrinsecas de la planta (Taiz y Zeiger, 2010), estos factores pueden ser: ~ "Temperatura. Las altas temperatura favorecen el aumento de la can- tidad de agua que puede contener el aire, lo cual se traduce en una mayor pérdida de agua por parte de las plantas. = Radiacidn solar. Los estomas, principalmente, se abren con la luz para permitir que se realice la fotosintesis, y esta apertura estomstica facilita la transpiracién. Un exceso de radiacién solar incrementa, por tanto, la transpiracién. = Humedad relativa, El bajo contenido de humedad en Ia atmésfera hace que exista una gran diferencia entre el contenido acuoso de la hoja y el aire circundante, lo cual facilita la transpiracién. - Velocidad del viento. El viento arrastra el vapor de agua que ro- dea ala superficie de las hojas; como consecuencia, se incremen- tala transpiracién. Uno de los més comunes para medir la transpiracién es la medicién de la conductividad estomética utilizando un porémetro de hoja, median- te el cual conocemas el flujo o la difusidn de vapor de agua que se realiza a través de los estomas, y de esta manera, se pueden someter a diferentes or- _ganismos de la misma especie a diversas condiciones ambientales, y poste- riormente, medir su conductividad estomitica para saber qué condiciones modifican la tasa de transpiracién (Buckley y Mott, 2013). Es importante recordar que el frijol es una planta de importancia a nivel nacional debido a su gran consumo y valor nutricional. Por esto, es necesario conocer qué factores podrian poner en riesgo de deshidratacién © estrés hidrico a los cultivos de frijol, yen un futuro poder prevenir pér- didas econémicas. OBJETIVOS 1. Medir la transpiracién y conductancia estomética de plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.), mediante dos métodos (gravimétrico y pord- metro de hoja). 2. Comparar la velocidad de transpiractén en plantas de frijol (P vulgaris L.) expuestas a diferentes condiciones ambientales (luz, oscuridad y aire). 2Cap 5 TRANSPAACION ¥ CONDUCTANCIAESTOMATCA MATERIALES Y METODOS Aportado por el equipo + Lrollo de papel aluminio Proporcionado por el laboratorio + 3 plintulas de frjol de 60 d en macetas individuales de 0.5 L + I ventilador + Lbalanza digital de 0.1 g de precision + 2 lamparas fluorescentes de 40 W + I porémetro de hoja, Decagon Devices, Inc. Procedimiento 1, Cubra con papel aluminio cada una de las macetas y alrededor del tallo de la planta, con el fin de evitar [a evaporacién del sustrato. 2. Pese cada una de las macetas ya cubiertas, y registre el peso inicial. 3. Divida las plantas en tres lotes, considerando una planta para cada uno de los tratamientos siguientes: luz, oscuridad y aire (se puede conside- rar un lote por cada equipo). . Mida la conductancia estomitica inicial en cada una de las plantas, 5. Coloque las plantas en cada uno de los tratamientos (luz, oscuridad y aire) al mismo tiempo, y deje pasar una hora. 6, Transcurrida 1 h y ain en los tratamientos, vuelva a medir la conduc- tancia estomitica de cada planta de la manera mas rapida posible. Re- gistre este valor como conductancia final 7. Una vez medidas las conductancias, retire las plantas de los tratamien- tos y yuelva a pesar las macetas para obtener el peso final. 8. Conjunte los resultados de peso de todos los tratamientos en ef cuadro 5.1, Considere como repeticiones los resultados de los demas equipos. 3Fsologls Vegetal - ince y pleases Cuadro 5.1. Resultados de cada equipo Made | Pe | feso | Dlerenca | conduei- | Conde | Oirencla de Tratamiento | NOt | intl | frat | “depeso. | PSI). Inhiba el transporte de electrones entre PSII y PSI con 10 ul. DCMU 1 mM e inmediatamente agregue 10 pl de dcido ascérbico 500 mM y 10 4. de DCPIP 10 mM para resttuir el transporte de electrones hacia el PSI. Este registro equivaleal funcionamiento de PSI iniciando del citocromob/{has- tael metil violdgeno. 1. Medio de eat 091 2 iaecies 50 2: Met volgen 104 ‘ocmy 10} S.ascotieo 10+ BCRP 10 vigena Tiempo (mints) Figura 11.3, Medicién de transporte de electrones. 65Fisologla Vegetal - Frcs yspczionss Analisis y procesamiento de datos 1. Calcule la velocidad de transporte de electrones de la cadena comple- ta (primera inflexién de la curva). La velocidad debe ser reportada en. moles de oxigeno/mg de clorofila total/minuto, 2. Calcule la velocidad de transporte electrénico de la cadena parcial (PSU) (Segunda inflexidn de la curva después de la inhibicién con DCMU). La velocidad debe ser reportada en nmoles de oxigeno/mg de clorofila total/minuto. 3. Analice y discuta los resultados, explique el comportamiento de los da- tos con respecto al uso de los inhibidores. 4, Anote en el cuadro 1.1 los resultados de la velocidad de transporte de electrones en tilacoides aislados de espinaca, Cuadro 11.1, Velocidad de transporte de electrones ‘en tilacoldes aislados de espinaca Tratamiento | Velocidad de transporte en ca- | Velocidad de transporte en | ‘dena completa (nmoles de 0.) | cadena parcial (nmoles de O,/ made coroflatatal/min) ing de clrofl total min) Repeticién 2 Repeticion 2 CUESTIONARIO L. gDénde acttia el metil violgeno? 2. :Dénde actita el DCMU? REFERENCIAS: Hipkins M.R, Baker N.R. 1986. Photosyothesis: energy transduction: a practical approach. IRL, Press. Oxford. 1016 p. “Taiz L, Zeiger E. 2010, Plant physiology. Fifth edition. Ed. The Benjamin/Cummings Publishing Co. California, E.U.A. 782 p. Walker D. 1987. The use of the oxygen electrode and fluorescence probes in simple ‘measurements of photosynthesis. Oxygraphics Limited. UK. 120-150 pp. 66ACTIVIDAD FOTOSINTETICA EN Solanum lycopersicum Mill. POR EMISION DE FLUORESCENCIA DEL FOTOSISTEMA Il: CINETICA DE TRANSPORTE ELECTRONICO INTRODUCCION rectamente relacionado con la absorcién de la energia luminica y Jel transporte electrénico en la membrana tilacoidal. Estos procesos pueden ser monitoreados a través de la emisién de fluorescencia de la clo- rofila a del fotosistema II (PSII). La relacion entre Ia emision de fluorescencia de la clorofila a del fotosistema II y el proceso fotosintético es directa. La energia luminosa absorbida por las moléculas de clorofila puede liberarse por tres vias: 1) usada para impulsar el proceso fotosintético (fotoquimico), 2) disipada como calor. 3) remitida como energia luminosa (fluorescencia) de menor energia, Estos tres procesos ocurren simultdneamente y, por tanto, “com- piten” entre si, de tal manera que el incremento en Ia eficiencia de uno de ellos resultaré en la disminucién de los otros dos. La medicién de la emisidn de la clorofila a provee informacién de la absorcién, distribucién y utilizacién de la energia electromagnstica para llevar a cabo el proceso fotosintético (Perales-Vela et ai, 2007) Cuando se ilumina una muestra preacondicionada a la oscuridad, la fluorescencia de la clorofila a se incrementa répidamente. Este incremento I a produccién fotosintética de oxigeno es un proceso que esté di-Fisiologia Vegetal - Pacpos 9 ali ‘ese reflejo del cierte (“reduccién") de los centros de reaccién del PSII y, por tanto, provee informacién de la actividad fotoquimica del PSII y el llenado (“reduccién’) de la poza de plastoquinona y los acarreadores finales del fo- tosistema I (PSI). La cinética de la fluorescencia de la clorofila a (conocida como “cinética de Kautsky” en honor a su descriptor) tiene una figura com- puesta de cuatro inflexiones nombradas OfIP (Figura 12.1). Fluorescencia variable (MV) elm att aoe oh oT “Tiempo (s} Figura 12.1, Cinética de emisién de fuorescencia del fotosistema len muestras preacondicionadas ala oscuridad. 1. O, es el valor minimo de la fluorescencia (F,.). Aparece alrededor de los 50 ps y en ese momento todos los centros de reaccidn estin abiertos “oxidados” 2, Jj se desarrolla alos 2 ms. F, esti relacionada con la reduccién parcial de Q, 1, se desarrolla a los 20 ms. F, estd relacionada con fa reduccién parcial de Q, ¥ 4, P, eS el valor maximo de la fluorescencia (F.,). El tiempo en el que se alcanza depende del protocolo experimental. En este momento todos los centros de reaccién estan cerrados “reducidos’ 3, 68‘opus 12, ACTIADAD FOTOSNTETICA EM Solanum ycopersicur il El analisis de la cinética de la fluorescencia de la clorofila a del PSII, se- gtin la prucba OJIP (Strasser y Strasser, 1995), se puede modelar establecien- do el destino del flujo de energia luminosa atravesando el PSII (Figura 12.2) Figura 12.2. Modelo simplificado del flujo de energia a través del fotosistema sein la prueba de OlIP (Strasser y Strasser, 1995). De esta manera, se obtienen los rendimientos cuanticos méximos para cada uno de los procesos: + gPo = (F,-F,)/F,, - Producto cudntico maximo de la fotoqui- mica primaria + yo = 1~ [(F,- Fy)/Fy - Fo] - Probabilidad de que un excitén atrapado mueva un electrin después de Q, + gEo = (gPo).(yo) - Probabilidad de que un excitén absorbido mueva un electrén después de Q, + @DIo = (F,/F,) - Producto maximo de disipacién energética como calor. OBJETIVO Evaluar la cinética de transporte electrénico en plantas de Solanum: lycoper sicum Mill por emisién de fluorescencia de la clorofila a del fotosistema Il. CyFilotogia Vegetal - Finns opacones MATERIALES Y METODOS Proporcionado por el laboratorio + 2 plantas de jitomate de 35 d con tratamientos a eleccién (1 en riego, 1 en sequfa, o 1 de sol, { de sombra o 1 con deficiencia de N, Issin deficiencia de N) + I fluorémetro PSI +L pinzas para medicién Procedimiento Preparacién de las hojas. La medicién se puede realizar directamente en la planta sin desprender las hojas. En caso de desprender las hojas, la me- dicién debe realizarse en un tiempo no mayor a 15 minutos. ‘Medicién de la emision de fluorescencia en hojas 1. Coloque las pinzas en las hojas. Las pinzas deberin tener la lamina ce- rrada para cubrir el orificio de medicién (Figura 12.3). Incube la hoja a temperatura ambiente por 10 min, para permitir la adaptacién a la oscuridad y con esta accién provocar la oxidacién de todos los compo- nentes de la cadena transportadora de electrones de Ia fotosintesis, de medicién antes de ‘realizar la medicién Figura 12.3, Colocacién de pinza en ta hoja 70Capulo12.ACTIOAD FOTOSWTENCA EW Seisnum eopescu il 2. Enciends el equipo presionando unos segundos la tecla “SET”: Con el bo- tén de MENU, seleccione el protocolo de > MEASURE, presione el botén de SET, Dentro de este ment seleccione el protocolo >OJIP y el equipo estara listo para medi 3. Transcurrido el tiempo de incubacién a la oscuridad, coloque la pin- za sobre el lector éptico. Asegirese de que el anillo de la pinza embo- ne sobre el anillo del lector de fluorescencia. Abra el obturador que cubre el orificio de la pinza y, habiendo seleccionado con el botén de MENU, el protocolo >OJTP, presione la tecla “SET” para que se realice la lectura; en la pantalla usted podré ver el porcentaje de me- dicién, al completar el 100%, Ia pantalla regresaré a la funcién OJIP para realizar una siguiente medicién. Los datos quedaran almacena- dos en el equipo (Figura 12.4). Figura 12.4. Ensamble de la pinza de hoja al fluorémetro "FluorPen FP 100” y lectura de la emisién de la luorescencia Para recuperar los registros almacenados en el “FluorPen” de Pho- ton System Instruments, Czech Republic, véase apéndice, A7. nFsologla Vegetal - rics y piciones Analisis y procesamiento de datos Analice las curvas OJIP y discuta las modificaciones en las inflexiones ob- servadas por efecto del tratamiento elegido. Cuestionario 1. Compare los valores, por tratamiento, en cada punto de la curva OJIP. En caso de existir diferencias, mencione las causas, REFERENCIAS Perales-Vela H.V,, Gonilez-Moreno S,, Montes-Horcasitas C., Cafizares-Villanueva RO, 2007. Growth, photosynthetic and respiratory responses to sublethal copper concentrations in Scenedesmus incrassatulus (Chlorophyceae) Che- ‘mosphere 67:2274-2281 Strasser [B, Strasser RJ, 1995, Mesauring fast uorescence transients to address en vironmental questions: The JIP-test. En: Photosynthesis: from light to bios phere, Mathis P. (Eds) Kluwer Academic Publisher, Dordrecht. 977-980 pp. naIDENTIFICACION DE PLANTAS C3, C4 Y MAC INTRODUCCION formas biolégicas, con su estrecha adaptacidn a las condiciones ambientales, dan informacién complementaria acerca del medio [donde se desartollan, Es objeto de la ecofisiologia vegetal compren- der los procesos fisioldgicos de los organismos, sus caracteristicas bio- quimicas y sus potencialidades genéticas, en interaccién con el ambiente donde los organismos se desarrollan (Taiz y Zeiger, 2010). Cabe resaltar que el entendimiento de las adaptaciones vegetales a su ambiente no solo se deben a sus posibilidades fisiolégicas, también intervienen adaptacio- nes morfolégicas para complementar el proceso, entre estas cualidades © aptitudes destaca la toma de minerales y la asimilacién de carbono en forma de CO,, Esta tiltima es la expresién més pura del proceso fotosin- Ltico, el cual, tiene tres manifestaciones basicas conocidas como foto- sintesis C,, C, y MAC (Metabolismo Acido de las Crasuldceas) (Socorro y Cristobal, 2013). Los tres mecanismos mencionados antes, tienen tanto ventajas como desventajas, y las plantas pueden competir con éxito sélo cuando los beneficios de su propio mecanismo fotosintético les favorecen. En un proceso fotosintético diferente ala fijacién de CO, establecida por el cicloFisologla Vegetal - iris y apkacones de Calvin, se comprobé que una vez realizados los procesos luminicos normales, el primer producto formado en las reacciones oscuras no es el Acido fosfoglicérico de tres carbonos, sino los acidos milico y aspértico que contienen cuatro étomos de carbono, razén por la cual, se denominé C, aesta ruta de fijacién, dando evidencia de que los aspectos morfologi- cos de las plantas estan en estrecha relacidn con los fisiolégicos, y estos, a su vez, dependen del medio ambiente en donde se desarrollan, Otra va- riante la encontramos asociada alas plantas sucullentas, las cuales parecen estar mejor adaptadas a condiciones muy dridas y, por tanto, uno de los ‘métodos mis eficientes que utilizan para la conservacién del agua, es el cierre de estomas durante el dia, por esta razén, este mecanismo fotosin- tético reduce su habilidad para adquirir y asimilar carbono, Estas plantas son identificadas por sus intensas fluctuaciones diarias de la acidez tisular (Cach-Pérez et al, 2014), En las figuras 13.1 y 13.2se presenta la anatomia caracteristica de los tipos metabilicos C,.C, y MAC. Figura 13.1. Estructura de las hojas C,, de Boutelovn sp. (a) yC,, de Syringa sp. (8) Figura 13.2. Cortes de hojas de diferentes orquldeas (MAC). ™Cpu 13 DEUTFACACION OE PLANTAS 3, C4Y BAC Las hojas con fotosintesis C, y C, muestran diferencias claras en su anatomia y ultraestructura (Figura 13.1 A y B). En las plantas C, dos com- plejos de células localizadas en la vaina que circunda el haz vascular, pre- sentan un cierto grado de especializacién fisiolégica. El interior llamado “vaina mesostomitica’, que tiene pocos 0 ningiin cloroplasto, muestran paredes engrosadas y reemplazan a los elementos de sostén faltantes en el haz. vascular. La vaina mesostomética esta circundada por una se- gunda cubierta parenquimatosa que contiene slo unos cloroplastos, veces mas pequefios que aquellos de! meséfilo. Las células de la vaina del haz en plantas C,desempefian un papel no tan significativo respecto alas C, en la asimilacién fotosintética del CO, (Taiz y Zeiger, 2010). Las plantas MAC no se pueden caracterizar por su tipo de anatomia, ya que no es constante; sin embargo, se puede hablar de algiin grado de suculencia ajustado con una gran extensién de clorénquima (Figura 13.2); no obstante, a esta planta se ha identificado por sus fluctuaciones diurnas de acidos orginicos (Geydan y Melgarejo, 2005). ‘Cualquiera de las vias de asimilacién del CO, por parte de las plantas produce almidén en alguna fase del proceso, por lo que la determinacién cualitativa de éste puede evidenciar el tipo de asimilacién que presenta la planta, en el caso de la C, los cloroplastos de las células del meséfilo se tefiirén de azul oscuro si se somete a una solucién de yodo, para las C, esa tincién ocurre predominantemente en las células de la vaina del haz (Taiz, y Zeiger, 2010) ‘OBJETIVOS 1. Identificar plantas con fotosintesis C,, C, y MAC por medio de su ana- tomia foliar. 2. Registrar los cambios en la concentracién de acidos orginicos en las plantas MAC durante un cielo diurno. 3. Detectar cualitativamente la ubicacién del almidén en cortes de tejido fotosintético. %Fisiologia Vegetal - nfs aplacons MATERIAL Y METODOS Aportado por el equipo + Fhojas pequefias de C3 y C4 Proporcionado por el laboratorio + 2 preparaciones fijas de hoja de plantas CC, y MAC +L microscopio dptico + 2vasos de precipitado de 50 mL. + 2vasos de precipitado de 100 mL. + A capas de gasa para fltrar + 25 mL deacetona al 80% +L parrlla con agitador magnético + 25m de lugol + 2 plantas suculentas (Sedum o Echeveria) con 10 den sequia + Lpiseta con agua destilada +L mortero con pistilo + I probeta de 25 mL +L bureta de 50 mL + 1 pinzas para bureta +L soporte universal + 100 mL de NaOH al 0.004 N (preparada con agua destilada pre- viamente hervida) + Lpotenciémetro + Zembudos de plistico Procedimiento 1. Observe las preparaciones de hojas de plantas C,, C,y MAC al micros- copio éptico con 400 aumentos y elabore esquemas indicando la ubica~ cidn de los cloroplastos, 1. Para determinar la posicién del almidén en hojas C, y C, coloque am- bos tipos de hojas en acetona al 80% y caliente hasta extraer la clorofila. 2. Para tefir las hojas, sumerja cada una en la solucién de lugol y observe en fresco con la lupa del microscopio éptico. 3. A las 07:00, 13:00 y 19:00 h del mismo dfa realice lo siguiente: Con un horadador, tome ! g de tejido de la planta MAC y macérelo con 4.5 ml, 16apy 13, DERTFICACION DE PLANTAS C3, C4 MAC de agua destilada previamente hervida. Filtre en cuatro capas de gasa y afore a 25 mL con agua destilada, Titule con una solucion de hidréxido de sodio (NaOH) 0.004 N hasta un pH de 8.3 con un potenciémetro, Cada mililitro de NaOH gastado, corresponde a 1 meq de acidos orga- nnicos por cada 100 g de tejido fresco. Analisis y procesamiento de datos 1. Realice un esquema o tome fotografias de las preparaciones observadas al microscopio, sefale las diferencias anatémicas entre C3, C4 y MAC, 2. Realice un esquema o tome fotografias de las hojas teftidas con lugol, que observ con la lupa del microscopio. indique los sitios donde la reaccién con el almidén fue positiva, ¢ identifique las diferencias exis- tentes entre C, y C, 3. Concentre los datos de acides titulable obtenidos en cada horario, tal como se indica en el cuadro 13.1. Posteriormente, aplique un anilisis de varianza tomando como factor al tiempo y, sies procedente, aplique una prueba de comparacién de medias y explique los resultados obtenidos. Cuadro 13.2, Resultados Hora 97.00 B00 1300 ml de NaOH gastados ml de NaOH gastados ‘mide NaOH gastados CUESTIONARIO 1, Dibuje un esquema de los tres tipos de fotosintesis en especies distintas, alas aqui estudiadas y seftale sus diferencias. 1, 3Cudles de las caracteristicas anatémicas reportadas para plantas C, y C, no aprecié usted en las especies revisadas en esta prictica? 2. Mencione por lo menos cinco familias que presenten metabolismo C, C,y CAM. " 3. 3Qué plantas son més eficaces en la captacién de CO,? nFisiologia Vegetal - Pecos 3 4, JEn qué condiciones ambientales predominan preferentemente las plantas C,,C, y MAC? 5. Mencione las cuatro fases del metabolismo acido de las crasuliceas. REFERENCIAS: Cach- Pérez MJ. Endrade [L., Reyes G.C. 2014, La susceptibilidad de las bromeliiceas epiftas al cambio elimitico. Botanical Sciences 92(2):157-168. Geydan TD, Melgargjo LM. 2005. Metabolismo cido de las crasuléceas. Acta Biolé- ¢gica Colombiana 10(2):3-15. Socorro A., Cristébal R. 2013, Fotosintesis Artificial. Comparacién Con El Mecanis ‘mo Natural, Revista Cubana de Fisica 30(1):9-13. ‘Taiz L., Zeiger E, 2010, Plant physiology. Fifth edition. Sinauer Assoctates Inc. Publi- Sunderland, Massachusetts USA. 782 p, 78ANAEROBIOSIS EN PLANTULAS DE FRUOL INTRODUCCION de algunos cukivos, se presenta en diferentes grados y se caracteriza por una deficiencia en la concentracién del oxigeno disponible o (De la Cruz etal, 2012) La anegacién del suelo no genera un estrés primario en la planta, ya que ésta no sufre ningiin cambio en su potencial hidrico ('Y) el verdadero problema llega como estrés secundario, consecuencia del exceso de agua que promueve la pérdida de nutrientes minerales en el suelo, pérdida de metabolitos intermedios por lavado de raices, falta de oxigeno (hipoxia 0 anoxia), exceso de CO,, sobre produccién de etileno y algunos otros pro- ductos resultantes del metabolismo de la planta por permanecer en estas condiciones como son etanol, acetaldehido, compuestos ciandgenos, entre otros (Prados, 2004), Muchas plantas presentan modificaciones morfolégicas asociadas con {a tolerancia a hipoxia, como es la formacidn de aerénquima, un tejido vege- tal con espacios largos ¢ interconectados lenos de gas. El aerénquima oftece ala planta una via interna para el movimiento necesario de oxigeno de la parte aétea dela planta ala raiz; pero también para la eliminacién y detoxifi- cacién de etileno acumuilado en el tjido (De la Cruz et al, 2012). I anaerobiosis pot inundacién es un factor limitante en la produccién posFsologa Vegeta -Pincpisy a A nivel fisioldgico se ha demostrado que las plantas en anaerobiosis, presentan modificacién en la concentracién de reguladores de crecimiento como acido abscisico y etileno (Kuen-Jin et al, 2014s Visser et al. 1997). Se observa una disminucién en el transporte de citocininas de la raiz al brote, disminucién de la permeabilidad de las membranas, peroxidacién de ipi- dos, degradacién de clorofilas o proteinas, asi como una disminucién de la expansidn foliar y cierre estomitico. ‘A nnivel molecular, se altera la expresién genética de enzimas asociadas con estrés anaerdbico como: alcohol deshidrogenasa, lactato deshidrogena- sa, aldolasas, alfa amilasa, invertasas y sacarosa sintasa (De la Cruz ef al, 2012; Biokhina, Virolainen y Fagerstedt, 2003). Particularmente en plintulas expuestas a hipoxia, se ha demostrado que el proceso de lignificacién disminuye o se inhibe por Ia disminucién en la actividad de enzimas peroxidasas, lo cual permite la elongacién de hipo- cétilos, brotes 0 peciolos (Tse-Min y Yaw-Huei, 1995). OBJETIVO Evaluar el efecto de la anaerobiosis en la morfologia, la anatomia y la acti- vidad peroxidasa de plintulas de Phaseolus vulgaris L. MATERIALES Y METODOS Aportado por el equipo + Lnavaja de doble filo + Lregla de 30cm + I marcador indeleble + 3 portaobjetos + 3 cubreabjetos Proporcionado por el laboratorio. + 12 plintulas de frijol de 21 d crecidas en agrolita + Lgradilla «12 tubos de ensayo de 100 x 10 mm + 2pipetas de 10 mL +L micropipeta 20-250 ul. 80‘cape 14 ANAEROBISIS EN LANL DE FOL + I mortero con pistilo + 1 palangana con hielo + 1 balanza con precisién de 0.01 g + I centrifuga clinica + Lespectrofotémetro + I microscopio éptico + 300 ml. de guayacol 100 mM + 300 ml. de peréxido de hidrégeno al 3% ‘+ 15 mL de buffer de fosfatos | mM, pH 6.2 + 15 mL de cloruro de sodio | M Se utilizardn 12 plantulas de frijol con siete dias de haber emergi- do, seis de ellas se inundarin por cuatro dias, el resto permanecerd en condiciones aerobias y servirin como control (Figura 14.1). Cada unidad experimental consistira de dos plintulas de frijol y se realizardn tres re- peticiones (r=3) de la germinacién 7aias 4 dias andias Figura 14.1. Procedimiento para la aplicacion de anaerobiosis, cen plntulas de Phaseolus vulgaris L. BtFisologla Vegetal - iris yapkacones Procedimiento i Etiquete las plintulas como: a) Control b) Anaerobiosis De cada plintula, registre la longitud de la raiz, En forma horizontal, coloque la raiz de cada pkintula sobre un portaobje- tos, En la parte media, realice un corte transversal < 1 mm y coloque los cortes sobre otro portaobjetos, cibralos y obsérvelos en el microscopio. . Actividad peroxidasa De cada par de plintulas, macere en frio 125 mg de raiz.con 2.5 ml. de bu- ffer de fosfatos, vierta el contenido en los tubos de ensayo y centrifugue 2 3500 rpm por 15 minutos. Recupere el sobrenadante en otro tubo y etiquete (peroxidasa soluble). 5, Resuspenda el sedimento con 2.5 mL de NaCl 1 M, incube por 15 min a temperatura ambiente (25-30 °C) y vuelva a centrifuger por 15 min a 3500 rpm. Recupere el sobrenadante y etiquete (peroxidasas unidas ala pared celular). 6. Dentro de la cubeta del espectrofotémetro, ya sea para determinar la actividad de las peroxicasas solubles o unidas a pared, mezcle 1950 ul de buffer, 50 ul del sobrenadante, con 50 pL de guayacol 100 mM, ajuste el equipo a cero de densidad dptica (DO) con 470 nm de longi- tud de onda. 7. Agregue en la mezcla anterior 50 il. de perdxido de hidrégeno al 3% ‘mezcle con rapidez, e inmediatamente proceda a leer la densidad éptica cada 15 s, por 3 minutos. 8, Se observard un incremento de la absorbancia o densidad dptica al pre~ sentarse actividad peroxidasa (Figura 14.2). 2 3. 2Capt M4 ARAROBIOSIS EN LANTULAS DE FRCL ae ‘Tejido macerado de la muestra 50 Mongtame B ask ge mp cn 0 Fi saalane gon do2-del» DO/min gus oleae ec rea) 2 o10 00/min/2.$ mg > OO/min/s é ous pp cone: Mioutos min} Figura 14.2. Grfca de la actividad peroxidasa. La velocidad inicial se obtiene locali- zando en las graficas un rango de puntos con tendencla lineal equivalente a1 min y calculando el incremento de DO por minuto, ys gramos de ted se calculan con el ‘peso del telido fresco que se maceré y tomando en cuenta el volumen utilzado para la lectura en el espectrofotémetro. Los resultados se expresan en DO/min/e, Analisis y procesamiento de datos 1, Con los promedios de sus tres epeticiones de la longitud de las rafces, elabore una gréfica y compare el crecimiento, asimismo registre sus da- tos en cuadro 14.1. CCuactro 14.1 ntegracién de ios datos obtenidos en los tratamientos experimentales ae arene = Perenidatas (60 min gH) (em) Selubles Unidas a pared! Control Anaeroblosls BFisiolagia Vegetal - Pincpeszplexcones Después de realizar los cortes y observar en el microscopio dptico, capture las imagenes en fotografias 0 realice dibujos de buena calidad. Identifique y sefale las estructuras que se observan para realizar una buena comparacién de la anatomia de ambos tratamientos. 3. Una vez que haya realizado la cinética enzimatica en los tratamientos, construya las graficas correspondientes alos dos grupos, calcule la velo- cidad inicial (Figura 14.2) y comparelas registrando los valores en el cua- {dro 14.1, No olvide realizar anslisis estadistico para determinar siexisten diferencias entre tratamientos. CUESTIONARIO 1, :Qué implica la formacién de aerénquima? 2, ;Qué otro proceso se puede encontrar alterado en una planta no adap- tada a la anaerobiosis? 3. Mencione cinco ejemplos de plantas que presenten adapt anaerobiosis. na la REFERENCIAS Blokhina ©, Vieolainen E, Fagerstedt K.V. 2003. Antioxidants, oxidative damage and ‘oxygen deprivations stress: Review. Arnal of Botany 91:179-194, De la Cruz Js Moreno L2, Magnitskiy S. 2012, Respuesta de las plantas a estrés or inundacign, Una revisién. Revista Colombiana de Ciencias Horticolas 6(1):96-109. Kyen-finT, Shu-Jen Cx Ming-Che , 2014. Ethylene plays an essential ale inthe reco ‘ery of Arabidopsis during post-anaetobiosis reoxygenation, Plant, Cell and Environment 37:2391-2405. Prados LA. 2004. Respuesta de ls plantas al anegamiento del suelo, tnvestigacton ‘grara, Sistemas y Recursos Forestles 13(1):101-107 ‘se-Min 1, Yaw-Hluel L, 1995. Changes in soluble and ell wall-bound peroxidase act- ‘ities with growth in anosia-teated rice (Oryza sativa f.) coleopiles and roots Plant Science 106 Visser, J. Wa Nabben R. H, M. Blom C. W. P, Voesenek L.A.C, 1997, Elongation by primary lateral roots and adventitious roots during condition of hypoxia and igh ethylene concentrations. Plant Cell and Environment 20364765. a4INDUCCION DE LA ACTIVIDAD -AMILASA EN SEMILLAS DE Phaseolus vulgaris L. INTRODUCCION si6n de los coloides e inicia los procesos enzimitticos: Este proceso se Imanifiesta con un incremento en la respiracién, derivado de la com- bustién de sustratos oxidables y la produccién de ATP en la mitocondria. Los sustratos se encuentran en el endospermo, exclusivamente en forma de polisaciridos de alto peso molecular como almidén, amilopectinas, amilosa y lipidos complejos (triglicéridos). Por esta razén, la semilla debe desarrollar un sistema enzimatico lo suficiente basto para la obtenci6n de monosaciridos y dcidos grasos. Tal proceso constituye la movilizacién de reservas nutritivas, Cuando los polisacaridos son degradados durante cl letargo, la semilla puede morir por falta de sustratos oxidables, similar 4 lo que ocurre cuando se someten a periodos prolongados de almace- namiento, donde la hidrélisis lenta del almidén libera glucosa que sale ficilmente al exterior, con ello se pierde también ATP requerido para la germinacién (Hopkins y Hiiner, 2008). En semillas de cereales y otras plantas, el embrién est rodeado por reservas presentes en las células, metabdlicamente inactivas del endos- permo que, a su ve7, se encuentra rodeado por una capa de dos a cuatro L: fase de hidratacién o imbibicién de las semillas induce la disper-Fslologta Vegetal - ini y apeadones ccélulas conocida como capa de aleurona. En la capa de aleurona se pro- duce la hidrdlisis de carbohidratos y proteinas mediante Ia actividad de la sa. Las giberelinas inducen la expresién del gen que incre- menta los niveles de ARNm, traducible para la sintesis de alfa amilasa, es decir, la accién de las giberelinas estimula la hidrélisis del almidén (Taiz y Zeiger, 2014). Si se extrae el embrién de una semilla de cebade, las células de la capa de aleurona no producen las enzimas hidroliticas. Lo que sugiere que el embrién estimula, con alguna hormona, la sintesis de las enzimas, como Ja alfa amilasa. En la capa de aleurona ocurre la sintesis de las enzimas ‘que degradan el endospermo, También existe evidencia de que el escutelo también secreta estas enzimas, en este caso las giberelinas parecen tener ‘efectos menos espectaculares sobre la movilizacién de reservas alimen- ticias en dicotiledéneas y en gimnospermas, que en cereales, aunque en algunas especies la presencia del eje embrionario atin es esencial para la degradacién normal de estas reservas (Azcn-Bieto y Tal6n, 2008). OBJETIVO Evaluar la actividad de la a-amilasa inducida por dcido giberélico (GA,) en semillas de Phaseolus vulgaris L. MATERIALES Y METODOS Aportado por el equipo + Lbisturt + 1 pinza de diseccién + marcador indeleble + 10 cajas de Petri estériles (traérlas una semana antes, el dia de la prictica se les devolverdn con medio de cultivo)* Proporcionado por el laboratorio + Lmechero de alcohol + 50 mL de alcohol etilico 96 % + 50 mL de solucién reveladora: preparada con 1 gL'' de yodo su- blimado y 2 g L" de yoduro de potasio granular 86Catal 15, NOUCCION DE LA ACTIADAD ANALASA EW SMM + 20 semillas de frijol previamente desinfectadas, por 10 min, con hipoclorito de sodio al 3 % y embebidas por 24 h en agua destila- da estéril *Paapreprarel medio de cultvo con almidén ease apéndice, AB Procedimiento 1, Tome 20 frijoles embebidos y coléquelos en la caja de Petri estéril con tun poco de agua destilada estéril, 2. Con el bisturi y pinzas sepate los cotiledones cuidadosamente, quitando la cubierta seminal 3. Bajo condiciones estériles, coloque en series de cuatro, con sus respectivas repeticiones (r=3) os siguientes tejidos vegetales en los tratamientos 0, 1 y 101mg L'' de dcido giberstico (Figura 15.1) + Cotiledones + Cotiledones con embrién + Embriones 2D,.— | ows | a 3 LE aa esa Riin——F Figura 15.1, Esquema de fos diferentes tejides que ayudarén a revelar a actividad de a-amilasa, 4, Incube entre 22 y 26°C por 48 h en oscuridad, 5. Después de lo anterior, marque la posicién de os embriones y cotiledones por le parte inferior dela caja, extraigalos de la caja (Figura 15.2). 87Fisologla Vegeta - Pins y pleaoes v D 0 v Figura 15.2. Vista inferior de una caja de Petri. Se observan los contornas de las semillas, marcados 48 h después dde permanecer en oscuridad. 6. Revele la actividad de la a-amilasa adicionando 10 mL de la solucién de ryodo sobre el medio, agite por 2 min y deseche la solucién en un conte- nedor. Enjuague ligeramente con agua corriente y observe a contraluz Jas regiones no tenidas. 7. De cada tratamiento y tejido registre el didmetro mayor de la zona clara (degradacién de almidén). 8. Capture sus resultados en el cuadro 15.1. Cuadro 15.1. Captura de resultados ‘Actividad amilasa (em) 6A, (mab) Embriones | _Cotledén con embeién | Cotledénsin embrién o 1 10 88opto 18. DUCE DE LA ACTINDAD -AMLASA EH SEMLLAS. Analisis y procesamiento de datos 1. Enel agar de la caja Petti, calcule el drea de la actividad de a-amilasa en cada tejido (Véase apéndice, A2) 2. Grafique los promedios y errores estindar para cada estructura de la semilla (cotiledén, embrién y cotiledén + embrién).. CUESTIONARIO 1, sCémo se lleva a cabo el proceso de la germinacién? 2, {Qué otras enzimas patticipan en la degradacién de almidones durante la germinacién de las semillas? 3. ;Cuales son los efectos de las giberelinas y cual es su modo de accién so- bre la germinacién? 4. gExisten otras a-amilasas activas durante la vida de la planta? ;En donde ycuindo actiian? REFERENCIAS Azcén-Bieto |, Talén M, 2008, Fundamentos de Fisiologia vegetal, Segunda Edicion, Mé- xico.Mc Graw Hill. 651 p. Hopkins WG, Hiiner NPA. 2008. Introduction of plant physiology, Fourth edition. USA"503 p. ‘Taiz Ly Zeiger E, 2010, Plant physiology. Fifth edition, Sinauer Associates Inc. Publi- shers, Sunderland, Massachusetts USA. 782 p. 89SUNSETS ENN IU ET YEO OTNSOLUCIONES PARA INCREMENTAR LA VIDA EN FLORES DE CORTE INTRODUCCION practicas de manejo sin detrimento en su calidad y vida de florero (Macnish et al. 2009). Los productores cosechan los tallos florales, los introducen en contenedores con agua o con soluciones hidratantes, los transportan al sitio de seleccién, se separan por tamaiios, se empaquetan con papel corrugado y se vuelven a colocar en los contenedores, para trans- portarlos al distribuidor o almacenarlos entre 0 y 2°C (Walton et al, 2010), En el florero, la vida de los tallos depende de la cantidad de azticares que hayan acumulado en las hojas durante su cultivo. La translocacién de los azticares es la tinica fuente de energia para la apertura de los bo- tones florales, La aplicacién de compuestos preservantes, como Chrysal clear’, Flora life’, sacarosa, sales de plata, icido-amino-oxi-acético o am no-etoxi-vinil-glicina, ala solucién, incrementa la vida de los tallos flora- les (van Doorn, 2012). Los compuestos preservantes mejoran el flujo hidrico, promueven la elongacién y apertura de los botones florales y retrasan la senescencia al inhibir la sintesis o evitar la accidn del etileno. Durante los primeros dias en el florero, los tallos absorben agua y luego la tasa de absorcin D= de la cosecha, las flores de corte deben tolerar las diferentesFisolota Vegetal - incios ypcsiones disminuye. Aquellos que mantengan por més tiempo el flujo hidrico, ten- drin mayor peso fresco y vida de florero (Reid, 2009). OBJETIVO Evaluar el efecto de Chrysal clear’, 10 g 1! y sacarosa, 4% en la vida de florero del clavel (Dianthus caryophyllus L.). MATERIALES Y METODOS Aportado por el equipo + Ivernier +L tijera para podar + Lregla de 30cm + Imasking tape Proporcionado por el laboratorio + 9tallos florales de clavel (Dianthus caryophyllus L.) + Lgradilla + 9 tubos de ensayo de 20x 17 em +L vaso de precipitados de 250 mL. + 120 ml de Chrysal clear’, 10 gL" + 120 mL de sacarosa al 4% + Lbalanza digital Procedimiento 1. Etiquete tres unidades de tubos de ensayo y tallos florales de la forma siguiente: a) control, b) Chrysal Clear’, ¢) sacarosa. 2, En los tubos etiquetados como control agregue 40 mL de agua de la llave; en los otros, 40 mL de la solucién correspondiente. 3, Previa tara del vaso de precipitadas, coloque en su interior cada tubo con la solucién afadida y registre su peso. 4, Uniformice a 10 cm a longitud de cada tallo, Tome como referen- cia la base del botén floral. A la vez que recorte cada tallo, registre su peso y coléquelo de inmediato en el tubo correspondiente. Las 2opt 6. SOLUCONES PARA INCREEENTAR LA IDA EN FLORES, unidades experimentales constarin de: un tubo con 40 mL. de so- lucién y un tallo floral. 5. Distribuya las unidades experimentales en toda la gradill y coléquelas, en el drea que se le asigne, dentro del anexo del laboratorio. 6. Diariamente, por 10 d, registre: a) el peso de cada tallo floral, b) peso de cada tubo con la solucién, c) didmetro superior del botén floral y d) 0 fotogrifico por tratamiento. Renueve la solucién correspon- snte al cuarto y séptimo dia, 7. Registre sus datos en los cuadros 16.1, 16.2 16.3. Cuatro 16.1. Peso (g) de cada tallo floral : “Wleripas de evaluaclon Tratamientos a[z[3[¢[sle]7]s]9 | Control ‘Chrysal clear Sacarosa Cuadro 16.2. Peso (g) de cada tubo con solucién Se e ‘Tlemipos de evaluaclén (d) aft2fs[e[s;Ts[r[e[s [wo Contr! Cchysal clear Sacarosa 93Fisiologia Vegetal - Pinos apliacones Cuadro 16.3. Didmetro (cm) de cada botén floral “iempor de evaluacion (@) ‘Tratamilentos tft2,3]¢[ste[7[s]o [| Control ae Cchrysal clear Sacarasa 1 Analisis y procesamiento de datos Obtenga los cambios de peso fresco (PF) y la tasa de absorcién de la solu- cin (TAS) con las ecuaciones siguientes: PF (%) = Ser 100 Donde: PE= Peso fresco PEt Peso freso del tallo al dia 1, 2,3... Fiz Peso del tallo al dia previo. (Psi -Psn TAS = 1) Pit Donde; ‘TAS= Tasa de absorcidn de la solucién (mL g d") PSn -1= Peso de la solucién al dia previo PSn= Peso de la solucién en el dia 1, 2, 3... Pi eso inicial del tallo floral,epi 6 SOLUCIONES PARA INCREMENT LA DA EM FLORES Con los datos de peso fresco, tasa de absorcién y diémetro de los botones florales construya gréficas donde se muestre el comportamiento de los tres tratamientos y sus errores estandar, Con el registro fotografico, construya una imagen comparativa de los tres tratamientos en los dias 1,5, 7 y 10. CUESTIONARIO 1. Mencione tres criterios para determinar el fin de la vida en florero. 2. Explique cémo contribuyen los preservantes Chrysal Clear” y sacarosa en la apertura de los botones y la vida de florero, 3. 4Cémo se relaciona el peso fresco de la unidad floral con la tasa de ab- sorcion y la apertura del botén floral? REFERENCIAS Macnish A.J, de TheijeA., Reid MS. 2009, An alternative postharvest handling strategy for cut fowers-dry handling afer harvest, Acta Horticulturae 847:215-222. Reid M.S. 2009, Postcosecha y manejo de las flores de corte. Ediciones HortiTecnia da. Colombia. 38 p. vvan Doorn W.G. 2012. Water relations of cut flowers: An update, Horticultural reviews 40:55- 108. ‘Walton E.f, Boldingh H.L., McLaren G.P, Williams M.H,, Jackman R. 2010. The dy- namics of starch and sugar utilisation in cut peony (Pazonta lactflora Pall) stems during storage and vase life. Postharvest Biology and ‘Technology 58:142-146, 95_esezrnarenengenon ge onarengonansseatsegreanucmaannnerzEFECTO DE LA ESCARIFICACION SOBRE LA GERMINACION DE SEMILLAS DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) INTRODUCCION cién de la germinacién en el tiempo en una poblacién de semillas, asi que la funcién de una semillaes establecer una nueva planta, y podria parecer extraiio que la latencia exista como un bloqueo intrinseco para el inicio de la germinacién, sobre todo cuando ello sucede sin restric- ciones bajo condiciones favorables. Existen dos tipos de latencia, en la mera, las semillas de algunas especies no germinan debido a la restriccién que imponen al embridn (no latente) las estructuras que lo rodean. En el segundo tipo de latencia, lo presentan otro tipo de especies en las cuales os embriones mismos son los que presentan latencia (latencia debida al embrin) (Azcén-Bieto y Talén, 2013). Algunas semillas latentes son metabdlicamente muy activas en estado de hidratacién yal recibir una sefal externa, como por ejemplo: luz, fro, tem- peratura alternante y/o tratamiento quimico y hormonal pueden estimular su ‘germinacién. Los eventos primarios en la liberacién de la latencia incluyen la recepcién del estimulo por el embrién, lo cual promueve cambios metabdli- cos y hormonales, dando como resultado final que el eje embriogénico de la semilla emerge y se obtiene la germinacién (Camacho, 1999), I a latencia es una caracteristica adaptativa que optimiza la distribu-Fisiologia Vegetal - rips Cada semilla pose una cubierta alrededor de la parte viviente in- tera, que en algunas semillas es més dura que en otras por lo cual se da un proceso de escarificacién de manera natural donde se ablanda la cubierta 0 testa de las semillas y permite que el agua alcance la parte interior de la semilla (Kigel, 1995). Sin embargo, en la actualidad Ia es- carificacién de las semillas de manera quimica, fisica y térmica tiene por finalidad abrir o debilitar la estructura externa de las semillas y pueda entrar el agua y los factores necesarios para que el proceso de germina- cién comience adecuadamente (Derek, 1997) El tamarindo es originario de Africa tropical y fue introducido en ‘América durante el siglo xv1 y ahora crece de manera amplia en las zonas tropicales y subtropicales de México. Su fruto tiene un alto valor nutritivo, y su adaptabilidad a condiciones climaticas y edéficas variables le confiere importancia econémica a nivel mundial. Es un drbol de tamafio medio a grande que ofrece una sombra atractiva, Su fruto es una vaina indehiscen- te que contienc en su interior de 1 a 12 semillas del tipo ortodoxo. Es deci semillas que presentan bajo contenido de agua, lo que les permite sobrevi- vir a petiodos prolongados de desecacién. De esta manera, conservan su capacidad de germinacién aun cuando se encuentren almacenadas a tem- peraturas bajas durante periodos de tiempo considerables, Sin embargo, al gual que como ocurre con varias leguminosas, las semillas de tamarindo presentan latencia, lo que implica que presentan dificultad para embeberse y posteriormente germinar, ocasionando desde pérdida de biodiversidad hasta pérdidas econémicas (Tapia-Pastrana et al, 2012). OBJETIVO Evaluar el efecto de tres técnicas de escarificacién para la ruptura de laten- cia en semillas de Tamarindus indica L. 9817. FECTO DE CARYICACION SOBRE LA GERBRACION, MATERIALES Y METODOS Aportado por el equipo + 8 cajas de Petri + Shojas de servitoalla +L tijeras + 1m de papel aluminio + Lplumén indeleble + Lmasking-tape +L frasco de 100 mL de boca ancha de papel #6 Proporcionado por el laboratorio + 40 semillas de tamarindo 20 mL de acido sulfirico 2-vasos de precipitados de 100 mL. 1 vaso de precipitados de 500 ml. 1 parrilla Ltermémetro Lagitador de vidrio 1 piseta con agua destilada 300 mL, de agua destilada Procedimiento 1, Tratamiento testigo: coloque 10 semillas de tamarindo en dos cajas de Petri (5 semillas por caja), con dos circulos de servitoalla en la base, mas 5 mL de agua destilada, Coloque otro circulo de servitoalla sabre las se- millas, humedeciéndolo con regularidad (con agua para beber), depen- diendo sus condiciones de hidratacién, 2, Tratamiento mecinico: life la testa de 10 semillas, hasta que se observe la parte interna (cotiledones de color blanco o amarillo), cuidando de no quitar mucho material de tefido nutritivo (Figura 17.1). Coloque las semillas escarificadas en dos cajas de Petri bajo las mismas condiciones del punto uno,Fiiologla Vegetal Fv yaleacanes Figura 17.1, Escarifcacién mecénica en semillas de tamarindo, lazona azul muestra cl lugar de la abrasién y el rea amarilla representa el tejido nutritivo una vez que {ue retirada parte de la cublerta seminal. Es importante evitar dafiar el embrién que se encuentra muy cerca donde se observa la cicatrizo lio. Hilio 3, Tratamiento con dcido sulfitrico: coloque con mucho cuidado 10 se~ millas en el vaso de precipitado de 100 ml que contiene 20 mL de éci- do sulfirico, durante un periodo de 20 minutos. Durante este tiempo, mueva con un agitador de vidrio para favorecer un tratamiento unifor- me. Al término del tiempo asignado, retire con cuidado las semillas. Esto se puede realizar con las pinzas, espatula o varilla de vidrio secas 0 decantando en el otro vaso de precipitado y ayudndose con las pinzas la varilla de vidrio. Una vez retiradas las semillas, enjuiguelas dos ‘veces con agus destilada a fin de retirar todos los restos del dcido y no afectar la germinacién. Por tiltimo, coloque las semillas a germinar en las mismas condiciones que en el punto uno. IMPORTANTE: Entregue el residuo de dcido al profesor responsable coal encargado del laboratorio, a efecto de disponer de él de forma segura, 100