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Instituto Nacional de Salud Centro Nacional de Salud Pblica

Laboratorio de Microbiologa y Biomedicina Laboratorio de Zoonosis Bacteriana


ACTUALIZACIN EN LOS PROCESOS LABORATORIALES DE BRUCELOSIS Del 21 al 22 de Agosto del 2007 LIMA PERU

Brucella y Brucelosis-Laboratorio de Referencia Nacional de Zoonosis Bacteriana-CNSP

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INTRODUCCIN El Instituto Nacional de Salud y el Laboratorio de Referencia Regional de Lima CiudadDISA V tiene como una de sus principales funciones la capacitacin y transferencia de tecnologa que permita la actualizacin de conocimientos de profesionales de la salud, la estandarizacin de procedimientos de laboratorio, adaptados a las necesidades locales, y contribuir al fortalecimiento del control de las Enfermedades transmisibles y no transmisibles que afectan a nuestro pas. La finalidad es establecer los criterios tcnicos para el enrolamiento en los establecimientos y el diagnstico en los laboratorios de referencia regional de Brucelosis.

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CONTENIDO a. Generalidades b. Obtencin y transporte de muestras c. Diagnstico por cultivo, d. Diagnsotico por serologa e. Vigilancia de Brucelosis f. Bibliografa g. Anexos h.

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A. GENERALIDADES 1. ETIOLOGA 1.1 Agente etiolgico La brucelosis conocida tambin como Fiebre de Malta, Enfermedad de Bang o Fiebre del Mediterrneo, es ocasionada por bacterias del gnero Brucella y el cuadro clnico viene determinado por la especie responsable de la infeccin. As B. melitensis tiene mayor virulencia y muestra predisposicin al desarrollo de recadas y evolucin a la cronicidad, B. suis produce con frecuencia formas localizadas crnicas con necrosis y supuracin, B. abortus se caracteriza por su menor invasividad, responsable de frecuentes formas asintomticas y de fcil control teraputico. En el Per la enfermedad se debe casi exclusivamente a B. melitensis, siendo poco frecuente la B. canis; no se han comprobado casos humanos por B. ovis y B. neotomae 1.2 Reservorios El reservorio principalmente lo constituyen el ganado caprino, vacuno, porcino ovino y canes. 1.3Transmisin Por consumo de leche o productos lcteos (queso) sin pasteurizar o alimentos preparados con ellos, provenientes de animales infectados y por contacto de la piel (solucin de continuidad) con tejidos, sangre, orina, secreciones vaginales, fetos abortados, placenta. Tambin como riesgo ocupacional en laboratorios, mataderos y puede ser consecuencia de autoinoculacin accidental de vacunas de Brucella - cepa 19 y vacuna Rev-1. 1.4 Perodo de incubacin El perodo de incubacin vara en la mayora de los casos entre 10 y 20 das. Algunas veces la sintomatologa puede aparecer ms tardamente, inclusive tras un perodo de varios meses. 1.5 Transmisibilidad No hay pruebas de que la enfermedad se transmita de una persona a otra. 1.6 Susceptibilidad y resistencia Todas las personas son susceptibles. No se ha definido la duracin de la inmunidad adquirida. 2. DESCRIPCIN CLNICA DE LA ENFERMEDAD De comienzo agudo o insidioso, con fiebre continua, intermitente o irregular de duracin variable, transpiracin profusa, en particular durante la noche, fatiga, anorexia, prdida de peso, cefalea, artralgia y dolor generalizado.

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Teniendo en cuenta que la brucelosis es una enfermedad que cursa con signos y sntomas inespecficos, ser necesario sospechar de la enfermedad en pacientes que cursan con orquiepididimitis, espondilitis, uvetis u otras formas inusuales o localizadas de la enfermedad como un sndrome de fatiga no diferenciada. Siguiendo su evolucin natural, la infeccin puede autolimitarse en el intervalo de unos meses tras varias ondas febriles. Muchas veces se establece una localizacin de la infeccin o el proceso no se resuelve espontneamente y tiende a la recurrencia o a la cronicidad. Algunos pacientes presentan una infeccin asintomtica, en estos casos, el antecedente epidemiolgico es un elemento de gran importancia para establecer una sospecha diagnstica. . 2.1 Clasificacin por tiempo de evolucin 2.1.1 Brucelosis aguda Desde el inicio de la sintomatologa clnica caracterizada por fiebre, sudoracin, artralgias, mialgias, dolor lumbar, hepatomegalia, prdida de peso y esplenomegalia. En esta fase se complica con hepatitis granulomatosa, artritis perifrica y sacroileitis, con una duracin de hasta 8 semanas. Acompaado de una prueba de seroaglutinacin o cultivo positivo. 2.1.2 Brucelosis subaguda Con un perodo de evolucin de enfermedad mayor de 8 semanas a un ao, es la forma tpica o clsica en reas endmicas caracterizado por fiebre baja y de tipo ondulante, compromiso articular y cambios hematolgicos (trombocitopenia o pancitomenia). Se incluyen tambin pacientes que presentan recadas 2.1.3 Brucelosis crnica De una duracin mayor de un ao, mas frecuente en adultos, generalmente sin fiebre, con mialgias, fatiga y depresin; tambin se observa espondilitis y uveitis, son raras la artritis perifrica y sacroileitis. Puede estar acompaado de ttulos de seroaglutinacin bajos, anticuerpos incompletos, anticuerpos bloqueadores y ser positivo a la prueba de Coombs. Se incluyen tambin pacientes que presentan recadas. 2.2 Localizaciones especficas ms comunes El desarrollo de localizaciones especficas es caracterstico de la brucelosis y pueden presentarse en cualquier fase de la enfermedad, aumentado su frecuencia en forma significativa con el tiempo de evolucin de la infeccin o con las recidivas. Pueden estar acompaadas de sntomas sistmicos, pero stos son a veces poco evidentes. A menudo se presentan varias localizaciones simultneas. 2.2.1 Ostearticulares Son las ms frecuentes y de mayor significacin clnica, entre ellas: Sacroileitis (frecuente en jvenes). Espondilitis (frecuente en adultos). Coxitis. Artritis perifrica (frecuente en nios y jvenes). Inflamacin de tejidos blandos periarticulares. Otras osteoartritis. 2.2. 2 Neurobrucelosis Meningoencefalitis. Neuropata ptica.

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Ataxia cerebelosa. Radiculopata. Depresin Fatiga crnica Hemorragia Intracraneal.

2.2.3 Hepticas Hepatitis (de tipo granulomatoso). 2.2.4 Genitourinarias La orquiepididimitis unilateral o bilateral, es un sndrome caracterstico de la enfermedad. La brucelosis debe tenerse siempre en cuenta en el diagnstico diferencial en un varn joven con orquitis. La localizacin en otros rganos del aparato genitourinario es ms rara, destacando la prostatitis. La frecuencia de aborto en la brucelosis es similar a la de cualquier infeccin sistmica que curse con bacteriemia. 2.2.5 Ocular La afeccin ocular es poco frecuente y se limita en general a defectos transitorios de la agudeza visual, sin anomalas detectables en la exploracin ocular o la observacin de pequeos exudados en el fondo de ojo. Se ha descrito todo tipo de formas clnicas: uvetis (ms comn), papiledema y neuritis ptica. En algunos casos se ha podido aislar el microorganismo del humor vtreo poniendo de manifiesto la naturaleza infecciosa del proceso. 2.2.6 Hematolgicas Pancitopenia: por mieloinfeccion o por hiperesplenismo. Prpura trombocitopnica. Anemia hemoltica autoinmune. Coagulacin intravascular diseminada. 2.2.7 Cardiovasculares Endocarditis. Miocarditis. Pericarditis. 3. DEFINICIONES OPERATIVAS 3.1 Caso presuntivo Caso que es compatible con la descripcin clnica y puede estar vinculado epidemiolgicamente al consumo principalmente de productos lcteos no pasteurizados de origen animal (queso, leche) o a casos probables o confirmados en animales. 3.2 Caso probable Caso compatible con la descripcin clnica, con antecedente epidemiolgico y resultado positivo a la Prueba Rosa de Bengala. 3.3 Caso confirmado Caso probable positivo a las pruebas confirmatorias serolgicas, aislamiento del agente o su demostracin por pruebas moleculares. El siguiente es el esquema de las definiciones operativas

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CASO CUADRO ANTECEDENTES CLNICO EPIDEMIOLGICO S X X X X X X PRUEBA ROSA DE BENGAL A X X PRUEBA CONFIRMA TORIA

Presuntivo Probable Confirmad o

B. OBTENCIN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS:

1. Toma de muestra para diagnostico microbiolgico: 1.1 Condiciones previas:


Las brucellas se pueden aislar de numerosas localizaciones, dependiendo del perodo evolutivo de la enfermedad, de la forma clnica y del momento y condiciones en que se realice la toma. En relacin con la seleccin de la muestra ms adecuada para obtener el mejor rendimiento diagnstico del cultivo es necesario conocer algunos aspectos sobre la patogenia de la brucelosis. La fase bacteriemia que coincide con la sintomatologa aguda de la enfermedad. Un aspecto interesante de la brucelosis humana es que la brucelemia no siempre se acompaa de fiebre, el hemocultivo es el mtodo de eleccin para el aislamiento de brucelas variando su eficacia en funcin del momento y condiciones de su realizacin. En los casos de brucelosis focalizada, y segn la forma clnica que presente el paciente, puede ser conveniente adems, la siembra de diferentes productos patolgicos como el lquido cefalorraqudeo, el lquido sinovial, la puncin medular. La eficacia diagnstica del hemocultivo depende por una parte de la forma clnica y del momento y circunstancias en las que se realice la toma, y por otra de los requerimientos respiratorios y metablicos de las bacterias y por tanto de los medios empleados para su aislamiento. Por ello, aunque el hemocultivo haya de realizarse con preferencia en los perodos febriles, puede igualmente llevarse a cabo en los momentos de apirexia. En cualquiera de los casos, no cabe duda de que el hemocultivo debe realizarse en todos los pacientes sospechosos independientemente de la forma clnica o evolutiva de la enfermedad e independientemente de que se realicen cultivos de otras muestras o de que se soliciten otras pruebas diagnsticas. Incluso, es preciso tener en cuenta que el hemocultivo puede ser la nica prueba diagnstica que sea positiva en algunas circunstancias como sucede en las fases muy precoces de la enfermedad o en algunas inmunodeficiencias. El tratamiento antibitico del paciente previo a la realizacin del hemocultivo es la causa ms importante de los fracasos de ste. Esto obliga a realizar la toma de sangre antes de la iniciacin de la antibioterapia, y si ello no fuera posible, es necesario interrumpir la antibioterapia durante un perodo mnimo de 48 horas antes de la realizacin del hemocultivo.

1.2 Materiales necesarios para realizar un hemocultivo: Frasco de hemocultivo Ligadura de jebe

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Alcohol de 705 Alcohol yodado Jeringa descartable con agujas 20x 1 21x1 Envase para desacrte de agujas. Algodn 1.3 Cantidad de muestra: La cantidad de la muestra puede variar de acuerdo a diversos factores, entre ellos el mas importante es la edad del paciente. Muestra de sangre: Neonatos 0,5 -1 ml Nios menores de 6 aos 1 -3 ml Nios mayores de 6 aos 3- 5 ml Adultos 5-10 ml Muestras de aspirado de medula osea 0,5 -1 ml

1.4

Obtencin de muestra de sangre: Reunir todo lo necesario, el nmero de la aguja depender del sitio de donde se tomara la muestra y del tamao de la vena. Se usa agujas para adultos 20x 1 21x1 para adulto y para nios una aguja 23 x 1 una mariposa (scalp vein). Escoger un brazo y aplicar una ligadura. Se escoge usualmente la vena ms prominente. Limpiar y desinfectar la piel en el sitio de insercin. Mojar un algodn con alcohol 70%, frotar el rea escogida, dejar secar, si se palpa nuevamente la vena, volver a desinfectar el rea. Se debe limpiar la zona varias veces. Luego de que el desinfectante haya secado introducir la aguja con el bisel de la aguja hacia arriba en un ngulo de 30-45 C. Colocar la aguja sobre la vena y empujar firme y deliberadamente hacia adelante. A medida que la aguja penetre en la vena, se siente que esta cede ligeramente y a veces la sangre ingresa en el cuello de la jeringa. Una vez que se ha penetrado en la vena, sacar la sangre aspirando con el embolo lenta y sostenidamente. Luego soltar la ligadura y colocar un pedazo de algodn sobre el sitio de insercin, manteniendo en su lugar la aguja. Retirar la aguja y presionara el algodn en el lugar hasta la fecha haya cerrado. Colocar un esparadrapo y mantener el brazo levantado por unos pocos minutos.

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Obtencin de muestra para hemocultivo y serologia (sistema al vaco): En casos excepcionales donde no se cuenta con hemocultivo se deber tomar sangre con sistema al vaco en dos tubos simultneamente. Para realizar el hemocultivo simultneamente y manteniendo la asepsia y limpieza mencionada arriba se tomara muestra con sistema al vaco en un tubo con anticoagulante de preferencia EDTA (tapa morada) la cantidad de 7 ml. Para pruebas serolgicas se deber tomar 10 ml en un tubo sin aditivos (tapa roja) y de esta se centrifugara a 2 500 rpm por 10 minutos y luego se har la separacin del suero en crioviales.

1.6

Envo y transporte de muestras: En aquellos laboratorios que no contara con estufa y cabina se seguridad biolgica los hemocultivos debern ser trasladados a su laboratorio referente a tempera ambiente. Las muestras se suero debern ser trasladados en cadena de fro (2-8C) a su laboratorio referente. En caso que se tomo en tubo con anticoagulante EDTA (tapa morada) esta deber ser enviada a su laboratorio referente a tempera ambiente para la realizacin del hemocultivo. C. DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE BRUCELLA El aislamiento e identificacin de Brucella en los productos patolgicos tiene ventajas indudables sobre el diagnstico directo, pues, adems de suponer un diagnstico de certeza absoluta, permite la determinacin de especie y biotipo de gran inters en epidemiologa. La Brucella son bacterias cuya manipulacin no est exenta de riesgos, y las contaminaciones entre el personal, an en centros particularmente bien dotados y con personal especialmente entrenado, no son infrecuentes. 1. Hemocultivos y mielocultivos Una vez obtenida la muestra (en el caso de sangre 5 a 10 ml y en aspirado de mdula sea 0.5 a 1ml), si el frasco tiene un diafragma esterizarlo con alcohol de 70% e introducir la muestra de sangre o aspirado de medula. Al frasco de hemocultivo inoculado realizarse un movimiento en remolino, esto repetir cinco veces. Luego descarte la aguja y la jeringa en un contener resistente a las punturas. Limpiar el diafragma del frasco de hemocultivo, etiquetar el frasco con nombre del paciente, procedencia y fecha de inoculacin. Dejar en incubacin a 37 C, aproximadamente a las 6 horas se deja que el liquido bae el medio slido por unos minutos, luego se vuelve el frasco a su posicin vertical y se deja incubando de 24 y 48 horas hasta que se observe crecimiento en la parte liquida, slida o ambas. De no haber desarrollo seguir incubando por un periodo de 22 das, para ello diariamente realizar el baado del medio slido del hemocultivo. Asimismo realizar un cultivo ciego a los 7,14 y 22 das de inoculado el hemocultivo en medio TSA y Agar Sangre al 5%. Se recomienda que el medio de hemocultivo contenga CO2, ya que las cepas de Brucella abortus requieren de este para su crecimiento primario, este es una

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condicin que limita la recuperacin de esta especie en nuestro medio donde la mayor parte de frascos de hemocultivo producidos no cumplen con esta recomendacin. 2. Reaislamiento Cuando se observa crecimiento en el hemocultivo esta se siembra en placa con agar TSA y Agar sangre al 5% (preparado con sangre desfibrinada de carnero) y estas se incuban de 48 a 96 horas en campana con CO 2 a 37 C para Brucella abortus y otras placas de TSA y Agar sangre en atmsfera normal a 37C para las otras Brucella que no requieren CO2 para su desarrollo.

3.

PRUEBAS PRESUNTIVAS: 3.1 Morfologa de la colonia: Las colonias de Brucella pueden ser visibles desde las 48 horas. Las colonias son redondas, presentan bordes lisos y son de un dimetro 2 a 3 mm esta se observa en la placa de TSA a contraluz de preferencia con la luz natural indirecta, en ellas se observa colonias translcidas y de color ambarino plido, vistas desde arriba aparecen colonias convexas y de un color blanco perlado. Asimismo se puede observar colonias pequeas las cuales dependen del tipo de Brucela y/o contaminantes de la placa. En la placa de agar sangre los cultivos sospechosos a Brucella no producen hemolisis a las 48 horas. 3.2 Morfologa celular: De las colonias de la placa de TSA preparar un frotis en una lmina porta objeto y realizar la coloracin Gram, el colorante de contraste (Safranina) debe dejarse por lo menos 3 minutos debido a que este germen se colorea mal, en el microscopio debe observarse coco-bacilos Gram negativos a 100X. 3.3 Prueba de oxidasa Se utiliza una tira de papel filtro humedecido con reactivo de oxidasa poniendo un poco de cultivo con la ayuda de un mondadientes de madera, la aparicin de un color rosado es indicativa de una reaccin positiva. Se utilizan controles positivo (Pseudomonas aeruginosa) y negativo (Escherichia coli). 3.4 Prueba de la catalasa Poner una gota de agua oxigenada en una placa petri, con un asa de siembra coger varias colonias de la placa de TSA y tocar la gota del agua oxigenada. Se observar la aparicin de un burbujeo si es positiva. 3.5 Consideraciones importantes: Cuando observa colonias que cumplan con este criterio Colonias lisas transparentes Cocobacilos gram negativos Colonias no hemolticas Oxidasa positivo Catalasa positivo

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Estas sern catalogadas como Brucella sp y sern enviadas al laboratorio de Zoonosis Bacteriana-CNSP/INS siguiendo las Normas de Bioseguridad adecuadas y acompaando la Ficha clnico epidemiolgica de Brucelosis. 3.6 Envo de cepas: Las cepas debern ser enviadas en tubos de borosilicato con tapn de jebe que contengan de 2-3 ml de TSA en plano inclinado, estas cepas deben ser inoculados en estos tubos y se incubaran a 37C por 24 horas y luego mantenerlo en refrigeracin (2-8C) hasta su envo al Laboratorio de Referencia Nacional-INS 4. PRUEBAS CONFIRMATORIAS Y TIPIFICACION 4.1 Requerimiento de CO2 Sembrar a la bacteria en 2 tubos de TSA en plano inclinado e incubar a 37 C por 48 horas, dejando una en campana de CO 2 y el otro en atmsfera normal, se observa el crecimiento, si este es igual en ambos tubos, la cepa no es dependiente de CO2. 4.2 Utilizacin de la glucosa y lactosa Se inocula en un tubo de medio oxidacin y fermentacin (OF) que contenga glucosa y lactosa al 1% de cada uno de los azucares, se incubara en atmsfera normal durante 48 horas el genero brucella no oxida ni fermenta si no produce una alcalinizacin del medio.

4.3 Produccin de ureasa Se prepara una solucin tampn de fosfatos ph 7.2 con urea al 5% y esta se coloca en tubos 12 x75mm en cantidades de 1ml posteriormente se inocula con una asa de siembra a partir de un cultivo de 48 horas, hasta lograr una suspensin densa equivalente al tubo de 3 de Mac farland, luego incubar a 37C, las lecturas se efectuaran a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos, el medio cambia a un color rosado cuando es positivo, de ser negativo esta se deja en incubacin hasta las 24 horas. 4.4 Utilizacin de nitrato Inocular una asada de cultivo de 48 horas en un tubo con caldo nitrato y esta se dejara en incubacin por 48 horas, al final de este perodo aadir gotas de reactivo de alfa-naftilamina, la presencia de una coloracin rojiza indicara una reaccin positiva. 4.5 Produccin de hidrgeno sulfurado (H2S) Sembrar en un tubo con TSA la cepa en un plano inclinado, luego colocar una tira de papel baado con acetato de plomo en el tubo en la parte contraria al plano inclinado, incubar en atmsfera de CO2 a 37C por 48 horas, tener cuidado que la tira de papel no toque el medio. Si es positivo el extremo del papel de acetato se obscurece debido al desprendimiento de H2S. 4.6 Pruebas de colorantes Se preparar una suspensin densa de Brucella en ml de suero fisiolgico estril, introducir la torunda estril en la suspensin del cultivo y luego se

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siembra en las placas colorantes mediante estras. Se observara el resultado del crecimiento a las 96 horas, se debe incluir cepas control de Brucella. 4.7 Prueba de la acriflavina Diluir la acriflavina neutra en 1:1000 en agua destilada (10 ul con 10 ml), sacar de esta dilucin una gota y poner en una lamina portaobjeto y con una asada suspender unas colonias. Las colonias lisas permanecen en suspensin mientras que las rugosas aglutinan inmediatamente y las mucoides forman filamento. las colonias intermedias pueden permanecer en suspensin o aglutinarse ligeramente, la acriflavina diluida puede conservarse en refrigeracin por lo menos un mes. 4.8 Aglutinacin con sueros polivalentes y monoespecificos Realizar dos suspensiones de la cepa en suero fisiolgico fenolado al 0.5% en una lmina portaobjeto, se les aade una gota de monoespecfico A y M, se mezclan y leen dentro de 1 minuto buscando grumos de aglutinacin en cualquiera de estos sueros. 5. Conservacin de Brucella Las Brucella se conservan en tubos con TSA en plano inclinado, guardado en refrigeracin por aproximadamente un mes, puede guardarse por mas tiempo en caldo TSB o BHI con glicerol al 10% a 70 C o pueden ser liofilizadas.

D. DIAGNOSTICO SEROLOGICO PARA BRUCELOSIS HUMANA


Los mtodos serolgicos son las pruebas mas utilizadas para el diagnostico de laboratorio; el lipopolisacarido (LPS) es la estructura mas importante en relacin con la respuesta inmune, pues esta en la parte mas externa de la clula por consiguiente la mayor parte de los anticuerpos estn dirigidos contra esta porcin. En cepas en fase lisa (S), el S-LPS esta formado por el lpido A, una regin central o core y una cadena de polisacridos o cadena O que es un homopolmero que contiene aproximadamente 200 residuos de perosamina unidos por enlaces -1,2 en cepas que tienen el eptope A (por ejemplo Brucella abortus biovar 1), mientras las cepas que tienen el eptope M (por ejemplo B. melitensis biovar 1) tiene cada 5 residuos un enlace -1,3. La presencia de estos enlaces determina que exista una reaccin cruzada entre las especies de Brucella en fase lisa. La cadena O la responsable de producir las reacciones cruzadas con otras bacterias que tambin tienen el mismo azcar (perosamina) en su estructura. La respuesta inmunitaria humoral humana frente a la brucelosis se caracteriza por una produccin inicial de IgM e IgG especficas frente a los antgenos brucelares, fundamentalmente frente al lipopolisacrido, que aumenta rpidamente despus de producirse la infeccin. En los pacientes con una brucelosis aguda y en los que el tratamiento ha sido eficaz, los ttulos de IgM declinan rpidamente en los meses siguientes; a los 12 meses menos del 20 % de los pacientes presentan este tipo de anticuerpos. Por el contrario, los ttulos de anticuerpos de clase IgG, aparte de alcanzar niveles ms altos que los de clase IgM, disminuyen ms lentamente, de forma que pueden ser detectados 2 aos despus de finalizado el tratamiento en ms del 50% de los pacientes. En los pacientes en los que fracasa el tratamiento y en aquellos en los que se produce una recidiva, los anticuerpos de clase IgG se mantienen elevados o incluso con mucha frecuencia pueden experimentar un aumento en el ttulo.

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La toma de la muestra suero se har en la fase aguda sntomas. 1. PRUEBA DE ROSA DE BENGALA 1.1Fundamento: Es una prueba cualitativa muy sensible que detecta IgG1 y su positividad persiste por mucho tiempo. Es til para al diagnstico de brucelosis aguda. Se considera a la prueba positiva cuando se observa aglutinacin. 1.2 Procedimiento: 4-10 das de iniciado los

Positivo

Negativo

Colocar 30 ul de suero problema sobre uno de los cuadrados de la lmina de vidrio. Colocar 30 ul de antgeno de Rosa de Bengala cerca de la gota de suero. Mezclar bien el suero y el antgeno utilizando un agitador o mondadientes distinto para cada muestra. La superficie ocupada por la muestra debe tener un dimetro de 23 a 24 mm. Hacer girar la lamina durante 4 minutos a razn de 10 12 movimientos por minuto. Esta se puede hacer en forma manual o con rotadores mecnicos. El resultado de la prueba se lee a los cuatro minutos sobre un fondo blanco. Las reacciones positivas presentan grumos de aglutinacin, que pueden ser grandes o pequeos La es cualitativa, por lo que el resultado se informa como positivo o negativo.

1.3 Interpretacin Se considera que la prueba es positivo cuando hay presencia de aglutinacin La prueba es cualitativa, por lo que el resultado se informa como positivo o negativo Se sugiere que todos los sueros sean rutinariamente sometidos a esta prueba como un tamizaje y que los que den reacciones positivas deben ser procesados con los mtodos de Tubo y 2 Mercapto como pruebas confirmatorias 2. PRUEBA DE AGLUTINACIN EN PLACA 2.1 Fundamento: Esta prueba fue descrita en 1928, se utiliza el antigeno para la prueba en placa preparado con brucella abortus 1119-3. La concentracin celular deber ser de 10-102%, esta prueba detecta inmunoglobulinas de tipo IgM como tambin del tipo IgG.

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Es una prueba de diagnstico rpido y es muy usas en los laboratorios hospitalarios y en otros establecimientos de salud por ser fcil de realizar, sin embrago sus resultados pueden variar cunado los antigenos empleados son de mala calidad o la tcnica no es la correcta. Ha sido estandarizada para tener una buena correlacin con la prueba en tubo y se considera como positivo a una dilucin de 1/200 o el aumento al cudruple del valor inicial en dos muestras paralelas conPositivo lo menos 1 semana de por Negativo diferencia, un ttulo de 1/100 es considerado solo como presuntivo. 2.2 Materiales: Los sueros de y el antgeno deben estar a temperatura ambiente 1 hora antes de realizar la prueba. Ya que los cambios bruscos de temperatura pueden disminuir los ttulos.

2.3 Procedimiento:

Con la Micropipeta unicanal en contacto con la placa se deposita 80, 40, 20,10 y 5 ul de suero en una columna de la placa. Agitar suavemente el antgeno, luego sacar con una Micropipeta unicanal 30 ul de antgeno y dejar caer sobre cada una de las porciones del suero. Con un agitador mezclar cuidadosamente la mezcla de suero y antgeno con un con un movimiento circular, empezando por la dilucin ms alta, siendo extendida cada dilucin aproximadamente de los siguientes tamaos: Extensin en Titulo (mm) 80 ul 27 1/25 40 ul 24 1/50 20 ul 1 1/100 10 ul 18 1/200 5 ul 15 1/400 Levantar la placa y agitar con un suave movimiento rotatorio (4 veces). Colocar la placa en el aglutinoscopio tapar y apagar las luces y marcar el reloj por 8 minutos. Despus de 4 minutos, rotar la placa nuevamente por 4 veces. Al cabo de 8 minutos, rotar nuevamente la placa por 4 veces y hacer la lectura inmediatamente registrando los resultados en el cuaderno. Suero

Nota: La prueba en placa ha sido estandarizada para tener una buena correlacin con la prueba en tubo y se considera como positivo a una dilucin de 1/200 o el aumento al cudruple del valor inicial. Observaciones: La lectura debe hacerse exactamente alos 8 minutos que es cuando las muestras alcanzan la aglutinacin mxima, ya que los tiempos mayores a ste, favorecen la evaporacin excesiva, que da apariencia de aglutinacin en la periferia de la mezcla suero antgeno.Esto no debe interpretarse como una reaccin incompleta.

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Si se quiere conocer el ttulo final del suero por el mtodo de placa se preparara una dilucin de 1:16 (0.1ml suero problema + 1.5ml de suero fisiolgico) y se sigue el mismo procedimiento. Los ttulos de la lectura sern : Suero 80 40 20 10 5 Ttulo No diluido 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400

Diluido 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400

2.4 Interpretacin Se considera positivo a una dilucin de 1/ 200 o el aumento al cudruple del valor Inicial en dos muestras pareadas con por lo menos 1 semana de diferencia El ttulo de 1/ 100 es considerado solo como presuntivo. 3. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS 3.1 PRUEBA DE TUBO Y DEL 2 -MERCAPTOETANOL La prueba en tubo sirve para corroborar los resultados obtenidos con otras pruebas serolgicas .La prueba en tubo esta menos sujeta a errores de manipulacin y presenta menos reacciones inespecficas que la prueba de Aglutinacin en placa. Detecta la presencia de IgG e IgM. La prueba del 2Mercaptoetanol (2ME) se basa en la propiedad de los compuestos qumicos con grupos sulfhdricos de inactivar las IgM. Es una prueba selectiva que detecta la presencia de IgG y se debe efectuar simultneamente con la prueba en tubo. 3.1.1 Preparacin de reactivos: Se debe preparar con anticipacin a la prueba. a.-Antgeno para la prueba en tubo: 1ml de antgeno mas 99 ml de solucin salina al 0.85% fenolada al 0.5% b.-Antgeno para la prueba de 2 ME: 1ML de Anfgeno ms 49ml de solucin salina al 0.85% c.-Solucin de 2 Mercapto Etanol 0.1Molar: 0.39ml de 2-Mercaptoetanol q.p. mas 49.61 ml de solucin de cloruro de sodio al 0.85% ( No utilizar solucin salina fenolada). 3.1.2 Procedimiento: Por cada muestra de suero se colocan dos hileras de 5 tubos de 12 x 75mm. Identificar el primer tubo de cada hilera con el numero correspondiente al suero problema.

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Una de las hileras se destina a la prueba de tubo y se marca con una T y la otra hilera en la que se har la prueba de 2 ME , se marca con una M. Con la micropipeta unicanal depositar 80 ul de suero correspondiente a la primera dilucin, retirando al Micropipeta a lo largo de la superficie interna del tubo. Utilizando el mismo procedimiento echar 40ul de suero en el segundo tubo, 20ul en el tercero, 10ul en el cuarto y 5ul en el quinto tubo. Repetir el procedimiento descrito para depositar las mismas cantidades de suero en la segunda hilera de tubos. Repartir las otras muestras y los sueros controles positivos y negativo en forma similar. Agregar 1 ml de solucin de 2ME a cada tubo de las hileras marcadas con M, agitar y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos Agregar 2ml de antgeno fenolado a cada tubo de las hileras marcadas para la prueba en tubo, agitar. Aadir 1 ml de antgeno para 2ME a los tubos marcados con M, agitar. Cubrir los tobos para evitar la evaporacin. Incubar las gradillas por 48 horas a 37 c en estufa.

3.1.3 Interpretacin La prueba en tubo se interpreta como la prueba en placa Se considera un ttulo de 1/200 o mayor como positivo Mientras que en la prueba del 2ME se considera cualquier ttulo de aglutinacin como positivo.

3.2 FENMENO DE ZONA Es la ausencia de aglutinacin o presencia de aglutinacin parcial en las diluciones bajas y aglutinacin completa en las diluciones altas. Con este tipo de reaccin se debe reportar la dilucin positiva mas alta como ttulo final, e indicar las diluciones en las cuales ocurre el fenmeno de zona.

3.2.1 Procedimiento Al momento de realizar la lectura de la prueba en tubo o de 2 Mercapto etanol buscar la ausencia de aglutinacin o en menor proporcin, en los primeros tubos mientras que en los siguientes se observa una aglutinacin completa. Anotar hasta que dilucin se observa este fenmeno y considerarlo como ttulo. 3.3 ANTICUERPOS INCOMPLETOS Esta prueba esta basada en el efecto de la fuerza centrifuga para permitir la aglutinacin y determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes. 3.3.1 Procedimiento, Lectura e Interpretacin Todos los tubos que no presenten aglutinacin o esta sea incompleta en la prueba de 2ME, sern numerados y centrifugados a 850 g (aproximadamente unas 2000 r.p.m.), por 15 minutos.

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Luego se incuban los tubos a 37 C por 30 minutos. La lectura se hace en igual forma que la prueba en tubo, se informa la presencia de anticuerpos incompletos cuando existe diferencia de dos diluciones o ms en la prueba de 2ME. El ttulo del suero esta dado por la dilucin mas alta que presente aglutinacin completa. Es comn encontrar ttulos de aglutinacin en tubo centrifugado comparables con el ttulo de la prueba en placa, lo que explica que solo se informe el resultado en la prueba de 2ME centrifugado.

3.4 ANTICUERPOS BLOQUEADORES Existen varios mtodos para la determinacin de anticuerpos no aglutinantes que se presentan en pacientes con brucelosis crnica, uno de ellos es la deteccin de anticuerpos bloqueadores. Esta prueba utiliza un suero humano positivo con un ttulo establecido, que se mezcla con el suero del paciente. Si existieran anticuerpos bloqueadores, ocurrir un bloqueo de la reaccin que debera ser positiva . 3.4.1 Procedimiento a. b. c. d. Colocar 80 ul de suero del paciente en un tubo de 12x75. Agregar 1 ml de antgeno para prueba en tubo Agitar e incubar a 37C por 3 horas. Usar un suero positivo cuyo ttulo este entre 1/100 y 1/400 en la prueba en tubo:

Ttulo del Suero Cantidad a usar en ul 1/100 20 ul 1/200 10 ul 1/400 5 ul e. Agregar la cantidad necesaria de suero positivo de acuerdo al ttulo. f. Agitar e incubar a 37C por 24 horas. g. Leer como en la prueba en tubo 3.4.2 Interpretacin Si el paciente presenta anticuerpos bloqueadores, estos bloquean los determinantes antignicos del antgeno, por lo que al aadir el suero positivo este no puede reaccionar. Si existe aglutinacin, el suero es negativo a anticuerpos bloqueadores. Si no existe aglutinacin el suero es positivo a anticuerpos bloqueadores.

GRFICO N1 PROTOCOLO PARA LA PRUEBA EN TUBO Y DE 2 MERCAPTOETANOL

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