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HISTOPA ULTRA TRA-ESTRUTURAIS ASPECTOS HISTOPATOLGICOS E ULTRA-ESTRUTURAIS DA LEISHMANIOSE CUTNEA DIFUSA (LCD) DIFFUSE CUTANEOUS LEISHMANIASIS (DCL) HISTOLOGICAL AND ULTRAESTRUCTURAL ASPECTS
Achila Lisboa Bittencourt Servio de Anatomia Patolgica do Complexo Hospitalar Universitrio Prof. Edgard Santos, Universidade Federal da Bahia - UFBA

Neste captulo sero considerados os aspectos histopatolgicos da leishmaniose cutnea difusa (LCD) polar, da LCD subpolar e da leishmaniose cutnea dimorfa. Nas leses no involudas da LCD polar, observam-se macrfagos vacuolados e repletos de parasitos, obscurecendo as estruturas da derme e, muitas vezes, da hipoderme (padro macrofgico). Este aspecto , frequentemente, associado atrofia epidrmica com faixa de Unna e, profundamente, a discreta infiltrao linfoplasmocitria. Nas leses involudas espontaneamente ou por ao de tratamento antimonial pentavalente (Sb+5), vem-se acentuao do infiltrado linfoplasmocitrio, diminuio do volume dos macrfagos e do parasitismo e reas de fibrose ao lado de necrose citoltica. Na LCD subpolar, o padro macrofgico menos acentuado e alterna-se com reas de infiltrado linfoplasmocitrio, de necrose citoltica e, por vezes, de infiltrao de eosinfilos. Na LC dimorfa, aspectos de ambas as formas polares da leishmaniose so observados em uma mesma leso ou em leses diferentes. O parasitismo menos acentuado e clulas gigantes e epitelioides so observadas ao lado de infiltrado linfoplasmocitrio mais intenso. No entanto, granulomas bem organizados no so vistos. O principal diagnstico diferencial destas formas de leishmaniose a leishmaniose drmica ps-calazar. Ultraestruturalmente observam-se, na LCD, lise de macrfagos, destruio parasitria no interior dos macrfagos, contato ntimo entre linfcitos e macrfagos parasitados e entre linfcitos e amastigotas. Tais aspectos associados infiltrao linfoplasmocitria e a fibrose sugerem ocorrer uma resposta imune celular limitada nestas formas de CL, embora insuficiente para controlar a infeco, a resposta imune poderia ser capaz de causar a involuo espontnea de algumas leses. Na LCD subpolar, estudos ultra-estruturais mostraram contato ntimo entre eosinfilos e macrfagos parasitados e lticos e a presena de grnulos de eosinfilos no citoplasma de macrfagos parasitados ou entre as membranas dessas duas clulas, o que leva a crer que a degranulao do eosinfilo possa constituir outro importante mecanismo parasiticida. Palavras-chave: leishmaniose cutnea difusa (LCD), histopatologia, estudos ultra-estrutural, Leishmania amazonensis. In this chapter, the histopathological aspects of diffuse cutaneous leishmaniasis (DCL), subpolar DCL and borderline cutaneous leishmaniasis are described. Microscopically, DCL consists of a monotonous infiltrate of vacuolated and heavily parasitized macrophages replacing the dermis and sometimes the hypodermis (macrophagic pattern). This pattern is frequently associated with epidermal atrophy and Unnas band. In the deep dermis foci of mild lymphoplasmacytic infiltration is usually seen. The increase of lymphoplasmacytic infiltration, the presence of fibrosis and the occurrence of macrophages with smaller vacuoles and fewer parasites are generally associated with involution of lesions that may occur spontaneously or under pentavalente antimonial (Sb+5) treatment. In the subpolar DCL, the parasitism and macrophagic pattern is less marked, and is intermingled with lymphoplasmacytic infiltration, cytolitic necrosis and eosinophils. In the borderline form of leishmaniasis aspects of both polar forms of infection are observed in the same lesion or in different lesions. The parasitism is less marked and giant and epitheloid cells are present associated with a more intense lymphoplasmacytic infiltration. However, well organized granulomas are not observed. Ultrastructurally it has been observed in DCL macrophage lysis, parasitic destruction within intact macrophages, close contact between parasitized macrophages and lymphocytes, and between parasites and lymphocytes. Such aspects associated with the lymphoplasmacytic infiltration and fibrosis suggest a limited CMI response in DCL. Although insufficient to control infection, the immune response may be able to promote the spontaneous regression of some lesions. Key words: Diffuse cutaneous leishmaniasis (DCL), histopatology, ultaestructural studies, Leishmania amazonensis.

Assim como a hansenase, a leishmaniose cutnea apresenta um espectro de aspectos clnico-imuno-patolgicos variando das formas clssicas cutnea e mucocutnea, representando o polo responsivo, leishmaniose cutnea
Recebido em 16/05/2009 Aceito em 08/06/2009 Endereo para correspondncia: Dra. Achila L. Bittencourt. Complexo Hospitalar Universitrio Prof. Edgard Santos, Universidade Federal da Bahia, Rua Dr. Augusto Viana, s/n. - Canela - CEP: 40.110-060, Salvador, Bahia, Brazil. Gazeta Mdica da Bahia 2009;79 (Supl.3):45-51 2009 Gazeta Mdica da Bahia. Todos os direitos reservados.

difusa (LCD) que constitui o polo no responsivo ou anrgico(12). Entre estas formas polares, j se descreveram as formas dimorfa e subpolar, esta ltima com aspecto intermedirio entre as formas difusa e dimorfa(1,12,14). A LCD foi descrita, pela primeira vez, em 1945, por Silva,(21) em um paciente natural da Bahia, sob a denominao de leishmaniose drmica no ulcerada em ndulos e placas infiltradas e hiperpigmentadas, com estudo clnico e histopatolgico. Este paciente foi, posteriormente, reestudado e acompanhado durante vrios anos na Clinica Dermatolgica da Faculdade de Medicina da Bahia e includo,

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Gaz. md. Bahia 2009;79 (Supl.3):45-51 maioria, mostram profundamente, discreta a moderada infiltrao linfoplasmocitria. Nas leses involudas espontaneamente ou por ao de tratamento, vem-se acentuao do infiltrado linfoplasmocitrio e reas de fibrose (Figura 3) e de necrose citoltica(7). Estudando bipsias de LCD, realizadas em leses ativas e em involuo, com ou sem ao de tratamento com antimonial pentavalente (Sb+5), observou-se que as leses em involuo apresentavam maior intensidade do infiltrado linfoplasmocitrio e de fibrose e menor parasitismo. A variao dos aspectos histopatolgicos foi observada, inclusive, em um mesmo paciente em bipsias realizadas no mesmo dia(3). Nos casos de LCD polar e subpolar, no h referncia ao encontro de reao granulomatosa em qualquer fase evolutiva da doena, exceo feita a casos submetidos a tratamento com interferon- associado ao antimnio, quando se observa este aspecto histolgico associado a acentuado infiltrado linfoplasmocitrio e hiperplasia epidrmica (observao pessoal) (Figura 4). A presena de eosinfilos na LCD raramente observada(1). Convit & Kerdel-Vegas(11), referem que nas leses iniciais da LCD visto o mesmo aspecto macrofgico das leses mais avanadas. No entanto, no BALB/c infectado por L. amazonensis, que mostra aspectos semelhantes a LCD humana, foi observado, nas primeiras 24 horas ps-infeco, acentuado predomnio de neutrfilos, os quais foram os principais responsveis pela fagocitose e destruio dos parasitos. Encontraram-se, em menor proporo, macrfagos e eosinfilos parasitados. No perodo de uma a quatro semanas, o infiltrado foi misto, com predomnio de macrfagos e com um nmero razovel de eosinfilos. Estas clulas, por vezes, chegaram a constituir 20% do infiltrado inflamatrio. Neste perodo, as clulas mais freqentemente parasitadas foram os macrfagos. O nmero de linfcitos aumentou progressivamente at ficar em torno de 7%, no final da quarta semana. Na fase tardia da infeco, entre a stima e a 13 semana, observou-se infiltrado inflamatrio misto alternando com reas constitudas por macrfagos parasitados e vacuolados. Contudo, no final desta fase, o aspecto histolgico foi montono, constitudo quase que exclusivamente por macrfagos volumosos e repletos de parasitos. Nesse estudo, viu-se que logo no inicio da infeco os neutrfilos foram s clulas mais efetivas na destruio parasitria(16). Patologia das leishmanioses dimorfa e leishmaniose cutnea difusa subpolar H referncia a dois casos de LC dimorfa na literatura nacional, ambos com teste de Montenegro negativo. Um deles apresentou, simultaneamente, ppulas, ndulos e lceras. Os aspectos histolgicos variaram nas diferentes leses. Em uma bipsia, encontrou-se aspecto macrofgico e, na outra, infiltrado linfoplasmocitrio com reao granulomatosa desorganizada ao lado de pequena quantidade de macrfagos parasitados (Figura 5)(14). O outro caso mostrou ndulos e

em 1968, em uma publicao sobre imunopatologia da LCD(2). Vrias denominaes tm sido propostas para esta forma de leishmaniose. Alguns autores preferiram design-la como leishmaniose anrgica hansenide (22), devido algumas semelhanas que apresenta com a hansenase virchowiana. No entanto, a designao de LCD a de uso mais generalizado e parece ser a mais adequada. Embora existam casos espordicos de LCD com leses localizadas, sabe-se que essas formas disseminam-se posteriormente, num espao de tempo que varia de poucos meses a alguns anos(11). A LCD apresenta aspectos clnicos, imunolgicos, parasitolgicos e anatomopatolgicos bem diversos da leishmaniose cutnea (LC) e cutneo-mucosa (LCM) (Tabela 1). No se deve confundir a LCD com a leishmaniose cutnea (LC) disseminada que uma forma diferente de LC, entidade bem caracterizada nos seus aspectos clnicopatolgicos e imunolgicos(9). Neste captulo sero abordados os aspectos patolgicos e ultra-estruturais da LCD americana. Patologia da leishmaniose cutnea difusa Descreve-se, geralmente, na LCD um quadro montono constitudo por macrfagos vacuolados e repletos de parasitos, obscurecendo as estruturas da derme e da hipoderme (Figura 1)(12,21). Este aspecto chamado de padro macrofgico. Os vacolos so produzidos pelo acmulo de parasitos e no contem gordura, como na hansenase virchowiana. In vivo, devem apresentar-se abarrotados de parasitos, que, em sua maioria, perdem-se durante o processamento do tecido. Os macrfagos vacuolados diminuem de volume medida que se aproximam dos planos profundos da pele, embora permaneam parasitados(7). Para melhor avaliar o grau de parasitismo das leses, deve-se avaliar o ndice parasitrio das mesmas(1). Tm sido usados, para esta avaliao, os critrios adotados por Ridley & Jopling(17) para a hansenase. Considerando que alguns autores referem o padro macrofgico da LCD como reao granulomatosa(12,18), importante definir o critrio de granuloma usado neste captulo. Granuloma considerado como leso inflamatria crnica, onde alm de clulas mononucleares so vistas clulas epitelioides e ou clulas gigantes multinucleadas(10,19). De acordo com este conceito, quando os pacientes no so submetidos a imunoterapia, no existe granuloma na LCD polar e subpolar. O aspecto macrofgico frequentemente associado atrofia epidrmica e a presena de faixa de tecido conjuntivo no infiltrado (faixa de Unna), logo abaixo da epiderme, do mesmo modo como ocorre na hansenase virchowiana (Figura 1). No entanto, esse achado no constante, vendo-se, por vezes, principalmente em bipsias de zonas de atrito, acantose e o infiltrado macrofgico invadindo a membrana basal da epiderme e, menos frequentemente, a prpria epiderme (Figura 2)(7). J foram observados parasitos tambm no interior de clulas de ductos sudorparos(2). As bipsias de LCD em sua

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Figura 1. LCD Polar. Atrofia epidrmica, faixa de Unna e difusa infiltrao de macrfagos vacuolados e parasitados. Profundamente, h discreto infiltrado mononuclear. HE, Aumento original 100.

Figura 2. LCD Polar. Epiderme com acantose invadida por macrfagos parasitados. H destruio da camada basal da epiderme e aspecto macrofgico na derme. HE, Aumento original 125.

Figura 3. Leso de LCD em regresso. Vem-se fibrose e denso infiltrado linfoplasmocitrio. HE, Aumento original 125.

Figura 4. Caso de LCD polar aps tratamento com IFN-gama. A V-se hiperplasia epidrmica e infiltrado linfoplasmocitrio. HE, Aumento original 50. B Reao granulomatosa. HE, Aumento original 125.

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Gaz. md. Bahia 2009;79 (Supl.3):45-51 Figura 6. LCD subpolar, leso ulcerada. Presena de vrios eosinfilos. HE, Aumento original 125.

Figura 5. LC dimorfa. Granuloma desorganizado com clula gigante multinucleada (seta). HE, Aumento original 400.

Figura 7. LCD subpolar sem tratamento. Presena de mltiplas reas de necrose citoltica. HE, Aumento original 250.

Figura 8. Esfregao de leso de LCD. Observar o ncleo e o cinetoplasto das amastigotas. Giemsa, Aumento original 1.200.

Tabela 1. Principais diferenas entre leishmaniose difusa (LCD), leishmaniose cutnea (LC), cutneo-mucosa (LCM) e leishmaniose cutnea disseminada (LD). Apresentao clnica Nmero de leses Destruio de mucosa Agente etiolgico Parasitismo no tecido Epiderme Reao granulomatosa Reao de Montenegro Ttulo de anticorpos Resposta linfoproliferativa Resposta a tratamento antimonial LCD ndulos muitas ausente L. amazonensis intenso em geral, atrfica ausente negativa muito elevado ausente ausente LC /LCM lceras uma ou poucas presente ou ausente L. amazonensis L. braziliensis raro ou ausente com hiperplasia presente ou ausente positiva baixo presente presente LC Disseminada ppulas, lceras e leses acneiformes muitas presente ou ausente L. amazonensis L. braziliensis raro ou ausente com discreta hiperplasia presente ou ausente positiva geralmente elevado presente ou ausente presente

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Figura 9. LCD Subpolar. Macrfagos com amastigotas coradas ao lado de macrfagos degenerados e clulas lticas. Imunohistoqumica com anticorpos anti-Leishmania amazonensis. Aumento original 640.

Figura 10. Leso de LCD em atividade. Macrfago com volumoso vacolo parasitforo contendo amastigotas degeneradas. Em torno e em contato intimo com o macrfago, notam-se alguns linfcitos. Aumento original 3.000.

Figura 11. LCD polar. Leso em atividade. ntimo contato entre um linfcito e amastigotas lesadas. Aumento original 7.000.

Figura 12. LCD subpolar. Leso ulcerada. Eosinfilo com amastigota lesada. No interstcio, presena de parasitos degenerados e grnulos de eosinfilos. Aumento original 7.000.

placas infiltradas. Clinicamente, foram vistos aspectos semelhantes hansenase dimorfa, tais como, colorao acobreada, leses em saca bocado e distribuio assimtrica das leses. Em uma mesma bipsia deste caso, observaramse ndice parasitrio 3 (numa escala de 1 a 6), moderado infiltrado linfoplasmocitrio, padro macrofgico 1 (numa escala de 1 a 4), freqentes eosinfilos e clulas epitelioides e gigantes multinucleadas dispostas esparsamente(1). J foram descritos dois casos de LCD subpolar, nos quais se observaram ndice parasitrio 3, freqentes eosinfilos (Figura 6) e muitos focos de necrose citoltica (Figura 7)(1). O padro macrofgico variou, nestes casos, de 1 a 2. Como se viu, nesta forma de LCD, o padro macrofgico e o parasitismo, so menos intensos que na LCD polar, h maior freqncia de eosinfilos e presena de necrose citoltica. Nestes casos os

eosinfilos predominaram nas leses ulceradas(1). A principal diferena da leishmaniose dimorfa a presena de reao granulomatosa neste tipo de leishmaniose. Diagnstico diferencial histopatolgico O exame citolgico nestas formas de LCD permite fazer o diagnstico, facilmente, pelo exame direto. So vistas nos esfregaos numerosas amastigotas livres ou no interior de macrfagos. So organismos ovais ou redondos, com 2 3m de dimetro que nas preparaes de Giemsa ou Wright mostram em vermelho duas estruturas, o ncleo redondo e o cinetoplasto (Figura 8)(7). No entanto, imprescindvel fazer o estudo anatomopatolgico para poder dar o diagnostico desta entidade e fazer o diagnstico diferencial com outros tipos de leishmanioses tambm ricos em parasitos. Nas seces

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Gaz. md. Bahia 2009;79 (Supl.3):45-51 A lise de macrfagos, a destruio parasitria no interior dos macrfagos, o contato ntimo entre linfcitos e macrfagos parasitados e entre linfcitos e amastigotas, a presena de infiltrado linfocitrio e de fibrose so aspectos que caracterizam uma resposta imunecelular, sugerindo que na LCD h uma resposta imune de tipo celular e focal, mas insuficiente para controlar a infeco. Esse tipo de resposta poderia explicar a regresso espontnea de algumas leses(5) . A observao, em estudos ultra-estruturais, em um caso de forma subpolar de LCD, de contato ntimo entre eosinfilos e macrfagos parasitados e lticos e a presena de grnulos de eosinfilos no citoplasma de macrfagos parasitados (Figura 12) ou entre as membranas dessas duas clulas, nas reas de contato ntimo, leva a crer que a degranulao do eosinfilo aps aderir membrana do macrfago parasitado constitui outro importante mecanismo parasiticida(6). J foi referido acima, que amastigotas podem aparecer no interior da epiderme. Ultra-estruturalmente observouse que os parasitos na epiderme podem localizar-se no interior dos ceratinticos ou entre estas clulas, dentro de macrfagos(5). Referncias
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histolgicas coradas pela hematoxilina-eosina (HE) tambm possvel visualizar a estrutura das amastigotas, quando ntegras. Para o diagnstico antomopatolgico da LCD essencial fazer correlao dos achados histolgicos com o quadro clnico e imunolgico do paciente para diferenciar a LCD polar das formas subpolar e dimorfa. Devem ser biopsiadas as leses mais exuberantes, evitando aquelas em involuo, cuja histologia pode criar problemas no diagnstico diferencial. O ideal sempre que possvel avaliar bipsias de leses em atividade e no submetidas a tratamento. Os aspectos histopatolgicos mais importantes que devem ser considerados para classificar estas formas de LC so a freqncia do parasitismo e a presena ou ausncia de reao granulomatosa. No h dificuldade no diagnstico diferencial com a LC do plo responsivo, com a LCM e com a LC disseminada porque nestas formas de leishmaniose os parasitos so escassos ou inexistentes (Tabela 1). Um diagnstico diferencial importante com a leishmaniose drmica ps-kalazar (LDPC), porque tanto a LDPC como a LCD podem mostrar riqueza parasitria ao exame direto e histopatolgico. Quando a LDPC manifesta-se sob forma de ppulas e ndulos, observam-se, na derme, muitos macrfagos parasitados, ao lado de infiltrado linfoplasmocitrio e de proliferao vascular(13,20). Como j referido, as leses da LCD podem, tambm, apresentar infiltrao linfoplasmocitria e menor freqncia de macrfagos parasitados, principalmente quando esto em involuo espontnea ou sob ao de tratamento imunolgico. A proliferao vascular tambm pode ser observada nas leses involudas de LCD. De qualquer modo, o diagnstico diferencial deve basear-se, tambm, na histria pregressa e na avaliao clnica do paciente. Como sabido, alm da pele e, raramente da mucosa nasal, no h envolvimento de outras reas do corpo na LCD(2). Sempre que possvel, importante cultivar o material obtido nas leses desses pacientes, no sentido de isolar o parasito e caracteriz-lo. A caracterizao do parasito pode tambm ser feita in situ, em cortes de blocos de parafina de bipsias fixadas em formol, fazendo-se a imunomarcao com anticorpos anti-L. amazonensis (Figura 9)(4). Estudos ultra-estruturais Vrios autores j mostraram ultra-estruturalmente, na LCD, amastigotas ntegras no interior de macrfagos, aparecendo lesados apenas aps o tratamento(8,23). No entanto, estudando, ultra-estruturalmente, quatro bipsias de LCD de um mesmo paciente, com leses bem desenvolvidas e involudas, Bittencourt et al.(5) observaram predominncia de parasitos degenerados e necrticos no interior dos macrfagos (Figura 10). Registraram, tambm, fibrose, lise de macrfagos e contato ntimo entre leuccitos e macrfagos parasitados e lticos e entre linfcitos e parasitos degenerados (Figura 11). Achados semelhantes forram observados na fase tardia da infeco do BALB/ pela L. amazonensis(15).

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