Scribd Logo
Upload

Welcome to Scribd!

  • WHO TRS 366 Fre

    Uploaded by

    Sihem
    11 views56 pages

    Original Title

    WHO_TRS_366_fre

    Copyright

    © © All Rights Reserved

    Available Formats

    PDF or read online from Scribd

    Did you find this document useful?

    Is this content inappropriate?

    Report this Document

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    11 views56 pages

    WHO TRS 366 Fre

    Uploaded by

    Sihem

    Copyright:

    © All Rights Reserved
    Download as PDF or read online from Scribd
    Flag for inappropriate content
    of 56
    ‘Pespete cr ne reévnte ps nécenarement les cons Ie ple ‘ip opted adopt port Orgenttion mote de Sa. ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE SERIE DE RAPPORTS TECHNIQUES No 366 NORMALISATION DES TECHNIQUES D’ETUDE DE LA GLUCOSE-6-PHOSPHATE- DESHYDROGENASE Rapport d’un Groupe scientifique de POMS ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE © Organbaton monde de Ia Sutd 1967 Les pubis de FOrgasnaton mondiale de la Sant nde de ln protection pete parler dipriions du Protocole N® 2 de ls Convention universe pour lt Protection dy Dro Auteur. Les ipstutons gouvernement os soe snantes ‘ou profesionsis pewent, toutes, rerodure des données, des extras ou des Ittratonsprovennt de es pubitions ant en demancer autorun 8 POrgai ‘Dour toute reproduction oy traduction ital, une atoration dot re demande ' la Dinson der Services UEaton et de Documentation, Organon mondiale de Santé, Gene, Suse. Organisation monde de le Suns sera toujours tts Bere {Tes Whignaons ances dane cote publtion cla prézentton dex données qu y fgaren wimptguent de fs part da Dicteur gurl deTOrgantaton monde J a Sante aucune rive Ge postion quunt au att jrcgue de tt ou tl pay outer, funde sce aucortes, nt quant au truce de sts ose, a mention de fms et de prods commerciax wimpiqu pus que ees reset grasa commit nt gto summands par Opin monde de ail rag &n nom Sépoxs. " ert es ses TABLE DES MATIERES ntroeuton Mantoationssinigus da sit en GERD ire idestiseaton des varianer de a GEPD 1 Nomeneltre Disibtion glopraphique 1 Transport tockage des chatins de sang Annet 1. Ets de mbuments sures deytroeytescareneét Annexe? Méthode standardise de dosage 6 la GOED éans Annexe 3. Résumé der méthodes de digs du dit en {GePD chee les hamizygoes de sexe masa Annexe 4, Teshiques de dépitage AW Bpreve de doo eee) Eprewe de ruction de In methemoglobin. ‘Annete 5. Crsctésiaton Hetropbortigue des variants de In Geo 7 Annexe 6 Pusdeation puree de la G€PD éeythocyabe Annexe 7. Constante de Mihac (Kn) Annexe, ade del thermonabite Annote 9. Clasifeation det varantes de la G6PD son la er Annet 10. Distibution plopraphiqu da dl en CPD ton da Wn de ere ri ” GROUPE SCIENTIFIQUE DE OMS SUR LA NORMALISATION DES TECHNIQUES DYFTUDE DE LA GLUCOSE-6:PHOSPHATE-DESHYDROGENASE Mente DK. Beth, Profescur de pate & Université de Tabingen, Republique érate llemaane 'G. J, Brewer, Asiunt Profesor, Deparnen of Human Genes and Meci- he, Univesiy of Michigan, Ann ArBor Mich, EUA Dr H.N. Kishan, Profesor of Petar, Unversiy of Non Casting, Chapa Hl. NC, EUA (Rapport) DL. Luzato, Chaat de cours d"bemstlogie, Univeité ibaa, Nigra Dr A. G. Motulbty, Profesor of Medsine and Genetics, Univesity of Washington, Stat, Wash, EUA (Prien) DB. Ramot, Chef du département dhimaolgie de THoOptal ¢Eut de Tel Mashomer, TelHastomer, Ia (Rapport) DFM. Siakclc, Profesur de génique humaine, Univeié de Ley, PayeBas De E. Beutler, Caiman, Division of Medicine, Ciy of Hope Modal Centr Duar, Cai, BUA (Chante) ‘Mo. C. Standley, Spsiaiseslentque,Senice de la Gésiqueharuine, ONS (Seotiares (Org. mond St Sie. Rapp techn, 1967, 366 NORMALISATION DES TECHNIQUES D'ETUDE DE LA GLUCOSE-6-PHOSPHATE-DESHYDROGENASE Rapport d’un Groupe scientifique de TOMS Le Groupe scientifique OMS sur la normalisation des techniques d'éeude 4e Ia lucose-G-phosphate-déshydrogénase sest réuni a Gendve du $ a0 10 décembre 1966. Ta réunion af ouverte par le DY A. M. M. Payne, Sous-Directeur général, qui a soubaité la bienvenve aux participants au ‘nom du Directeur général, IL a rappelé que le Groupe avait été convoqueé la suite d'une recommandation du Groupe scientifique OMS sur les Ihémoglobinopathies et troubles apparentés soulignant la nécessité de normaliser les procédés identification des anomalies de la glucose-6- pphosphate-déshydrogénase (G6PD). Les participants étaient done invités | examiner les cas de cette nature qui ontéts signals, proposer descritéres pour leur identification et leur nomenclature et defini des techniques pour leur caractrisation Le DF A. G. Motulshy a éélu Président du Groupe et le D¥ M. Sinis- caleo Vioe Président. Le D¥ H. N. Kirkman et le DT B. Ramot ont bien voula se charger des fonctions de Rapporteurs INTRODUCTION Depis une dizaine d'années, Pattetion internationale se porte sue es anomalies et Jes mutations intéressant la G6PD chez Thomme, & la fois parce qu'elles sont a Porigine de divers troubles hémolstigues et parce ueles constituent utiles marqucurs génétiques. Les déiciences de lt GEPD de T'hématie humaine se tencontrent dans de nombreux pays et intézessent plus de 100 millions dindividus, favorisunt chez certains Pap- parition danémies hémolytiques sous Teffet de divers médicaments et futres agents, notamment dimportants composés antipaludiques. Des * Org. mond: Santé Sér. Rapp eck, 1966, 338 6 TecHMQUES D'ETUDE DE LA GLucosE-e-rnosPHATE-DESHYDROGENASE ‘observations donnant & penser qu'elles conférent une certaine résistance ‘au paludisme & faleiparum ont valu & ees anomalies un surerft ints Les études qui ont ainsi été faites dans de nombreux laboratoies et centres rmédicaux ont permis de constater que ln tare présente une importante hétérogénété & Ia fois clinique, biochimique et génétique. La diversité des techniques et des termes employés est une cause suppiémentaire de Gificutés, qu'on pourrait réduire en normalisant les crittes ulisés pour Tidentifcation des porteurs, en adoptant une nomenclature uniforme et en élimitant les secteurs ob une action internationale serait indiquée, ‘Ava suite de Tinteodustion des amino-8 quinoléines dans arsenal thérapeutique ily a prés de 40 ans, on a constatétrés t0t une association centre cet antipaludique et Vapparition d'anémies hémolytiques aigués chez certains suetssensbles. Soumise & des études cliniques approfondis ily a lune quinzaine d'années, la sensbiité & Tun de ces composé, Ia prima- 4quine, s'est révélée due a une anomalie intrinsbque des érytheocytes, lle- sméme lige une perie de glutathion rédut qui se produit quand les globules rouges sont soumis & une action oxydative. D'autres travaux ont montré gue cete anomali, comme la plupart des autres du m’me genre, résultait ‘Sun abaissement margué du taux de GSPD dans Vérythroeyte. En tant que catalyseur de la premie étape de Ja vole oxydative de Vhesose monophosphate, cette enzyme occupe une postion elé dans Je métabolisme des érythrocytes. Cetle voie aboutit i la réduction du nicotinamide-adénine-dinucléotide phosphate (NADP) en NADPH. Ne pouvant avoir recours au eyele eitrique, le globule rouge ne semble pas posséder d'autres moyens de réduire cette co-enzyme ; pourtant, il a besoin de NADP pour mainteni Ie glutathion sous su forme réduite et peut-tre aussi pour d'autres fonctions. Par ailleurs, le glutathion parait & son tour nécessuie pour maintenr intacts les groupements sulfhydryl & Vintéieur {et peut-tre la surface de l'érythrocyte. Ilse peut également qu'il joue un role important dans Te catabolisme du peroxjde d’hydrogine dans I'éry- throcyte. Il est vite apparu, dans les études sur 'hmolyse provoquée par Ia primaguine, que la sensiblté des suet s'étend non seulement i d'autres antipaludiques du groupe des amino-8 quinoléines mais encore & d'autres miédicaments,& des substances toxiques (annexe I), aux feves et & certaines eressions tees qu'ifections et acidose diabétigue. Les mécanismes de Phémolyse ne sont pas connus avee précision, Le deficit en G6PD est transmis par un gine lig au sexe. Ce gine s'ex- prime intégralement chez le mile, et on n’observe pas de transmission de pére fis. Dans chaque cellule dela femme, un seul des deux génes et actif. Les tisus et les érytbrocytes des femmes hetérozygotes représentent is ‘une mosaigue de celles normales et de cellules mutantes, en proportion ‘eds variable. Du fait de sa fréquence relativement élevée dans certaines populations, le gine a été d'une grande aide pour la topographie du chro- ‘mosome X ainsi que pour de nombreux autres travaux genctiques RAPPORT D'UN GROUPE SCIENTINIQUE DE L'OMS 1 2, MANIFESTATIONS CLINIQUES DU DEFICIT EN GoPD. La manifestation clinique la pls typique du défcit en GOPD est la erse Inémolytique précipitée par des facteurs exogénes, Toutefois, de ce méme point de vue clinique, les anomalies dela GOPD peuvent se divser en trois groupes. Le premier groupe comprend les variantes sans expression clinique. ‘Quciques-unes (par exemple es types Baltimore-Austin, Tbadan-Austin) sont lectrophorétiquement anormales, mais ont une activité enzymatique nor- Inale ou quasi normale. D’autres (par exemple les types Barbieri ou Seattle) font une activité enzymatique nettement diminuse aver absence effet cini- ‘que apparent. On ne sauraiteependant, sans une étude approfondie, exclure totalement la possibilité dépisodes hémolytiques bénins cher ces suets. ‘Les individus du deuxiéme groupe présentent une réaction hémolytique aprés Fabsorption de certains des médicaments énumérés & Pannexe 1, sans toutefoissoutrir dane maladie hémolytique chronique. C'est notaniment Je cas des mutants noirs (A), ehinos (y compris le type Canton) et médi- terranéens. Liévolution de Thémolyse dorigine médicamenteuse a été éeudige avec ‘beaucoup de soin chez les Noirs ameéricains. La crise aigué commence dans Jes 24 a 48 heures qui suivent administration du médicament, De gravite ‘r&s variable, la réaction peut aller d'une légére anémie transitoire restant inapercue du sujet, & une hémolyse sévére accompagnée de douleurs dor- sales et abdominales et d'un ietée avec coloration des urines. Chez les [Noirs américains earencés, on a constaté que Ihémolyse se stabilise sponta nnément, méme quand Padminstration du médicament se poursuit. Enefet, les hématies jeunes ont suffisamment d'enzyme pour résister 4 Veffet du ‘médicament hémolytique. Bien que ces phénoménes sient été étudiés d'une fagon moins détaille chez les Méditerranéens, on sait que, dune manidre sénérale, evolution elnique est plus grave et que ces suet réagissent des ‘médicaments qui sont sons effet chez les Noits (voir Pannexe 1). En futre, hémolyse ne parait pas sarter d'elle-méme, parce que les hhémaies jeunes contiennenttrs peu d enzyme. Les manifestations cliniques| Jes plus séricuses de a dicience en G4PD, cesti-dre le faisme et la mala- die hémolytique du nouveau-né, sont rares chez les Noirs américains mais plas fréquentes chez les Méditerrantens et les Orientaux défcints. Non traits, ces épisodes hémolytiques sont souvent mortls. Lihyperbilirabingmie du nouveau-né, qui aboutt & Tete nvcléaire, se produit aprés exposition de Venfant ou de la mére a certains médicaments| fu at naphtaléne, et purfois méme sans intervention agents de ce genre, chee les nourrissons méditeranéens, chinois et noirs deicients en G&PD. Litére nucléaire du nouveauené sins administration de médicaments est plus Frequent dans certains régions que dans d'autres. I n'apparat pas plus 8 TECHNIQUES D'ETUDE DE LA GLUCOSE-s-PHlOSuATE-DESHYDROGENASE précocement que Victére physiologique. Il atteint son maximum entre le {roisitme et le cinguitme jour suivant la naissance, mais quelquefois au cours de la deuxieme semaine seulement. Comme Thyperbilitubinemic rgonatale sans autre cause se rencontre en Gréce cher les enfants défcients en GEPD mais n'a pas été observée aux Etats-Unis d Amérique chez les enfants d'ascendance greeque, on peut supposer.que des faeteurs de milieu jouent un rae. Comme I's soulgné le Groupe scientifique OMS sur les hémoglobino- pathies et troubles apparentés il ne semble pas qu'il y ait intérét &eliminer des banques de sang le sang défiient en GOPD, Toutelois, efit que peut avoir sur les sujets attents dictére néonatal Vexsanguino-transfusion de sang deficient n'est pas connu et demande done & étre ud ‘Diavtre part, les individas porteurs de la tare peuvent de temps & autre séagir par des accidents hémolytiques i des infections virales ou bacté- ‘iennes, Mais es malades recevant en général un traitement médicamenteux, il est parfois dificil de savoir si la réaction hémolytique est imputable & Tinfection, au médicament ou aux deux. La discrimination est peut Etre ‘alisable en miliew hospitalier ou militaire, of on est micux em mesure écarter Péventualté d'une exposition insoupgonnée aux médicaments, Les sliferences de sensibilté entre Mediterranéens Gd(—)A— et Gd(—) ont as encore fait objet d"investigations expérimentale eomplétes, Un moyen sensible d'évalue les effets hémolytiques posibles dun medicament consiste 2 étudier la survie post-ransfusionnelle @érythrocytes anormaux marques chez des receveurs normaux auxquels on administre ensuite le medicament. Liapplication de cete méthode & la détermination de la sensibilité de cel Indes autres que les cellules Ga(—)A— serait d'une grande utilité, ‘Lingestion de féves fralches ou euites, ou méme inhalation de pollen 4e Vieia faba, déclenche chez les individvs carencés en GOPD, en général ans les heures qui suvent, un épisode hémolytique aigu d'allare souvent ddramatique et pouvant entrain la mort en Tabsence d'un traitement par transfusion sanguine. Le favisme ne se rencontre que chez les sujets carencés en G6PD. Ineistant chez les porteurs de la variante A™, il est [paticulitrementfréquent chez let porters dela variante méditeranéenne. ‘On ignore pourquoi certains sujets peuvent cependant parfis consommer des feves impuntment. Divers auteurs supporent qu'un facteur génétique complémentare es indispensable au déclenchement du favisme- Le troisitme groupe d'anomalies de la G6PD est caractérise par ce qu‘on pourrait appeler une anémie hémolytique congénitale non sphérocytaire (AHCNS). Les malades présentent une réticulocytose chronique et une anémie sporadique ou chronique. Certaine font de Vhyperbilrubinémie ddans Ia. pétiode néonatale. Ces manifestations d'hémolyse svobservent ‘méme sans egression médicamenteuse. Il semble que, dans ce groupe, les * re. mond. Same Ser. Rap. techn, 196,398 RAPPORT D'UN GROUPE SCIENTIFIQUE DE L’oxs 9 accidents émolytiques se produisent aussi bien spontanément qu’en réponse a des infections ou A des médicaments. Il est done indigué d'éviter| administration de médicaments qui pourraient avoie un eflet hémolytique (annexe 1). La spléncctomie ne réduit généralement pas la gravité de la maladie. Des études enzymologiques ont fait apparatre une hétérogénété consiérable dans le groupe considré (voit tableau & Ja page 19). I ative que TAHCNS s'accompagne de cataracte juvéile ‘Les tares du deuxiéme et du trosiéme groupe sont parfois doublées un déicit en GOPD dans autres tissus, mais cet éat n'a pas encore attaché 8 un syndrome clinique défni. On sefforce actuellement de déter- miner s'il existe des associations statistiquement signiicatives avec ler troubles non érythroeytaires. 3. CRITERES D'IDENTIFICATION DES VARIANTES DE LA G6PD_ La GOPD, qui représente moins dun vingt milliime des protéines totals de Tefythrocyte humain, ne peut actuelement sotenit avec 1a pPureténécessaire aux analyses peptidiques déallés qu'entratantlaborieu sement de grandes quanttés de sing. Cependant, ele présente un certain rnombredecaractristiquesfonctionneles qui donnent une plus grande varité ‘de moyens effeetuer la détermination phénotypique que cn este cas avec des protdidestels que lee hémoglobines humaines. En attendant qu'on ait zmis au point des microtechnigues convenant une analyse peptidique ‘étallé, plusieurs des méthodes actueles conserveront leur ube pour la ‘iscrimination entre les différentes variantes. Des confusions se sont p= ‘dutes dans Fdentication des nouveaux types parce que les chercheurs ne fe communiquent pas assez leurs échantillons,n'appliquent pas des méthodes 4e laboratoite uniformes et caracévisent Tenzyme de manitee insufisante. Un certain nombre de caractéristiques ui permettent de distinguer cntte elles les variantes de la GSPD sont exposées plus en détail dans Jes sections suivantes et dans les annexes. Les analyses doivent se limiter aux éhantllons provenant de miles hémizygotes. De Tavis du Groupe Scientifique, Ia earactérisation d'une nouvelle variante doit porter au moins sur les points suivants Activité de Ia G6PD érythrocytsite (annexe 2) Migration électrophorétigue (annexe 5) Constante de Michaelis (K,,) sur le GOP (annexe 7) Tau relatif d'utilisation du 24G6P (section 3.3.2) ‘Thermostabilté (annexe 8) 1 peut aussi y avoir intéré, entre autres choses, & déterminer les opti- mums de PH, la Ky du NADP, la chaleur d'activation, lt réponse aux ihibiteurs et la migration en miliew chromatographigue. Les études fami= 10 TECHNIQUES D'ETUDE DE LA GLUCosE-6-rnosrHATE-DESHYDROGENASE Tiales qui a &€ possible dentreprendre ont fait apparaitre que le mode de transmission dela tare était, comme on s'yattendai, lg au chromosome X. Les auteurs qui décrivent une variante nouvelle devraient, si possible, y joindre une étude de ce genre Unité de GOPD et dosage de Vactvite enzymatique Liunité activité devrait Etre définie comme Ia quantté d'enayme qui catalyse la réduetion d'une mieromole de NADP par minute & 25°C dans Jes conditions d'épreuve décrites & Tannexe 2. Sans doute Ia Commission des enzymes de I'Union internationale de biochimie a-telle recommandé {que les unités activité enzymatique soient établies par des déterminations pratiguées ala température de 30°C. Toutefois, eomme une documentation considérable @ d6ja Gf rassemblée sur la G6PD normale ct anormale en ‘opérant & 25°C, température intialement reeommandée par la Commission, ‘semble prétérable pour le moment de continuer dans cette voie. Un proto: cole standard d'expertse des hémolysats est proposé a Vannexe 2. De nombreux tests disriminatoires ont été congus il en est donne un résumé 4 Fannexe 3. S's permettent tous de repérer avec fact les hommes ‘ypiquement déficents, la plupart sont beaucoup moins srs dans e cas des femmes hétérozygotes. L'annexe 4 déert plus en détail des tests qui ont donne satisfection sur ie terrain. Il est important de se rapper que Factvits de la G6PD, notamment de la variante A, est plus grande dans les éry- Uhrosytes jeunes. Ua sujet déicientatteint dane forte rticuloeytose risque done etre classé & tort vers la limite inférieure de la normale et, par consé- ‘quent, de passer inapergu, surtout dans un test de dépistage. Hi peut done ¥¥ avoir lieu de procéder & des tudes familiales ou de réexaminer le sujet laprés que la distribution par age des érythrocytes est redevenue normale, Caractértation életrophorétique La mobilité Alectrophorétique est une des propridtés utilisées pour Viden= tification de Ja G6PD anormale. Un grand nombre de variantes ainsi caractdrisées ayant &é derites au cours des dernieres années, Tapplication une technique uniforme d'électrophortse présente une importance évi- dente. Le syséme ial serait celui qui permettait une separation maximale des variantes mais qui resteraitinsensible aux Nuctuations de activité spé- cifique ou aux légéres différences dans les conditions de conservation des chantillons. Une séparation des bandes dlectrophorétiques d'enzymes nor- ‘male et mutant se produit, par exemple, avec certains systémes discontious ‘Tris-itrate-borae sion n'a pas pris soin d'gjouter du NADP & Péchantl- Jon avant T'électrophorése. Il est recommande de préparer les hémolysats fen présence de NADP, d'acide éthylénediamine ttraccique (EDTA) et de béta-mercaptosthanol et de ne pas oublir ces agents lorsqu'on pratique la purification ou la dialyse de la G6PD humaine, L'addition dimhibiteurs RAPPORT D'UN GROUPE SCIENTIFIQUE DE 1/OMS n des enzymes protéolytiques, tls que Facide e-amino-n caproique, peut éte zalement ule. Deux systémes d'lectrophorise en. gel damidon dans lesquels on connait les positions relatives d'un grand nombre de variantes sont décrits {annexe 5. Avant de conclore au caractire nouveau d'une variante, it audit Pexaminer dans au moins un des deux systémes. De nouvelles techniques dlectrophorése qui s'daborent actuellement permettcont peut- ire de tealiser une melleare résolution ow un tei plus rapide <°éehan- tillons nombreux. C'est en raison de ces posibiltés que éectrophorése fen gel dacitate de cellulose, par exemple, retient depuis quelque temps Trttention, Dans plusieurs cas, deux variantes indfféenciables dans un systéme étaient facile & distinguer dans un autre. I est done hautement Aksirable de procéder & une électophorése sur su moins deux systémes {quand on étudie une variate qui paratt nouvelle Pour étre pleinementsatisfasante, la comparaison électrophorétique de deux variantes doit re effetuge en méme temps sur le méme gel. Travail de laboratoire de reference, T'étude simultante de toutes les variantes ‘connues sur plusieurs systmes d'leetrophorése en milieu gel serait d'une rand uit. Caractéristques cinétigues de la GOPD ‘Comme pour les hémoglabines humaines, certaines GEPD anormales sont décelables par leur migration dectrophorétigue partculire, mais la fonction catalytique complexe de la G6PD offre un moyen supplémentare de caractérisation, Des anomalies fonctionnelles ntont 6 observées jus ‘Qviei que parm’ les mutants & activité réduite, oft le dStict est rarement Shisant pour empécher la caractérisaion, Ces recherches fournssent aussi e précicuses indications sur Feffcacté physiolopique de Tenzyme. CCependant, la détermination des caractérisiques cinétiques de Ven- zyme exige Ia mise en @uvre de techniques qui sont étrangires & de nom- breux chercheurs, Pluseurs précautions générales doivent éte prises pr lablement, Quand on compare les résultats obtenus avec ceux autres auteurs, il faut tenir serupuleusement compte de la force ionique, de la nature du tampon, du pH, ete. Certains substrats, notamment aux sels de buaryum, se trouvent dans le commerce. Comme il peut se produire une ‘énaturation de Venzyme et une alteration de ses caratérstiques cintiques si le baryum n'a pas été totalement liming, il est préférable d'acheter un sel de potassium ou de sodium. La présence de sulfate d'smmoniam et {autres ions contaminants riquaat facilement de modifier plusieurs carac- ‘éristiques fonctionnelles, une dialyse complete de Venzyme est de rigueur. Dans le eas de la G6PD, il faut éviter Vintevention de toute enzyme conta- rminante ou de toute réaction parasite qui entraineraient soit une pete, soit ‘un exois de substrat ou de produit 12 TecHMiques p'fruDe DE LA GLUCOSE-s#HosPHATE-DESHYDROGENASE La GoPD doit ete le seul facteur capable de modifier le pouvoir absor- bbant. 11 importe done de procéder & une purification au moins partielle de enzyme avant dentreprendte Ia détermination de ses caractristiques étiques, afin d’écarter Ia phosphe-gluconste-déshydrogénase et d'autres enzymes qui pourraient fausser les résultats, L'annexe 6 expose en détail la méthode quia été le plus largement appliquée cet ee, et qui et parti- culitrement indiquée pour Ia comparaison des nouvelles variantes avec les ‘Les paramétres cinétiques qui font Vobjet des paragraphes ci-aprés semblent tre les plus utiles et les plus pratiques pour la caractrisation tla différencation des variantes de la GéPD. Néanmoins, pour étude des mécanismes des réactions, d'autres techniques exploration peuvent tre tout aussi indiquées, sino plus. Constante de Michaelis (Ky) La K,, est dafini comme Ia concentration de substrat pour laquelle Ia vitesse de la réaction est égale & la moitié de la vitesse maximale (Vmax ou V), Elle indique jusqu’od la concentration du substrat peut ére abassée sans nuite sérieusesbent i T'eficacité d'une enzyme. Un cértain nombre de GOPD anormales ont une Ky plusieurs fois infricure & d'autres ou a la normale. Pour obtenir des esdmations valubles des constaates de Michaelis dela GOPD, il faut utiliser un spectre aussi large que possible de concentra- tions de substrat, avec de préférence un éeart de 10 2 100 fois entre le ‘maximum et le minimum, eur-mémes situés de part ct d’autre de a Ky. Pour bien faire, la réaction devrait te suivie au moyen d'un test sufisam- ‘ment sensible pour qu'on puisse mesurer Is vitesesinitales mime avee des concentrations de substat assez nettemeat infrieures& la Ky. La GSPD 1 deux substrats. La Ky, pour le GOP s‘obtient en mesurant ls vitesses aux fortes concentrations de NADP et a dillérentes concentrations de GOP, Inversement, on détermine la Ky pour le NADP en mesuraat les vtesses 8 différentes concentrations de NADP et aux fortes concentrations de GOP. La concentration des solutions de G6P et de NADP doit étre enzymolo- iquement normalisée. Malheureusement, les préparations de NADP da commerce parassent contaminées par des substances qui modifient lege rement les valeurs de la Ky, aussi bien sur es échanillons normaux que su les prélévements anormau, Il est done recommandé de résever un lot de NADP et de G6P pour les déterminations considérées, ‘Les constantes ‘de Michaelis peuvent etre déterminées en tragant La coutbe de I/y en fonction de I/S, de v en fonction de v/S ou de S/v en fonction de S (: vitesse; S: concentration de substrat). Plusiews études récentes montrent que c'est la premitre de ces trois méthodes qui comporte Je plus grand risque d'erreur. L'application de la méthode des moindses carrés (régression) introduit une objectvité souhaitable dans les ealeuls, Il [RAPPORT D'UN GROUPE SCIENTIBQUE DE L’OMS B cconviendrait également d'assigner des limites de confiance aux estimations, Imais on ne peut encore y purvenit sans faire des hypothéses sur la manigre dont eer evans 8, La cured og gx onton de log S peut dtr utile sion s'apergoit qu'il mexiste pas de relation de Michaelis Menten ‘La spectraphotométrie permet des estimations satisfasantes de 18 Kyy pour le G6P, mais, tant doané lates faible Ky, de la GEPD humaine pour Te NADP, il y a intr & utiliser un spectrophotométre & dispositi de fluorescence pour Ia déterminer avee exactitude. Les estimations de la Ky, ‘pour les analogues des substrats peuvent aussi fournr parfis des renscigne= ‘meats utiles. ‘Lannexe 7 décrit la méthode de determination de Ia Ky quia été _utilsée pour la plupart des Variants, Test recommandé d'y recourir chaque fos qu'il agit de Comparer de nouvelles variants avee des cas dj études Uallisation analogues des subsrats (On a découvert des variantes qui different dela GSPD normale ainsi quent elles par leurs capacités relatives d'utilisation analogues des Substrats Parmi ces analogues, on connaitparticuliérement bien le 2-dés0xy- shveose-6-phosphate 24G6P) et le galactose-6-phosphate (Gal6P), mais il fn existe d'autres, Des quanttésidentiques de préparation d'enayme (sul- fisantes pour obtenir wae variation d'absorbence de 0,02 8 0,05 par minute avec le G6P) sont ajoutées & deux mélanges (voir annexe 2) contenant respectivement di G6P et un analogue du G6P & la méme concentration finale. La vitesse de la deuxiéme réaction est exprimée en pourcentage de la premire, Pour les variantes étadiées & ce jour, les modifications de la vitesse relative d'utilisation du 24G6P et du Gal6P étaient parallles. Le Gal6P ne se trouve pas toujours dans Te commerce, et les préparations sont parfois contaminées par le GOP; il est done préférable dutliser le 24G6P ‘comme analogue. Courbes activité en fonction du pH La détermination des vitesses de réaction de la GSPD a dilférents pH permet de distinguer entre elles certaines variants, Les vteses sont affec- {es non seulement par le pH, mais aussi parla force ionique et la nature ‘du tampon, Malgré tout Fintézétqu'elles présentent, ls courbes des vtesses ‘maximales au pH optimal prendraient trop de temps a établir dans le cs ‘une enzyme Comme le GSPD, qui postde deux substrats. Si des concer trations saturantes de substrat n'existent pas & tous les pH, les courbes des pH optimaux.refetent aussi les variations dela Ky Ilse produit parfois tun decroissement de turbidité avec un pH inférieur & 6 par suite dune 14 TecmmQUES D'FTUDE DE LA GLUCOSE-s-PHOSPHATE-DISHYDROGENASE préciptation des protéines. Comme, outre ces dificultés, les mesures écesstent une forte consommation d'enzyme, Pétablissement de courbes activit-pHt doit éte considéré comme soulitable mais non indispensable pour la caractérsation des nouvelles variantss. Mesure de Péergie activation Liénergie activation se mesure d'aprésFeffet de la température sur la viteste maximale de la réaction. En rapportant log v A/T (T écant la température absolue en degrés Kelvin), on obtient, si fe systéme suit la Lot ‘'Attheaius, une ligne droite dont la peate est proportionnelle & énergie ‘activation, Dans le cas de Ia GOD, il est pas certain que la relation Tinéaire se vérfe sur un large intevalle de température. I importe done de préciser les temperatures auxquelles les mesures ont été faites. L'inter- valle 20°C-40"C paralt indiqué. Il faut se rappeler que les constantes de “Michaelis pour Pun et autre substrat peuvent étre affecées par a tempé- ature, Jusquici, on n't guére relevé danomalies dans énergie dactiva- tion, Autres paramétres cinétiques Leet difféentel des inhibiteurs et de divers ses offre un autre moyen de déccler les diférencesfonctionnelles. Des études préliminares aver des ‘aetifs& groupementsuiThydryle montrent que des dilferences de sensbiite peuvent sobserver, méme entre des variantes dont les proprigés cinétiques font par ailleurs identiques. Thermostabilité La G6PD humaine et stabilise ou inactivée par de nombreuses subs- tances, notamment par les protéinases ct les NADPases qui contaminent parfois les Iysas, La stabilté de Tenzyme peat dépendre non seulement de Ta pureté mais aussi dela conceatration d2s proténes, vore de la concen tration de Tenzyme elle-méme. Toutefois, quelques variantes semblent iférenciables, d'aprés leur thermostabilité, de Ia G6PD normale et des futres variantes, Liannexe 8 décrit en détal ds techniques qu'il est recom= ‘mandé d'appliquee pour évaluer la thermostabilité dans des conditions qui tendraient A rduire Veffetrelatit des substances contaminantes. Du fait Gu'l est souvent nécessaire de travailler sur des enzymes qui ne sont que partiellement purisése, Ia meillure maniére de déterminer la thermosta- bitte relative est de chauffer ensemble des échaatillons pris deux & deux. autres méthodes devaluation de la thermostabilité relative se revle- ront peuttre plus sensible, Des graphigues rapportant les températures de « transition » & Ia concentration de NADP dans le milieu mis en incuba RAPPORT D'UN GROUPE SCIENTIFOUE DF 10M 1s tion fournissent des courbes nettement différentes pour plusieurs des variantes énumérées dans le tableau de la page 23. La température de ‘transition » est celle qui fait diminuer V'atiité enzymatique de moité en un temps donne. dentifcation dliecte (fingerprinting) de la. G6PD Depuis qu'on est récemment purvenu & isoler Ia GSPD avec une trés grande pureté et un fort rendement, on est en mesure de procéder & des léterminations directs de Ia G6PD sur des sujets& activité érythrooytaice normale. Ces études ont montré que la GSPD-B ne différe de la G6PD-A. «que par un seul acide aming. Malheureusement, pour isoler la G6PD avec Tn pureté qwexigent ces determinations il faut de grandes quantités de sang tne importante activité intiale. I est done urgent de mettre au point des ricrotechniques pour la purification t V'analyse peptidique d'échantillons provenant d'un seul sujet. Autres moyens de earactériser la G6PD ‘Diaprés des travaux récens, i et possible de distinguer la GEPD A de Ja G6RD A par chromatographic en colonne sur disthylaminothyl- cellulose (DEAE-Sephadex) ou carboxyméthyl-cellulose (CM-Sephaden). Diautre part, la GOPD B et Ia G6PD méditerranéenne seraient difféen- ciables str colonne en gel de phosphate de calcium, Les techniques immunologiques offrent maintenant le moyen de déceler fes protéines de la G6PD et detimer la quantité de ce matériel antigénique dans chaque échantillon de sang, mais elles ne permettent pas encore de faice des distinctions qualitatives entte les variants, On peut espérer par ailleurs que, grice aux techniques de mieropurification, il deviendra pos- sible de distinguer entre les carences qui sont dues & un déficit quanttatit ct celles qui tennent & une insufisance fonctionnelle de Penzyme. Les techniques récentes de séparation des hématies jeunes et des hématies Agées dans un méme éehantllon de sang permetient eévaluer Ia Tabilité ln vivo de la G6PD érythroeytaire en partant dela constatation que 'hématie semble devenir incapable de synthétise les protéines apres un certain temps. "On a réuss ybrider de la GOPD B et de la GOPD de rat ainsi que de la GoPD de vache et de rat. En revanche, Vhybridation dune variante humaine avec une autre n'a pos encore pre réalisge, Les études e’hybri= dation permettront peut-dte de savoir si a GPD humaine se compose de chaines polypeptidiques dissemblables et, dans affirmative, de determiner celle qui est modifige dans une variante donnée. 16 TecHiQuEs D'ETUDE DE LA GLUCOSt-e-rHOSeHATE-DistYDROGENASE 4. NOMENCLATURE Des problémes de nomenclature surpssent souvent dans les domaines oles connaissances évoluent rapidement. Ces le cat ii. Il importe done able plus rapidement possible une nomenclature standard pour éviter le foisonnement de synonymes et de terminologies divergentes Recommandations générales Le Groupe scientifique a été unanime & considérer qu'il ait soubaitable pout ing ‘gerne acts encore plus fort, par exemple (hh) pour vogue the sctte quate for aperieare a normale 2) Dans le symbole phénotypique, Ie signe indiatif de Vactivité enzy- matique dot Gre suivi d'une virgle, laquelle doit re suivie & son tour du nom spéeifique de Ia variante. ‘fy Les désignations B, A et A~ doivent &tre conservées pour les enzymes; les deux premigres indiquent état non déficitair et la trosiéme Ja variante fréquente qui s'observe principalement ehez les Noirs, Les cractristiques des trois enzymes sont indiquées schématiquement dans Te _s) On appellera « Méditerranée» la variant déitaire courante ayant une ‘migration éleetrophorétique identique & celle de B et les caratéristiques cexposées dans Ie tableau, 1 Les noms recommandés pour la plupart des autres variantes sont donnés dans le tableau. 4) Tine faut pas affecter de nom défnitif 4 une variante supposée now velle avant de sre assuré, par un teavail de caractérisation appropri, auelle est bien sans pebobdent (voir la section 3). En attendant, le nom Sera mis entre gullemets, lequels seront supprimés Jorsque la variante ‘aura et caractérisée et reconnue originale i) Dans la caracttisation phénotypique d'une femme hétérozygote, il coiivient dindiquer expression phénotypiqueeffectivement observe et non Te phénotype infers. On peut se ervir d'une barre oblique pour séparer les deux noms dans les désignations génotypigues. Exemple: Gd4/Gd?. 1b) Il peut arriver que des isoatlles courants commandant une Tégére variation activité soient mis en évidence dans es populations «nor ‘males, Il faut alors en faire éat entre parenthéses apres le nom du mutant tant dans la désignation phénotypique que daas la designation 18 TECHNIQUES D'ETUDE DE LA GLUCOSE-<-pHosPHATE-DESHTYDROGENASE Exemples de désignations phénotypiques et génotypiques Deseroton bre de Pence ate Ene normale a4), on Enzyme dcr ayant une mobile ee. Ga), Maderande Gdn twophoresque arsiogse ese de By pe Sente dane de nombres popultons sree tne feguece indquant ut pelymorghieme [Enzyme nant use acid vine de nore G1), A oan ‘mile une mobile eropboreigu pe- ‘are eae do B, present chez es Not sneue uni nga ome Eanme diate ayant une mobile Ge Gil), A— on trophorsigue analogue & al de A st pe Seate cher les Noire aves ane inquenes Inaigoant un polymorphisne Exenple pique d'une vrane veisembla- Gal), «Tubingen» Gd ies ‘lamest nouvelle, mais qa spar fat he dune erslarigue comple ‘empl hypothdiqa esoaltescommane GAC), BC ) am» dant de leguesiférences gosntaves ‘Tacvi dans a popultion « aormale > ie nom de Tioaiie Agurerae dant ta iti dont cote ae \emne) ome) Examples typgues de dtsigatons pour ls Gal), B camcas fenmer Un genotype pet donaer ou Ge tombrevxpcelynesioa Tie do Ind), AB se et ec ow Gt) 3° | ances Bowne X. oa): ooncan cas jo0— Garson atjeacenee amon wy (ows) ageo v1 30 SBINVRIVA $30 AETV i 22 TECHNIQUES DIETUDE DE LA GLUCOsE-crHoseHATE-DésHYDROGENASE [REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES nee, W. B & Uchida, 1 (968) Amer J hum, eves 6,380 Boyer, 8. Hee al (1962) Pro, nat Acad. Se (Wash), A, 1868 ‘ikus, HN. Hendihson, EM. (196) Ane ur. Gene, 18, 26 ‘Yorhids, A, Stamstoyansopouos, G.& Motulky, A. G. (1967) Scone, 186,97 Long, W.K. eal (1965) J. Labs ein. Meds, 48, 81 Porter, 1, Het al (1961) Laney 1, 898 Maris, PA. ea. (96D Nanve (Lond), 194, 454 Azevedo, Ee (1966) C4 par eatlr, E. Proceedings of Iteration Conress of Haumetiog, Spey 9, Ramat, B.A BLO, F (196) Ant. ham. Genet 28, 167 10. Pita, PV. Ct (1966) J cla en, 8,823 1H, Stamatoyannopoulos, . eal (1964) Lane, 2, 932 12. Stamatoyannopouls, ©. ta. Blod ous pres) 13. Kirkman, H. Nea (1965 J: Lab ein Med, 66, 8 14 Shows, TB. (196) Scene, 14, 1086 1S, Khan, H. No etal. (961) Cold Spr, Harb. Symp. quant, Bi, 29, 391 16. MoCardy, PR. et (1966 JLab clin Med, 67, 3 17. Klekman, HLN, ea (964) J. Lab. elt Med, 63,728 18 Ramot, Bet a (1960) JLab ln Med, 4 95 19, Kikmaa, Hy N. eta (1965) J La. cle Med, 68, 22 20, Kiskman, WN. Ries, HD. (961 Atmer J. Dis Cd, 102,313 21, Kirkman, H. Nt al. (96) J. Zab lle Med, €8, 715 22, Luzzto, L& Allan, N.C, (1965) Bochom biophys, Ret. Comm, 21, $47 23. Deen, RJ. (1965) J. Lab. clin. Med, 8, $50 2A. Gall, 1. eal (968) Clin es 1, 268 % m, Helg, H.& Borne, K. (1965) Dick med. Wack 91, 158 Waller, HD. ea (1966) Klin, Wehr, 123 ‘Yorhids, A. (conmanication peonnelle) RAPPORT D'UN GROUPE SCIENTINQUE DE Loss 2B 5, VARIANTES, Le tableau qui préeéde donne une liste de variantes en indiguant la nomenclature recommandée et les propriétés connues. Tl se peut que ‘quelgues-unes des nombreuses variantes qui ont été signalées n'y figureat ‘A Vannexe 9, les vat ordre de certitude, c'est leur caractérsation, tes frites dans Te tableau sont classées par dire daprés le détail plus ou moins poussé de 6, DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE [La plupart des travaux effectués A ce jour sur la réparttion des vasiantes 4e la G6PD dans la population se ont bornés au depstage dela diience enzymatique par diverses méthodes relativement sommaites. Rares sont les fenquétes qui ont comporté des déterminations quantitatives et des analyses Aletrophorétiques. en résulte que la distribution mondiale des variantes {dela GOPD (voir Fannexe 10) n'est connve que pour cells qui se traduisent par un défict enzymatique assez prononeé. Dans V'nterpréation des don- fies présentées dans annexe, il importe de tenir compte d'un certain nombre de considérations. 1. Lorsqu’elle repose uniquement sur des éprewves de premier tri et quelle west pas appuyée par des études familiaes ou des données sur Tat du sang cher les porteurs de la tare, la constatation d'un deficit let ou moyen en G6PD ne permet pas de conclure & existence d'une variate, La prudence est notamment de rigueur lorsqu'll s'agit de popu- lations dont Fétat général de nutrition et de santé est mauvais, ear il est alors difficile de faie le départentee les enzymopénies héréitares et ls fics sequis. 72. lnversement, dans les régions ob sévissent certaines maladies hésé- iaires ou acquises (par exemple des anémies hypochromes aver mito- cytore) qui déterminent une élévation de Vactvite en G6PD par unité de volume sanguin, fe risque de lniscr échapper des cas ’enzymopénie héré- ditate est tees grand, surtout sie géne mutant est d'un type qui ne produit {qu'une carence enzymatique Iégére on moyenne et si Ton se contente ‘Sépreuves relativement sommaies. '3. De fortes variations dans la fréquence des gines ont &1é observées, réme a Vintérieur de zones peu étendies et ethaiquement homogénes. Ik Serait done imprudent, au stade actuel, de considérer comme valables pour des groupes ehnigues ou des terioiees importants les renseignements souvent maigres qui ont été recueilis sur de petits échantillons. 24 TecnIQUES D'ETUDE DE LA GLUCOSE-<-rHOsPHATE-DESHYDROGENASE (Ces réserves tant formulées, on est fondé a trer des données reproduites A Tannexe 10 es conclusions provioires suivantes 1) Le nombre total des sujet présentant un type ou un autte de deficit 2 G6PD peut fe raisonnablement estimé & 100 millions environ pour ‘ensemble du monde, 2) La distribution du deficit en GOPD accuse une association positive avec celle du paludisme a falciparum, en ce sens que toutes les régions oi des fréquences élevées d'un type ou d'un autre de Venzymopénie ont &té sigoalées sont ou étaient des régions de forte endémicité paludique. Le fat {que le dficit en GOPD n'ait pas ct observé dans quelques régions impalu- «déesnvinvalide pas nécessairement cette constataton, puisqu'l est & pré- sumer que le paludisme ne joue le role d'agent sélectit que si le gene du dficit en GOPD a été introduit dans une population par mutation ou par migration. 3) Dans Tensemble, on peut dire que Tenzymopéaic du type grave (avec mobilité dectrophorétique normale) est particuligement répandue dans les populations méditerranéennes, proche-orientales et exttéme-orien= tales, tandis que eclle du type bénin (aves mobilité lectrophorétique d'al- re A) mest fréquente que dans Jes populations afvicaines. Toutelois, TFexistence de tts rares mutants au locus de la, GSPD, avee ou sans dit ‘enzymatique et mobilité électrophorétique anormale, a tf signalée dans les régions les plus diverse, y compris dans 'hémisphére nord. 4) Le nombre de variantes de Ia G6PD, e'esta-dire de mutations au locus de la G6PD (es observations biochimiques et génétiques sugetrent u'll vagit d'un cistron unique), doit etre plus grand que ae semblerait Tindiquer la fréquence du seul défct enzymatique. Cest du moins oe que permet de penser la grande dilfusion de la variante dectrophorétque Gd(+).A, qui se rencontre, par exemple, chee 20 % environ des Nigériens ft des Noirs améieains de sexe masculin. On est alors amené & supposer que plusieurs isoalléles des génes normaux peuvent exister méme dane des tions relativement homogines. Les études de Ia cortélation de ivté enzymatique entre germains dans le cas du gine Gily tendent & ‘confrmer cette hypothise. 5) Quoi quil en soit de Mhypothése relative au re du paludisme, le {ait que quelques-unes seulement des variants de la GEPD ont atcint une fréquence notable incline fortement & penser que des mécanismes slectifs ‘ont pu intervenir dans le maintien du polymorphisme observé au locus en ‘question. Toutefois, diverses études montrent que le paludieme & fleiparum pourrait ben Ere le facteurécologique quia assuré la sélection des varantes ‘méaiterranéennes et aftiaines, Néanmoins, la plupart des preuves dans ce sens sont encore indirectes. L'étude des densitésparasitaires chez des sujets e génotypesdiférents « donné jusqu'ci des résultats contraditoirs et Pon. [RAPFORT D'UN GROUPE SCIENTIFIQUE DE LOMS 2s manque encore de renseignements directs sur la mortlité et la fecondité des individus déficents en GSPD. (6) Btant donn¢ les considérations gui préotdent, ily alcu de réuni des données hématologiques,électrophorétiques et familiales avant de tree des ‘conclusions défnitives des observations recuellies sur Jes variantes de la GEPD par des méthodes de simple dépistage. 7. CENTRES DE REFERENCE Centre international de reference Le Groupe recommande comme une mesure de I plus haute impor- tance laeréation d'un centre international de référence plact sous les aus- pices de Organisation mondiale de la Santé, Ses fonctions seraient les 1. Entretenr une collection de référence de toute les variantes connues ‘ten fournir si possible des échantillons aux laboratoires qualifés qui vour 10M), Laver ensuite jusgu’d ce que la DEAE-cellulose devienne rose pile ow incolore, [Eluer Tenzyme de la colonne avec 15 ml de tampon phosphate (pH 5.8, 0,1 M) renfermant du NaCl 0,5 Met du morcaptoéthanol 10°M, de PEDTA 10M et du NADP 2x10° M. Assurer Télution complete par suecion. 3. Pricipitaion avee le sulfate d’ammonivom Ajouter environ 2 ml de NagHPO, 0,5 M & la solution d’enzyme déerte ‘crdessus. Ajouter 40g de (NH),SO, pour 100 ml de solution enzyme. Laisser séjourner au moins 30 minutes au froid, puis centrifuger (& 10000 g pendant 30 minutes). Note. Avant Vaddition de (NH),SOg, on peut ajouter de Tacide saminocaproigue 10*M ou du DFP 10M pour empécher Taction des ‘enzymes protéoytiques. 4, Siliconization de la verreie 4) Préparer une solution aqueuse e diméthylchloroslane Gv'on obtient aux Etats-Unis aux Applied Science Laboratories, P.O. Box 140, State College, Pa.) 1, Remplir la vercerie de cette solution et Fy laisse sejourner plusieurs 6) Rincer au toluene. <4) Rincer au methanol (2 ou 3 feis) 2) Laver A Peau, 48 TecrquEs D'érUDE DE LA GLUCORE-+-PHOsPHATE-DESIYDROGENASE 5. Préparation de la DEAE-cellulose La DEAE-cellulose (0,5-1 mEq) est vendue par Bio-Rad ou Serva.) 4) Suspendtre dans au moins $ volumes d'eau et laisserreposer environ 30 minutes. Enlever les petites particules par décantation, Répéter opération une fos 1) Mettre en suspension dans eau, ajouter une solution de NaOH jusqu’a ce que Talcalinité du surmageant dépasse pH 11, Ajouter une Solution de NaCl jusqu'a une concentration finale de 0,2 M. ©) Laver avec de eau dans un blichnerjusqu'a ce que le pH du filtrat devienne presque neutre, d) Mette en suspension dans au maine 10 volumes de tampon phos: phate 0,005 M (pH 6,4). A Vide d'un pH-métce ajuster le pH de lt suspension 2 6,4 en ajoutant de Pacide cblorhydrique 2N. ©) Laisse reposer 30 minutes, décanter et emetire en suspension dans Je tampon phosphate 0,005 M. La DEAE-cellulose en suspension dans le tampon se conserve au roid. Annexe 7 CONSTANTE DE MICHAELIS (K,) La détermination de la Ky se fait dans des mélanges réactifidentiques ceux qui sont utilisés pour le titrage des hémolysats, & cei prés qu’on fat varier Ia concentration d'un des substrats. Il faut se servitexclusive- ‘ment d'échantillons partiellement puriés par dialyse, exempts de P6GD (phospho-6-gluconate-déshydrogénase) et Je facteurs parasites. On dilue TFenzyme dans la solution de dalyse (voir annexe 6) jusga’a la concentration {qui assurera un taux d'absorption de 0,006 & 0,012 pat minute dans Vessat standard, IL faut sassurer que les cuves contenant tous es réactfs, Pexoep- tion du GSP et du NADP, ne manifestent aucun changement de densité ‘optique par comparaison avec un blane contenant de eau ou de Pair. On ‘peut ensuite prendre Pair ou Peau comme repére de lecture dans les titrages 4 diferentes concentrations de substrat. On ajoute toujours le méme voli ime d'enzyme ($0 sl) aux mélanges réacts, Les vitesse iniiales sont déter- + BioRad Lab. 2nd and Gella Avenue, Richmond, Californie, EUA; Serva Enwiklangs Labs Allemagne Ussbae sax Ente Uni pr Clr Schlesinger Chem, Mig. Corp, $00 Mineola Avenue, Cale Pace, Long Iisa, New Yor) [RAPPORT D'UN GROUPE SCIENTIFQUF DE 10m ” six concentrations diférenes de substrat. Pour les préparations ‘de GEPD ayant des Ky, presque normales il est commode d'utlser Tint valle 0,02:2 mM pour la mesure de Ia Ky sur GOP et 1,33-200 1M pour Ja mesure de la Ky, sur NADP. Pour la mesure de cette deuxiéme Koy i faut un spectrophotométre & disposiif de Muorescence et une conceats- tion plus faible d'enayme. Les résultats doivent tre portés sur graphique selon une des méthodes décrites plus haut. ILy intr faire Vajustement par la méthode des moindres carrés(régression). Annexe 8 ETUDE DE. LA THERMOSTABILITE, [Les enzymes anormales et les enzymes témoins sont dialysées ensemble ‘dans un bécher de la manitre iadiguée 4 Pennexe 6. On ajoute une petite {ration de la solution de dialyse & Penzyme témoin et kTenzyme anormale Jjusqu’ ce que Factivté(unités par ml) de la premitre soit dix fois cele de Ja seconde. On les appellera respectivement « témoin ajusté» et « variante ajustée >, Lintervalle 0,02-0,05 unités/ml est commode pour la variante juste. On ajoute une fraction du «témoin ajusté» & dix parties de la solution de dialyse, et Yon chauife diversement plusieurs prises essai Jjusqu'a ce qu'on trouve Ja température qui entralne une perte activité environ 20 % en 20 minutes. On introduit alors les préparations dans de pelts tubes en matiére plastique ou des microtubes & centrifugation silico nisés, selon Te schéma suivant ‘Variant ste Mot oat ‘Tenoin sje son Son Solaton de ise ea 3 Albumine de bauf, 30 mgiol 10M “10a 104 Mon MO HOW ‘Mélanger le contenu de chacun des trois tubes. Transférer $0 il de ehacun ddans des cuves renfermant le mélange de titrage de Ia GOPD (voir annexe 2) pour déterminer les activités a Vinstant zéro. Les activités & cot instant

    You might also like