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INTRODUCCIN El Instituto Nacional de Salud y el Laboratorio de Referencia Regional de Lima CiudadDISA V tiene como una de sus principales funciones la capacitacin y transferencia de tecnologa que permita la actualizacin de conocimientos de profesionales de la salud, la estandarizacin de procedimientos de laboratorio, adaptados a las necesidades locales, y contribuir al fortalecimiento del control de las Enfermedades transmisibles y no transmisibles que afectan a nuestro pas. La finalidad es establecer los criterios tcnicos para el enrolamiento en los establecimientos y el diagnstico en los laboratorios de referencia regional de Brucelosis.
CONTENIDO a. Generalidades b. Obtencin y transporte de muestras c. Diagnstico por cultivo, d. Diagnsotico por serologa e. Vigilancia de Brucelosis f. Bibliografa g. Anexos h.
A. GENERALIDADES 1. ETIOLOGA 1.1 Agente etiolgico La brucelosis conocida tambin como Fiebre de Malta, Enfermedad de Bang o Fiebre del Mediterrneo, es ocasionada por bacterias del gnero Brucella y el cuadro clnico viene determinado por la especie responsable de la infeccin. As B. melitensis tiene mayor virulencia y muestra predisposicin al desarrollo de recadas y evolucin a la cronicidad, B. suis produce con frecuencia formas localizadas crnicas con necrosis y supuracin, B. abortus se caracteriza por su menor invasividad, responsable de frecuentes formas asintomticas y de fcil control teraputico. En el Per la enfermedad se debe casi exclusivamente a B. melitensis, siendo poco frecuente la B. canis; no se han comprobado casos humanos por B. ovis y B. neotomae 1.2 Reservorios El reservorio principalmente lo constituyen el ganado caprino, vacuno, porcino ovino y canes. 1.3Transmisin Por consumo de leche o productos lcteos (queso) sin pasteurizar o alimentos preparados con ellos, provenientes de animales infectados y por contacto de la piel (solucin de continuidad) con tejidos, sangre, orina, secreciones vaginales, fetos abortados, placenta. Tambin como riesgo ocupacional en laboratorios, mataderos y puede ser consecuencia de autoinoculacin accidental de vacunas de Brucella - cepa 19 y vacuna Rev-1. 1.4 Perodo de incubacin El perodo de incubacin vara en la mayora de los casos entre 10 y 20 das. Algunas veces la sintomatologa puede aparecer ms tardamente, inclusive tras un perodo de varios meses. 1.5 Transmisibilidad No hay pruebas de que la enfermedad se transmita de una persona a otra. 1.6 Susceptibilidad y resistencia Todas las personas son susceptibles. No se ha definido la duracin de la inmunidad adquirida. 2. DESCRIPCIN CLNICA DE LA ENFERMEDAD De comienzo agudo o insidioso, con fiebre continua, intermitente o irregular de duracin variable, transpiracin profusa, en particular durante la noche, fatiga, anorexia, prdida de peso, cefalea, artralgia y dolor generalizado.
2.2.3 Hepticas Hepatitis (de tipo granulomatoso). 2.2.4 Genitourinarias La orquiepididimitis unilateral o bilateral, es un sndrome caracterstico de la enfermedad. La brucelosis debe tenerse siempre en cuenta en el diagnstico diferencial en un varn joven con orquitis. La localizacin en otros rganos del aparato genitourinario es ms rara, destacando la prostatitis. La frecuencia de aborto en la brucelosis es similar a la de cualquier infeccin sistmica que curse con bacteriemia. 2.2.5 Ocular La afeccin ocular es poco frecuente y se limita en general a defectos transitorios de la agudeza visual, sin anomalas detectables en la exploracin ocular o la observacin de pequeos exudados en el fondo de ojo. Se ha descrito todo tipo de formas clnicas: uvetis (ms comn), papiledema y neuritis ptica. En algunos casos se ha podido aislar el microorganismo del humor vtreo poniendo de manifiesto la naturaleza infecciosa del proceso. 2.2.6 Hematolgicas Pancitopenia: por mieloinfeccion o por hiperesplenismo. Prpura trombocitopnica. Anemia hemoltica autoinmune. Coagulacin intravascular diseminada. 2.2.7 Cardiovasculares Endocarditis. Miocarditis. Pericarditis. 3. DEFINICIONES OPERATIVAS 3.1 Caso presuntivo Caso que es compatible con la descripcin clnica y puede estar vinculado epidemiolgicamente al consumo principalmente de productos lcteos no pasteurizados de origen animal (queso, leche) o a casos probables o confirmados en animales. 3.2 Caso probable Caso compatible con la descripcin clnica, con antecedente epidemiolgico y resultado positivo a la Prueba Rosa de Bengala. 3.3 Caso confirmado Caso probable positivo a las pruebas confirmatorias serolgicas, aislamiento del agente o su demostracin por pruebas moleculares. El siguiente es el esquema de las definiciones operativas
1.2 Materiales necesarios para realizar un hemocultivo: Frasco de hemocultivo Ligadura de jebe
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Obtencin de muestra de sangre: Reunir todo lo necesario, el nmero de la aguja depender del sitio de donde se tomara la muestra y del tamao de la vena. Se usa agujas para adultos 20x 1 21x1 para adulto y para nios una aguja 23 x 1 una mariposa (scalp vein). Escoger un brazo y aplicar una ligadura. Se escoge usualmente la vena ms prominente. Limpiar y desinfectar la piel en el sitio de insercin. Mojar un algodn con alcohol 70%, frotar el rea escogida, dejar secar, si se palpa nuevamente la vena, volver a desinfectar el rea. Se debe limpiar la zona varias veces. Luego de que el desinfectante haya secado introducir la aguja con el bisel de la aguja hacia arriba en un ngulo de 30-45 C. Colocar la aguja sobre la vena y empujar firme y deliberadamente hacia adelante. A medida que la aguja penetre en la vena, se siente que esta cede ligeramente y a veces la sangre ingresa en el cuello de la jeringa. Una vez que se ha penetrado en la vena, sacar la sangre aspirando con el embolo lenta y sostenidamente. Luego soltar la ligadura y colocar un pedazo de algodn sobre el sitio de insercin, manteniendo en su lugar la aguja. Retirar la aguja y presionara el algodn en el lugar hasta la fecha haya cerrado. Colocar un esparadrapo y mantener el brazo levantado por unos pocos minutos.
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Envo y transporte de muestras: En aquellos laboratorios que no contara con estufa y cabina se seguridad biolgica los hemocultivos debern ser trasladados a su laboratorio referente a tempera ambiente. Las muestras se suero debern ser trasladados en cadena de fro (2-8C) a su laboratorio referente. En caso que se tomo en tubo con anticoagulante EDTA (tapa morada) esta deber ser enviada a su laboratorio referente a tempera ambiente para la realizacin del hemocultivo. C. DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE BRUCELLA El aislamiento e identificacin de Brucella en los productos patolgicos tiene ventajas indudables sobre el diagnstico directo, pues, adems de suponer un diagnstico de certeza absoluta, permite la determinacin de especie y biotipo de gran inters en epidemiologa. La Brucella son bacterias cuya manipulacin no est exenta de riesgos, y las contaminaciones entre el personal, an en centros particularmente bien dotados y con personal especialmente entrenado, no son infrecuentes. 1. Hemocultivos y mielocultivos Una vez obtenida la muestra (en el caso de sangre 5 a 10 ml y en aspirado de mdula sea 0.5 a 1ml), si el frasco tiene un diafragma esterizarlo con alcohol de 70% e introducir la muestra de sangre o aspirado de medula. Al frasco de hemocultivo inoculado realizarse un movimiento en remolino, esto repetir cinco veces. Luego descarte la aguja y la jeringa en un contener resistente a las punturas. Limpiar el diafragma del frasco de hemocultivo, etiquetar el frasco con nombre del paciente, procedencia y fecha de inoculacin. Dejar en incubacin a 37 C, aproximadamente a las 6 horas se deja que el liquido bae el medio slido por unos minutos, luego se vuelve el frasco a su posicin vertical y se deja incubando de 24 y 48 horas hasta que se observe crecimiento en la parte liquida, slida o ambas. De no haber desarrollo seguir incubando por un periodo de 22 das, para ello diariamente realizar el baado del medio slido del hemocultivo. Asimismo realizar un cultivo ciego a los 7,14 y 22 das de inoculado el hemocultivo en medio TSA y Agar Sangre al 5%. Se recomienda que el medio de hemocultivo contenga CO2, ya que las cepas de Brucella abortus requieren de este para su crecimiento primario, este es una
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PRUEBAS PRESUNTIVAS: 3.1 Morfologa de la colonia: Las colonias de Brucella pueden ser visibles desde las 48 horas. Las colonias son redondas, presentan bordes lisos y son de un dimetro 2 a 3 mm esta se observa en la placa de TSA a contraluz de preferencia con la luz natural indirecta, en ellas se observa colonias translcidas y de color ambarino plido, vistas desde arriba aparecen colonias convexas y de un color blanco perlado. Asimismo se puede observar colonias pequeas las cuales dependen del tipo de Brucela y/o contaminantes de la placa. En la placa de agar sangre los cultivos sospechosos a Brucella no producen hemolisis a las 48 horas. 3.2 Morfologa celular: De las colonias de la placa de TSA preparar un frotis en una lmina porta objeto y realizar la coloracin Gram, el colorante de contraste (Safranina) debe dejarse por lo menos 3 minutos debido a que este germen se colorea mal, en el microscopio debe observarse coco-bacilos Gram negativos a 100X. 3.3 Prueba de oxidasa Se utiliza una tira de papel filtro humedecido con reactivo de oxidasa poniendo un poco de cultivo con la ayuda de un mondadientes de madera, la aparicin de un color rosado es indicativa de una reaccin positiva. Se utilizan controles positivo (Pseudomonas aeruginosa) y negativo (Escherichia coli). 3.4 Prueba de la catalasa Poner una gota de agua oxigenada en una placa petri, con un asa de siembra coger varias colonias de la placa de TSA y tocar la gota del agua oxigenada. Se observar la aparicin de un burbujeo si es positiva. 3.5 Consideraciones importantes: Cuando observa colonias que cumplan con este criterio Colonias lisas transparentes Cocobacilos gram negativos Colonias no hemolticas Oxidasa positivo Catalasa positivo
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4.3 Produccin de ureasa Se prepara una solucin tampn de fosfatos ph 7.2 con urea al 5% y esta se coloca en tubos 12 x75mm en cantidades de 1ml posteriormente se inocula con una asa de siembra a partir de un cultivo de 48 horas, hasta lograr una suspensin densa equivalente al tubo de 3 de Mac farland, luego incubar a 37C, las lecturas se efectuaran a los 15, 30, 60, 120 y 180 minutos, el medio cambia a un color rosado cuando es positivo, de ser negativo esta se deja en incubacin hasta las 24 horas. 4.4 Utilizacin de nitrato Inocular una asada de cultivo de 48 horas en un tubo con caldo nitrato y esta se dejara en incubacin por 48 horas, al final de este perodo aadir gotas de reactivo de alfa-naftilamina, la presencia de una coloracin rojiza indicara una reaccin positiva. 4.5 Produccin de hidrgeno sulfurado (H2S) Sembrar en un tubo con TSA la cepa en un plano inclinado, luego colocar una tira de papel baado con acetato de plomo en el tubo en la parte contraria al plano inclinado, incubar en atmsfera de CO2 a 37C por 48 horas, tener cuidado que la tira de papel no toque el medio. Si es positivo el extremo del papel de acetato se obscurece debido al desprendimiento de H2S. 4.6 Pruebas de colorantes Se preparar una suspensin densa de Brucella en ml de suero fisiolgico estril, introducir la torunda estril en la suspensin del cultivo y luego se
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Positivo
Negativo
Colocar 30 ul de suero problema sobre uno de los cuadrados de la lmina de vidrio. Colocar 30 ul de antgeno de Rosa de Bengala cerca de la gota de suero. Mezclar bien el suero y el antgeno utilizando un agitador o mondadientes distinto para cada muestra. La superficie ocupada por la muestra debe tener un dimetro de 23 a 24 mm. Hacer girar la lamina durante 4 minutos a razn de 10 12 movimientos por minuto. Esta se puede hacer en forma manual o con rotadores mecnicos. El resultado de la prueba se lee a los cuatro minutos sobre un fondo blanco. Las reacciones positivas presentan grumos de aglutinacin, que pueden ser grandes o pequeos La es cualitativa, por lo que el resultado se informa como positivo o negativo.
1.3 Interpretacin Se considera que la prueba es positivo cuando hay presencia de aglutinacin La prueba es cualitativa, por lo que el resultado se informa como positivo o negativo Se sugiere que todos los sueros sean rutinariamente sometidos a esta prueba como un tamizaje y que los que den reacciones positivas deben ser procesados con los mtodos de Tubo y 2 Mercapto como pruebas confirmatorias 2. PRUEBA DE AGLUTINACIN EN PLACA 2.1 Fundamento: Esta prueba fue descrita en 1928, se utiliza el antigeno para la prueba en placa preparado con brucella abortus 1119-3. La concentracin celular deber ser de 10-102%, esta prueba detecta inmunoglobulinas de tipo IgM como tambin del tipo IgG.
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2.3 Procedimiento:
Con la Micropipeta unicanal en contacto con la placa se deposita 80, 40, 20,10 y 5 ul de suero en una columna de la placa. Agitar suavemente el antgeno, luego sacar con una Micropipeta unicanal 30 ul de antgeno y dejar caer sobre cada una de las porciones del suero. Con un agitador mezclar cuidadosamente la mezcla de suero y antgeno con un con un movimiento circular, empezando por la dilucin ms alta, siendo extendida cada dilucin aproximadamente de los siguientes tamaos: Extensin en Titulo (mm) 80 ul 27 1/25 40 ul 24 1/50 20 ul 1 1/100 10 ul 18 1/200 5 ul 15 1/400 Levantar la placa y agitar con un suave movimiento rotatorio (4 veces). Colocar la placa en el aglutinoscopio tapar y apagar las luces y marcar el reloj por 8 minutos. Despus de 4 minutos, rotar la placa nuevamente por 4 veces. Al cabo de 8 minutos, rotar nuevamente la placa por 4 veces y hacer la lectura inmediatamente registrando los resultados en el cuaderno. Suero
Nota: La prueba en placa ha sido estandarizada para tener una buena correlacin con la prueba en tubo y se considera como positivo a una dilucin de 1/200 o el aumento al cudruple del valor inicial. Observaciones: La lectura debe hacerse exactamente alos 8 minutos que es cuando las muestras alcanzan la aglutinacin mxima, ya que los tiempos mayores a ste, favorecen la evaporacin excesiva, que da apariencia de aglutinacin en la periferia de la mezcla suero antgeno.Esto no debe interpretarse como una reaccin incompleta.
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2.4 Interpretacin Se considera positivo a una dilucin de 1/ 200 o el aumento al cudruple del valor Inicial en dos muestras pareadas con por lo menos 1 semana de diferencia El ttulo de 1/ 100 es considerado solo como presuntivo. 3. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS 3.1 PRUEBA DE TUBO Y DEL 2 -MERCAPTOETANOL La prueba en tubo sirve para corroborar los resultados obtenidos con otras pruebas serolgicas .La prueba en tubo esta menos sujeta a errores de manipulacin y presenta menos reacciones inespecficas que la prueba de Aglutinacin en placa. Detecta la presencia de IgG e IgM. La prueba del 2Mercaptoetanol (2ME) se basa en la propiedad de los compuestos qumicos con grupos sulfhdricos de inactivar las IgM. Es una prueba selectiva que detecta la presencia de IgG y se debe efectuar simultneamente con la prueba en tubo. 3.1.1 Preparacin de reactivos: Se debe preparar con anticipacin a la prueba. a.-Antgeno para la prueba en tubo: 1ml de antgeno mas 99 ml de solucin salina al 0.85% fenolada al 0.5% b.-Antgeno para la prueba de 2 ME: 1ML de Anfgeno ms 49ml de solucin salina al 0.85% c.-Solucin de 2 Mercapto Etanol 0.1Molar: 0.39ml de 2-Mercaptoetanol q.p. mas 49.61 ml de solucin de cloruro de sodio al 0.85% ( No utilizar solucin salina fenolada). 3.1.2 Procedimiento: Por cada muestra de suero se colocan dos hileras de 5 tubos de 12 x 75mm. Identificar el primer tubo de cada hilera con el numero correspondiente al suero problema.
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3.1.3 Interpretacin La prueba en tubo se interpreta como la prueba en placa Se considera un ttulo de 1/200 o mayor como positivo Mientras que en la prueba del 2ME se considera cualquier ttulo de aglutinacin como positivo.
3.2 FENMENO DE ZONA Es la ausencia de aglutinacin o presencia de aglutinacin parcial en las diluciones bajas y aglutinacin completa en las diluciones altas. Con este tipo de reaccin se debe reportar la dilucin positiva mas alta como ttulo final, e indicar las diluciones en las cuales ocurre el fenmeno de zona.
3.2.1 Procedimiento Al momento de realizar la lectura de la prueba en tubo o de 2 Mercapto etanol buscar la ausencia de aglutinacin o en menor proporcin, en los primeros tubos mientras que en los siguientes se observa una aglutinacin completa. Anotar hasta que dilucin se observa este fenmeno y considerarlo como ttulo. 3.3 ANTICUERPOS INCOMPLETOS Esta prueba esta basada en el efecto de la fuerza centrifuga para permitir la aglutinacin y determinar la presencia de anticuerpos no aglutinantes. 3.3.1 Procedimiento, Lectura e Interpretacin Todos los tubos que no presenten aglutinacin o esta sea incompleta en la prueba de 2ME, sern numerados y centrifugados a 850 g (aproximadamente unas 2000 r.p.m.), por 15 minutos.
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Luego se incuban los tubos a 37 C por 30 minutos. La lectura se hace en igual forma que la prueba en tubo, se informa la presencia de anticuerpos incompletos cuando existe diferencia de dos diluciones o ms en la prueba de 2ME. El ttulo del suero esta dado por la dilucin mas alta que presente aglutinacin completa. Es comn encontrar ttulos de aglutinacin en tubo centrifugado comparables con el ttulo de la prueba en placa, lo que explica que solo se informe el resultado en la prueba de 2ME centrifugado.
3.4 ANTICUERPOS BLOQUEADORES Existen varios mtodos para la determinacin de anticuerpos no aglutinantes que se presentan en pacientes con brucelosis crnica, uno de ellos es la deteccin de anticuerpos bloqueadores. Esta prueba utiliza un suero humano positivo con un ttulo establecido, que se mezcla con el suero del paciente. Si existieran anticuerpos bloqueadores, ocurrir un bloqueo de la reaccin que debera ser positiva . 3.4.1 Procedimiento a. b. c. d. Colocar 80 ul de suero del paciente en un tubo de 12x75. Agregar 1 ml de antgeno para prueba en tubo Agitar e incubar a 37C por 3 horas. Usar un suero positivo cuyo ttulo este entre 1/100 y 1/400 en la prueba en tubo:
Ttulo del Suero Cantidad a usar en ul 1/100 20 ul 1/200 10 ul 1/400 5 ul e. Agregar la cantidad necesaria de suero positivo de acuerdo al ttulo. f. Agitar e incubar a 37C por 24 horas. g. Leer como en la prueba en tubo 3.4.2 Interpretacin Si el paciente presenta anticuerpos bloqueadores, estos bloquean los determinantes antignicos del antgeno, por lo que al aadir el suero positivo este no puede reaccionar. Si existe aglutinacin, el suero es negativo a anticuerpos bloqueadores. Si no existe aglutinacin el suero es positivo a anticuerpos bloqueadores.
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