UNIVERSIDAD DE SEVILLA BRARETARIA CIENCIAS [ean AY eae no _442, CONTRIBUCION AL ESTUDIO CITOLOGICO DE LOS CILIADOS HIPOTRICOS Trabajo presentado para optar al Grado de Doctor por la Licenciada D2 CONCEPCION FEDRIANI IRISO. Q deans Sevilla, Marzo de 1974 Prof. D. Julio Pérez Silva Catedrético de Microbjologia “Atlas s ¢ [= Si emu & Png a YaT UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DB BIOLOGIA BistioTeca Doy mi autorizacién a la Biblioteca de esta Facultad para 9. que mi Tesis Doctoral. af be beatin. el Coleen ey defo bes = Consulta en depésito. — Préstamo interbibliotecario. — Reproduccién parcial. - Reproduccién total. = Tipo de Usuarios, = Otros términos. (O Alu au Firmado: (Ces « Sevilla, all deEl presente trabajo iniciado en 1971, ha sido rea- lizado en el Departamento de Microbiologfa de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Sevilla, bajo la direccién del Prof. J. Pérez Silya,a quien agradezco cordialmente su orjentacién, interés y constante dedicacién. Mis sinceros agradecimientos, Al Dr. Rafael Molina y Pifial de Castilla y a Isabel Sanchez. por-la valiosa y desinteresada ayuda que me han pres. tado constantemente. A la Dra. Gil Alvarez, del Instituto “Jaime Ferrdn” de Microbiologia del C.S.1I.C. por la elaboracién de las mi - crografias electrénicas. A Antonio Torres Rueda,alumno de 5% Curso de Cien - cias Btol6égicas y a José Arroyo Lépez, Licenctado en Ciencias Blolégicas as{ como a los restantes compafieros de este Depar tamento por su yaliosa ayuda. Por Gltimo, agradezco el apoyo ecanémico que me han prestado la Universidad de Sevilla y el Ministerio de Educa- cién y Ciencia a través del Plan de Formacién de Personal In vestigador.INTRODUCCION....... bee e eee cece e ene eee MATERIAL Y METODOS.....seseeeseeeeeeeees eee A. MATERIALES. B. METODOS...........- seen eee eres tenes 1,- Seleccién del material ........ 2.- Medios de cultivo....... aeeeeee 3.- ObservaciGn in VivO.....eeeeeee 4,- Tincién de orgdnulos superfi - ciales.. 5.- Tincién de nacleos...........4+ 6.- Tinciones para la observaci6n con fluorescencia.......--. vee 7.- Técnicas para la microscopfa electréntca. beeeee RESULTADOS...... A. ESTUDIO SISTEMATICO DE LOS CILIADOS DEL VALLE DEL GUADALQUIVIR..... tees B. ESTUDIOS REALIZADOS CON LAURENTIA sp. 36 40 44 46 47 48 561.- Condiciones de cultivo........-e- 57 Zoe DESCHIPCLON. ..csecceeseeeseseeeees 59 B.~ DIVISION. cece eee ewe wae eeseeeae 67 a) Divisién nuclear. b) Reorganizacién de los organulos superficiales.. n 4.- Exquistamiento.....sseeeeeeeseeees 75 B.> ConjugactOn......ceseeeeecesseeees 78 C. ESTUDIOS REALIZADOS CON STYLONYCHIA MY ILLUS eee eee eee eee Beene +. 80 DESCUSION. .c...6c cscs Geode eseseasseccdecase 5 88. PONCLUSIONES.. 0... ee cece cece cece ncecnrveces | 94 RESUMEN. oc cceeeceseccceseccrctesveecseccveene) 99 BEBLIQGRAPIA......ccissccetsecesoeedeaetesees «103INTRODUCCIONComores sabido, los ciliados hipotricos son un grupo de protozoos que se conoce desde hace mas de dos si- glos y cuyos caracteres principales son: cuerpo aplanado dorsoventralmente; cilios somdticos fusionados formando rros en la superficie ventral; peristoma amplio con zona adoral de membranelas bién desarrotlada; reproduccién ase~ xual por escisi6n binaria, reproduccién sexual por conjuga cién; la mayorfa son formas libres que viven en agua dulce, salobre o salada, y solo unos pocos son pardsitos. De todos estos caracteres, la presencia de cirros y la amplia zona adoral de membranelas son los dos rasgos diferenciales mas importantes, ya que dan unidad a las casi 400 especies descritas hasta la fecha. Segin datos que hemos recogido en las obras de KAHL (40), KUDO (47), GRELL (30), HALL (32), CORLISS (16), DOGIEL (23), asf como en la reciente versién de BORROR (15) y-. en otras publicaciones que hemos consultado directamente, el primer intento de clasificacién de los hipotricos fue realizado en 1786 por MULLER, quiém reunié todas las espe- ctes en dos géneros: Trichoda, con 89 especies, y Kerona, con 14, basdndose en que todos presentan el caracter coman de poseer “6rganos externos". En 1830, EHRENBERG realizé una serie de trabajos encaminados a establecer una clasificacién mas completa yque culminan con el recenocimiento de 4 familias: la fami- lia OXYTRICHIDAE, con cuatro géneros (Oxitricha, Kerona, Urostyla, Stylonychia); la familia EUPLOTIDAE, con dos gé- neros (Euplotes y Discocephalus); la familia ASPIDISCIDAE, con un género (Aspidisca) y por Gitimo, la familia TRACHE- LIDAE, con seis géneros de los cuates cinco no se conside- ran actualmente como hipotricos. En 1859, STEIN establece seis familias dentro de los hipotricos, dos de las cuales se consideran actualmen- te como pertenecientes a los holotricos; una, a los hetero tricos, y las tres restantes, que son familias OXYTRICHI - DAE, EUPLOTIDAE y ASPIDISCIDAE, son las que se admiten hoy como pertenecientes al grupo de los hipotricos. En 1889, BUTSCHLI reconoce sélo cuatro familias de las seis establecidas por STEIN, pero sigue admitiendo la familia PERITROMIDAE, que actualmente se incluye entre los heterotricos. Ademés, establece una serie de subfami- lias dentro de la familia Oxytrichidae. Es POCHE (56) quien en 1909 deja reducido el gru po de los hipotricos a las tres familias actualmente admi- tidas. Los trabajos de ALFRED KAHL marcan un hito en la historia de la clasificacién de Tos ciliados hipotricos.Su monograffa, publicada hace unos cuarenta afios (41) per. manece vigente como recopilacién de las descripciones de la mayoria de las especies publicadas antes de 1930. KAHL divide el orden de los hipotricos em las tres familias ad- mitidas por POCHE, y las define de acuerdo con los carac- teres siguientes: FAMILIA OXYTRICHIDAE: Zoma de membranelas bién desarrollada. La dotacién de cirros corresponde esencial- mente al tipo oréginal. Las hileras de cirros ventrales suelen estar més o menos reducidas, pero siempre se con- servan dos hileras (denominadas hiteras marginales). Exis, ten cerdas dorsales. FAMILIA EUPLOTIDAE: Zona de membranelas bién de sarrollada. La dotacién de cirros esté m&s bién formando grupos aislados. Las hileras margimales y ventrales no se reconocen como tales. Existen cerdas dorsales. FAMILIA ASPIDISCIDAE: Zoma de membranelas reducida a una pequefia regién preoral aislada. En la parte anterior izquierda se conserva todavia un resto dificilmente visi- ble de membranelas muy pequefias, parecidas a cirros. La do tacién de cirros se presenta en dos grupos claramente dis- tintos en cuanto a su organizacién y configuraci6n: grupo fronto ventral, que suele estar formado por siete cirros,y el grupo transversal originariamente de cinco cirros, que faltan a veces. En cuanto a las subfamilias, KAHL considera que las propuestas por BUTSCHLI estan justificadas por el gran némero de géneros que comprende la familia Oxytrichi daes pero, puesto que el propio KAHL descubrié gran ndme- ro de formas intermedias (que tendfan a unir las subfami- lias) asf como una serie de géneros nuevos que harian ne- cesario la creacién de otras nuevas, no intenté revisar las familias, sino que las dividié directamente en géneros. Como veremos mas adelante, las especies objeto de nuestro estudio pertenecen a la familia Oxytrichidae, subdividida por KAHL en 26 géneros atendiendo principalmen te a la existencia y disposicién de los cirros transversa- les, caracter al que da preferencia sobre la disposici6n de los cirros frontales. A continuacién exponemos parte de la clave de los géneros que nos va a ser necesaria a la hora de clasi ficar las especies que hemos seleccionado para realizar el presente trabajo.1(24) 2g (1) 40(25) 41 (46) 42(43) 43(42) 44 (45) 45 (44) 4641) Faltan los cirros transversales. - En el campo frontal no existe ningin cirro espe- cial mas engrosado y aistado. Las hileras ventra- les se prolongan parcialmente hacia el campo fron tal, hasta el borde anterior y no presentan ape- nas cirros més gruesos. 26 - En el campo frontal existen cirros atslados y cla ramente reforzados, casi siempre estén especial- mente reforzados los tres cirros més anteriores.41 - Todos los cirros ventrales estén formando hileras (de 1 a 6 hileras). En el caso de que haya cirros ventrales totalmente aistados por detras de la bo- ca, éstos no estén reforzados y son poco ostensi- bles. En un género faltan complétamente los cirros ventrales. 42 - Cirros ventrales formando cuatro o més hileras: Urostyla. - Cirros ventrales formando una a tres hileras, 0 faltan. 44 - Faltan los cirros ventrales (una especie marina con peristoma en forma de cuello): Trachelostyla. - De una a tres hileras ventrales: Holostycha - Cirros ventrales, al menos en parte, reunidos en grupos. 4747658) 4g (53) 49 (50) 5049) 51 (52) 52(51) 53 (48) 54 (55) 55 (54) Cirros yentrales, en parte, formando hasta tres hi. leras; ademés existe un cirro postoral y un grupo posterior de pocos cirros aislados. 48 Las hileras ventrales son cerradas, corren parale- lamente al eje longitudinal. 49 Las hileras ventrales, cerradas, estén una a la iz quierda y dos a la derecha. Cirros transversales en hilera cerrada. Qnychodromopsis Los dos cirros transversales del lado derecho estan alejados y situados por detraés de los tres izquier dos. 51 A cada lado hay una hilera cerrada en cirros ventra les. Allotricha Dos hileras cerradas de cirros ventrales en el la- do derecho: Pleurotricha. Las hileras de cirros ventrales cerradas corren cla ramente oblicuas desde el lado anterior derecho has ta el posterior izquierdo. 54 Una hilera oblicua de cirros ventrales que llega hasta las proximidades de los cirros transversales. Gastrostyla Hileras ventrales cortas que apenas rebasan la base del peristoma. La zona adoral es de posicién late~ ral: Gonostomum56(47) 57 (58) - Faltan hileras ventrales cerradas. 57 ~ El extremo posterior del animal puede prolongarse en un largo y delgado peddnculo: Ancystropodium 53 (57) - En el extremo posterior no se observa ninguna pro. longacién. 59 59(50) _ En et campo frontal existen de 12 a 15 cirros grue sos. MacronGcleo dividido en cuatro fragmentos (cuatripartito): Onychodromus 60/59) _ En e1 campo frontal existen pocos cirros (en la ma yorfa de los casos hay ocho dispuestos en tres gru pos). Macronicleo casi siempre dividido en dos frag ment mentos y rara vez en uno o cuatro: Oxytricha En su libro publicado 1961 CORLISS (16) propone una nueva clasificacién del orden Hypotricha, pero aunque acla- ra algunos problemas de nomenclatura, aporta pocos datos nueyos a tener en consideractén. En el mismo afio, FAURE-FREMIET (26), bas&ndose en la distribucién de los cirros, divide los hipotricos en dos subérdenes: Sub6rden Strichotrichina, con cirros fronto ventra - les distribuidos regularmente en hileras y al que dividié en cuatro familias. Suborden Sporadotrichina con seis o me nos cirros por hilera y al que divididé también en cuatrofamilias. Esta modificacién fué aceptada como parte de la cla sificacién propuesta por el Comité de Taxonomfa y Problemas taxonémicos de 1a Sociedad de Protozoologos, presidido por HONINGBERG (36). Como puede verse, todos estos sistemas de clasifica- cién estan basados en el aspecto morfoldgico que presentan los individuos durante la interfase y por tanto no reflejan apenas las posibles relaciones filogenéticas de unos grupos con otros. Por otra parte, dado que no existen restos fési- les, estas relaciones han de basarse principalmente en estu dios comparativos de los procesos marfogenéticos. En 1972 BORROR (15), basandose en los conocimientos actuales sobre los procesos de morfogénesis durante la divi sién de los ciliados hipotricos, ha elaborado un sistema de clasificacién que pretende ser menos artificial que los an- teriores y en el que se incluyen nuevas especies descritas por diversos investigadores en afios recientes. En este sistema propone las siguientes familias: Familia Urostylidae, Familia Psilotrichidae, Familia Holostichidae, Familia Spirofilidae, Familia Oxytrichidae y Familia Euplotidae, las cuales veremos més adelante en de talle.10 Tratando de dar mayor uniformidad a la terminologia, BORROR ha propuesto una serie de conceptos y términos para definor los orgdnulos superficiales de los ciliados hipo- tricos. Esta terminologta es la que adoptamos nosotros en las descripciones y discusi6n, por ello creemos convenien- te expresarla a continuacién: Zona_adoral_de membranelas (ZAM).~ Aunque es facil- mente-reconocible y aparentemente similar en la mayorfa de los hipotricos, la ZAM no sélo varfa ampliamente de unos géneros a otros dentro de una misma familia, sino que ade- mas est sujeta a variaciones relacionadas coh la morfogé- nesis. En efecto, durante 1a divisiGén celular, la zona de membranelas de las células hijas posteriores pueden desarro Jlarse sobre la superficie de la célula (Holostichia, Kah- liella, y Urostyla) o bién en un surco subcortical (Euplo- tes, Keronopsts, Trachelostyla). Por regla general, el pré tero hereda 1a ZAM de 1a célula parental, pero en Diophrys, Keronopsis, Trachelostyla y Uronichia 1a ZAM parental se reabsorbe y es reemplazada por otra de nueva formacién DEMBORKE (20), KOOL (46), WALLENGREU (77). Esta similitud en la estomatogénesis del prétero en géneros tan alejados es de poca importancia taxonémica y, por tanto, se atribuye a una conyergencia evolutiva. Asf mismo existe cierta varia11 cién intraespecifica en cuanto al n@mero de membranelas de la ZAM, pero el aspecto general y de ésta 1a configuracién (depresiones, crestas, posicién topegréfica) de la cavidad bucal, es un caracter relativamente estable que puede ser usado para la identificacién de las especies. Membrana ondulante (MO).- BORROR admite éste término dinicamente por su tradicién histérica, ya que sefiala la in- conveniencia de emplear un nombre que también se aplica a estructuras no homélogas que existem en otros grupos de pro tozoos. En la mayorfa de los hipotricos, 1a MO consiste en una serie longitudinal de cilios que a menudo corresponden a mas de una hilera, y que estd situada a lo largo del bor- de derecho de Ta abertura bucal. Durante 1a morfogénesis, 1a MO del prétero se origina por desdiferenciacién de la es tructura parental y reorganizacién definitiva de una unidad funcional. En el opisto, 1a MO se desarrolla a partir de una serie longitudinal de granulos Basales, situados a la derecha de 1a ZAM. Al parecer hay poca variabilidad intraes pecifica en la configuracién de ta MO. Dentro de un mismo género (por ejemplo Oxytricha platistoma) o, incluso dentro de una familia (por ejemplo Euplotidae) puede haber una ten dencfa hacia una hipertrofia de ta MO. Sin embargo, en los Euplotidae, hay algunas especies que tienen una membrana on dulante modificada, o bién carecen de ella.12 Cirro bucal.- Durante la estomatogénesis, tos granu- los basales del extremo anterior del primordio de la MO proliferan y producen el cirro bucal. Asf, el primer cirro frontal de Urostyla weissei, uno de tos cirros frontales de Kahliella y el cirro 1/I de especies de Oxytricha y de los Euplotidae no estén morfogenéticamente relacionados con los demas cirros y constituyen un tipo especial de org&nulo. £1 cirro bucal puede aparecer inmediatamente a la derecha de 1a OM, o tener otra localizacién préxima al extremo anterior de la superficie ventral de la célula. Los tres tipos de orgdnulos que se acaban de descri- bir no son exclusivos del Orden Hypotrichida, pues se han observyado estructuras homélogas también en el heterotrico CondyTostoma. E1 cirro bucal de Condylostoma se origina, no a partir de la ciliacién somdtica, como indicé KAHL (41) ni de Ta zona de membranelas, como imdicé FAURE-FREMIET(26), sino a partir del extremo anterior de 1a membrana ondulante desdiferenciada (76). Los siguientes orgénulos, som privativos de las espe cies del Orden Hypotrichia. Cirros frontales.- Los cirros frontales estan situa- dos en 1a superficte ventral a la derecha de 1a cavidad bu- cal, y son, més o menos diferentes del resto de la cilia - cién. Pueden presentarse formando hiteras de finos cirros o13 bién formando grupos de cirros mas gruesos, y en Urostyla grandis, por ejemplo, constituyen una parte muy ostensible de 1a ciliacién. Los cirros frontales pueden originarse por diferenciacién anterior de un campo de hileras de cilios, que da lugar en su zona posterior a los cirros medio ventra les, o bien a las hileras yentrales de cirros no modifica~ dos que aparecen en los Urostylidae y Holostichidae. Los ci rros que en los Oxytrichidae y Euplotidae ocupan una posi- cién topogréfica similar no son homélogos de los cirros frontales y se denominan cirros. frontoventrales. Cirros frontoventrales.- Est&n situados la superfi cie ventral de algunos de los Urostytidae y miembros de los Oxytrichidae y Euplotidae. Los cirros frontoventrales se originan por coalescencia de los cilios de cinco o més (ge- neralmente cinco) hileras longirudinales numeradas segdn el sistema de Wallengren de la siguiente forma: La MO y el ci- rro bucal se diferencian de la hilera 1; las restantes hile ras se numeran de izquierda a derecha a través de la super- ficie ventral, II-VI. Las especies de algunos géneros pre- sentan una reduccién en el ndmero y un aumento en el tamafio de los cirros de derecha a izquierda a trayés de la superfi cie ventral. Es decir, la fila II suele dar lugar a menos cirros y més grnades que la fila VI. También, En Oxytrichi- dae y Euplotidae, el nimero total de cirros frontoventrales14 producidos es un caraécter relativamente estable y a veces puede utilizarse para la identificacién de géneros e inclu- so de especies. Cirros marginales izquierdos.- Alo largo del margen ventrolateral izquierdo del cuerpo puede haber una o mas hi- leras longitudinales de cirros marginales. £1 extremo ante- rior de la hilera (0 hileras) termina en el borde posterior izquierdo de la cavidad bucal. Los cirros marginales izquier dos pueden faltar, como en Aspidisca, estar reducidos a dos cirros como en Euplotes, o bién pueden formar una o més hile ras longitudinales, pero estén sujetos a poca variaci6n es- tructural dentro de cada especie. Los cirros marginales iz- quierdos de las células hijas se originan a partir de hile- ras longitudinales de cilfos que se desarrollan por dentro, es decir, por el lado medial, de los cirros marginales iz- quierdos parentales. Cirros marginales derechos.- Una o més hileras longi tudinales de ctrros marginales derechos pueden existir a lo largo del margen ventrolateral del cuerpo. Aunque estos se desarrollan de forma similar a los cirros marginales izquier. dos, differen en variabilidad en cuanto. al némero de hileras ¥ probablemente en la estructura de las fibrillas radicula- res ciliares (31).15 Cirros transversales.- Este término tradicional alu- de a un grupo de cirros cuyo conjunto sigue en muchos hipo- tricos una trayectoria en forma de J o bién forma una linea transversal de cinco o mas cirros muy ostensibles cerca del extremo posterior de la célula. Tales cirros se originan, al menos por tres procesos morfogenéticos diferentes. Los cirros transversales de Urostyla weissei se derjvan de ci- lios que proliferan en el extremo posterior de unas hileras de algunos cirros parentales, que se desdiferencian. En los Holostichidos los cirros transversales se diferencian a partir de ciljos del extremo posterior del campo de cirros medioventrales. En los Oxytrichidae y Euplotidae se desarro lan a partir del Gltimo cirro (1/11, 2/111, 1/IV, 1/V, 1/VI) que se origina junto con los cirros frontoventrales de un campo de cinco hileras ventrales. Cilios dorsales.- Los cilios de la superficie aboral de los hipotricos pueden ser largos y facilmente visibles (Trachelostyla), cortos y gruesos (Euplotes), o reducidos a papilas o ausentes (Aspidisca). Sus cuerpos basales a menu- do estan situados debajo de fosetas corticales y, al parecer, no presentan cinetodesmos. Debido a Ya dificultad que encie- rra Ja tincién de estas estructuras, solo en muy pocos casos se ha estudiado su modo de replicacién (17) (18). En Urosty- la wessei y Stylonichia (39) las hileras de cilios dorsales16 se desarrollan por proliferacién cinetosémica de dos regio- nes (anterior y posterior). Sin embargo, las dos filas dor sales derechas en Stylonychia, no se fortian por dentro de las antiguas, sino que aparecen sobre el margen derecho de la célula, adyacentes al primordio de los nuevos cirros mar ginales derechos. En Euplotes, los nuevos cirros dorsales se originan a partir de hileras situadas cerca del plano de divisién, en el ecuador de 1a célula. Aunque la creacién de algunas especies est& parcialmente basada en el nimero de hileras de cilios dorsales (12) (74), esta caracteristica varfa dentro de las especies (11) (34). Cirros caudales.- Los cirros posteriores bién dife - renciados de Stylonychia, se originan a partfr de grdnulos basales de los extremos posteriores de las cuatro primeras hileras del lado izquierdo de la superficie dorsal y se lla man cirros caudales. Cirros caudales derechos.- Los cirros grandes que hay en la superficie postlateral derecha de Diophrys y Uronychia, asi como los pequefios cirros posteriores a los cirros trans- versales en Euplotes, se derivan de los grénulos basales del extremo posterior de las hileras de cil.ios del lado derecho de la superficie dorsal (37) y, por tanto, no son homélogos a los cirros caudales de Stylonychia. La posicién topografi- ca comin y el origen morfogenético similar de estos cirros17 en los Euplotidae, justifica el nombre empleado aqui. Cirros medioventrales.- Entre los cirros marginales derechos e izquierdos de los Holostichidae, hay una doble fila de cirros que, a menudo, estan dispuestos en zig-zag. Los cirros medioventrales se originan a partir de una serie de hileras transversales en Urostyla cristata (39), Keronop- sis rubra, Holosticha diademata, y Uroleptus caudatus (15). Las hileras se forman por reagrupamiento de los cuerpos ba- sales y cilios de estas hileras transversales. Tienen poca yariacién en extensién lateral (p.e. ndmero de hileras). Sin embargo, en la organizacién de Keronopsis rubra_, un indivi duo puede tener ocasionalmente el grupo anterior de los ci- rros medioventrales preexistentes, a un lado del campo re- cién organizado. Las hileras transversales del extremo pos- terior de este campo dan lugar a los cirros transversales en este grupo de ciliados. SISTEMA DE CLASIFICACION PROPUESTO POR BORROR. Tenien do en cuenta los procesos morfogenéticos durante la divi - sién y la dotacién de cirros de los individuos durante la interfase, BORROR, (15) distingue seis familias: 1.- Familia Urostylidae: BUTSCHLI, 1889. Cirros en 3-12 filas ventrales. No existen cirros marginales, fronto-18 ventrales o medioyentrales, distintos anatémica o morfogené ticamente. Nueve géneros, con Urostyla como género tipo. 2.- Familia Psilotrichidae: BUTSCHLI, 1889. Cirros relativamente uniformes, en 5-10 hileras ventrales oblicuas. No existen cirros frontales diferenciados. Cirros transver- sales poco ostensibles. Pequefias formas ovales con ciliaci6n bucal moderadamente desarrollada y generalmente, con una gran membrana ondulante. Tres géneros, con Psilotricha como género tipo. 3.- Familia Holostichidae: FAURE-FREMIET, 1961. Exis ten cirros marginales izquierdos, derechos y medioventrales. Los cirros medioventrales generalmente se presentan formando hileras en zig-zag, que se originan (al menos en Holosticha, Keronopsis y Uroleptus) de la alineacién de hileras transver sales de cilios durante la divisién. Siete géneros, con Ho- losticha como género tipo. 4.- Familia Spirofilidae: VON GELET 1929. Cirros en hileras helicoidales. Superficie aboral reducida a hileras helicoidales. Siete géneros, con Hypotrichidium como género tipo. 5.- Familia Oxytrichidae: EHRENBERG 1838. Al menos una hilera a cada lado de cirros marginales, cada una de las cuales contiene por 10 menos cinco y generalmente 20 0 més19 cirros. Presentan cirros frontoventrales. Cirros transversa- les generalmente presentes. Catorce géneros, con Oxytricha como género tipo. 6.- Familia Euplotidae: EHRENBERG, 1838. Cirros mar- ginales ausentes (excepto en el género Swedmarkia y una espe cie de Discocephalus). Cirros marginales izquierdos, general mente ausentes (Aspidisca, Euplotaspis, Gastrocirrus y Paraeu- plotes) o reducidos a 1-3 cirros (Diophrys, Euplotes, Euploti- dium, Swedmarkis y Uronychia). Cirros caudales derechos pre- sentes en Diophrys, Discocephalus, Euplotes y Uronychia. Ci- rros transversales presentes. Cirros frontoventrales en grupos que son similares morfogenéticamente a los cirros frontoventra les de los miembros de los Oxytrichidae. Zona adoral de mem- branelas y membrana ondulante ampliamente modificadas. Once géneros (Certesia, Gastrocirrus y Paraeuplotes) se colocan aquf solo provisionalmente. BORROR incluye una serie de miembros de los Oxytrichi dae en otras familias, quedando ésta reducida a un grupo muy homogéneo que comprende catorce géneros, de los cuales Gastro- tyla, Histriculus, Oxytricha, Stylonychia y Trachelostila, presentan una gran similitud en e1 modelo morfogenético de Jos cirros frontoventrales. Los restantes géneros, se colocan aqui atendiendo a su semejanza en 1a distribuci6én de cirros durante la interfase, dado que su morfogénesis no se ha estu-20 diado adn. Entre estos Gitimos se encuentran: Género Onychodromus.- Comprende una sola especie des- crita por STEIN (69) en 1859 con el mombre de 0. grandis. Los Gnicos trabajos realizados sobre la biologfa de esta especie son los publicados por los MAUPAS(48} en 1889. Posteriormente TUFFRAU (73) publicé un trabajo en el que compara la ultraes- tructura de los cinetosomas en varias especies de ciliados hipotricos entre las que se encuentra 0.grandis. Género Laurentia.- Descrito por DRAGUESCO (24) en 1966, con una sola especie, L.macrostoma. Se le considera pré ximo a Keronopsis y Holosticha. De forma ovoide, con una re- gién apical ensanchada y una regi6n posterior bastante puntia guda. La longitud media es de doscientas micras, en animales fijados. Gran peristoma triangular en forma de embudo, muy abierto por 1a parte alta y bordeado por potentes membrane - las, en ndmero de 50 a 60. En e? lado derecho del peristoma hay una gran membrana ondulante. La ciliacién es bastante compleja y primitiva; cons- ta de: dos hileras de cirros marginates; cirros frontoventra- les de distribucién bastante andrquica y que presentan una cierta variabilidad; cirros ventrales distribuidos a grandes rasgos en tres hileras; 6-10 potentes cirros transversales; 9-12 cirros ventrales de disposicién anarquicas a veces, 4-5 cirros caudales bastante largos; 6-7 cirros de forma varia - ble colocados entre los cirros transversales y caudales.21 El aparato nuclear est& constitujdo por 3-6 gruesos macrondcleos de contorno irregular, acompafiados por otros tantos micronicleos esféricos. En 1971 DRAGUESCO (25) ha descrito una nueva especie de éste género L.monilata que no es recogida por BORROR en su sistema de clasificacién (15) y cuyo cardcter mas signifi cattyo es el de poseer un macronicleo moniliforme constitui- do por 9-16 nédulos conectados entre sf por gryesos puentes carioplasmicos. Salvo esta descripcién parcial hecha por DRAGUESCO, no se conoce nada acerca de 1a biologfa del género Laurentia; por ello, nos ha parecido interesante dedicar cierta aten - ctén al estudio de una especie aislada y cultivada por noso tros y que, como veremos mis adelante, responde a las carac teristicas de éste género. Son muchos los trabajos que se han realizado en cilia dos hipotricos, pero la mayorfa de ellos recaen sobre espe- cies pertenecientes a los géneros Oxytricha, Euplotes y Sty- Jonychia. Estas especies por su gran difusién en las aguas y en el suelo y por la relattva facilidad con que se culti- yan han servtdo para investigaciones muy diversas, algunas de ellas ciertamente interesantes. Con varias especies de cada uno de estos géneros se ha estudiado la citologfa tanto a nivel microscépico como22 ultramicroscépico, asi como diversos aspectos de su ciclo biolégico: divisién, conjugacién, autogamia, enquistamjento, exquistamiento, etc. En muchas de elas se han completado recientemente los estudios de 1a divisi6n celular con los de morfogénesis de los orgénutos citidares y los de 1a conju gacién con los de desarrollo del esbezo macronuclear. Por citar algunos ejemplos de investigaciones reali- zadas con dichos géneros mencionalremos, en el caso de Oxy~ tricha, las descripciones de la divisién (66, 60), conjuga- cién (60,29,42) y 1a demostracién de cromosomas politénicos @s). Euplotes ha sido bastante mas estudiado. Se han publi cado algunos estudios sistematicos (74,14) asi como trabajos citolégicos entre los que cabe destacar los ya clasicos de TURNER (75) sobre los sistemas fibrilares y los recientes de TUFFRAU (73) sobre la ultraestructura de la infraciliacién de los orgdnulos ciliares. Asimismo, son notables las inyes- tigaciones de KATASHIMA (43) sobre razas matadoras y los de HECKMAN (35) en torno a la herencia de los tipos de aparea - miento. En cuanto a la divisién del macrondcleo, son de des- tacar los trabajos autorradiogréficos de GALL (27) encamina- dos a eluctdar el significado de las bandas de reorganizacion. Y con respecto al desarrollo del esbozo macronuclear, ademas de los trabajos de ALONSO y PEREZ-SILVA (5) en Tos que demues23 tra la existencia de cromosomas politénicos, destaca el de RAO y AMMERMANN (61), en el que se hacen estudios sobre la incorporacién de uridina y timidina tritiada en el esbozo macronuclear y en los cromosomas politénicos. Posiblemente el género més estudiado es Stylonychia, concretamente la especie S.mytilus. Merecen destacarse los trabajos sobre la estructura microscGpica realizados por MAUPAS (48) por la precisién de sus observaciones, asf como otros sobre la ultraestructura realizados por TUFFRAU (73) y por ROTH (64) y GIL; ALONSO,P.; y PEREZ-SILVA,d (28). La divisién celular ha sido estudiada en Stylonychia pustulata (70), S.muscorum (1), y m&s recientemente se ha jnvesttgado 1a morfogénesis de los nueyos cirros (31,65,71). Son varios los estudios publicados sobre 1a conjuga cién de S.mytilus (54,8,49). También se han descrito este proceso en S.pustulata (48,55,54,59) y en S.muscorum (3). Dado que una parte del trabajo que sometemos a la consideracién del Tribunal verse sobre el desarrollo del es bozo macronuclear de Stylonychia, creemos conveniente deta- Jlar algo més los estudios que hemos encontrado en la biblio graffa referentes a este interesante problema. AMMERMANN (7), del Zoologisches Institut de Tubinga (Alemania), en su Tesis Doctoral (8) hizo una descripcién de24 Ja conjugacién en Stylonychia mytilus, y al estudiar el de sarrollo del esbozo macronuclear describi6 la existencia de cromosomas politénicos comparables a los que ya habien sido descritos en las células de las gldndulas salivares de las larvas de dipteros. Indic6 que estos cromosomas se encon traban unidos por sus extremos formando un largo filamento a modo de espirema, al que denominé cromosoma colectivo. Al mismo tiempo que AMMERMANN, e independientemente, ALONSO y PEREZ-SILVA (2), del Instituto “Jaime Ferran" de Madrid, estudiando la conjugacién y el desarrollo del esbozo macronuclear de Stylonychia muscorum encontraron también cromosomas politénicos, que segdn demostraron més tarde, es- tos mismos autores (5), se encuentran separados, al menos muchos de ellos, Asimismo PEREZ-SILVA y su grupo (5) encon~ traron estos cromosomas en otros varios géneros y especies de hipotricos, demostrando el apareamiento somatico en Stei- nia candens (6). Aparte de 1a importancia que tiene 1a existencia de cromosomas politénicos en unos seres tan alejados de los dfp teros, dos hechos principales, descritos en St.mytilus, pro- moyieron el estudio de estas estructuras en varios laborato- rios.del mundo, y estas investigaciones se han ido intensi- ficando cada vez mis, realizdndose trabajos a nivel molecu- lar relacionados con las transformaciones que experimenta el ADN durante el desarrollo del esbozo macronuclear.25 Los dos hechos a que nos referimos son: 1.- La desaparicién de gran parte del ADN en una determi- nada fase del desarrollo del esbozo macronuclear. AMMERMANN (10) midi6 fotométricamente las variaciones en el contenido de ADN en el esbozo macronuclear, des de el comienzo del desarrollo del sincarién hasta la formacién del macronicleo definitivo. Este proceso du ra unoas 80-100 horas. Al principio se observa un in- cremento en el contenido de ADN hasta que hacia las 40 horas se produce una caida brusca en la cantidad de este compuesto, quedando el esbozo macronuclear con un nivel muy bajo, el cual después de 75 horas comien za a aumentar rapidamente, durante la fase de endopo- liploidizaci6n, hasta que se alcanza la cantidad corres pondiente al macrondcleo definitivo del exconjugante. La descripci6n de puffs en los cromosomas politénicos. PEREZ-SILVA y sus colaboradores (4) al estudiar el de- sarrollo del esbozo macronuclear en Stylonychia mytilus, encontraron que hacia las 26-30 horas después de la separactén de los exconjugantes, los cromosomas polité nicos presentan unos ensanchamientos comparables a los puffs que ya habfan sido descritos en los dipteros. Aunque en sus experimentos pretiminares, estos autores no lograron demostrar con claridad la incorporacién de26 uridina en dichas regiones ensanchadas, la similitud morfoldgica con los puffs es tam estrecha que impul-. s6 en este sentido su estudio por otros investigadores. Recjentemente PRESCOTT (57,58) investigé el fenémeno descrito por AMMERMANN, de la desaparicién del ADN durante e1 desarrollo del esbozo macronuclear y 11eg6 a la sorprenden te conclusién de que ésta pérdida no es s6lo cuantitatiya, sino también cualitativa, es decir que el macronicleo adulto hay menor variedad de ADN que en el sincarién, y, por tanto, que en el microndcleo. Ello plantea una serie de interrogan tes en torno a la naturaleza y funcién del ADN que se pierde. En cuanto a la aparicién de zonas ensanchadas en los cromosomas de Styionychia mytilus, AMMERMANN (9) realiz6 un estudio autorradiogréfico para demostrar la incorporacién de uridina en e] esbozo macronuclear, y, al obtener resultados negativos, 1leg6 a la conclusién de que en estas zonas no habia sfntesis de ARN y que, por tanto, se trataba no de ver daderos puffs sino de artefactos producidos durante la prepa racién del material. No obstante, RAO y AMMERMANN (61) tra- bajando con Euplotes ‘euristomus lograron demostrar 1a incor- poracién de uridina en e1 esbozo macronuclear, aunque la ra- diactividad no se perdfa totalmente en los testigos tratados con RN-asa. Esta radiactividad aparece de forma homogénea en27 todo el esbozo, sin que se detecte una mayor sfntesis en zonas concretas de éste. Nuestra idea al iniciar este trabajo de Tesis Docto- ral fue el contribuir a la elucidacién de estos dos proble- mas, empleando otra especie de hipotrico que presentara mas ventajas para el estudio. Por ello 1a primera parte de nues tro trabajo consisti6 en una busqueda sistemdtica de cilia- dos que presentasen menor ndmero de cromosomas politénicos en su-esboso macronuclear; este estudio nos servirfa al mis. mo tiempo para explorar los ciliados del Valle del Guadal- quivir. Como ya indicaremos al exponer los resultados, de todas las especies encontradas, hemos seleccionado dos: Sty- Jonychia_ mytilus y Laurentia sp. Esta dltima, muy parecida a L.macrostoma, descrita por DRAGBESCO en 1966, ofrecfa la posibilidad de realizar un estudio completo de 1a morfolo~ gia y de la biologia, principalmente en lo referente al de- sarrollo de] esbozo macronuclear. Sin embargo, sélo pudimos hacer observaciones parciales de Ta conjugacién y de los cromosomas politénicos, debido a que al poco tiempo de te - nerla en el laboratorio dejé de conjugarse. Por ello, con esta especie nos hemos limitado a estudiar la divisién, mor- fogénesis y exquistamiento.28 En cuanto a Stylonychia mytilus, nos ha servido para aclarar algunos puntos acerca del desarrollo del esbozo ma- cronuclear. Para ello hemos aplicado las técnicas de tincién con naranja de acridina (62) y corifosfina(44), recientemen- te puestas a punto por MOLINA (50) en sus trabajos sobre la heterocromatina de Allium cepa y de Pleurodeles waltlii. Como hemos dicho anteriormente de una de las muestras de agua recogidas, hemos aislado una especie de Laurentia, que resulté ser un material muy apropiado para los estudios citolégicos puesto que reunia #as siguientes condiciones: - Se cultiva bien y muy abundante en el laboratorio. - Los cirros se tifien con facilidad, lo que permite hacer estudios de morfogénesis. - Los micronicleos son relativamente grandes pudien do ser observados con facilidad. = Son frecuentes los fenémenos de enquistamiento y conjugacion. Sin embargo, a los seis meses de tener estas especies en eT laboratorio, perdié la facultad de conjugarse de ahf que solo presentemos un estudio parcial de este fenémeno. Pe ro, dado que el desarrollo del esbozo macronuclear plantea probtemas de gran importancia, no hemos querido dejar de es- tudiar este aspecto de 1a tesis y por ello, después de ensa-29 yar distintas especies, selecctonamos una Stylonychia myti- lus que ofrece ventajas para ello.MATERIAL Y METODOS31 A. MATERIALES. . Como ya hemos indicado, el material que nos ha ser. vido para realizar este trabajo ha sido seleccionado entre los distintos protozoos que hemos encontrado durante el es tudio de medio centenar de muestras de aguas, recogidas en las provincias de Sevilla y Huelva. Han sido objeto de es- te estudio las siguientes especies: Laurentia sp.- Aislada de la muestra de agua n2 28, que fue recogida en una charca del Parque de M2 Luisa de Sevilla durante el curso 1971-1972, y que desde entonces se viene cultivando en nuestro laboratorio. Stylonychia mytilus.- Aisladas repetidas veces de muestras de aguas recogidas en Puebla del Rio (Sevilla), durante los cursos 1971-1972. Como alimento para el cultivo de las anteriores es- pecies hemos utilizado: Colpidium sp.- Aislados de muestras de agua de di - versas procedencias y empleado fundamentalmente como alimen. to de Laurentia sp. Chilomonas sp.- Aislado de diversas muestras de agua y que, cultivado junto con Colpidium sp., ha sido utilizado para alimentar los cultivos de Stylonychia mytilus.32 Levaduras.- También hemos empteado como alimento las siguientes especies de levaduras, aisladas de aceitu- nas en fermentacién y que nos han sido facilitadas por el Instituto de la Grasa de Sevilla. Tomlopsis famata Ansenuta anomala Criptococcus luteolus Saccharomyces lactis Pichia membranafacians Saccharomyces roussi Debariomyces hansenii Saccharomyces oleaginosis Candida krusei Saccharomyces cerevisial Saccharomyces chevaliere Kloekera apiculata Saccharomyces veroneae Candida tropicalis B. METODOS. 1.- Seleccién del material. Para la seleccién de las especies objeto de nuestro estudio, hemos recogido en riachuelos, estanques y charcas de las provincias de Sevilla y Huelva muestras de aguas’ jun to con pequefias plantas acudticas, hojas muertas, algas, etc. Estas muestras fueron tomadas en frascos de plasti- co y' 1llevadas al laboratorio para su estudio. Porciones de cada muestra se colocaron en tazas de Boveri con los distin tos medios de cultivo que describiremos a continuacién y fue33 ron examinadas en dias sucesivos, durante los cuales, a la vez que haciamos un estudio sistematico de las especies ob servadas, seleccionabamos aquellas més interesantes para el estudio citoldgico. Para la clasificacién de las especies hemos utili- zado principalmente las claves de KUDO (47), las de KAHL (41) y las de JAHN y JAHN (38). 2.- Medios de cultivo. Como medios de cultivo para 1a obtencién de células abundantes que nos permitiera realizar los estudios previs- tos hemos empleado los siguientes: Medio de extracto de suelo.- Este medio se prepara partiendo de una solucién madre que se obtiene mezclando 100 gr. de tierra (que no esté abonada con sustancias mine- rales) con 500 ml. de agua destilada; la mezcla se lleva al autoclave y se tiene alli durante dos horas a 130°C, luego se mezclan 50 ml. de esta solucién madre con un litro de agua destilada y desionizada. A esta mezcla se le afiaden 4 ml. de soluci6én de NO,Na al 0,4% y un ml. de soluci6n de PO,HNa, al 0,08%. Por Gltimo se esteriliza al autoclave du- rante 30 minutos a 1202C. 7 A este medio de cultivo se afiadié como alimento se- gin los casos:34 - Colpidium sp.- Cultivado en medio de extracto de suelo al que se le afiadfa una pequefia cantidad de harina integral de trigo. - Colpidium sp. y Chilomonas sp.- Cultivados conjun- tamente en medio de extracto de suelo con harina integral de trigo. - Diversas especies de levaduras que fueron cultiva das en agar Nagai. La composicién del agar Nagai es la siguiente: Extracto de levadura. see 2 ge. Peptona bacteriolégica.......eeree ceevee 158 gr. Sulfato aménico..........5. Lives oceeeces 1a5'9h. Fosfato monopotasico Pere reas he et Rete eer eerie 10 gr. Aga reer eeeeee tire reece eter sees 18 gre Agua destilada pao 1000 ml. El pH final se ajusta a 5,5. Preparacién: Los compuestos se disuelven en autocla ye durante cinco minutos, una vez disueltos se filtra; se reparte en tubos 9 matraces y se esteriliza en el autoclave durante 20 minutos a 1202C cuidando de que no suba la tempe ratura.35 Medio de infusién de lechuga.- Este medio, recomen- dado por WICHTERMAN (78), se prepara de la siguiente forma: Se lavan unas cuantas hojas de lechuga en agua co- rriente. Se colocan extendidas sobre un papel de filtro y se Ilevan al horno para que se desequen lentamente hasta que adquieran un color amarillento y se hacen quebradizas. Se trituran en un mortero hasta dejarlas reducidas a polvo. A continuacién a un litro de agua destilada hirviendo, se Je afiade un gramo del polvo de lechuga anteriormente prepa- rado y se deja reposar durante cinco minutos, se filtra, se esteriliza en matraces de 200 ml. en autoclave a 120°C durante 30 minutos. Antes de filtrar, es conveniente afladir carbonato caélcico para neutralizar e¥ medio. Este medio lo hemos utilizado casi siempre diluido a la mitad con extracto de suelo. 3.- Observa Con microscopio estereoscépico.- Las especies selec cionadas han sido observadas en vivo bajo 1a lupa binocular, con objeto de ver su modo de locomocién, flexibilidad y as- pecto externo. Con eT microscopio.- Las observaciones con el micros copio, casi siempre en contraste de fases, se han realiza- do mediante el método de 1a gota pendiente y también entre36 porta y cubre. Dado que estos organismos presentan un movi- miento bastante rapido hemos tenido que emplear una técnica que nos permitiera disminuir la velocidad y que ha consisti do en afiadir al medio alguna sustancia, en nuestro caso la metil-celulosa, que lo hagan viscoso, con 1o cual los orga- nismos se mueven muy lentamente y se pueden observar con fa cilidad detalles de morfologfa, estructura y disposicién de los orgénulos externos. 4.- Tincién de orgénulos superficiales. Para poner de manifiesto estos orgdénulos hemos em - pleado las dos técnicas siguientes: Método de PEREZ-SILVA y RAMIREZ-MONTESINOS (53). Este procedimiento consiste esencialmente en la fi- Jaci6én de los organismos con tetréxido de osmio, coloracién los orgdnulos con cristal violeta y mordentado con gliceri- na yodada. El fijador es una solucién acuosa de tetréxido de osmio al 2%, tamponada a un pH de 7,6 segGn PALADE (52). El cristal violeta se prepara en solucién alcohéli- ca concentrada, cuya composicién es: Cristal violeta.......... 1 gr. Etanol de 962 20 mi.37 Esta solucién no se altera con el tiempo siempre que se conserve herméticamente cerrada para evitar la eva- poracion. La solucién de trabajo se obtiene afiadiendo una go ta de la soluci6n anterior, a 5 ml. de agua destilada. Es conveniente utilizar esta solucién recién preparada. La glicerina yodada se prepara mezclando dos partes de glicerina y una de solucién de lugol. Esta altima tiene la siguiente composicién: Yoduro potésico..........--- 0,6 gr. Yodo. .seeeeeee Gebevbcbevecee 0,3 gr. Agua destilada...........--. 90 ml. Método.- En un cubreobjetos se colocan una o dos go tas del cultivo de protozoos y con una pipeta muy fina se ya retirando liquido hasta dejarlos casi en seco. Después se afiade una gota del fijador, el cual se deja actuar duran te varios minutos, y luego se afiaden dos otres gotas de la solucién de cristal violeta y Bajo la lupa se observa la co loracién progresiva de los org4nulos superficiales hasta que han tomado una coloracién violeta intensa, en cuyo momen to se detiene la coloracién mediante la adicién de una gota de glicerina yodada. A continuaci6n se retira parte del liquido, se afiade38 una gota de glicerina limpia y se monta sobre un portaobje- tos. En la técnica original, los protozoos eran tefiidos en un porta excavado y de alli eran pasados a un porta usual mediante una pipeta, y se montaba la preparacién; pero noso tros hemos comprobado que el hecho de tefirlos directamente sobre el cubreobjetos, evita la deformacién o pérdida del material, ya que no son necesarias tantas manipulaciones. Con esta técnica, en las preparaciones bien teflidas, los organulos superficiales (cirros, membranas, membranelas) toman una intensa coloracién violeta, que destaca sobre un fondo ligeramente tefiido de este mismo color. Estas prepara ciones no son permanentes, pero se comservan varios dias, si bien se va perdiendo la coloracién de los cirros al tiem po que se intensifica la de los niécleos. odo de BORROR (13 Esta técnica se basa en el empleo de una mezcla fija dora-colorante, que se obtiene incorporando al fijador de NISSENBAUM (51) una solucién de nigrosina-formol segdn DEROUX y FARDY (21), y que tifie especfficamenté los cilios y otras estructuras superficiales de los ciliados. Para la realizacién de esta técnica se necesitan dos39 soluciones madre, que son las siguientes: Soluci6n A.- Consta de 10 ml. de solucién acuosa saturada de CloHg; 2 ml. de Acido acético glacial; 2 ml. de formol concentrado; y 10 ml. de t-butanol. Solucién B.- 20 ml. de soluci6n concentrada de for mol; 4 gr. de nigrosina soluble en agua; 100 ml. de agua destilada. La solucién de trabajo se obtiene mezélando 12 volad menes de Ja solucfén A con un voldmen de la soluci6n B. Procedimiento: Se coloca una gota de un cultivo abun dante de organismos sobre un portaobjetos limpio, y con una pipeta se deja caer desde una altura de 2-3 cm. una gota de Ja solucién de trabajo. Después de varios segundos se incli. na Tigeramente el portaobjetos a fin de que el exceso de li quido se deslice a la vez que.se afiaden nueyas gotas de la soluci6n de trabajo. Después de este procedimiento, los or- ganismos quedan fijados, tefiidos y adheridos al portaobjetos, y al cabo de 15 segundos, la preparacién se puede deshidra- tar, clarificar y montar. En las preparaciones hien tefiidas los orgdnulos ci- lfarés aparecen en negro, sobre un fondo gris claro.40 Inclusi6n en resinas y observaci6n de cortes por microscopfa de contraste de fases. Esta técnica serd descrita mas adelante ya que es la misma empleada para las observaciones al microscopio electrénico, salvo que los cortes, de 2 u de espesor, se hicieron en el Piramitén y se montaron con aceite de inmer sién entre porta y cubre. 5.- Tincién de nicleos. Para el estudio de la morfologfa de los niicleos y de los procesos carjolégicos que tienen lugar en la divisi6n, conjugacién y exquistamiento hemos utilizado las siguientes técnicas: Tinci6n con orcefna aceto-clorhidrica.- Hemos segui do la técnica descrita por TJIO y LEVAN (72). El colorante se preparé como sigue: 2 gr. de orceina sintética GURR, se disolvieron en 55 ml. de Acido acético glacial calentado hasta ebullicion y manteniendo ésta durante diez minutos. A continuacién se deja enfriar y se afiade agua destilada has- ta completar 100 ml. y se deja reposar durante 24 horas, después de las cuales, se filtra, y se afiade C1H 1N en pro- procfén de una parté de acido clorhfdrico por cada nueve de Ja solucién de orceina acética.41 En nuestro caso, 1a solucién asi preparada nos re- sultaba excesivamente concentrada, por lo que 1a soluci6n de trabajo la obtentamos diluyendo la anterior, al 50%, con dcido acético glacial al 45%. Las preparaciones se realizam colocando en un por- taobjetos una gota de un cultivo abundante de protozoos y, con una pipeta fina, se va retirando el liquido hasta de- jarlos casi en seco; a continuacién, se afiade sobre ellos una gota de la solucién de orceina, se deja actuar por va rios minutos, se coloca un cubreobjetos y se puede obser- var al microscopio. Esta técnica presenta las ventajas de una gran ra- pidez y de provocar un ligero hinchamiento de los nfécleos, lo cual hace que éstos sean mis facilmente visibles; pero presenta el inconveniente de que las preparaciones no son permanentes y s6lo pueden ser observadas durante algunas horas. Tincién con Verde de metilo-pironina-naranja G Para esta tincidén hemos utilizado la mezcla neutra de GROSSO (63) que se prepara de la siguiente forma: A 75 ml. de.agua destilada se van afiadiendo sucesi vamente, y precisamente por este orden, soluciones acuosa saturadas en las siguientes cantidades:42 Verde de Metilo........ veecees 352 Mm. Pironina wees - 6,0 ml. NaranjaiG..... seeeee Vecersecee TO. mt. A las 24 horas se filtra esta solucién, que queda asi preparada para ser usada, conservandose durante mucho tiempo sin alterarse. Procedimiento.- Los protozoos se fijan sobre portaob jetos previamente gelatinados con metanol-acético en propor cién 3:1, y antes de que se sequen se le afiade una gota de alcohol de 962. Se pasa por los alcoholes 962, 702, 40° y agua, se vierte el colorante encima y se deja actuar duran te 5-10 minutos. A continuactén, se escurren el colorante, se lava con alcohol absoluto y, después de pasar las prepa raciones dos veces por alcohol absoluto y xilol, se montan con caedax. En las preparaciones bien tefidas, los ndcleos apare cen en verde; el citoplasma, de un ligero color rosa, y las yacuolas digesttvas, st las hay, de color naranja. Tirict6n dé Feulgen.- Para esta tincién hemos emplea do los siguientes reactivos: Ffjador de Sanfelice compuesto de: Acido crémico al 1%. FOrMol.....seeeeeee eee Actdo acético.........43 Hidrolisis.- Se Tley6 a cabo en C1H IN. Reactivo de Schiff.- Lo hemos preparado de la forma siguiente: lgr. de fucsina se pone en um matraz Enlermeyer con 200 ml. de agua hirviendo y después de unos cinco minutos se pasa por decantaci6n a otro matraz. Se deja que se enfrie hasta 50° y se filtra. Se afiaden 20 mi. de C1H 1N se enfria al chorro de agua hasta 252, y se disuelve en el liquido un gr. de SO,HNa. Se deja reposar 24 horas a la temperatura am- biente mientras la soluci6n se decolora. Este reactivo se ha de conservar en la oscuridad y bien cerrado. Agua sulfurosa.- Se mezclan 200 ml. de agua corrien te con 10 ml. de una solucién al 10% de SO3HNa y 10 ml. de CIH IN. Esta mezcla ha de utilizarse recién preparada. Procedimiento.- Se coloca una gota de suspensi6n de protozoos sobre un porta con albdmina, se retira el agua con una pipeta muy fina y se afiaden unas gotas de solucién de Sanfelice. Aicontinuacién, se va separando la parte li- quida hasta dejar los protozoos casi en seco y se lleva el portaobjetos a una placa de petri grande que tiene en el fondo un papel de filtro empapado en formol al 40%, y una varilla que sirve de soporte al porta; se deja estar de 15 a 20 minutos y después, sin quitarlo de alli, se ponen unas gotas de Sanfelice sobre la preparacién y se deja estar to-44 da 1a noche. Al dia siguiente, se escurre el Sanfelice, se lava con agua durante 15 a 20 minutos y se pasa por la serie de alcoholes hasta llegar al de 962 donde se deja toda la no- che. Se hidrata pasando por la serie de alcoholes de concentracién decreciente hasta agua y se procede a la hi- drolisis introduciendo el porta primeramente en C1H 1N frio, después se tiene durante 8 minutos en C1H 1N a 602,y por dltimo se pasa nuevamente a C1H frio. Se lava con agua y se tiene en el reactivo de Schiff durante hora y media. Pasado este tiempo, se lava tres veces con agua sul furosa, 2 minutos cada vez, en tres pocillos diferentes; por Gltimo, se lava con agua, se pasa por la serie de alco_ holes y se monta la preparaci6n. 6.- Tinciones para 1a observacién con fluorescencia. Para el desarrollo del esbozo partimos de un culti- vo de exconjugantes del que hicimos sucesivas preparaciones a dtstintos tiempos después de su separacién. La fijactén se 1levé a cabo sobre el portaobjetos con una solucién recientemente preparada y compuesta de tres partes de metanol absoluto y una parte de dcido acéti co glacial.45 Los colorantes empleados fueron los siguientes: Tincién con Naranja de Acridina.- La solucién de trabajo se obtuvo preparando diluciones 1/10.000 y 1/50.000 en tampén fosfato de Sorensen con un pH de 6,8; 7,0 a par- tir de una solucién stock de Naranja de Acridina (Merck) 0,1% en agua destilada conservada en nevera a 4°C. El tiempo de tincién fué de 10 minutos y posterior mente fueron lavadas las preparaciones para lavar el exce- so de colorante en dos bafios de 2-5 minutos de tampén fos- fato de Sorensen, pasando posteriormente a montar las pre- paraciones en el mismo tampén. Tincién con Corifosfina.- La solucién de trabajo fué preparada a partir de una solucién stock de Corifosfina (G.T.GURR. Londres) a1 0,5% en tampGm acetato pH = 4,4 por diluci6n hasta 1/20.000 y 1/25.000 con solucién fosfato-fe nol-salino, pasando posteriormente a 1a solucién de colo- rante durante diez minutos tras los cuales eran montadas en el tampén antes mencionado y observada en el microscopio de fluorescencia. Para la observacién en fluorescencia fué usado el dispositiyo de fluorescencia del fotomicroscopio Zeiss con filtros de excitactén BG38 y BG12 y filtros analizadores 53/44 estando preyisto el dispositive de fluorescencia con46 lémpara Osram HBO-200 de alta presién. 7.- Técnicas para la microscopia electrénica.- Fijacién.- Para la fijacién se empleé una soluci6n de tetréxido de osmio al 2% en un tampén de acetato de ve- ronal a pH 7,4. E1 tiempo de fijaci6n fué de 20 minutos. Inclusién.- E1] material previamente fijado, se in- cluyé en agar, cortandose a continuaci6n en pequefios bloques, a fin de facilitar su manipulacion. La deshidratacién de estos pequefios bloques se Ilevé a cabo en una serie de alcoholes desde 50% hasta 100%, a continuacién se lavaron en 6xido de propileno y se incluye- ron en Epon 812. Estas inclusiones fueron talladas con e] Piramiton donde se hicieron a su vez cortes gruesos (2 micras de espe sor) para su examen con mtcroscopfa de contraste de fases, y a continuacién se hicieron los cortes ultrafinos para el microscopio electrénico en un Ultramicrotomo LKB. Parte de los bloques se enyiaron al Departamento de Protozoologfa del Instituto "Jaime Ferrén" del C.S.1.C., donde la Dra. Gil Alvarez, hizo los cortes y las micrografias electréni- cas en el Servicio de Microscopio Electrénico del Centro de Inyestigaciones Biolégicas.RESULTADOS48 A.- ESTUDIO SISTEMATICO DE LOS CILIADOS DEL VALLE DEL GUA- DALQUIVIR. Esta parte de ia Tesis tiene por objeto el buscar especies apropiadas para el estudio tznto morfolégico como de los procesos de reorganizacién del macrondcleo. Al mis- mo tiempo nos sirve para ampliar los datos sobre los proto zoos de la Peninsula Ihérica, ya que el Valle del Guadalqui vir, que nosotros sepamos, no ha sido estudiado nunca en este sentido; sin embargo cémo el objeto principal de esta exploracién en la seleccién de material no nos hemos dete~ nido especialmente en la identificacién de las especies, si bien, hemos procurado reflejar todos los datos posibles en cuanto a la localizacién de las muestras y en algunos casos otros datos referentes a las muestras de agua. Para mayor comodidad los resultados se exponen a continuacién en un cuadro donde se indica procedencia de la muestra y los protozoos encontrados. Con un asterisco se sefialan Tos seleccionados para su estudio.49 CUADRO I.- Ciliados observados en las distintas muestras de MUESTRA aguas y musgos recogidas en las provincias de Se villa y Huelva. Frotonia sp. Sonderia sp. Euplotes sp. Paramecium sp. Euplotes sp. Frontonia sp. Euplotes sp. Spirostomum sp. ronucleatum Frontonia sp. Urosoma sp. Loxodes magnus striatus PROCEDENCIA CILIADOS OBSERVADOS Canal de Pue- Stentor coeruleus bla del Rio. Loxodes magnus 1 " striatus " rostrum Spirostomum sp. Canales del Urocentrum turbo borde de la ca Coleps elongatus Zi rretera de Pue Stylonychia sp. bla del Rio. Venta de la Urocentrum turbo 3 Cruz a 12 Km. Loxédes rostrum de Puebla del Paramecium multimic Rio. Charca en ca- Stentor coeruleus rretera de Spirostomum 4 Puebla del ‘cyclidium sp. Rio. Chilodonella cucullulus Rio Viar en Paramecium bursaria Cantillana. Urocentrum turbo 5 Stylonychia mytilus Paramecium caudatum Frontonia Teucas * Aspidisca sp. Euplotes sp.50 MUESTRA PROCEDENCIA CILIADOS OBSERVADOS Cantillana Keronopsis sp. Loxodes magnus 6. Rio Viar Stentor roeseli Trachelius sp. Charca de jun- Didinium nasutum Coleps elongatus * 7 cos en carretera Stylonychia mytilus de Cantillana. Dileptus anser Rio Viar, zona Trachelius ovum Stentor roeseli 8 derecha. Canti Frontonia acuminata Vorticela sp. Vana Paramecium bursaria Spirostomum sp. Stentor coeruleus Rio Viar. Can Frontonia sp. Dileptus anser 9 tillana. Trachelius ovum Stentor roeseli Rio Viar. Can. Chidodonella cucullulus 10 tillana. Charca de la Metopus sp. Caenomorpha me- il Rinconada, dusula Paramecium sp. Musgo de la Colpoda sp.” 12 azotea de la Facultad.51 MUESTRAS PROCEDENCIA CILTADOS OBSERVADOS Carretera Ama Didinium nasutum Spirostomum sp. rilla. Charca Paramecium sp. Frontonia sp. 13 a la salida Vorticella sp. Oxytricha sp. de Sevilla. Charca en ca Stylonichia Coleps sp. 14 rretera de Se Paramecium sp. Loxodes sp. villa a Brenes Stentor coeruleus Metopus sp. Vorticella sp. Carretera de Stylonychia sp. Euplotes sp. 15 Ja Rinconada —-Urocentrum turbo — , Arroyo Mira- Paramecium sp. Oxytricha sp. 16 flores. Carre Vorticella sp. tera de Brenes Arroyo las cu. Urocentrum turbo Frontonia sp. 7 lebras. Carre- Stylonychia sp. Euplotes sp. tera de Canti- Tlana. Musgo de un ca- Stylonychia sp. Paramecium sp. 18 nal en la carre Oxytrichia sp. tera de Brenes. Sierra de Ca- G0nestomum sp. Colpidium sp: 19 Chilodonela cucultulus bra.52 MUESTRA PROCEDENCIA CILIADOS OBSERVADOS Salinas de Frontonia sp. Dyophrys sp. 207 S. Fernando (Cadiz). Estanque de Stylonychia sp Trachelius ovum las magnolias. a1 Parque de M2 Luisa. (Sevilla) * Canal de Villa Stylonychia mytilus 22 franco del Gua dalquivir. Charca carre- Stentor coeruleus Paramecium sp. 23 tera de Alcalé Didinium nasutum de Guadaira. Canal de la Stentor roeseli Frontonia sp. 24 carretera de Urocentrum turbo Utrera. Chilodonella cucullulus Carretera de | Paramecium sp. 25 Alcala de Gua . daira. Carretera de Coleps hirtus 26 Alcala de Gua Oxytricha sp. daira.MUESTRA 27 28 29 30 31 32 33 PROCEDENCIA Charca de las Palmeras. Carre tera de Puebla. Charca del Par que de M2 Lui- sa (Sevilla). Torreblanca (carretera de Alcala de Guadai ra). Torfeblaica (carretera de Alcala de Gua- daira). Charca de To rreblanca. Torreblanca Torreblanca 53 CILIADOS OBSERYVADOS Lacrimaria sp. Stentor roeseli Vorticella sp. Dileptus anser Laurentia-sp. Oxytricha sp. Frontonia sp. Euplotes sp. Halteria Euplotes sp. Frontonia sp. Urocentrum turbo Paramecium sp. Urocentrum turbo Paramecium sp. Loxodes sp. Frontonia sp. Spirostomum sp. Frontonia sp. Paramecium sp. Frontonia sp.MUESTRA 34 35 36 37 38 39 PROCEDENCLA Canal de To- rreblanca. Parque de M9 Luisa (Sevilla). Estanque de los Lotos (Parque de M2 Luisa). Charca en ja carretera Canti llana-Villaverde. Coto de Dofiana (lucio del Pa- lacio). Coto de Dofiana (charca detras del Palacio). 54 CILIADOS OBTENIDOS Euplotes sp. Frontonia sp. Stylonychia mytilus Halteria sp. Stentor coeruleus Stylonychia sp. Coleps elongatus Stylonychia sp. Euplotes sp. Didinium nasutum Euplotes sp. Holosticha sp. Halteria sp. Frontonia sp. Uroleptus sp. Prorodon discolor Halteria sp.MUESTRA 40 41 42 43 44 PROCEDENCIA Pozo artesiano. Coto de Dofiana. Charca del Co to de Cofiana. Charca del Co- to Dofiana. Charca del Co- to de Dofiana. Charca del Co- to Dofiana. 55 CILIADOS OBTENIDOS Loxodes sp. Spirostomum sp. Sonderia sp. Halteria sp. Euplotes sp. Stylonychia sp. Frontonia leucas Urocentrum turbo Urosoma caudata Frontonia sp. Paramecium sp. Metopus sp. Lacrymaria sp. Oxytricha sp. Dileptus anser Stylonychia mytilus Lacrymaria sp. Euplotes sp. Frontonia leucas Halteria sp. Euplotes sp. Paramecium bursaria Frontonia sp. Lacrymaria sp. Frontonia leucas56 MUESTRA PROCEDENCIA CILIADOS OBSERVADOS Carretera del Frontonia sp. Halteria sp. 45 Coto de Dofiana Stentor igneus Stentor sp. (Huelva). Climacostomum virens Urostyla sp. Oxytricha sp. Stylonychia sp. Carretera del Halteria sp. Oxytricha sp. 46 Rocio. (Huelva). Paramecium sp. Urosoma caudata Lacrymaria sp. Stylonychia mytilus Charca en la Colpidium sp. 47 carretera de Holosticha sp. Constantina. Charca préxima Stylonycha sp. 48 a Cazalla. Oxytricha sp. Halteria sp. Chilodonella sp. B.- ESTUDIOS REALIZADOS CON LAURENTIA SP. Como se dijo en 1a introduccién se conocen dos espe cites de Laurentia descritas por DRAGUESCO (24) (25) creador del género y que, como veremos, son a primera vista muy pare cidas a Onychodromus, sobre todo Laurentia macrostoma, que57 suele tener el macronGcleo dividido en cuatro fragmentos tal como describié MAUPAS (48) para Onychodromus sin embargo, la dotacién y distribucién de los cirros es muy diferente y, por tanto, estos dos géneros son féciles de distinguir tan pronto como se hace una tincién de cirros, si bien el término de comparacién empleado ha sido siempre la descripcién e ilus traciones de MAUPAS, puesto que hasta el momento no conocemos otras descripciones. Por ello, nos parecié interesante hacer una descripcién detallada de la especie de Laurentia, que he- mos aislado, para luego hacer un estudio de las condiciones de cultivo, morfologfa, division, y exquistamiento asi como algunas observaciones sobre 1a conjugaci6n. 1.- Cond ones de cultivo.- Los Gnicos estudios publi. cados sobre Lavrentia son los de DRAGUESCO, los cuales son bastante incompletos ya que solo se hace una descripci6n par- cial sobre individuos que probablemente se encontraban en las muestras originales, sin haber sido previamente aislados y cultivados; por ello, creimos necesario establecer las condi- ciones de cultivo en que estos ciliados se desarrollan mejor, sin lo cual serfa imposible estudiar los procesos de division y¥ Morfogénesis. Dada su afinidad con Stylonychia, probamos primeramen te los medios que segdn nuestra propia experiencia son mas apropiados para esta Gltima; asf ensayamos el medio de extrac58 to de suelo afiadjendo como alimento distintos protozoos o le vaduras. Cada uno de estos microorganismos se ensayaron como elemento en experimentos por duplicado para comprobar cual de ellos soportaba mejor el desarro-lo de Launentia. Se vid que en todas las levaduras probadas se desarrollaba pero len tamente. La adicién de una mezcla de Colpidium y Chilomonas, que, como veremos més adelante, es el alimento éptimo para Stylonychia, puede servir para el crecimiento de Laurentia, pero estos protozoos se alimentan principalmente de Colpidium, acumulandose los Chilomonas en el cultivo; por ello, el me- jor alimento result6é ser Colpidium sp, sobre el cual depredan activamente los Laurentia dividiendose con gran rapidez. To- dos los dem&s alimentos resultaron menos apropiados que Colpi dium. Cuando en lugar de medio de tierra se ponfa medio de infusién de lechuga se observaba tos primeros dias un creci- miento satisfactorio, que luego se hacfa m&s lento a medida que se enturbiaba el medio de lechuga debido al crecimiento de bacterias. Después de una serie de tanteos elegimos como medio éptimo para el cultivo de Laurentia, el siguiente: medio de extracto de suelo al que se afiade un cultivo de Colpidium sp. cultivado a su vez en medio de extracto de suelo al que se afiade harina de trigo integral. Es conyeniente que el Colpi-59 dium proceda de un cultivo de 5 dias como minimo. Dado que Laurentia es un depredador muy activo es conveniente que en lugar de afiadir todos los alimentos una vez diaria afiadirlo dos veces al dia. En cuanto a la temperatura de cultivo, hemos ensa - llado dejarlo a 1a temperatura del laboratorio o en una ca- mara climatizada a 202 C11 y no se han observado diferencias apreciables en el rendimiento de los cultivos. 2.- Descripcién.- Los ejemplares tefiidos por los mé- todos de PEREZ-SILVA y RAMIREZ-MONTESINOS (53) y de BORROR (13) experimenta relativamente pocas deformaciones, y por tanto la descripcién hecha sobre estas prepardciones coinci de prdacticamente con las observaciones que hemos hecho sobre individuos vivos por microscopfa de contraste de fases. Son de tamafio relativamente grande, de 250 a 320 u de longitud por 100 a 150 u de anchura méxima. E1 cuerpo es de contorno ovalado, més ancho por la parte anterior y estre chado por la parte posterior, que suele terminar en punta (fig.1). Es muy aplanado dorsoventralmente con muchos entran tes y salientes destacando una profunda depresién en la mitad anterior de 1a parte ventral (Fig.2). La_dotacién de cirros es bastante compleja y respon- de a la descripcién parcial que ha hecho DRAGUESCO (24) paraFig. 1.- Laurentia ‘sp.Micrograffa de un individuo visto por el lado ventral en la que se puede apreciar ‘ el aspecto general y Ja dotacién de orgdnulos superficiales. Técnica de BORROR. Laurentia sp. Micrograffa de un corte sagital de un individuo observado por microscopfa de con - traste de fases. Puede aprecierse que el cuerpo es aplanado dorsoventralmente, Esquema de la morfologfa general y de la dotacién de cirros de Laurentia sp, Dibujado sobre proyec- ctones de diapositivas hechas a partir de prepara. ciones tefitdas por el método de PEREZ-SILVA y R. MONTESINOS y de BORROR. Fig.Fig. 4.- Laurentia sp. Micrograffa de un corte longitudt- nal observado por mtcroscopfa de contraste de fa ses. Se puede apreciar parte de la zona adoral de membranelas, 1a membrana ondulante que delimit tan el amplio peristoma. Fig. 5 y 6.- Laurentia sp. Micrografias de dos cortes ho- rizontales pertenectentes a una misma serie en las que puede apreciarse que la zona de membrane las penetra en el interior de la célula y dos fragmentos de macrondcleos, en uno de ellos se dis. tinguen unos corpdsculos més oscuros que se corres ponden con los nucleolos.60 Laurentia macrostoma, basada en las observaciones sobre unos pocos individuos. Nosotros, después de haber observado cerca de 600 individuos creemos que podemos dar una descripci6n bastante completa de la distribucién de los cirros y membra- nelas. El peristoma es muy amplio (Fig.3, 4) de forma trian gular y en su parte anterior pasa al lado dorsal. Por su parte posterior termina en punta hacia 1a mitad del cuerpo. Esté bordeado por unas 60 membranelas muy desarrolladas so- bre todo las que se insertan en el borde anterior del cuer- po del individuo, haciendose cada vez mas pequefias a medida que se acercan al vértice del peristoma, el cual penetra ha- cia el interior de la célula (Figrs. 5 y 6). En las microgra fias electrénicas se observa que cada membranela esta forma- da por tres filas completas de cilios (Figrs. 7 y 8) a las que se afiade una cuarta fila incompleta, formada por dos o tres ctlios. En el borde derecho del peristoma se observa clara- mente una membrana ondulante (Fig. 9) en las preparaciones tefiidas con cristal violeta o con nigrosina, y en los cortes favorables observados por microscopia de contraste de fases puede apreciarse que ocupa aproximadamente las tres cuartas partes del borde derecho del peristoma. Los cilios que la integran son relativamente largos. De las micrograftas elec trénicas puede deducirse que hay dos membranas o bien queFigrs. 7 y 8.- Lauzentia sp. Micrograffas electrénicas en las que puede apreciarse que las membranelas es- tan formadas por tres filas de cilios. En una de las membranelas se observa una 42 fila formada por tres cilios, (Fig.7).x 8.094 y x10.000.- Laurentia sp. Micrograffa de un individuo visto por la cara ventral en el que puede apreciarse claramente la membrana ondulante en el borde dere cho del pertstoma. Por delante de esta membrana se distingue el cirro bucal y a la derecha de ella Tas hileras de cirros frontoventrales. Tinctén de BORROR.61 dicha membrana es doble, aunque Jas dos hileras muy cerra- das de cilios que se cbservan, estén bastantes separadas entre. sf (Fig. 10). Bordeando la cara ventral del animal hay una hilera de cirros marginales a cada lado (Figrs. 1 y 3). Los cirros marginales derechos se extienden desde la parte anterior del cuerpo hasta el vértice posterior y su némero oscila en tre 40 y 45. La hilera marginal izquierda estd formada por 25 a 30 cirros aproximadamente del mismo tamafio que los mar ginales derechos. Esta hilera comienza en las proximidades del vértice peristomético y, por tanto, muy cerca de la li- nea media del individuo, y desde alli se dirige hacia el margen, siguiendo hasta el extremo posterior del cuerpo, don de se continda con la hilera derecha. Los cirros frontoventrales (Figrs. 1, 3 y 9_ se dis ponen formando las seis hileras admitidas por BORROR (15) y que se designan con los ndmeros romanos del I al VI. La hilera I no contiene més que el cirro bucal (Fig.9), que es quizdés el més desarrollado de todos y esta situado inmediatamente delante del extremo anterior de 1a membrana ondulante: La hilera II est& formada por cinco cirros que se alinean a la derecha de la membrana ondulante y siguiendo .-Fig. 10.- Laurentia sp. Micrograffa electrénica de un cor te horizontal de un individuo, que afecta el mar gen derecho del peristoma. Pueden apreciarse dos hileras cerradas de cilios que forman parte de la membrana ondulante. x3.192,62 una direccién paralela a ésta, estos cirros estan ligeramen te menos desarrollados que el cirro bucal, pero, son més robustos que los de Jas restantes hileras. La hilera III se extiende desde 1a parte anterior hasta el extremo posterior del peristoma y esté formada por siete cirros dispuestos regularmente y de tamafio bastante menor que los de la hilera Il. La hilera ndmero IV rebasa el vértice peristomatico, Tegando casi hasta 1a parte anterior de los cirros trans- versales, y esté formada por siete u ocho cirros sensiblemen te iguales a los de la hilera III. La hilera V comienza algo més retrasada que la IV y se extiende hasta las proximidades de los cirros transversa Jes; esta formada por ocho o nueve cirros. La hilera VI paralela a la anterior consta de ocho o nueve cirros y termina muy préxima a los cirros transversa les. A la derecha de esta dltima hilera y en su parte posterior existen de dos a cuatro cirros alineados que puede considerarse como una VII hilera muy reducida. Los cirros transversales son bastante m&és largos que Jos anteriores y algo mas robustos. Suelen ser seis, o siete de los cuales cuatro forman hileras y los otros dos estan si