RevInter: Artigo original

21

Reviso dos aspectos toxicolgicos e perspectivas teraputicas. (Parte I)

Carlos E. M. Santos Graduando em Farmcia. Faculdade de Farmcia do Centro Universitrio da Bahia. Bolsista do ProUni desde 2007. Estagirio de toxicologia da Intertox.

Botulismo:

Resumo

As intoxicaes alimentares constituem um dos significantes problemas de sade pblica, com grande incidncia mesmo em pases desenvolvidos. Embora dentre as mais raras, a intoxicao botulnica das mais severas e fatais existentes, devido grande potncia da toxina, dificuldade diagnstica e curta margem teraputica dos antdotos usados. Com o conhecimento dos mecanismos bioqumicos da exocitose vesicular, incluindo a composio da maquinaria exocittica SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor [NSF] attacchment receptor) e seu respectivo conjunto de protenas envolvidas nas etapas exocitticas, tornou-se possvel elucidar o mecanismo de ao txica da toxina botulnica, e direcionar os estudos de potenciais agentes teraputicos para o botulismo. Nesse trabalho, faremos uma reviso sobre o botulismo; abordaremos as atuais informaes sobre o mecanismo da exocitose, relacionando-as aos novos dados toxicolgicos da neurotoxina botulnica; na parte II, descreveremos as recentes pesquisas, avanos e perspectivas na produo de antdotos com maior margem teraputica no contexto do botulismo.

about the mechanism of exocytosis by linking them to new toxicological data of botulinum neurotoxin; in the Part II, well describe recent research, advances and perspectives in the production of antidotes with greater therapeutic margin in the context of botulism. Keywords: Botulism, Clostridium botulinum neurotoxin and exocytosis. botulinum,

As intoxicaes alimentares constituem um dos significantes problemas de sade pblica, com grande incidncia mesmo em pases desenvolvidos. Segundo um documento publicado pelo departamento de sade pblica de Massachusetts, nos Estados Unidos, ocorrem cerca de 76 milhes de casos por ano naquele pas, por causas diversas, resultando em pelo menos 300 mil hospitalizaes e 5 mil mortes (Massachusetts Department of Public Health, 2008). No Brasil, apesar da ampla problemtica da subnotificao de casos, foram registrados, em 2007, 1449 casos de intoxicao por alimentos, com pelo menos 2 bitos notificados (SINITOX, 2007). Embora dentre as mais raras, a intoxicao botulnica est entre as mais severas e fatais intoxicaes existentes, devido Palavras-chave: Botulismo, Clostridium botulinum, grande potncia da toxina, dificuldade diagnstica exocitose e neurotoxina botulnica. e curta margem teraputica dos antdotos usados.

Introduo

Abstract

The food poisoning is one of significant public health problems, which high incidence even in developed countries. Although rare, botulism is among the most severe and fatal poisonings existing because the great power of the toxin, diagnostic difficulty and short therapeutic margin of antidotes used. With the knowledge of the biochemical mechanisms of vesicular exocytosis, including the composition of the machinery exocytotic SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor [NSF] attacchment receptor) and its corresponding set of proteins involved in exocytotic steps, it became possible to elucidate the mechanism toxic action of botulinum toxin, and direct studies of potential A toxina foi inserida na prtica mdica em therapeutic agents for botulism. In this work, we 1983, para tratar pacientes com estrabismo, sendo seu will review on botulism, discuss current information
Revista Intertox de Toxicologia, Risco Ambiental e Sociedade, vol.3, n2, mar/jun, 2010

A neurotoxina botulnica (NTBo) produzida pela bactria gram-positiva e anaerbica Clostridium botulinum, responsvel pelo bloqueio neuromuscular e paralisia, decorrente da inibio de liberao de acetilcolina na fenda sinptica, estando envolvida no grupo das mais graves intoxicaes por alimentos. Os mais importantes veculos da toxina so vegetais em conserva, derivados de carne e frutos do mar, associados a processamento e armazenamento inadequados. Outras formas de exposio toxina relatadas na literatura so: infeco de feridas comuns, ou decorrentes do uso de drogas por via parenteral; iatrognicas (uso de formulaes com a toxina); e potenciais ataques terroristas.

RevInter: Artigo original

22

uso expandido a outras desordens neuromusculares, com injeo local de nfimas quantidades no msculo afetado (Timbrell, 2008). Atualmente algumas formas da toxina tm sido comercializadas, como o Botox (neurotoxina tipo A) e o Myobloc (neurotoxina tipo B), ambos com usos especficos aprovados pela FDA (Food and Drug Administration). O primeiro, aprovado para o tratamento de blefaroespasmo (espasmo das plpebras), distonia cervical (espasmos musculares graves no pescoo) e hiperidrose axilar primria severa; e o segundo, aprovado para adultos com distonia cervical. O Botox cosmtico, tambm composto pela toxina tipo A, usado no campo cosmiatria, para melhoria temporria de linhas e rugas na face, muitas vezes relacionado ao uso indiscriminado, com alto risco sade. A FDA recebeu vrias notificaes de reaes adversas, relacionadas com a ao sistmica da toxina, com efeitos como dificuldade de deglutio e dificuldade respiratria, sendo necessrios tubos de alimentao e/ou ventilao mecnica como medidas de interveno, com casos graves que resultaram em internao e/ ou bito. Esses casos graves de botulismo ocorreram aps tratamento em diversas condies, com uma ampla faixa de doses, principalmente em pacientes peditricos. Nos casos ocorridos em pacientes com idade inferior a 16 anos, para o tratamento de desordens neuromusculares, as doses variaram de 6,25-32 unidades/ Kg para o Botox, e, de 388-625 unidades/Kg para Myobloc; relacionando efeitos graves em doses tpicas em pacientes com condies subjacentes(FDA, 2008). Sete subtipos (A-G) de toxina foram descobertas, atravs de suas caractersticas antignicas especficas, sendo que A, B, E e F envolvem as intoxicaes humanas, e C e D, as intoxicaes de importncia veterinria. Existe ainda a distino entre os subtipos C1 e C2, segundo alguns autores. As neurotoxinas botulnicas so protenas de alto peso molecular (~150 kDa), sintetizadas na forma inativa (cadeia nica), e so ativadas por uma protease, para formar uma molcula de cadeia dupla, ambas ligadas atravs de ponte dissulfeto: uma cadeia leve (50 kDa), responsvel pela ao txica, e uma cadeia pesada (100kDa), responsvel pela translocao seletiva da cadeia leve ao citosol da clula nervosa (Zangh, 2009).

que apenas um grama da toxina cristalina, se dispersa de maneira proporcional (condio pouco provvel), poderia matar cerca de um milho de pessoas. Sabe-se bem que a toxina termolbil, e o tratamento mnimo de 20 minutos a 79 C ou de 5 minutos a 85 C para a inativao de 1 x 10 5 DL50 de toxina botulnica tipos A, B, E e F para alimentos cidos ou de baixa acidez suficiente (Vega, 1986). Com o conhecimento dos mecanismos bioqumicos da exocitose vesicular, incluindo a composio da maquinaria exocittica SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor [NSF] attacchment receptor) e seu respectivo conjunto de protenas envolvidas nas etapas exocitticas, tornouse possvel elucidar o mecanismo de ao txica da toxina botulnica, j que, anteriormente, sabia-se apenas da conseqncia: a inibio da liberao de acetilcolina, sem, no entanto, conhecer-se por qual mecanismo ocorria a inibio.

Bioqumica da exocitose

Desde a sugesto de Katz e col., em 1952, quanto existncia de vesculas envolvidas na liberao de acetilcolina nas junes neuromusculares, e nesses ltimos anos, com os adventos da bioqumica estrutural e funcional e da biologia molecular, tornaram-se possveis avanos na elucidao das estruturas proticas e suas funes na exocitose, com consequentes possibilidades de investigar melhor a liberao de neurotransmissores e os mecanismos de regulao. A liberao de acetilcolina na juno neuromuscular realizada atravs da fuso de dois componentes: o complexo protico da membrana da vescula e o complexo protico da membrana do terminal sinptico. O primeiro (v-SNARE) possui uma protena essencial, a sinaptobrevina ou VAMP 2 (Vesicle-associated Membrane Protein); e o segundo (t-SNARE), composto pela sintaxina e a SNAP-25 (synaptosomal-associated protein of 25 kDa), cujo direcionamento membrana da superfcie celular especfico (Lin e Scheller, 2000).

Segundo outros modelos atuais de exocitose, sugere-se que outras protenas esto envolvidas no processo, tais como a Munc 18-1, que interage A neurotoxina botulnica est entre os mais com as protenas SNARE na fuso das membranas potentes agentes txicos e, segundo Arnon (2001) da vescula e do terminal; a sinaptogamina1( Ca2+ apud Zangh (2009), a toxina apresenta DL50 (toxina sensor ), que sensvel ao influxo de Ca2+e dispara Estimou-se rapidamente a exocitose; e a protena vesicular Rab3, tipo A) para ratos de 0,1 ng/Kg.
Revista Intertox de Toxicologia, Risco Ambiental e Sociedade, vol.3, n2, mar/jun, 2010

RevInter: Artigo original

23

que regula a liberao exocittica atravs da ligao expostas a diferentes concentraes de neurotoxina zona ativa das protenas RIM1 e RIM2 (Sudhof, BoNT/A ()-, ou de cadeia pesada recombinante 2004). - rHC ()-, por 16 horas. A cadeia pesada da toxina (rHC), demonstrou ausncia de atividade inibitria; A exocitose ocorre em etapas definidas - enquanto, a BoNT/A () demonstrou potente transporte, direcionamento, travamento, ancoragem atividade inibitria, sugerindo, portanto, ser a cadeia e fuso -, nas quais uma srie de interaes leve responsvel pelo efeito txico. (Adaptado de protena-protena regula o transporte da vescula do Zhang, 2009.) citosol neuronal fenda sinptica. Sabe-se tambm que o evento exocittico acontece de forma cclica, No citosol, essa cadeia leve age como uma Zn2+ocorrendo rpidas etapas de liberao, dependentes endopeptidase contra protenas-alvo intracelulares do influxo de clcio, e ainda, etapas de reciclagem especficas, tanto na membrana plasmtica como atravs de endocitose, disponibilizando as vesculas da vescula sinptica, catalisando protelise das para nova liberao de molculas (Site do Instituto de mesmas, inibindo a liberao de neurotransmissores Cincias Biolgicas, UFMG, 2010). atravs da desativao da maquinaria exocittica, assim causando o bloqueio e paralisia muscular.

Mecanismo da ao da toxina botulnica

Conforme anteriormente descrito, as toxinas so sintetizadas na forma inativa (cadeia nica), e so ativadas por uma protease, para formar uma molcula de cadeia dupla, ambas ligadas atravs de ponte dissulfeto. A cadeia leve (50 kDa) responsvel pela ao txica, e a cadeia pesada (100kDa), responsvel pela translocao seletiva da cadeia leve ao citosol da clula nervosa. Para confirmar a ausncia de toxicidade da cadeia pesada, Zang e col. (2009) fizeram um ensaio de liberao de glicina, estimulada usando concentraes com 80 mM de K+, crescentes de cadeia pesada recombinante (rHC ou recombinant Heavy Chain) de toxina botulnica, comparando o grau de inibio com crescentes concentraes da neurotoxina tipo A, confirmando a ausncia de toxicidade na primeira e a alta toxicidade da neurotoxina tipo A. ( fig. 1).
FIGURA 1

Cada grupo de neurotoxina (A-G) cliva stios especficos das protenas do complexo SNARE, impedindo a montagem completa do complexo de protenas envolvidas na fuso, e, conseqentemente, o bloqueio da liberao de acetilcolina. As toxinas botulnicas tipo A, C e E clivam a SNAP-25 (25 kDa synaptosomal associated protein), sendo que o tipo C tambm cliva a sintaxina. As toxinas botulnicas do tipo B, D, F e G, clivam a sinaptobrevina (Arnon e Schechter, 2001). Sumarizando, observa-se que 7 subtipos da neurotoxina possuem toxicidades distintas, conseqentemente, diferentes escalas de durao de efeito, com ao em trs alvos proticos da maquinaria exocittica: SNAP-25, sintaxina e sinaptobrevina. As mais graves manifestaes clnicas em intoxicaes humanas esto relacionadas ao tipo A da neurotoxina, devido ao tempo prolongado de ao no neurnio afetado (Thanongsaksrikul, 2010).

% de Liberao de Glicina

As histricas barreiras no tratamento da intoxicao botulnica e as atuais perspectivas teraputicas

Concentrao [nM]

Fonte: ZHANG, 2009

Figura 1. Curva concentrao-efeito que expressa a taxa de liberao de glicina em culturas que foram

A terapia atual envolve medidas de suporte respiratrio e administrao da antitoxina de origem animal (geralmente, de origem eqina) ou anticorpos recombinantes multivalentes. A grande dificuldade no tratamento atribui-se principalmente a uma varivel cintica, j que aps a entrada da neurotoxina na clula nervosa, a antitoxina no pode alcan-la. Assim, com a sndrome j estabelecida, devido ao tempo de psexposio ou da fase diagnstica, a janela teraputica torna-se extremamente curta. Outro importante aspecto a freqncia com que ocorrem reaes adversas no tratamento, devido imunogenicidade do

Revista Intertox de Toxicologia, Risco Ambiental e Sociedade, vol.3, n2, mar/jun, 2010

RevInter: Artigo original

24

antdoto, como no caso de doena do soro e reao Massachusetts Department of Public Health. - Food anafiltica fatal (Zangh, 2009; Thanongsaksrikul, Protection Program. Food Poisoning: What It Is 2010). and How to Report It in Massachusetts. (Acessado em maro de 2010). Disponvel em: Assim, nos ltimos anos, as novas abordagens h t t p : / / w w w. m a s s . g o v / E e o h h s 2 / d o c s / d p h / na produo dos antdotos vm sendo feitas visando- environmental/foodsafety/foodborne_illness/report_ se resolver/minimizar o problema de ineficcia foodborne_illness.pdf teraputica, devido incapacidade do agente de alcanar a toxina no citosol do neurnio; bem Site do Instituto de Cincias Biolgicas da como reduo da toxicidade, devido ao potencial Universidade Federal de Minas Gerais (ICB/UFMG) imunognico. Nesse contexto, as ferramentas de Ancoragem e fuso de vesculas sinpticas . biotecnologia, qumica farmacutica e farmacologia, (Acessado em 15 de maro de 2010). Disponvel em: tm sido empregadas no desenvolvimento de novos http://www.icb.ufmg.br/biq/neuronet/grupob/fusao. antdotos. Apesar do pouco interesse da indstria htm farmacutica quanto pesquisa/produo de novos antdotos, surgiram novas hipteses e estudos com SUDHOF, Thomas C. The Synaptic Vesicle Cycle. potencial de reduo de toxicidade nos tratamentos Annual Review Of Neuroscience, Dallas, v.27, p. 509existentes, bem como desenvolvimento de novos 547, 2004. antdotos a partir do conhecimento da cintica e dos mecanismos bioqumicos de ao da neurotoxina. THANONGSAKSRIKUL, J.; SRIMANOTE, P. [et. Esses os aspectos que procuraremos aprofundar em al.]. A V H that neutralizes the zinc-metalloproteinase activityH botulinum neurotoxin type A. The Journal of artigo posterior. of Biological Chemistry, V. 285, p 1-23, 2010.

Referncias bibliogrficas:

ARNON, S. S.; SCHECHTER, R.; INGLESBY, T.V. TIMBRELL, J. A. Principles of Biochemical [et al.]. Botulinum toxin as a health weapon. The Toxicology, London: U.K., 2008. p. 352-354. VEGA, Pedro Valle. Toxicologia de Alimentos. Journal of the American Medical Association, v.285, Metepec: Eco, 1986. p.45-49. n.8, p. 1059-1070, 2001. FDA. - Food and Drug Administration. Bad Bug Book: Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook - Clostridium botulinum. (Acessado em 16 de maro de 2010). Disponvel em: http://www. fda.gov/food/foodsafety/foodborneillness/ orneillnessfoodbornepathogensnaturaltoxins/ badbugbook/ucm070000.htm FDA. - Food and Drug Administration. Early Communication about an Ongoing Safety Review of Botox and Botox Cosmetic (Botulinum toxin Type A) and Myobloc (Botulinum toxin Type B). (Acessado em 22 de junho de 2010). Disponvel e m : h t t p : / / w w w. f d a . g o v / D r u g s / D r u g S a f e t y / gSafetyInformationforPatientsandProviders/ SafetyInformationforHeathcareProfessionals/ ucm070366.htm LIN, R. C.; SCHELLER, R. H.; [et. Al.] Mechanisms of synaptic vesicle exocytosis. Annual Review Of Cell And Developmental Biology Journal, Stanford, v.16, p.19-49, 2000.
Revista Intertox de Toxicologia, Risco Ambiental e Sociedade, vol.3, n2, mar/jun, 2010

ZHANG, Peng; RAY, Radharaman; SINGH, B. R; DAN, Li; ADLER, M.; RAY, P. An efficient drug delivery vehicle for botulism countermeasure. BMC Pharmacology, v.9, p. 9-12, 2009.