Disefio de Oligos para PCR IMPORTANTE El disefio depende del tipo de PCR a realizar Las herramientas mas utilizadas son: (© Primer 3 Plus ©. Blast de NCBI El par debe estar cercano a 3” para mayor contienen. El par debe estar separado por: por lo tanto ultimo exén mas. La region a amplificar no deb Contenido de CG va de 50a 6 La longitud de los oligos ‘Temperatura melting. Temperatura maxima: Diferencia maxima de Tr Maxima complement Maximo poliMild stripping Buffer, 1L 15g glycine ——? OB S14 1gsDs_ ——> 22 VG 40 mL Tween 20 — boumr Dissolve in 800 mL distilled water. —— %0 mL Adjust pH to 2.2 rahe Bring volume up to 1 L with distilled water —>y \oo ml Procedure 4. Using a volume that will cover the membrane, incubate at room tem oar on perature for 5-10 min, Discard buffer Repeat incubation for 5-10 min with fresh stripping buffer ——_ Discard buffer Wash for 10 min in PBS Wash for 10 min in PBS 7. Wash for 5 min in TBST 8. Wash for 5 min in TBST 9. Ready for blocking 7 a) /- § — Gir: ie Giet now 100 ML — sps 07 (Sm) pH LSBe, bes Leaulie (2x) Ths Base 244) CToom othG.8, eh) SDs 4 wh C10 f-) , pomw ot duet Re de Romefens) Wit pews oh Bunk, cdacar elt. Rirca, \ Qa Caliains) Zur) sab oi Se ve \b BF wrscaphoetavel A ual ai Wo dooklada A.B wal onl: 2 ve 6025 OS al \ watExtraccién de RNA total 1 3 4 Agregar 800 uL de trizol (fenol e isotiocianato de guanidina; Invitrogen) a 4 °C (manteniéndolo 5 minutos en hielo). Esto puede ser directo en la caja, previamente enjuagada con PBS, o bien sobre las células extraidas en un tubo eppendorf. Transferir a tubo eppendort de 1.5 mL (en caso de no haberlo hecho antes; en caso contrario resuspender con 1 mt de Trizol) y homogeneizar en vértex por 5 segundos. Agregar 200 ul de cloroformo, agitar en vortex e incubar en hielo 5 minutos. Centrifugar a 14,000 rpm por 15 min. A4°C, Observacién: Se obtienen dos fases; una inferior de color rojo compuesta por fenol-cloroformo en elcual quedaron las proteinas y una fase acuosa incolora en la parte superior, en la cual se encuentra el RNA. EI DNA se mantuvo en la interfase. 5, 6 Se precipita el RNA transfieriendo la fase acuosa a un tubo eppendorf de 1.5 mL y agregando isopropanol en proporciones equivalentes al volumen de RNA (aprox. 500 iil) y ‘mantener a 4°C durante toda la noche, Posterior a la incubacién se centrifuga la(s) muestra(s) a 14,000 rpm durante 15 min. a 4°C. Observacién: Una pastilla de color blanco amarillento al fondo 7, 10. Retirar sobrenadante por decantacién y lavar con 1 ml de Etanol al 75% en Agua libre de DNAsas y Proteasas (Inyectable) agitando en vortex durante 30 segundos. Centrifugar a 12,500 rpm durante 8 min. a 4°C En seguida se realiza otro lavado con 1 ml de Etanol al 80%, centrifugando a 12,500 rpm durante 8 min. a 4°C. Eliminar todo el sobrenadante y secar la pastilla formada de cada muestra Resuspender la pastilla (RNA) en 50 yil de agua inyectable.PROTOCOLO INMUNOFLUORESCENCIA 1. Sembrar células en condiciones de Cultivo celular. 2. Lavar 3 veces por 5 minutos con PBS. 3. Fijar con Paraformaldehido 4% durante 20 minutos en agitacién y lavar 3 veces con PBS 5 minutos cada vez. NOTA: En este punto se permeabilizan las células de acuerdo a los objetivos, con 500 uL de metanol al 100% y las que no se permeabilizan se les adicionan 500 uL de PBS por 6 minutos a -20° C. P§S- Triton x100- Boa 20 icles Resurecbibina 4 blequecs 4. Bloquear as clues a PBS-BSA al 1% durante una 1 hora a 37°C. 5. Retirar bloqueo e incubar toda la noche a 4° C con anticuerpo primario en dilucién 1:20/1:50 (para mRPe) (ab185466 rabbit). * 6. Una vez pasado el tiempo de incubacién, lavar 3 veces durante 5 minutos e incubar EN LA OSCURIDAD con anticuerpo secundario anti-rabbit acoplado a FITC (IgG-FITC, Santa Cruz sc-2012) en dilucién 1:200/4:400 en PBS. durante 40 minutos en agitacion. 7. Lavar 3 veces durante 5 minutos y tefiir los nuicleos con Hoechst en dilucion 1:1000 en PBS durante 5 minutos. 8. Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS y dejar secar para montarlas en antifade y guardarlas en la oscuridad.SOLUCION DE BLOQUEO ‘ 3%Leche “© 2% Albumina “ Aforo con TBS Tween 0.1% GELES SDS-PAGE | rsx (corrida) a6 (Concentrador) El eles 4Geles 2Geles 4Geles (Aerilamiday 9) smi 75 mb 1.33 mL 2.66 mL (GTrispH8ig 9) sm 75mb 2.5mb Smt [S0S10%07 7) 200 wt 300 nL 100 ui 200 it [Agua miliQ’ 9) 9.66 mt 14.5 mb 6.1 mb 12.2mb = “ “ “ “ (EMED tou opt Spe 20 ut MEMBRANA DE NITROCELULOSA Y- Recortar rectangulo de 5x8 cm ¥ Activar membrana 20 min. antes de que termine la Electroforesis con buffer de transferencia + MetOH (20%). Y Rotular con nombre de proteinas de interés con lépiz (preferentemente en esquina superior). BUFFER DE LAEMLIE (DE CARGA) v sps ¥ Glicina Y B-Mercaptoetanol ¥ Azul de Bromofenol BUFFER DE RIPA (LISIS) Y 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) ¥ 150mM NaCl Y 1% Nonidet P-40 (sustituible por tritén ¥ 0.1%sDS ¥ Inhibidor de proteasasBUFFER DE CORRIDA 1 Litro 1X % Litro 5X Tris Base (25 mM) 3.028 7.558 Glicina (1.92 mm) 1aaig 36.025 g SDs (10%) 10mt 25mL Agua M Aforo aL Aforo a500 mL Nota: Disolver los solutos en aprox. 60% del volumen final en agitacion constante con mosca, Alustar pH a 8.3 y agregar SDS antes del aforo. BUFFER DE TRANSFERENCIA, 1Litro ‘SDS (0.037%) 0.375 g/ 3.7 mL (preparado al 10%) Glicina (39 mm) 2.938 Tris Base (48 mM) 5.828 Metanol (20%) * 200 mt. ‘Agua Mili Aforar a 800 mL. Nota: Agregar el metanol antes de usarte de acuerdo a la cantiday id requerida para una concentracién del 20%. SDS al 10% 1, Pesar 10g y diluirlos en 100 mL de Agua MiliQ. 2. Agitar con mosca en parrilaligeramente caliente. 3. NO REFRIGERAR TBS 1X pH 7.4 _ 1Litro Tris Base (50 mM) 6.058 Nacl 8.768 ‘Agua Mili. Aforo a1 Litro TBS Tween 0.1% ‘+ Llitro de TBS 1X +1 mL de tween TBS Tween 0.05% + 1 Litro de TAS 1x +500 jul de TweenCULTIVO CELULAR Descongelar geen Resembrar ahens xo Congelar Noosens Extraer Pahons Contar Rene 5. Nota: Para viabilidad se utiliza azul de tripano al 0.4% en PBS. Preparar cajas Petri con DMEM suficiente (6-7 mL). ‘Atemperar los criotubos lentamente (con hielo). ig Una vez atemperados los criotubos transferir el contenido a las cajas api m Incubar por 30 minutos y observar que las células hayas pegado, Una vez adheridas cambiar medio, ‘ Decantar medio. Lavar 2 veces con 2 mL de PBS. Decantar. Despegar y resuspender. a En cajas previamente preparadas con 7 Ccluias por goteo en toda la caja. Mover para homogeneizar el medio Incubar a 37°C Decantar medio y lavar con PBS. Despegar células con PBS-EDTA Colocar 1 mL de la suspension Centrifugar a 3000 rpm por un Resuspender el Pellet en 1 mld Dejar a 4°C durante 1 hora mit Dejar en REVCO y colocar nitrog Decantar medio y lavar con Pi Despegar con PBS-EDTA. Transferir a tubo eppendorf, Centrifugar a 7000 rpm por un Retirar sobrenadante. Congelar el pellet. Decantar medio ylavar con PBS Afiadir 1.5 mL de PBS-EDTA yd ‘Transferir a un tubo eppendorf, Resuspender las células y colocar previamente limpiada. re Cbsewar y conta al mieroscapo; 4 secciones de cadacy