A.E.F.l. ASOCIACION ESPANOLA DE FARMACEUTICOS DE LA INDUSTRIA VALIDACION DE METODOS ANALITICOS AUTORES Generalidades, materias primas y especialidades farmacéuticas Leticia Aguirre Ortega Maribel Martin Pomar F, Javier Garcia Garcia Begofia Mateos Pérez Teresa Garcia Junca Cristina Ochoa de Echagilen Aguilar Miquel Illera Fontanet Miguel Angel Ortega Sanchez Marta Juncadella Roca 7 Marti Pujol Forn Monica Lizondo Carbo Marisa Reig Serrat Anna Maria Lluch Sanfeliu Marta Torres Gonfaus Métodos en Microbiologia Susana Antunez Moreno Cesca Niubo Prats Ana Maria Carro Vifiaras Maria Pilar Oliver Aguera Antonia Garcia Avila Meétodos en Bioandlisis M.* Cruz Caturla Perales Carlos Nieto Abad Carles Celma Lezcano José Antonio Pérez Cuadrado Gregorio Encima Garcia Maria Rovira Guerin Josep M. Jansat Rufach Digna Tost Robusté Estadistica aplicada y tablas estadisticas Rogelio Cortés Loras COORDINADORES José Antonio Pérez Cuadrado, vocal de I+ de la Seccién Catalana de AEFI Marti Pujol Forn, vocai de Control de’ Calidad de la Seccién Catalana de AEFILa Asociacion Espafiola de Farmacéuticos de la Industria-AEFI, agradece la inestimable colaboracién de las siguientes empre- sas que han facilitado la edicién de esta monografia: Agilent Technologies Innovating the HP Way analitica MERCK [> PH-C == AGILENT TECHNOLOGIES Carretera Nacional VI - Km 18,200 28230 Las Rozas (Madrid) Tel.: 91 631 30 42 MCC ANALITICA, S.A. C/. Ganduxer 129 08022 Barcelona Tel.: 93 212 00 33 MERCK EUROLAB Distribucién material para laboratorio Pol. Merck 08100 Mollet del Valles (Barcelona) Tel.: 93 565 55 00 PERKIN ELMER, S.L. Av. Universitat Autonoma 3. A 08290 Cerdanyola del Vallés (Barcelona) Tel.: 93 582 45 22 PH-C Laboratorio de analisis C/. Esmeragda 19-21 08950 Esplugues de Llobregat (Barcelona) Tel.: 93 473 96 62 SOCIEDAD DE VALIDACION DE SISTEMAS, S.L. C/. Fedanci 8-10 - Baixador de Sant Joan 08190 Sant Cugat del Vallés (Barcelona) Tel.: 93 675 25 24INTRODUCCION: OBJETO, AMBITO DE APLICACION Y CONTENIDO DE LA MONOGRAFIA En el afio 1989 un grupo de profesionales integrantes de la Seccion Catalana de AEFI (Asociacion Espariola de Farmacéuticos de Industria) preparo una. monografia sobre “Validacién de métodos analiticos”. Por aquel entonces era un tema de gran actualidad pero estaba lejos de su regulacion y habia muchas opiniones divergentes de su necesidad o de como llevarla a cabo. Estaba muy extendida la idea de que la validaci6n analitica era un tramite burocratico, con poca o ninguna implicacion por parte del laboratorio y que bastaba incluirla en los dosiers de Registro. Los objetivos primordiales de aquella publicacion fueron: * Aportar una vision global y sistematizada de la validacion analitica. : ¢ Orientar a los técnicos de los laboratorios dé control e 1+D que se enfrentaban, en su trabajo diario, a la problematica de la validacion El ambito de aplicacion de la monografia se dirigid principalmente hacia los métodos analiticos de tipo quimico e instrumental de uso mas comun: control de materias primas, producto terminado y estudios de estabilidad y de desarrollo galénico. Los métodos analiticos de tipo microbiologico y los, destinados a estudios de metabolismo. farmacocinética y bioequivalencia podian presentar particularidades que no se contemplaban en aquel trabajo. : Desde entonces y hasta la actualidad la situacion ha cambiado radicalmente, de tal forma que hoy en dia no se concibe la idea que un laboratorio pueda utilizar un método analitico que no haya sido objeto: previamente de algun tipo de validacién, transferencia o, simplemente, comprobacion. La bibliografia cientifica en este campo es tan abundante que se hace dificil seleccionar los trabajos mas interesantes. Actualmente el tema esta bien regulado, con monografias de caracter obligatorio como tas publicadas en las Farmacopeas Europea y Americana 0 bien con textos de cumplimiento recomendable como son las Normas ICH (International Conference Harmonisation) o tas guias editadas por las agencias reguladoras. A pesar de todo ello, de forma periédica y desde diferentes sectores, se han venido recibiendo peticiones de actualizacion de la Monografia AEFI. Las Vocalias de Control de Calidad e 1+D de AEFI Catalana decidieron finalmente acometer de forma conjunta la confeccién de una nueva Monografia y crearon una comisién de trabajo con este fin. A grandes rasgos el planteamiento de la Comision se basé en que la Monografia debia cumplimentar los puntos siguientes: 1) Ambito de aplicacién amplio, con inclusion de todos los campos analiticos de las areas quimica, galénica. microbiolégica y farmacoldgica. 2) Explicacion y desarrollo de los principales conceptos teéricos. 3) Inclusion de ejemplos. 4) Explicacion de los Conceptos estadisticos necesarios Para una buena comprension de la parte tedrica y de los ejemplos ‘electronica, instrumentacion (caliBracion, cualificacion y' mantenimiento), sistemas informaticos, etc. Todo ello con el objetivo de crear un entorno favorable a la obtencién de resultados seguros y fiables. * La segunda parte trata de la Validacién de métodos analiticos de tipo quimico e instrumental para especialidades y materias Primas. Se desarrollan los parametros fundamentales de la validacion (selectividad, linealidad, precision, exactitud y limites de deteccion y cuantificacion) y una serie de temas relacionados: idoneidad de los sistemas, robustez, transferencia de Métodos analiticos, métodos de Farmacopea, métodos para plantas medicinales y revalidacién. La cuarta parte trata de la Validacién de métodos analiticos para los estudios de Farmacologia, Farmacocinética y Bioequivatencia y se basa en el estudio y comentario critico del borrador de la FDA (Food and Drug Administration) sobre “Bioanalytical Methods Validation for Human Studies": Validacion durante la fase Previa a un estudio (selectividad, curva de calibracién, precision, exactitud, recuperacién, estabilidad de las muestras), validacién durante la fase de realizacion del estudio y documentacién. Finalmente la quinta parte sobre Estadistica aplicada incluye una exposicion de los conceptos estadisticos fundamentales (poblacion y muestra, indices estadisticos La Comision agradece especialmente la colaboracién de las empresas que han esponsorizado el proyecto, gracias a la cual se favorecera la difusion y distribucion de la Monografia.INDICE GENERAL ABREVIATURAS GLOSARIO PARTE!: | GENERALIDADES a PARTE Il: VALIDACION DE METODOS DE ANALISIS EN MATERIAS PRIMAS Y ESPECIALIDADES FARMACEUTICAS. PARTE Ill: VALIDACION DE METODOS DE ANALISIS EN MICROBIOLOGIA PARTE IV: VALIDACION DE METODOS EN BIOANALISIS PARTEV: ESTADISTICA APLICADA APENDICE "1 9) 39 136. 209 249 315,a (=a) b (=p) e e% gl (=v, DF) kv miz x er ee oe) N Abreviaturas y simbolos 7 ABREVIATURAS Y SIMBOLOS Término independiente en una recta de regresion o curva de calibracion. Pendiente en una recta de regresion o curva de calibracion Diferencia significativa en una prueba estadistica Residual en la recta de regresion € t- i) Error en porcentaje. Factor de respuesta Grados de libertad. Factor de‘Capacidad.” Relacién masa/carga. en espectrometria de masas. Generaimente coincide con la masa de un ion (si la carga es la unidad). Tamafio de la muestra; numero de valores ‘de una serie; numero de réplicas de un tratamiento. Nanogramo. Nanometro. Probabilidad de que un estadistico determinado sea mayor que el valor observado. Partes por millon (equivalente a g/mL © g/g). Partes por billn anglosajén (1x10°°) (equivalente a ng/mL. o ng/g). Coeficiente de correlacién. i Coeficiente de determinacion. Desviacion estandar de una muestra. Variancia de una muestra. Desviacién estandar de la media. Estadistico de Student. Tiempo de retencién de un analito. Tiempo muerto (tiempo en el que un compuesto no retenido pasa por el interior del sistema). Variable independiente (valor nominal). Media de una muestra. Valor estimado o calculado de la variable independiente. Variable dependiente (valor experimental). Valor estimado 0 caiculado de la variable dependiente. Variable tipificada de la curva de Gauss 0 normal.8 Abreviaturas y simbolos AAPS American Association of Pharmaceutical Scientists. AOAC Association of Official Analytical Chemists. ANOVA Analisis de la variancia. BPL(=GLP) Buenas practicas de laboratorio. CCF (=TLC) Cromatografia en capa fina. cl lonizacion quimica (método de ionizacion en Espectrometria de Masas). CLE Concentraci6n limite de endotoxinas (método LAL), CSE Endotoxina estandar de contro! (método LAL). CV(=CV%) Coeficiente de variacion D Estadistica de la prueba de normalidad de Kolmogorov. DAD Detector de diodos. DOF Grados de libertad. DLso Dosis letal 50. EC Electroforesis capilar i EMEA Agencia Europea de Medicamento. EPA Environmental Protection Agency. EU Unidades de endotoxina (método LAL). EP(=Eur. Pharm.) Farmacopea Europea. ER% Error relativo porcentual. Se utiliza especialmente en Bioandlisis. F Valor de la distribucién de Snedecor-Fisher. FDA Food and Drug Administration. FTIR Espectrometria IR con transformada de Fourier. G Estadistico de la prueba de homogeneidad de variancias de Cochran. GC (=CG) Cromatografia de gases. : GC-MS Acoplamiento de cromatografia de gases con espectrometria de masas GM Media geométrica (método LAL). HPLC Cromatografia liquida de alta resolucion He Hipotesis nula. Hy Hipotesis alternativa. Ic (=LC) Intervaio de confianza. ICH International Conference of Harmonisation. IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry. ' K Numero de grupos. LAL Lisado de amebocitos de Limulus. LC(=LOQ) Limite de cuantificacion. LD(=LOD) Limite de deteccion LIMS Laboratory Information Management Systems.MC (=MS) MDV MS MS-MS. N NIST NMP PBR PFC Q(=R) R(=R %) Rs RSE SC (=SS) SIM a TSA TSB UFC UusP uv (=gl 0 DF) Cee ra hg (=meg) ¢ Abreviaturas y simbolos 9 Media cuadratica (en ANOVA). | Maxima dilucion valida (método LAL) Espectrometria de masas. : = Espectrometria de masas en tandem. Numero de platos tedricos. National Institute of Standards and Technology. Numero mas probable de microorganismos. Patron de referencia del método endotoxina (LAL). Pass/Fail Cutoff (método LAL). Estadistico del test de recorrido de Dixon. Porcentaje de recuperacion. Resolucion (cromatografia) Endotoxina estandar de referencia (método LAL). Suma de cuadrados en ANOVA. Monitorizacion selectiva de iones (método de adqui sensibilidad en espectrometria de masas). ion de elevada Factor de asimetria. Agar triptona soja. Caldo triptona soja. Unidades formadoras de colonias. Farmacopea de los Estados Unidos. Ultravioleta. Anchura de pico cromatografico. Error de tipo | (falso positivo). Error de tipo II (falso negativo). Grados de libertad. Longitud de onda. Sensibilidad del lisado (LAL). Estadistico de la distribucion de Poisson. Desviacién estandar de la poblacién. Variancia de la poblacion. : Media de la poblacion Microgramo. Estadistico de Chi cuadrado.Glosario 11 GLOSARIO En los casos procedentes se indica entre paréntesis la expresion equivalente en lengua inglesa. El presente glosario se limita a los términos estadisticos y propios de, Ja validacion analitica Analito (Analyte) sustancia contenida en la muestra sometida a andilisis. Blanco de matriz biolégica (Blank matrix). Matriz biologica (normalmente sangre, plasma, suero u orina) libre de los analitos a cuantificar. Blanco, placebo o matriz de la muestra (Blank, placebo, sample matrix). Muestra Preparada para la lectura final pero que no contiene analitos. Puede ser un blanco de los reactivos o bien un blanco de la muestra problema que contenga todos los ingredientes de la muestra problema excepto los analitos. En este‘ ultimo caso se denomina placebo 0 matriz de la muestra. . - Este concepto de matriz no puede aplicarse a las plantas medicinales, ya que no es posible separar los analitos del resto de componentes. ‘En el ambito de plantas el término matriz se utiliza como sindnimo de muestra representativa. Cantidad declarada o nominal (Labeled amount). Es la cantidad 0 concentracién teérica de un analito. Cuando se trabaja con concentraciones relativas se le da valor 100. Cantidad estimada o calculada. Contenido, riqueza, potencia. Es la cantidad o concentracién de analito hallada tras la ejecucion del método analitico, ya sea por un método directo o por comparacion con un estandar o varios estandares (interpolacién en una curva de calibracién). Coeficiente de variacién 0 desviacion estandar relativa (Coefficient of variation or relative standard deviation).'Es la desviacion estandar expresada como funcidén de la media. Normalmente se exptesa en porcentaje. CV (%= —*100 Desviacién estandar (Standard deviation). Estadistico basico indicativo de la dispersion o variabilidad de los resultados. | , Le-xF _ fn Ex?- (Ex)? ion estandar de la media o error estandar (Standard error of the mean). La desviacién estandar de una media de n resultados se obtiene a partir de la siguiente expresion: Disefio factorial (Factorial design). Plan de experimentacion cuya caracteristica mas destacable es que los valores de todos los factores se van moviendo simultaneamente. En la experimentacion los disefios mas utilizados son los de dos niveles, de forma que un disefio factorial completo de K factores con dos niveles Por factor, conduce a un numero de experimentos igual a 2".12 Glos Disefio factorial fraccionacs (Fractional factorial design). Los disefos factoriales fraccionados permiten estudiar un numero elevado de factores con un numero de experimentos mucho menor de lo que requeriria un factorial completo. Si el numero de niveles es 2. el numero de factores a estudiar es K y el grado de fraccionamiento es P, el numero de experimentos a realizar es 2*?. Al reducir el numero de experimentos se presentan una serie de confusiones, que pueden afectar a la puesta en evidencia de las interacciones entre los efectos principales. Distribucion de probabilidad . Modelo matematico que retaciona los valores de una variable con su probabilidad de ocurrencia en la poblacion. Las distribuciones mas frecuentes son la normal, la t de Student, la F de Snedecor y la chi-cuacrado entre otras. Efecto de la dilucion (Dilution effect). El rango de una recta o curva de calibracion debe abarcar el rango de las concentraciones esperadas de analito en las muestras problema. No es recomendable extrapolar resultados por debajo ni por encima de! rango estudiado en la linealidad. Cuando Ia concentracién de la muestra problema es superior al limite superior del rango de linealidad se puede diluir la muestra convenientemente (con agua o con blanco, segun los casos) y reanalizarla. Conviene demostrar que el efecto de Ia dilucion no afecta la exactitud y precisién del método mediante el andlisis de muestras con patrones o placebos cargados con analito sometidas al proceso de dilucion. Error relativo porcentual (Relative error in percentage). Desviacion en porcentaje de los valores experimentales frente a los valores tedricos. e%=ER%= [(Valor experimental- valor terico)/valor tedrico]*100 En el caso de una curva de calibracién el error relativo porcentual de cada uno de los patrones se halla mediante la expresion: ER% = Girw)]. 100 Xi siendo x, los valores tedricos y 3; los valores experimentales estimados por aplicacién de la ecuacién que define la curva de calibracién. (Si es una recta: i= 6; = ayb ). Error, Error sistematico, Error aleatorio (Systematic error, Random error). Los errores analiticos, que se cometen al.efectuar los analisis, pueden ser determinados o indeterminados. Los errores determinados o sistematicos van en una sola direccion y se deben a fallos de instrumentos, personas 0 métodos. Deben eliminarse (0 corregirse sus efectos) puesto que afectarian la exactitud del método. Los errores indeterminados 0 aleatorios son de origen desconocido, actuan en ambas. direcciones y determinan ta variabilidad de los resultados o precision del método. Los errores indeterminados son objeto de los tratamientos estadisticos (no confundir los errores analiticos con los errores « y fs 0 riesgos de los tests estadisticos). Estabilidad de la muestra (Sample stability). Es un requerimiento basico la demostracion de la estabilidad de la muestra y de los patrones durante el tiempo comprendido entre su Preparacion y la finalizacion del analisis, especialmente cuando se utilizan equipos automaticos en donde las muestras pueden permanecer horas antes de ser analizadas. En el ambito bioanalitico la estabilidad es uN parametro fundamental. Estandar de referencia. Estandar de trabajo (Primary reference standard. Working Standard). Un estandar de referencia o patron primario es un producto homogéneo con propiedades especificas (identidad, pureza y riqueza) que ha sido analizado y certificado por un organismo cualificado y homologado (reconocido oficialmente)Glosario 13 Un estandar de trabajo o patron secundario es un estandar cuya riqueza (u otras caracteristicas), ha sido comprobada y calibrada mediante un método validado frente a un patron de referencia. Exactitud (Accuracy). Expresa la Proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero, valor nominal, tedrico o un valor de referencia y el valor encontrado experimentaimente. Capacidad del método analitico Para proporcionar resultados lo mas cercanos posibles al valor tedrico 0 nominal Matematicamente se expresa como el valor numérico del error sistematico (diferencia entre el valor medio hallado yel verdadero) o bien como error relativo Pporcentual. En Microbiologia. cuando se trata de efectuar contajes microbianos, Ja exactitud se define como el porcentaje de recuperacion frente al valor de! indculo. En Materias primas y Especialidades se utiliza también el Porcentaje de recuperacion como expresion equivalente a la exactitud si bien el concepto de recuperacion puede ser diferente a la exactitud en otros ambitos de trabajo (Bioandlisis, Plantas medicinales, etc.). Véase el lérmino de “recuperacién” de este glosario Factor de capacidad (Capacity factor). En un método cromatografico es el numero de volumenes de fase movil necesarios para eluir un compuesto después del volumen inicial contenido en ta columna. Factor de simetria, factor de asimetria o factor de cola. (Tailing factor). Medida de la asimetria de la sefial generada Por el pico cromatogtafico. Fiabilidad (Reliability). Capacidad de un método analitico para mantener durante Pperiodos de tiempo apropiados los cntenos {undamentales de validacion. La fiabilidad indica las Prestaciones del metodo para uso rutinario. : : Grados de libertad (Degrees of freedom). Numero de categorias independientes que definen una muestra o una poblacién. En el calculo de la desviacion estandar significa el numero de desviaciones independientes con respecto a la media y vale n-1. En el calculo de la recta de regresi6n, el numero de grados de libertad es n-2. Homogeneidad de variancias (Variance homogeneity). En muchos tests estadisticos es necesario comprobar previamente la homoscedasticidad (homogeneidad de variancias) de las muestras mediante tests especificos (F de Snedecor, Cochran,’ Barlett, Levene, etc). La condicién de variancias diferentes recibe el nombre de heteroscedasticidad. Idoneidad del sistema (System Suitability test). Conjunto de ensayos que permiten comprobar en el momento de utilizacion del, método que eli sistema (analista, reactivos e instrumentos) es adecuado para llevar a cabo la determinacién para la que se ha establecido y validado dicho método. Incertidumbre de una medida (Uncertainty). Estimacion del intervalo dentro del cual se encuentra el valor verdadero de la cantidad medida una vez efectuadas las correcciones debidas a errores sistematicos. Intervalo, rango, amplitud o recorrido (Range). Diferencia en magnitud entre la mayor y menor concentracién de analito que puede determinarse satisfactoriamente con adecuada linealidad, exactitud y precision. Si bien la denominacion fango es muy comun, deberian utilizarse los términos intervalo, amplitud 0 recorrido como mas apropiados para esta definicion (Rango es el equivalente inglés del término “Rank” que significa numero de orden dentro de una serie). Intervalo de confianza o limites de confianza (Confidence interval o confidence limits). Intervalo en torno al valor estimado que contiene el valor real con una probabilidad determinada. Se aplica en diversas situaciones: limites de confianza de una determinacion individual, de una media de resultados, de una variancia, de una recta de regresion, etc.14 Qwesair Limite de cuantificacion (Limit of quantification). Minima cantidad de analito que puede determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y precision. Limite de deteccion (Limit of detection). Minima cantidad de analito que puede ser detectado aunque no necesariamente cuantificado con precisién y exactitud. Linealidad (Linearity). Capacidad del método Para proporcionar resultados que son directamente (0 por medio de transformaciones matematicas) proporcionales a la concentracién del analito en la muestra dentro de un rango establecido Marcador de calidad. En el analisis de ciertas plantas medicinales y con el objeto de definir unas especificaciones de calidad se determinan analitos presentes en la planta (marcadores de calidad) que no son los causantes de la actividad terapéutica. Media aritmética (Mean, average). Valor de centralizacion de una muestra o poblacion. Equivale a la suma de todas las observaciones dividida Por el numero de las mismas. Método analitico o ensayo (Analitycal procedure, analitycal method, test Procedure). Procedimiento que explica detalladamente todas las operaciones necesarias para efectuar un analisis concreto. Método bioanalitico (Bioanalitycal method). Método destinado a la determinacion de analitos presentes en matrices biolégicas, normalmente Sangre, plasma, suero u orina. Método de referencia (Referece method). Método validado del que se sabe que resulta adecuado para efectuar un cierto tipo de andlisis. Método indicativo de estabilidad (Stability indicating method). Método altamente selectivo en el que la presencia de impurezas y productos de degradaci6n influye en los resultados obtenidos. Muestra (Sample). Producto resultante de una operacion de muestreo. El muestreo debe ser representativo y con un determinado caracter aleatorio si bien, en algunos tipos de analisis y en aplicacion de Ia filosofia del peor caso, se propician muestreos sesgados. Muestra de control de calidad (en bioanilisis), (Quality control Sample). Muestra de matriz biolégica con una concentracién conocida de uno o varios analitos que se utiliza para comprobar la precision y exactitud del Método asi como la estabilidad de los analitos. No se utiliza para la determinacién de ta curva de calibrado. Muestra de patrén de calibrado (en bioandlisis), (Calibration standard Sample); Muesta de matriz biologica con una concentracién conocida de uno o varios analitos. Se utiliza exclusivamente para la determinacién de la curva de calibrado. Muestra real, analitica o problema (en bioandlisis), {Analitycai sample, real sample). Muestra biolégica Susceptible de ser analizada. No se refiere a muestras de patron de calibrado 0 a muestras de céntrol de calidad preparadas con blancos de una matriz biolégica. Ponderacion, modelos de regresion ponderada (Weighting method). Se aplica para corregir la heteroscedasticidad 0 falta de homogeneidad de variancias en las respuestas de los distintos niveles de una curva de calibracion. Se emplea en Bioandlisis al ser muy amplio el rango de concentraciones. Dado que en la regresion por minimos cuadrados las diferencias entre los valores experimentales y los valores calculados suelen ser mucho mayores en los valores altos de concentracion, la ponderacién equilibra el peso de las distintas concentraciones de ia curva de calibrado. Los factores de ponderacién mas utilizados son 1/Concentracion y 1/Concentracién al cuadrado.Glosario 15 Precision (Precision). Capacidad de un método Para proporcionar resultados proximos entre si. Grado de, dispersion de los resultadas analiticos respecto a su valor medio. Se puede estudiar a tres niveles: Repetibilidad. Evalua la precision del método efectuando una serie de analisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones Operativas (aparatos, reactivos, analista) en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto. Precision intermedia: Evalua la precision del método frente a variaciones internas dei laboratorio (analista, dia, instrumento, etc.). Es la precision intralaboratorio. Reproducil lidad: Evalua la precision entre laboratorios diferentes. Recta de regresion (Recta de calibracion, Curva de calibracién). (Regresion line, Calibration line, Calibration curve). Relacion entre las respuestas instrumentales que Produce un analito y las concentraciones del mismo. Siempre que sea posible se buscara una respuesta de tipo lineal. Cuando no lo sea se podran efectuar transformaciones matematicas para “rectificar” la curva de calibracion o bien se ajustara a funciones mas complejas. Cuando el rango de trabajo sea muy amplio' se pueden utilizar factores de ponderacién. Recuperacién (Recovery). Se define como eficacia en el rescate del analito de la matriz de la muestra. Es un parametro que se debe estudiar durante el desarrollo del método analitico. La recuperaci6n ideal es del 100%. Recuperaciones mayores indican interferencias debidas a la matriz o errores determinados que deben eliminarse; recuperaciones menores indican pérdidas de analito durante las fases de preparacion de la muestra. Cuando la recuperacion no es satisfactoria pero es reproducible cabe la posibilidad de utilizar el método analitico empleando un factor de correccién que compense las pérdidas de analito. De esta forma no se ve afectada la exactitud. Es el caso por ejemplo de métodos analiticos para validar la limpieza de equipos. Lo mas habitual, sin embargo, es que el Propio método analitico incorpore mecanismos que eliminen el error de recuperacion, por ejemplo rectas de calibracion realizadas con la matriz, métodos de adicién de estandar o métodos con estandar internd. Relacion sefial-ruido. Ruido de fondo (Signal to noise ratio, background noise). En sistemas instrumentales es la sefial residual o linea de base registrada con concentracién cero de analito. Es decir, es la sefal ruido que proporciona un blanco o placebo. Matematicamente suele expresarse como la desviacion estandar de la respuesta de un cierto numero de blancos. Réplicas y repeticiones. En la presente monografia se entiende como “réplicas” o teplicados a los andlisis sucesivos de una muestra en las mismas condiciones utilizando el método analitico completo, ‘desde la Preparaci6n de la muestra hasta la medicién final de analito. Las inyecciones repetidas de la muestra final (duplicado, triplicado) que se realizan para mejorar la precision instrumental no son réplicas, sino repeticiones que dependeran de la precision del sistema instrumental empleado. Residual (Residual). Es la diferencia entre el valor observado experimentalmente y el valor estimado en una recta de regresién o curva de calibracién. Resolucion (Resolution). Medida de la separacion entre' dos picos cromatograficos. El valor de resolucién ideal es aquel que permite la resolucién hasta la linea de base entre los picos de interés. Revalidacion (Revalidation). Repeticion total o parcial de la validacion de un método analitico debido a modificaciones en el Propio método, equipos, muestras a analizar, etc. al objeto de garantizar que los resultados continuan siendo fiables.16 Glosario Robustez (Robustness). Medida de la capacidad de un método analitico Para permanecer inalterado ante pequehas pero deliberadas variaciones en ciertos parametros, Proporcionando idea de su fiabilidad o estabilidad durante su empleo en rutina. No debe confundirse con el término Ruggedness, citado.en la Farmacopea USP que seria asimilable al termino reproducibilidad. Selectividad (Selectivity). Capacidad de un Método analitico para medir y/o identificar simultanea o separadamente los analitos de interés de forma inequivoca sin interferencias de impurezas , productos de degradacion, compuestos relacionados, excipientes u otras Sustancias presentes en la matriz de la muestra. Capacidad del método Para producir una respuesta para el analito de interés distinguible de todas las otras respuestas de los demas componentes de una mezcla potencialmente compleja. : La especificidad se utiliza como sinénimo de la selectividad aunque deberia reservarse para aquellas situaciones donde la respuesta obtenida sdlo se puede Producir con una tnica entidad quimica. Sensibilidad (Sensitivity). Capacidad. de un método analitico para detectar pequefas concentraciones de analito. Serie analitica o ensayo de lote de muestras en bioanilisis (Analitycal run, analytical batch): conjunto de muestras formado por al menos una curva de calibracion idéntica a la utilizada en la validacion, muestras de control de calidad y muestras problema procesadas conjuntamente. * Sesgo (Bias). Error sistematico o determinado. (Véase “error” en este glosario). Suma de cuadrados (Mean square). En Estadistica y especialmente en ANOVA, una suma de cuadrados es la suma de los cuadrados de las diferencias entre los componentes de una serie y su media aritmética. La suma de cuadrados dividida Por los correspondientes grados de libertad da el valor de la media cuadratica 0 variancia. . Test o Prueba de Hipétesis (Hypothesis testing). Prueba que permite decidir con un cierto riesgo de error cual dé las hipotesis (nula o alternativa) es la verdadera. La hipdtesis nula se designa por H, y es la que se debe Probar 0 contrastar. La hipétesis alternativa es la complementaria y se designa por H,. Esta hipotesis no se somete directamente a prueba pero es la mAs verosimil cuando Ia prueba estadistica nos conduce a rechazar la hipotesis nula. ~ . Tests unilaterales y bilaterales (one sided, two sided tests). En los tests bilaterales las diferencias de las muestras a comparar son en ambos sentidos; en los unilaterales en un Solo sentido. Asi en una prueba bilateral Para comparar dos desviaciones estandar (2 colas): Hipétesis nula H,: 0; = 62 Hipotesis alternativa Hi: 61 # a2 En una prueba unilateral (1 cola a la derecha 0 la izquierda): Hipotesis nula Ho: 0; < 62 Hipotesis alternativa o, > 62 Transferencia de un método analitico. Proceso de demostracion y verificacion dentro de un laboratorio que un método previamente validado en otro ambito conduce a resultados fiables.Glosario 17 Validaci6n (Validation). Establecimento de la evidencia documental que un procedimiento analitico conducira con un alto grado de seguridad a la obtencién de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos. Obtencion de pruebas documentadas de que un método analitico es lo suficientemente fiable como para producir el resultado previsto dentro de los intervalos definidos. Valor estimado en una recta de regresion (Expected value). En una recta de regresion de ecuacion y= bx + a, son los valores estimados de la variable dependiente (¥) obtenidos al aplicar dicha ecuacion sobre los valores tedricos x, Valor recalculado en una curva de calibracion (Back calculated values). En una recta de regresién de ecuacion y= bx + a, son los valores estimados de la variable independiente (+) obtenidos al aplicar dicha ecuacion sobre los puntos experimentales y,. Es decir, son los resultados de las concentraciones de los patrones recalculados utilizando la propia ecuacion de la curva de calibracion: Valor verdadero asignado (Assigned Value). En la determinacién'de la exactitud es el valor que se asigna ala muestra de concentracion conocida, es decir, el valor de concentracién que se acepta como verdadero en dicha muestra Variancia (Variance). Cuadrado de la desviacion estandar. : Liv-xP _n¥\?-E 2) n-] n(n=1)GENERALIDADES1. INDICE: PARTE | Generalidades GENERALIDADES... 1.1 Validacion de métodos analiticos.. 23 1.1.1 Definicion ... eee 23 -1.1.1 Definicion general 23 1.1.2 Definicion analitica : +23 -1.1.3 Otros terminos relacionados con la validacion . 23 2 _Razones que justifican la validacion de métodos analiticos -1.2.1 Métodos susceptibles de ser validados.. 3 Entorno legal... -1.3.1 Requerimientos para el FEGISHIO Lecce cece 13.2 Normas de Correcta Fabricacion de Medicamentos 1.1.3.3 Farmacopeas..... ae -2 _ Organizacion: buenas practicas de laboratorio. 1.2.1 Organizacion y personal ‘i 1.2.2 Instalaciones . = . : es 1.2.3 Cuidado, alojamiento y confinamiento de los elementos utilizados en los sistemas experimentales bioldgicos .......... 1.2.4 Aparatos, reactivos, material y especimenes. 1.2.4.1. Aparatos .. 1.2.4.2. Reactivos. 1.2.4.3 Material y especimenes. 1.2.5 Sistemas experimentale: 1.2.6 Productos de referencia y muestras de ensayo 1.2.7 Documentacién. Procedimientos escritos .. 1.2.8 Archivo de documentos.............. 1.2.9 Verificacion de los resultados... 1.2.10 Autoinspeccién .. oe ee 1.3 Fases en el desarrollo de un método analitico y criterios de validacion 1.3.1 Definicién de las caracteristicas de practicabilidad .... i 1.3.2 Estudios de estabilidad de la muestra preparada para andlisis . 1.3.3 Puesta a punto. Caracteristicas de idoneidad. 1.3.4 Caracteristicas de fiabilidad . 1.4 Documentacion de la validacion 1.4.1 Protocolo de validacién. 1.4.2 Realizacion de la validacion y evaluacion de los resultados. 1.4.3 Informe de validacién... 1.4.4 Certificado de validacién 1.4.5 Archivo 1.5 RevalidacionGeneralidades 23 1. GENERALIDADES Este capitulo de introduccion general ha sido redactado basicamente desde el punto de vista del analisis de materias Primas y de especialidades farmacéuticas. Por este motivo, muchos 1.1 Validacién de métodos analiticos 1.1.1 Definicién El término validacion ha sido definido en la literatura, de diversas maneras y por numerosos autores. Aunque los términos dados son diferentes el significado de las mismas es siempre el mismo: a) especificar e implementar, b) aprobar y c) documentar. Veamos dos de las posibles definiciones de validacién: 1.1.1.1 Defi i6n general Seguin las Normas de Correcta Fabricacion (edicion 99): Validacion: Obtencién de pruebas Con arreglo a las Normas de Correcta Fabricacion, de que cualquier procedi iento, proceso, equipo, material, actividad © sistema produce en realidad el resultado previsto. 1.1.1.2 Definicién analitica Validacion: Es el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento analitico conducira, con un alto grado de seguridad, a la obtencion de resultados precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de calidad Previamente establecidos. 1.1.1.3 Otros términos relacionados con la validacion Cualificacion: £1 término validacién se amplia a veces para incluir el concepto de cualificacién y consiste en la operacién Por la que se comprueba que un equipo funciona correctamente y produce €n realidad los resultados Previstos (NCF, ed. 99). Calibracién: Conjunto de operaciones que determinan, bajo condiciones Previamente definidas, la relacion entre los valores indicados por el sistema de medicion y los valores Conocidos correspondientes a un patron de referencia (NCF, ed. 99). En resumen, los términos “validacién, Cualificacion y calibracién”, son conceptos que suelen emplearse de forma indistinta, sin embargo conceptualmente son diferentes. Validar es verificar documentalmente que un método o proceso hace jo que tiene que hacer.« Generandtades Cualificar es dotar o verificar las cualidades o caracteristicas inherentes a un aparato (maquina. equipo, instrumento, etc.). Calibracion es una Parte de la cualificacion, Esta monografia se cifie, exclusivamente, a la validacion prospectiva de métodos analiticos, ya que |a validacion fetrospectiva (realizada en base al histérico obtenido a partir de un determinado Procedimiento) no se recomienda en ningun caso. ‘4.1.2 Razones que justifican la validacion de métodos analiticos * Demostrar que los métodos son adecuados a los analisis Propuestos en las condiciones descritas. La validacion es la herramienta que permite obtener las pruebas documentales al respecto. * Trabajar con métodos que ofrezcan confianza y Seguridad en los resultados, lo cual a su vez minimizara el numero de fallos y repeticiones Permitiendo un importante ahorro de costes. calidad y eficacia del producto. * La validacion es también un paso o requisito previo de los procesos de transferencia de métodos analiticos. Para iniciar la validacion es necesario previamente: * Tener perfectamente caracterizado el analito. * Trabajar con una formulacién definitiva (en caso de especialidad), puesto que cambios en la composicién incluso a nivel de excipientes afectaran Probablemente al Procedimiento analitico. 1.1.2.1 Métodos susceptibles de ser validados Son validables los métodos analiticos clasificados en la siguiente forma: + Ensayos de identificacién. * Ensayos para la determinacion del analito de interés de una materia prima o de una especialidad farmacéutica.Gi eee ee eae a Uae eee eee See at eee Generalidades 25 * Ensayos para la determinacion de caracteristicas farmacotécnicas inherentes (Ej. test de disolucién), * Ensayos de limite de impurezas y de cuantificacion de impurezas. * Ensayos para ja determinacion de analitos en fluidos biologicos y en productos naturales. * Ensayos microbiologicos. 1.1.3. Entorno legal 1.1.3.1 Requerimientos Para el registro En el Procedimiento o Registro Multiestado de Productos Farmacéuticos de la Comunidad Econémica Europea, vigente en Esparia desde 1986, se contempla la necesidad en los apartados IIC IIE y IIF de la validacion de los métodos analiticos utilizados. En el mismo documento se indica lo ‘Siguiente réspecto al “Informe de Experto” (parte II) “El experto debe resumir los datos relativos a fa validacion de los métodos de andlisis. Debe comentar la forma en que los controles propuestos garantizan las propiedades quimicas, fisicas y organolépticas”. Ademas la FDA (Food and Drug Administration) requiere para el tegistro de nuevos Productos que los métodos analiticos sean validados y debidamente documentados. .2 Normas de Correcta Fabricacion de Medicamentos Las Normas de Correcta Fabricacian ai: Medicamentos de la CEE en =i capitulo 6 de Control de Calidad indica que los met»: 3 de andlisis deben estar validagos (apartado 6.15). De igual forma las Good Manu: uring Practice de los’ EEUU indican que deben establecerse y documentarse la exacthus, sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de !os métodos analiticos utilizados 1.1.3.3 Farmacopeas Validacion frente a los Métodos Oficiales ylo de Farmacopeas: Se puede diferenciar entre validacion de métodos de ‘andlisis de Principios activos y especialidades farmacéuticas. . los activos de sintesis: Los métodos oficiales o de Farmacopea se consideraran Principi validados siempre y cuando se apliquen a Principios activos con la misma ruta de redactada la Monografia. * Especialidades: No es recomendable considerar ningun metodo oficial o de Farmacopea totalmente validado Para una especialidad, Puesto que dificilmente tendra los mismos componentes ni la misma Proporcion. No obstante Puedeh emplearse como punto de partida métodos desarrollados para especialidades tipo, como pueden ser los de la Farmacopea Europea (EP), Farmacopea26 Generalidades 1 Americana (USP) o Farmacopea Britanica (BP), que permitiran obviar una gran Parte del desarrollo analitico. En la USP 24 (USP 24, 2000) aparece, en la seccion de Informacion General, en el Apartado | Validation of Compendial Methods” pag. 2149-2152, que es de aplicacién para métodos analiticos nuevos o revisados. 1.2 Organizacion: buenas practicas de laboratorio Para validar un Método analitico se requiere en primer lugar un entorno de trabajo que garantice la seguridad de los resultados que se obtengan. La consecucién de esta garantia de calidad requiere trabajar de acuerdo con unas pautas correctas. mayo y el 2043/1994 del 14 de octubre, y anexos a dichos Reales Decretos. Las dreas de trabajo bajo normas BPL. son: a) Organizacion y personal del laboratorio b) Instalaciones C) Cuidado, alojamiento y confinamiento de los elementos utilizados en los sistemas experimentales biolégicos d) Aparatos, materiales, reactivos y especimenes e) Sistemas experimentales f) Productos de referencia y muestras de ensayo 9g) Documentacion h) Archivos: almacenamiento y conservacidn de registros i) Verificacién de estudios i) Inspecciones 728 Generalidades detalle las instrucciones de funcionamiento, los métodos, materiales y programas a realizar en los aparatos. También se indicara la persona responsable de cada operaci6n. Debe mantenerse un registro de las diferentes Operaciones que se realicen en el equipo o instrumento, ya sean de funcionamiento, mantenimiento, limpieza, calibracién ° Cualificacion. Estos registros es recomendable archivarlos durante un periodo de tiempo no inferior a 5 afios. Los diversos PNT’s, los registros de comprobacién y una copia del manual de instrucciones deben estar localizables a disposicién del analista. 1.2.4.2. Reactivos Los reactivos quimicos deben ser Preparados por personas cualificadas y segun Procedimientos descritos en las Farmacopeas u otros Procedimientos aprobados. En la etiqueta de los reactivos es conveniente hacer constar: * origen * identificacion de ta sustancia * concentracion : * condiciones de conservacion * fecha de preparacién * seguridad * fecha de caducidad * analista Deben guardarse registros (libreta de laboratorio) de cada preparacion y procesos de estandarizacion. El agua es el disolvente mas utilizado tanto en la Preparacion de reactivos como en los analisis, por lo que debe controlarse adecuadamente mediante andlisis fisico-quimicos y microbiolégicos. 1.2.4.3. Material y especimenes El material de vidrio interviene en la mayoria de los andlisis y se tiende erroneamente a dar por supuesta su idoneidad. Esto Puede extenderse a materiales de Porcelana, cuarzo, plastico y metalicos. Los errores a causa de estos materiales pueden ser debidos a: * Suciedad o contaminacion: tras su limpieza' hay que considerar la posibilidad de que queden residuos contaminantes de utilizaciones anteriores y/o detergentes. En algunos casos se requiere la utilizacién adicional de disolventes organicos o mezcla cromica. Se recomienda un aclarado final con agua purificada y/o alcohol. * Defectos del material: la exactitud del material volumétrico (buretas, pipetas y matraces aforados) tiene una gran influencia en el resultado de los analisis. Por tanto, debe calibrarse y contrastarse a su recepci6n y periédicamente, desechando el que no cumpla las especificacionesGeneralidades 27 Accontinuacion se comentan algunos de estos aspectos. 1.2.1. Organizacion y personal Es uno de los factores mas importantes a la hora de asegurar ia calidad del andlisis. El laboratorio debe disponer de suficiente personal técnico, bien organizado y dirigido para que puedan efectuarse los estudios en un tiempo razonable y sin sobresaltos, de manera que existan las condiciones apropiadas Para poder efectuar las tareas de preparacién, formacion, supervision, calibracian, validacion, etc.; actividades en suma que podrian denominarse de “prevencién de errores". Una de las causas mas importantes de obtencion de resultados erréneos es el apresuramiento,, para evitarlo es necesario establecer una planificacion de los controles y analisis que se han de realizar. ' El personal debe poseer unos conocimientos y una preparacion adecuados al tipo de estudios que vayan a realizar, asi como experiencia en las técnicas a emplear, de lo contrario debera recibir la adecuada formacion. 1.2.2 Instalaciones Las instalaciones del taboratorio, tanto interiores como exteriores, deben reunir las condiciones idéneas en cuanto a dimensiones, construccion, disefio y ubicacion para poder realizar los estudios de forma correcta ' Por ejemplo, su disefio debe permitir la correcta disposicion entre las sustancias quimicas o bioldgicas existentes y el flujo de los materiales para que no puedan confundirse. Deben existir procedimientos de control y supervision de las condiciones ambientales en las zonas criticas, como pueden ser los estabularios. 1.2.3 Cuidado, alojamiento y confinamiento de los elementos utilizados en los sistemas experimentales biolégicos Si el laboratorio realiza estudios con animales u otros sistemas biolégicos (sistemas microbianos, sistemas celulares o subcelulares), debe disponer de medios adecuados para el cuidado, alojamiento y confinamiento de los mismos, para evitar problemas que puedan afectar al experimento y como consecuencia, a la calidad de los datos. 1.2.4 Aparatos, reactivos, material y especimenes 1.2.4.1 Aparatos El laboratorio debe disponer de instrumentos en cantidad suficiente y de capacidad adecuada para responder a las exigencias de los ensayos que se realizan. Se deben mantener limpios y en buen funcionamiento Para obtener resultados fiables. Con este fin se realizaran las comprobaciones, calibraciones y Cualificaciones de los equipos e instrumentos de medici6n (incluidos los sistemas informaticos). La cualificacion Tequiere que los equipos sean instalados correctamente e inspeccionados, limpiados, conservados, comprobados y calibrados Periddicamente, segtin procedimientos escritos. Estos Procedimientos Normalizados de Trabajo (PNT) describiran con suficiente28 Generalidades detalle las instrucciones de funcionamiento, los métodos, materiales y programas a realizar en los aparatos. También se indicara la persona fresponsable de cada operacién. Debe mantenerse un registro de las diferentes operaciones que se realicen en el equipo o instrumento, ya sean de funcionamiento, mantenimiento, limpieza, calibracién ° Cualificacion. Estos fegistros es recomendable archivarlos durante un periodo de tiempo no inferior a 5 afios Los diversos PNT’s, los tegistros de comprobacién y una copia del manual de instrucciones deben estar localizables a disposicion del analista. 1.2.4.2 Reactivos Los reactivos quimicos deben ser preparados por personas cualificadas y segun Procedimientos descritos en las Farmacopeas u otros Procedimientos aprobados. En la etiqueta de los reactivos es conveniente hacer constar: * origen * identificacion de ta sustancia * ~concentracién . * condiciones de conservacion * fecha de preparacién * seguridad * fecha de caducidad * analista Deben guardarse registros (libreta de laboratorio) de cada Preparacién y procesos de estandarizacion. El agua es el disolvente mas utilizado tanto en la preparacion de reactivos como en los analisis, por lo que debe controlarse adecuadamente mediante andlisis fisico-quimicos y microbiolégicos. 1.2.4.3 Material y especimenes El material de vidrio interviene en la mayoria de los analisis y se tiende erroneamente a dar por supuesta su idoneidad. Esto puede extenderse a materiales de porcelana, cuarzo, plastico y metalicos. Los errores a causa de estos materiales pueden ser debidos a * Suciedad 0 contaminaci6n: tras su limpieza' hay que considerar la posibilidad de que queden residuos contaminantes de utilizaciones anteriores y/o detergentes. En algunos casos se requiere la utilizacién adicional de disolventes organicos o mezcla cromica. Se frecomienda un aclarado final con agua purificada y/o alcohol. * Defectos del material: la exactitud del material volumétrico (buretas, pipetas y matraces aforados) tiene una gran influencia en el resultado de los analisis. Por tanto, debe calibrarse y contrastarse a su recepcion y periodicamente, desechando el que no cumpla las especificaciones.Generalidades 29 En el analisis de concéntraciones muy bajas de analito (por ejemplo en bioanilisis, validaciones de limpieza y validaciones de impurezas) es recomendable el uso de material desechable. Los especimenes se identificaran Por sistema experimental, estudio, naturaleza y fecha de muestra. 1.2.5 Sistemas experimentales Son estudios realizados en el laboratorio a partir de sistemas quimicos y fisicos, celulares, microbianos y vegetales o animales. : * Sistemas fisicos y quimicos: la instrumentacion empleada para la obtencion de datos deben estar correctamente situada, disefiada y dimensionada. Se podran utilizar sustancias de referencia Para verificar estos sistemas experimentales. En los sistemas automatizados, los datos generadés se trataran como datos primarios y se archivaran, * Sistemas biolégicos: Para asegurar la calidad de los datos que nos proporcionen estos sistemas, se crearan y mantendran unas condiciones apropiadas de alojamiento registros de los examenes, medidas de Cuarentena, morbilidad, mortalidad, comportamiento, diagnéstico y tratamiento de los sistemas experimentales. Se realizara también una adecuada eliminacion de residuos y desechos al finalizar los ensayos. 1.2.6 Productos de referencia y muestras de ensayo Todos ellos deben Presentar protocolos de Preparacion, manipulacién y almacenaje. Ademas se ha de registrar una serie de datos como son la recepcién, la toma de muestras, la utilizacion y el almacenamiento. Se etiquetaran debidamente y Se llevara un registro sobre su identidad, Pureza, composicién, estabilidad, trazabilidad, asi como de posibles impurezas. Se puede encontrar diferentes tipos de productos de referencia y de ensayo: » * Procedentes de proveedores externos. * Patrones de referencia Primarios originales (USP, EP, etc.) * Patrones de referencia secundarios de trabajo (working standards) * Mezclas o diluciones que Se preparan en el laboratorio Las muestras de ensayo deben ser representativas y obtenidas segun procedimientos de muestreo escritos Y aprobados, que deberan incluir los agrupamientos y tratamientos Previos al andlisis. La identificacién debe ser clara e indeleble con indicacién det nombre o descripcion, lote, fecha, numero de envase al que corresponde, etc.30 Generalidades 1.2.7. Documentacion. Procedimientos escritos Los documentos, prdcedimientos y especificaciones escritas constituyen un elemento indispensable para el correcto funcionamiento del laboratorio, debiendo existir: ¢ Los PNT que recojan las instrucciones necesarias para el trabajo de laboratorio: * Procedimientos generales (toma de muestras y su tratamiento, limpieza, seguridad e higiene, verificacion de resultados de autoinspecci6n, circuitos de documentacion, validacién de procedimientos, etc.) * Procedimientos para funcionamiento, calibracién y mantenimiento de aparatos. * Métodos de analisis y especificaciones: En ellos se incluyen ios métodos de control de materias primas, materiales de acondicionamiento, controles en, proceso, productos intermedios y acabados. Por ejemplo, en un laboratorio de control de calidad, estos procedimientos constan de una serie de ensayos analiticos habitualmente clasificados en tres grupos principales; ensayos de identificacién, ensayos de pureza y ensayos de determinacién cuantitativa. Cada uno de estos ensayos analiticos comprende una serie de apartados: Objetivo Material y reactivos Sustancias de referencia Instrumentacién Procedimiento detallado de su realizacién, incluyendo preparacién de ta muestra, condiciones instrumentales y numero de repeticiones Verificacién de idoneidad de las condiciones operatorias definidas * Formulas para el calculo de resultados y su tratamiento estadistico si es necesario * Bibliografia y referencias « Libretas de laboratorio u hojas de trabajo: Son los documentos que recogen los datos primarios obtenidos durante el desarrollo de un método analitico. En la practica, estos documentos permiten auditar la ejecucion y trazabilidad del analisis. 2 * Registros de resultados: La mayoria de los instrumentos proporcionan un registro impreso: balanzas, espectofotometros, cromatégrafos, etc. Estos deben conservarse anexos a las libretas de laboratorio u hojas de trabajo. * Seguimiento de resultados: Para los analisis de rutina conviene efectuar tabulaciones de resultados por producto, de manera que sea posible la revisién a lo largo del tiempo y la deteccién de tendencias. Herramientas informaticas actuates como los LIMS (Laboratory Information Management System) facilitan la ejecucion de esta tarea. i {: Generalidades 31 Informe final: ' En el caso de estudios Se elaborara un informe final donde se recogeran los datos Primarios, graficas. tablas, etc. En el caso de controles de rutina se recogeran los informacion. * Identificacion de las muestras + Referencia del método de analisis * Especificaciones con Sus limites de aceptacion * Resultados obtenidos * Conclusiones * Fecha de inicio y final de los analisis y firma de los analistas y del supervisor que han intervenido en su realizacién : 1.2.8 Archivo de documentos - Debe proporcionarnos una disponibilidad inmediata de la documentacién de uso diario en un plazo razonable de tiempo. Sdlo podra acceder a éste personal autorizado. El sistema de archivo debe permitir conservar durante el tiempo establecido la documentacién analitica 1.2.9 Verificacion de los resultados sobre la muestra, su registro y su inclusién en el boletin de andlisis. E| supervisor debe Cuando se utilicen sistemas informaticos deben validarse para garantizar su seguridad frente a errores de funcionamiento o manipulacién. Tambien deben considerarse aspectos de confidencialidad. 1.2.10 Autoinspeccion Un programa de autoinspecciones o auditorias internas con personal de la propia seccion de trabajo o seccion afines, conduce a una critica abierta y constructiva sobre todas las actividades del laboratorio, con consecuencias positivas a todos los niveles puesto que: * Responsabiliza y motiva a todo ef Personal en Ia filosofia de las BPL. « Ayudaa seguir los procedimientos correctamente. ae * Propone una serie de cambios o mejoras en la calidad del trabajo realizado, siendo un instrumento importante para actualizar procedimientos y estimular la innovacion, 1.3 Fases enel desarrollo de un método analitico y criterios de validacion No existe una guia oficial que indique la optima secuencia de experimentos analiticos necesarios para ef desarrollo de un Método, ya que esto depende del Método en si mismo No obstante, el desarrollo lagico de un Método analitico transcurre en diferentes fases.dé Generalidades 1.3.1 Definicion de las caracteristicas de practicabilidad Han de evaluarse los parametros de Practicabilidad del método analitico: precision exigible, Sensibilidad deseable, grado de selectividad, tiempo, coste, tamafio de la muestra, Cualificacion del personal, tipo de equipo e instrumentacion, condiciones de seguridad. etc. 1.3.2 Estudios de estabilidad de la muestra preparada Para anilisis La estabilidad de la muestra Preparada para analizar se evalua durante la fase de desarrollo del método junto con la robustez. La forma de evaluacion de este parametro, por ejemplo. ‘en métodos cromatograficos, Consistiria en realizar inyecciones replicadas de una misma muestra a lo largo del tiempo que se considere necesario. En caso de que la estabilidad de la muestra pueda afectar al resultado en el periodo’ de tiempo evaluado, se ha de hacer constar en el método de aniiisis. 1.3.3 Puesta a punto. Caracteristicas de idoneidad La puesta a punto del método analitico, incluye desde los Primeros estudios de tanteo con patrones, hasta la utilizacién del método en muestras reales que garanticen el buen funcionamiento del sistema en el momento del analisis. El estudio de robustez se utiliza para optimizar y ver la criticidad del valor de los parametros del método antes de validar. A partir de este estudio se definiran las caracteristicas de La comprobacién de Ia idoneidad forma Parte integral del método, y debe realizarse cada dia al inicio del analisis (dependiendo de la duracién de €ste, sera conveniente realizarlo a intervalos de tiempo), para comprobar el Correcto funcionamiento del sistema. Los requerimientos y parametros a evaluar en un ensayo de idoneidad dependeran del tipo de método. vas : 1.3.4 Caracteristicas de fiabilidad Esta ultima etapa permitira conocer las caracteristicas de fiabilidad del método para su aplicacion rutinaria. Dichas caracteristicas son las que demuestran la capacidad de un método analitico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de validacion., Generalidades 33 Las caracteristicas de fiabilidad comprenden ios cinco criterios fundamentales de validacion, (no necesariamente aplicables en todos los casos) y de los que derivan en la practica todos los parametros de validacion: a) La capacidad de un método para determinar el analito sin interferencias de impurezas, productos de degradacion, excipientes u otras sustancias presentes en la muestra, se telaciona con el término selectividad. Selectividad: capacidad de un método analitico para medir y/o identificar simultanea o separadamente los analitos de interés, de forma inequivoca, en presencia de otras sustancias quimicas que puedan estar presentes en la muestra. = La proporcionalidad entre concentracién del analito y respuesta del instrumento. Este concepto se relaciona con los términos linealidad y rango. : Linealidad: se define como la capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente (o: por medio de transformaciones matematicas) proporcionales a la concentracién del analito en la muestra dentro de un tango establecido. Rango: se define como el intervalo entre la concentracion superior e inferior para las cuales se ha demostrado la correcta precision, exactitud y linealidad del método. a) La dispersion de una serie de resultados alrededor del valor medio o central, es decir, el “mas-menos” de un procedimiento analitico se relaciona con el término precision. Precision: Es la capacidad de un método para proporcionar resultados préximos entre si. Se puede estudiar a tres niveles: Repetibilidad: Evalua la precisién del método (precision intraensayo). Precision intermedia: Evalua la precision frente a variaciones de analista, equipo y dia (precision intralaboratorio o precisién interensayo). . Reproducibilidad: Evalua la precision entre laboratorios (precision interlaboratorios), d La diferencia entre el valor hallado en el analisis y e! valor verdadero. Concepto telacionado con el término exactitud. Exactitud: expresa la proximidad entre e| valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o valor de referencia y el valor experimentalmente encontrado. e La cantidad minima de analito requerida para obtener un resultado significativo esta relacionada con los términos limite de deteccién y limite de cuantificacion. Limite de cuantificacién: se define como la minima cantidad de analito que puede determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y precision. Este parametro. tiene sentido y especial interés en la determinacion de concentraciones bajas de analito. Limite de deteccion: se define como la minima Cantidad de analito en una muestra que puede ser detectado aunque no necesariamente cuantificado con precision y exactitud. El hecho de que sea necesario evaluar unos u otros parametros dependera basicamente del tipo de ensayo, pudiendo fesumirse en la siguiente tabla recomendada en la guia ICH Q2A:34 Generalidades Tabla 1. Datos requeridos Para la validacién de métodos analiticos. Impurezas Valoracion: Parametros Identificacion - + Disolucién _ ie : - Contenido Cuantitativo Test limite Exactitud No: Si No Si Precisio _ - j Repetibilidad No Si No Si Precision intermedia__ No si” No! si) Selectividad 7 ie Sie ee sie Si Limite detecci6n No. a a Si No Limite cuantificacion No Si No No. Linealidad _No esl No fT Si Rango No Si No FT Si Notas: (1) En los casos en los que se realiza la reproducibllidad no es necesario realizar la precision intermedia, (2) La falta de selectividad de un procedimiento analitico Puede ser compensada por otros procedimientos (3) Puede ser necesario en algunos casos. (4) Puede ser requerido segun el método de acuerdo a USP 24 (6) USP 24 sélo considera el estudio de la precision en los ensayos de comprobacién de caracteristicas (tes! de disolucion), Los otros parémetros pueden ser requeridos 1.4 Documentacién de Ia validacién Toda validacién comienza a partir de un método ya Probado y ajustado. La validacion trata de demostrar con un numero minimo de ensayos, que tanto el método de analisis como su sistema analitico asociado Pproduciran resultados adécuados a las exigencias Preestablecidas. Dicha demostracién debe ser siempre documentada de acuerdo al siguiente esquema: : PROTOCOLO DE VALIDACION REALIZACION DE VALIDACION EVALUACION DE RESULTADOS ANALITICOS INFORME DE VALIDACION CERTIFICADO DE VALIDACIONGeneralidades 35 1.4.1. Protocolo de validacion Se trata de un documento que ha de recoger el objetivo, la definicién del sistema a validar, la identificacion de los parametros, el disefio del plan experimental y los criterios de aceptacion. Debe ser especifico para cada producto y método, debiendo ir firmado y fechado por las personas responsables de la validacién y aprobacion. El esquema de un protocolo de validacion puede incluir los puntos siguientes: Objetivo: Exposicién de Ia finalidad de fa validacion y propuesta de fechas de inicio y final. Responsables : Relacion de las Personas que llevaran a cabo la validacion y de las que la aprobaran. Parametros a estudiar: Los parametros a estudiar se seleccionan en funcion de las caracteristicas de la muestra, tipo de método analitico y tango de concentracion del analito. Muestras: El muestreo se realizara de acuerdo con procedimientos escritos, en los cuales se indicaran los sistemas de identificacion y tratamiento previo de las muestras. Si se Precisan Placebos, también existiran procedimientos del método de preparacion. Equipos: Se han de identificar los equipos implicados en el proceso de validacion (pH- metros, balanzas, cromatégrafos, etc.), y comprobar que estan convenientemente cualificados, referenciando estos datos en el informe de validacién. ot Métodos analiticos: Existiran métodos escritos describiendo el procedimiento para la determinacion de los parametros a evaluar, con indicacion de reactivos, patrones, materiales, técnica y calculos. Criterios de_aceptacion: Se estableceran a priori Para cada uno de los parametros, basandose en las necesidades 0 finalidad del método y en la informacién recogida durante la fase de desarrollo del procedimiento analitico. 1.4.2. Realizacion de la validacion y evaluacion de los resultados Todos los datos primarios deben ser perfectamente auditables. Una vez realizada la parte experimental de la validacién, se evaluaran los resultados obtenidos. Si durante la ejecucion del protocolo se produce alguna modificacion se afadira ‘como un anexo al mismo explicando el cambio introducido respecto al original y la razon que lo justifica: 1.4.3 Informe de validacion Los informes de validacion deberan incluir: a) Referencia al protocolo en el cual se describe el procedimiento para la determinacién de cada uno de los parametros a evaluar. b) Resultados de las determinaciones de cada parametro incluyendo todos los datos primarios.36 Generaidades c) Referencias de la Calibracién y cualificacion de los instrumentos utilizados y resultados de la verificacion de los Parametros de idoneidad antes de iniciar el estudio de validacién. d) Discusién de los resultados y conclusiones. Se indicaraé la aceptacién o no de la validacién de! método analitico. También se Puede aceptar un método analitico con limitaciones para un tipo de muestras concreto. 1.4.4 Certificado de validacién El certificado de validacién 0 documento formal de aprobacion que emite el laboratorio con los resultados obtenidos Para cada pardmetro, debe ser firmado por las personas responsables. Este certificado Puede ser independiente, incluyendo un resumen del Protocolo de validacion y de los resultados obtenidos, o bien anexarse al final del informe. 1.4.5 Archivo Los documentos referentes ‘a la validacion se archivaran adecuadamente durante todo el tiempo de vida del Producto. . 1.5 Revalidacién La revalidacion de un método analitico consiste en repetir de forma total o Parcial su validacion, ya sea debido a modificaciones en e! Método, equipos, en la muestra a analizar, etc., para garantizar la obtencion de resultados fiablesVALIDACION DE METODOS DE ANALISIS EN MATERIAS PRIMAS Y ESPECIALIDADES FARMACEUTICASINDICE: PARTE Il ae TARIE Validacion de métodos de analisis en materias primas y especialidades farmacéuticas 1, INTRODUCCION 2. SELECTIVIDAD 2.1 Definicion.... 2.2 Ambito de aplicaci 2.2.1. Seguin objetivo del ensayo 2.2.1.1 Identificacign....... 2.2.1.2 Ensayos de Pureza. 2.2.1.3. Determinacion cuantitativa de un cho 2.2.2 Segun la técnica analitica aplicada 2.2.2.1 Ensayos especificos.. 2.2.2.2 Ensayos absolutos . 2.2.2.3 Ensayos separativos .... 2.3 Procedimientos de determinacion de la selectividad 2.3.1 Por adicion de las interferencias ....... — 2.3.2 Aplicacién de técnicas confirmatorias con muestras sometidas a estrés. 2.4 Comentarios y conclusiones......... ee compuesto o riqueza de un Principio 3. LINEALIDAD Y RANGO. 3.1 Definicion... 3.2 Ambito de aplicaci6n 3.2.1 Valoracién del contenido de principio activo 3.2.2 Uniformidad de contenido 3.2.3 Disolucién de principio activo. 3.2.4 Cuantificacion de impurezas 3.3 Procedimientos de determinaci6n de ia linealidad. 3.3.1 Consideraciones generales.... 3.3.2 _ Evaluaci6n estadistica de la linealidad 3.3.2.1 Ecuacién de la recta. Pendiente y ordenada en el origen. 3.3.2.2 Coeficiente de Correlacién (r) y coeficiente de determinacion (r?) 3.3.2.3 Variancia residual constante (homoscedasti dad)... 3.3.2.4 Analisis de la Variancia: ANOVA ... 3.3.2.5 Test de linealidad .. 3.3.2.6 Test de Proporcionalidar 3.4 Ejemplo... 3.5 Comentarios y conclusiones 4. PRECISION. 4.1 Definiciones 4.2 Ambito de aplicacion 4.3 Repetibilidad........... i 4.3.1 Repetibilidad del sistema instrumental . 4.3.2 Repetibilidad de! método... 4.4 Precision intermedia. 4.5 Reproducibilidad oe 4.6 Comentarios y conclusiones.5. EXACTITUD........ 5.1 Definicion y generalidades. 5.2 Ambito de aplicacion 5.3 Procedimientos de determinacion de la exactitud 5.3.1 Riqueza de un principio activo........ = 5.3.1.1 Aplicacién del método analitico a una muestra de riqueza conocida 5.3.1.2 Comparacion con un método de referencia validado........... 5.3.2 Determinacién cuantitativa de un analito en un Producto acabado . 5.3.2.1 Aplicacion del método anali ico a una muestra de concentracion conocida ........ aren 5.3.2.2 Comparacién con un Método de referencia validado 5.3.3 Determinaci6n cuantitativa de impurezas 5.4 Criterios de aceptacion.... 5.5 Comentarios y conclusiones 6. LIMITE DE DETECCION Y LIMITE DE CUANTIFICACION 86 6.1 Definicion y generalidades. 6.2 Ambito de aplicacion | 6.3 Procedimientos de determinacion-del LD yLc.. 6.3.1 Método basado en el examen visual ..... 6.3.2 Método basado en la relacion sefal/ruido a 6.3.3 Método basado en la desviacion estandar de la respuesta del blanco y la Pendiente de la recta de calibrado.. Hn 3.1 Métodos instrumentales Que corrigen la sefial frente a un blanco. Métodos instumentales gue no coven ie sehal fems eunsts S34 Mecce casaco en la extrapolacion de fa recta de calibrado a concentracién cero .. eee 6.3.5 Método experimental de calculo para el 6.4 Comentarios y conclusiones LC (Método EURACHEM). 7. ROBUSTEZ.. 7.1 Definici6n 7.2 Ambito de aplicacién . 7.3 Procedimiento de determinacién de la robuste: 7.3.1 Factores y niveles de influencia . 7.3.2 Disefios factoriales fraccionados 7.3.2.1 Disefio factorial completo de o influencia de tres factores..... 7.3.2.2 Disefio factorial fraccionado de influencia de cuatro factores........... 7.3.2.3 Disefios factoriales de Plackett-Burman 7.3.2.4 Disefios factoriales de Youden-Steiner. 7.4 Comentarios y conclusiones.... cho experimentos (2°) para evaluar ta ocho experimentos (2*') para evaluar la 8. IDONEIDAD DEL SISTEMA (SYSTEM SUITABILITY TEST) 8.1 Definicion 8.2 Ambito de aplicacion 8.3 Procedimiento de determina 8.4 Parametros de evaluacién 8.4.1 Precision del test de idoneidad del sistema, 8.4.2 Parametros cromatograficos . 8.4.2.1 Factor de capacidad (k’).. 8.4.2.2 Numero de platos teéricos (N) 8.4.2.3 Factor de asimetria o de cola in de la idoneidad .8.4.2.4 Resolucion = 8.4.3 _Limites de deteccion © Cuantificacion 8.5 Comentarios y Conclusiones............ 9. TRANSFERENCIA DE METODOS ANALITICOS. 9.1 Definicién y generalidades 9.2 Ambito de aplicacién 9.3 Procedimiento .... 9.4 Criterios de aceptacion 9.5 Comentarios y Conclusiones.. 10. METODOs DE FARMACOPE, 10.1 Ambito de aplicacién 10.2 Procedimiento . 119 10.2.1 Materias Primas 119 10.2.2 Especialidades 4 119 10.3 Ajustes en métodos cromatograficos de Farmacopea. 120 10.3.1 Métodos HPLC . eee -120 10.3.2 Métodos GC .. 121 10.3.3 Métodos TLC y cromatografia en pape 124 10.3.4 Métodos en cromatografia de fluidos Supercriticos . 10.4 Comentarios y conclusiones........ 11. REVALIDACION 11.1 Definicion. 11.2 Ambito de aplicacion 11.3. Procedimiento...... 11.4 Comentarios y conclusiones. 12, PLANTAS | MEDICINALES, EXTRACTOS y ESPECIALIDADES FITOTERAPEUTICAS 12.1 Definici6n.. : 12.2. Ambito de aplicacion y caracteristicas de las plantas medicinales. ee 12.3 Particularidades en los estudios de validacion de métodos analiticos de valoracién de analito/s en planta medicinal, considerada como materia prim: 12.4 Revalidacion ... 12.5 Conclusiones y comentarios..Introduccién Materias primas y especialidades 45 1. INTRODUCCION Esta parte de la Monografia desarrolla los cinco parametros fundamentales de una validacién analitica: selectividad, linealidad. y rango, precision, exactitud y limites de deteccién y cuantificacion. Cada uno de ellos comprende un capitulo donde se exponen los principales conceptos tedricos y Se anexan algunos ejemplos ilustrativos en diferentes circunstancias. La robustez es el tema del capitulo siguiente. Es un parametro perteneciente a las fases de prevalidacion y puesta a punto de! método que esta muy conectado con la definicién de ios criterios de idoneidad del sistema. Se dedica un capitulo a la idoneidad del sistema, que debe definirse durante las fases de desarrollo del método y aplicarse rutinariamente cada vez que se utilice puesto que garantiza que el sistema instrumental y el método analitico van a funcionar correctamente en el momento de su uso. ~ La transferencia de métodos analiticos y los métodos de Farmacopea son objeto de sendos capitulos especiales, asi como un capitulo dedicado a la revalidacion. Cierra esta parte de la Monografia un capitulo especifico sobre métodos de anilisis para plantas medicinales cuya validacién presenta algunas particularidades.40 Materias primas y especialidades : Selectividad 2. SELECTIVIDAD 2.1 Definicién Capacidad de un método analitico para medir y/o identificar simultanea o separadamente los analitos de interés, de forma inequivoca, en Presencia de otras sustancias quimicas que Puedan estar presentes en la muestra. Procedimientos analiticos que emplean instrumentacién no especifica. Como existen muy Pocos métodos que den respuesta solo a un unico analito, el término selectividad es La presencia de interferencias puede tener distintos efectos en la determinacién del analito como: ‘ * — tmposibilitar su inequivoca identificaci6n (aparicién de faisos Positivos). * Distorsionar ta respuesta del analito (afectan normalmente a la pendiente y ordenada en el origen de la recta de calibrado). Este efecto Puede delatar la presencia de interferencias desconocidas, aunque también puede ser consecuencia de recuperaciones no {ineales. La selectividad de un método analitico se deberia determinar antes de iniciar el estudio de cualquier otro parametro de validacion, dado que debe Conocerse en qué grado la respuesta del método es Unicamente Proporcionada por el analito, sin interferencia de otras sustancias relacionadas con él'de una u otra forma. 2.2 Ambito de aplicacion En el andlisis farmacéutico la tendencia mayoritaria es la utilizacién de métodos lo mas selectivos posibles, en los que la presencia de otros componentes tienen escasa influencia en los resultados, por ejemplo métodos cromatograficos. No obstante, se pueden utilizar métodos poco especificos (por ejemplo potenciométricos o espectrofotométricos) si existen momento desconocida, que interfiera. También se puede dar el caso contrario, de hallar alguna posible interferencia que en la practica diaria sea improbable que se produzca. Para efectuar estudios de selectividad se precisa la maxima informacién sobre impurezas y Productos de degradacion potencialmente presentes en la muestra, asi como sobre posibles interferencias debidas a excipientes u otros componentes. El estudio de la selectividad es uno de los parémetros de mayor importancia dentro de fa validacién de un método analitico. Atendiendo a criterios tecnicos, se deber4 establecer, en cada caso, hasta que Punto se debe buscar interferencias (con excipientes, impurezas y Productos de degradacion), debido a la imposibilidad de reflejar todas las situaciones y consideraciones posibles.Selectividad Matenas primas y especialidades 47 Los criterios de selectividad que debe satisfacer un método pueden diferir dependiendo de la finalidad con que se aplique. El grado de selectividad asociado a un método adquiere mayor relevancia si su finalidad es evaluar la estabilidad del principio activo o de la forma farmacéutica. El método ha de permitir distinguir entre todas las posibles especies quimicas existentes 0 que puedan generarse. Sin embargo, para un método de control de calidad de tutina la existencia de alguna interferencia se podria aceptar si ésta es conocida y de magnitud aceptable. En estos casos la selectividad Puede entrar en conflicto con el coste y el tiempo necesarios para la determinacién del analito. Las conclusiones de los estudios de selectividad estan vinculados al origen de la muestra, la optimizacién de la preparacion, ta especificidad de !a medida y las condiciones instrumentales. Por tanto, cualquier cambio en fas mismas supone una reconsideracion del estudio realizado. Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto el estudio de la selectividad es el parametro que en mas ocasiones debe revisarse. A grandes rasgos el estudio de Ia selectividad variara su Planteamiento segun el objetivo y la técnica analitica aplicada 2.2.1 Segun objetivo del ensayo 2.2.1.1 identificacion Se debe demostrar que sustancias de composi muestra. : método es capaz de discriminar sin interferencias entre el analito, nN similar y otros productos que puedan estar presentes en la Durante el desarrollo de una molécula la identificacion requerira la comprobacién de la estructura de la molécula mientras que en un método para el control de calidad rutinario no sera necesaria la confirmacién completa de la estructura quimica o composicion del Producto y bastard con la comparacién con una substancia de referencia. En estos casos el objetivo es confirmar, con un grado de seguridad aceptable, que el producto se corresponde con lo esperado. 2.2.1.2 Ensayos de pureza Se debe garantizar que el método Permite una evaluacién de las impurezas y los productos de degradacién definidos en estudios previos, sin interferencia de otras sustancias que puedan estar presentes en la muestra. Para estos ensayos se Presupone que se han realizado estudios previos y se han definido las impurezas y productos de degradacién susceptibles de aparecer. Si el método es selectivo para determinados Productos de degradacién puede utilizarse para controlar la estabilidad del producto. 2.2.1.3 Determinacion cuantitativa de un compuesto o riqueza de un principio activo El método debe evitar la interferencia de excipientes, productos de degradacion ylo impurezas en la respuesta Proporcionada por el compuesto o el Principio activo objeto de la evaluacion analitica.40) Wlatenas primas y especialidades , Selectividad 2.2.2. Segun la técnica analitica aplicada 2.2.2.1 Ensayos especificos Como se ha indicado anteriormente se considera apropiado reservar este término para aquellos métodos analiticos que proporcionen un 100% de selectividad. Este tipo de métodos representaria la situacién ideal aunque en el analisis farmacéutico actual su utilizacién no es muy comun. Se podrian considerar ensayos especificos algunos inmunoensayos, la espectroscopia de absorcién atémica o un acoplamiento masas/masas. 2.2.2.2 Ensayos ‘dbsolutos El uso de métodos de valoracién no especificos se debe combinar con la utilizacion de otros Procedimientos analiticos Para demostrar la idoneidad del andlisis, como por ejemplo una valoraci6n potenciométrica combinada con un test de impurezas. 2.2.2.3 Ensayos separativos Son los ensayos de mas amplia aplicacién en la industria farmacéutica actual aunque hay que recordar que no estan libres de interferencias. Por ejemplo, en cromatografia liquida no es suficiente para asegurar la selectividad del ensayo con determinar el tiempo de retencién, Seria necesario la comprobaci6én de la ausencia de interferencias con la aplicacién de una técnica complementaria adecuada. Este tipo de andlisis Proporciona una segunda via de informacién que confirma la Primera. Entre las combinaciones posibles se puede citar las siguientes: * Cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC) acoplada a un detector de diodos (DAD) * HPLC/ Espectrometria de masas (MS) * HPLC con confirmacion Por columnas de diferente Ppolaridad * Cromatografia de gases (GC)/MS * GC/Espectroscopia de infrarrojos con transformada de Fourier (FT-IR) En la siguiente figura se muestran alguna de las situaciones que se pueden producir al abordar el estudio de la homogeneidad del pico:Selectividad @) 7 Perl observado en et pico cromatogitico : Pefil individual pera cada componente a) Situacion ideal. EI Pico observ: ado correspondiente a una sola especie substancia presente en la mur quimica, ninguna otra estra eluye a un tiempo de retencién Parecido al del analito de interés. b) Superposicién Perfecta. Dos sustancias Presentes en la m mismo tiempo de retencién, El equipo no detectaria la coeluci el maximo del pico no Corresponderia con el obtenido con la si Cc} 9° 8 og = Ss. o =} @ 3 a 1 Au 3am som nom ad ‘not aionaadae bala ‘Compuesto A Compuesto B Au) me im in ae ole a0” ye,9U Matenas prmas y especialidades Selectividad Una vez demostrada la selectividad del método se Puede prescindir de la técnica complementaria. El método Seguira siendo valido-mientras se aplique a muestras obtenidas a través de la misma ruta de sintesis y con igual perfil de impurezas. En la aplicacién tutinaria del método los parametros del test de idoneidad del sistema permiten comprobar el mantenimiento de fa selectividad del método. 2.3 Procedimientos de determinacién de la selectividad En el estudio de la selectividad, como norma general, se comparan los resultados del analisis de muestras con y sin analito en presencia o ausencia de impurezas, productos de degradaci6n, sustancias relacionadas y/o excipientes. Se pueden plantear diferentes alternativas Para proceder a la demostraci6n documenta! de la selectividad de! método. 2.3.1 Por adicién de las interferencias La primera aproximaci6n seria de aplicacién para aquellos analitos para los que se tienen identificadas. las posibles interferencias y éstas se encuentran disponibles de forma aislada. de muestras con y sin analito en presencia 0 ausencia de dichas interferencias. Se evaluara @ que nivel se producen y si es preciso modificar el método 0 afiadir alguna técnica complementaria. Para una forma farmacéut a y una materia prima los grupos de muestras que se Preparan normalmente serian los siguientes: Determinaciones para la forma farmacéutica Determinaciones para la ria prima Matriz Blanco Analito? Analito” Matriz + Analito : Otras sustancias similares? Matriz + Analito + Impurezas (Disolventes Analito, Productos de Degradacién + Impurezas Residuales, Trazas Metdlicas) + Productos de (Disolventes Residuales, Trazas Metalicas, Degradacién....‘ Reactivos de Sintesis)... * Nota: 1 Entendida como todo aquello que acompafia al analito de interés. La cantidad de matriz sobre la que se realizara el analisis sera equivalente a la fraccién que se tomaria en una aplicacion rutinare dee método. En el andlisis de la matriz ninguno de los componentes deberia dar, de forma ideal, una respuesta cuantificable para descartar posibles interferencias por su parte. 2 Elanalito a comprober corresponderd al 100% de la concentracion de trabajo. Es el punto de referencia. 3° Especialmente en métodos de identificacién es ‘susceptible comprobar el caracter discriminatorio del ensayo si se aplica sobre otros Productos de composicién similar Por los que pudiera ser confundido (ej. una sal ‘sédica por una potasica o calcica), 4 Las impurezas y productos de degradacion que se adicionen corresponderén a los niveles maximos aceptados en el producto en cada caso. Otro aspecto a considerar es la determinacién de muestras donde el analito puede encontrarse de diferentes formas: unido/libre, inorganicoforganometalico, diferentes estados de oxidacion, Puede ser de interés el analisis de las impurezas por separado, La eleccién de la Concentracién en la que se realiza el estudio podria ser la tedrica de abajo para el principio activo u otros compuestos de interés (ej. conservantes) y las interferencias a su limite maximo establecido. En caso de que se observen interferencias, su nivel puede evaluarse a partir del analisis de seis replicados y el grado de discrepancia entre