V 346.08 ~ 2 GRAND-DUCHE DE LUXEMBOURG Breve OU du 9 SQ Janwier 1986 de Erni Ce Moyes ‘Titre délivzé :.__™ JUIN 4986 (8) Service de la Propriété Intellectuelle SS LUXEMBOURG Demande de Brevet d’Invention 'T. Requéte Le-société-—dite:-VIRATEK-INC,;—Hy land Avenue 3300, Coste-Mese, () Cali fornie-92626;-Etats-Unisd’Amérique;représentée-par-Mattre ‘Atain-RUKAVINA;~avocat—avoué,-demeurant-a-Luxembourg;—10A;—bd- @) de_la..Foine,..agissant..en.sa.qual.itéde.mandataire, Eeerelat) ce —-neuf-janvier-1900-quatre-vingt=six-— a @ a 15:00--- heures. au Ministére de Economie et des Classes Moyennes, & Luxembourg : wht + Ja présente requte pour Yobtention d'un brevet d'invention eoncemant: —— ~ = = = — a ——ennnne A) “Compositions-et-néthede-de traitement des-maladies—virates— chez—les-plantest : ~ a 2. la délégation de pouvoir, datée de Costa Mesa le ..29-décembre—1985 8. Ia description en langue... frangaise........ de Tinvention en deux exemplaires; 4. J fo. planches de dessin, en deux exemplaires; : 5. la quittance des taxes versées au Bureau de IEnregistrement & Luxembourg, Je .9-janvier-1986— - eer 1 ‘déclare(at) en assumant la responsabilité de cette déclaration, que (es) inventeur(s) est (eon!) : Monsieur-Richerd-Monroe-FALLIS, 1825 Wedgwood Drive; Uptand;— © Californis-Stssh-ee Monsteur Roberts Angee Sh git Sb Pate Se Sente-MonicayCatifornie-90402; tous deux-aux Etats-Unis~d“Amériq revendique(nt) pour Ja susdite demande de brevet la priorité d'une (des) demande(s) de (6) -brevet—d invention deposée(s) en (7) Ebats—Uni- ~dAmér ique———— © —46-Jjenvier-1985-sous~te-numéro“6925365 au nom d¢ 5 —inventeurs—~ = — ent) pour Iui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, & Luxembourg. 10A,-boulevard-de.la-Foine———». = — — (10) sollicite(nt) 1a délivrance d'un brevet d'invention pour Vobjet décrit et représenté dans les fannexes susmentionnées, — avee afournement de cette déivrance & 7... mls. (U1) “Le ..mangeflytne- : ey ¢ UA Tl, Procés-ferbal de Dépot a La susdite demande de brevet d'invention a &t6 déposée au Ministare de I'Bconomie et des Classes Moyenhes, Service de la Propriété Intellectuelle & Luxembourg, en date du: 4-45.00 heures @ Nom, prénom, firme; adresse — @ sil a eu aeprésenté por > agletant en quahid de mandatalne = daw Gu GEOL 2 toutes ities — titre do Pinvention — G) noms et adress ~ (@) brevet. certicat addition, mode Wasi "ty ays — ( date — @) déposentoriginaire ~ qb adresse ~ (i) &, 12 ou 18 molsVSS Se ei Ai MEMOIRE DESCRIPTIF déposé & I'appui d'une demande de BREVET D‘INVENTION formée par VIRATEK, INC. pour : "Compositions et méthode de traitement des maladies virales chez les plantes". Inventeurs : Richard Monroe Fallis et Roberts Angus Smith.10 15 20 25 30 compositions et méthode de traitement_des maladies virales_chez Jes plantes’ La présente invention est relative & des agents antivi- Faux pour combattre les maladies virales chez les plantes. Les virus et les viroides sont responsables d'un grand nombre de maladies chez Jes plantes, qui provoquent chaque année des pertes importantes et cofteuses aux cultures. Pour ce qui est des cultures annuelles se développant & partir de graines, les pertes varient souvent d'une année a I'autre suivant les conditions ambiantes. Les virus dans les cultures d'arbres (vivaces) entrainent souvent des pertes croissant progressivement (appelées dépérissements) au fur et A mesure du vieillissement des plantations. Ces maladies chroni- ques peuvent entrafner des conséquences économiques trés graves compte tenu du temps, du travail, du capital et du terrain investis dans la culture. Les cotits associés aux maladies virales dans les plantations comprennent non seulement les frais de remplacement mais également a perte de récolte pendant que I'on attend que la culture remplacée atteigne sa pleine production. Par exemple, dans Je cas des citrus , Je processus de croissance avant que les arbres ne soient totalement productifs peut prendre plusieurs années. Les virus provoquent également des pertes considérables dans les cultures de champ et les plantes ornementales, qui ne se reproduisent pour Ja plupart qu'exclusivement par voie végétative, en particulier les pommes de terre, les framboises, les raisins, ls agumss, les pommes, les cerises, les orchidées, les lilas, les iris, les roses et les oeillets. Le virus est maintenu dans les plantations se propageant végétativement et tous les descendants sont infectés en Mabsence d'une thérapie et d'un programme de développement. Le résultat est une perte de récolte chronique. De plus, les cofits de surveillance des zones géogra- phiques en ce qui concerne I'évolution de 1a maladie et les symptémes YY10 15 20 25 30 35 de celle-ci dans Jes plantations existantes sont associés a I'éventualité d'un développement de la maladie virale dans les plantations. La diminution de rendement des récoltes et des plantes ornementales qui en résulte pose un probléme économique important aux cultivateurs et au public. A présent, la lutte la plus fréquemment utilisée contre les maladies virales consiste en une série de méthodes de cul- ture, qui empéchent les plantations de stinfecter. On plante une semence exempte de virus, certifiée dans le sol, qui est fumigé pour détruire des vecteurs, tels que les nématodes. Les emplacements de plantation ou Jes périodes de plantation sont choisis de maniére & Gviter les vecteurs aériens naturels, tels que les pucerons et les cicadelles. Afin de mifimiser les centres d'infection initiaux, on choisit des aires de plantation qui ne soient pas trop fortement enva~ hies par des mauvaises herbes ou des plantes indigénes qui servent de nourriture aux virus en question. Si de tels réservoirs d'hdtes existent, il peut stavérer nécessaire d'avoir une période sans culture de maniére A rompre les cycles naturels qui permettent aux virus de se déplacer continuellement de la culture au réservoir et dans Je sens inverse, Un autre type de lutte est la sélection de plantes permettant de résister aux virus. Ceci s'avére efficace lorsque l'on est en présence de sources de résistance qui peuvent étre reproduites dans des plantes intéressantes, pour autant que n'apparaissent pas de nouvelles souches de virus, qui peuvent surmonter la résistance. Ce procédé n'est, toutefois, pas efficace contre les variétés résistan- tes dans certaines cultures. Souvent, la sélection de résistance n'est pas un moyen de lutte possible du fait de Iinsuffisance de sources de génes de résistance appropriés. Le probléme majeur associé aux méthodes de lutte susmentionnées est qu'aucune technique de développement ow sélection de résistance n'est efficace pour un grand nombre de maladies virales. Contrairement aux autres parasites et maladies des plantes, il n'y ‘@ aucun moyen de lutte chimique efficace utilisable par les cultiva- ‘teurs. Par conséquent, un grand nombre de maladies restent incontrélées.10 15 20 25 30 35 Les plantes sensibles n'ont pas de mécanismes de défense pour se débarrasser elles-mémes des virus une fois qu'elles sont infectées, & Hinstar des animaux qui ont un syst8me immunitaire bien développé. Une fois qu'une plante est infectée, elle est infectée pour la vie. Les buts de la présente invention consistent & prévoir un agent antiviral, qui est actif dans le traitement et la prévention d'une gamme étendue de maladies de plantes induites par un virus ou un viroide, qui se révéle actif A de faibles concentrations en procu- rant des effets contrélables , et qui peut étre distribué de facon efficace & la plante malade par une série de méthodes et a divers stades de développement de la plante. La présente invention concerne utilisation du com- posé 1-@-D-ribofurannosy!=1,2,4-triazole-3-carboxamide et de ses dérivés 2,3,5-triacétylique et 5'-butyrylique dans le traitement des maladies provoquées par divers virus chez les plantes, ainsi que les compositions contenant de tels composés. Le 1-f+D-ribofurannosy!-1,2,4-triazole-3- carboxamide et ses dérivés ont montré une activité antivirale & large spectre. Les composés peuvent @tre administrés aux plantes par arrosage du sol, topiquement, par injection ou sous la forme de pulvéri- sation foliaire. De plus, les composés peuvent étre administrés seuls ou en combinaison avec d'autres agents de pénétration, tels que, par exemple, le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le diméthylformamide (DMF), ou d'autres agents antiviraux, tels que, par exemple, I'adénine arabinoside suivant l'environnement et Jentité virale particuliére A traiter. Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.798.209, qui a éé redélivré le 14 novembre 1978, sous le n° Re 29.835, décrit le composé 1--D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide comme agent antiviral montrant une activité antivirale & large spectre & Ja fois in vitro et in vivo. Les dérivés 2,3,5-triacétylique et 5'-butyryli- que du I-fS Deriboturannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide, qui montrent également une activité antivirale, sont décrits respectivement dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique nos. 3.897.415 et 3.984.396. Ce qui suit est une description détaillée de l'utilisation du composé 1+ B-D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide (ou10 15 20 25 30 35 de ses dérivés) seul ou en combinaison avec d'autres agents antiviraux dans le traitement de diverses maladies virales chez les plantes, ainsi que des compositions contenant de tels composés. Dans le but d'illus- ‘trer davantage invention, le 1-B-D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-car- boxamide et ses dérivés seront appelés de facon interchangeable (a) Je composé, (b) 1a ribavirine (dénomination non commerciale adoptée par le U.S. Adopted Names Council) ou (c) sous sa dénomination chimi- que susmentionnée. Une utilisation possible de Ja ribavirine réside dans Je traitement préventif ou thérapeutique des plantes infectées par un virus. Pour ce qui est des plantes de culture, tout traitement Qui peut retarder Ja date A laquelle la plupart des plantes montrent les effets provoqués par” Minfection virale, peut s'avérer efficace comme méthode de lutte. Une solution consiste & combiner un humus réfléchissant pour chasser les vecteurs aériens au moyen d'un virucide, tel que la ribavirine. Une seconde solution pour les maladies des cultures consisterait & vaporiser les mauvaises herbes visées micux connues comme étant des réservoirs & virus pour cultures, avec de Ja ribavirine. A ce sujet, l'avantage d'utiliser la ribavirine & la place d'un herbicide est d'empécher de tuer la totalité des mauvaises herbes et plantes sauvages vaporisées et non seulement les plantes visées. La ribavirine s'avere également intéressante sur es plantes ornementales. Dans le cas des plantes ornementales, le caractére désirable amoindri résultant des symptémes de I'infection virale est peut-€tre plus important que les pertes de produit provoquées par le virus. Les plantes qui sont exemptes d'entités virales seraient également exemptes de symptémes de maladie, qui souvent se manifes- tent d'eux-mémes par un mouchetage et des marques, en réduisant ainsi le caractére commercial des plantes ornementales, qui sont vendues pour leur attrait visuel. La ribavirine pourrait @tre extrémement efficace comme moyen permettant de faciliter la production de plantes exemp- tes de virus et d'augmenter Ja production et la qualité de la génération de plantes suivante. Ceci pourrait étre réalisé dans la production de souches exemptes de virus pour plantes se propageant par voie10 15 20 25 30 35 végétative, comme les arbres fruitiers et noyers, les plants de fraisiers ou les plants de pommes de terre. Ou bien, la ribavirine pourrait &tre incorporée dans les processus de propagation de culture de tissu normaux utilisés habituellement pour la propagation d'un grand nombre de plantes ornementales. La ribavirine slavére également intéressante pour traiter les semences de maniére & empécher Ja transmis- sion des virus par les semences. Une autre utilisation possible de la ribavirine est d'éliminer les virus ou de maintenir les tissus de plantes dans un état exempt de virus au cours des techniques de propagation habituelles, que Ion utilise actuellement. Un exemple consiste en Iutilisation d'embryons somatiques encapsulés pour la propagation de tissus somati- ques de manigre & empéchér toute modification sexuelle ou la nécessité d'une sélection de plantes plus poussée. La ribavirine peut stavérer particuligrement intéressante pour conserver des plantes exemptes de virus par son application sur des embryons somatiques. On peut faire propager certaines plantes asexuellement, ce qui exclut toute Modification génétique chez leurs descendants qui, sans quoi, pourrait se produire par propagation sexuelle a partir de la semence. Le traite- ment des embryons somatiques par de la ribavirine avant encapsula~ tion permettra de conserver les descendants de la plante dans un Etat exempt de virus. On pourrait également utiliser le composé en combinaison avec des processus de mécanisme phytogénétique Nouvellement mis au point, dans lesquels ia ribavirine pourrait @tre incorporée dans des processus de propagation normaux. Le 1-| Tannosy!-1,2,4-triazole-3-carboxamide et ses esters (2,3,5-triacétylique et *-butyrylique) sont solubles dans eau et peuvent étre administrés aux plantes, aux semences, aux souches et au sol suivant la présente invention sous la forme d'une solution aqueuse. Les composés sont également solubles dans des solutions d'alcool (5-15% en volume) et d'eau, de diméthylformamide (DMF) (5-25%) et d'eau, de diméthylsul- foxyde (DMSO) (5-25%) et d'eau et de diméthylsulfoxyde seul. Les procédés d'application de la ribavirine peuvent @tre groupes en trois catégories +10 15 20 25 30 35 (1) les traitements thérapeutiques de plantes entidress (2) la production de plantes exemptes de virus via la culture de tissu; et (3) le traitement de semences. Le composé peut tre appliqué sous la forme d'une vaporisation foliaire sur les plantes entiéres en méme temps que les additifs qui pourraient faciliter la pénétration et le recouvrement. La ribavirine en des concentrations de lordre d'environ 100 ppm 4 environ 2000 ppm est efficace pour les applications foliaires et comme arrosage du sol. Pour le traitement des arbres, od la dimension ou les conditions ambiantes empéchent l'utilisation d'une application foliaire, le composé pourrait étre injecté dans le tronc par écoulement par gravité ou par injection sous pression, comme on le fait actuelle- ment avec des fongicides et des antibiotiques & action générale. Un certain nombre de méthodes, au moyen desquelles on pourrait utiliser la ribavirine pour produire des plantes exemptes de virus, sont possibles. Lune de ces méthodes consisterait 4 traiter les plantes enti@res, comme décrit ci-dessus, de maniére 8 obtenir de plus grandes zones exemptes de virus & proximité des extrémités en cours de crois- sance. Une autre méthode consisterait & régénérer de grandes extrémi- tés de pousses sur des milieux contenant de la ribavirine de manigre & éliminer Ie virus. La ribavitine pourrait également étre _incorporée comme composant dans es milicux utiis’s pour la propagation de culture de tissu de plante normale. Le traitement pourrait étre réalisé & différents stades de développement du protoplaste, du calus, des em- bryons ou des plantules de la plante. La ribavirine apparait comme étant plus efficace au cours de certains stades de développement chez certaines plantes. Des concentrations d'environ 10 & environ 400 pM s'avérent efficaces. Au moins deux méthodes que Ion pourrait utiliser pour le traitement des semences infectées par un virus sont le traitement des plantes entiéres, comme décrit ci-dessus, pour stassurer que les10 15 20 25 30 35 semences produites n'abritent pas de virus, et le traitement des semences produites sur des plantes infectées par le ‘virus avec le moyen de transmission approprié pour empécher les plantes résultantes ¢'étre infectées. On pourrait également appliquer Ja ribavirine sur la se- mence, la faire pénétrer dans des semences ou I'appliquer sous la forme d'un arrosage du sol. De plus, on peut utiliser la ribavirine comme compo- sant d'un traitement chimique multiple de tissus infectés viralement. Il est clair compte tenu de ce qui précéde que la ribavitine serait intéressante dans la prévention et le traitement des maladies virales des plantes aussi bien en serre qu'2 l'extérieur. La ribavirine s'est montrée active vis-d-vis de virus dans les groupes de virus" de plantes suivants : potexvirus, potyvirus, clostérovirus, tymovirus, carlavirus, cucumovirus, ilarvirus, tombusvirus, virus de la maladie bronzée de la tomate et virus de la mosaique de la luzerne.Les virus des groupes du tobamovirus et du bromovirus ne sont que légérement sensibles & la ribavirine. Le Tableau suivant illustre les types de maladies virales contre lesquelles a ribavirine s'est révélée efficace. TABLEAU. Maladies virales de plantes contre lesquelles 1a ribavirine est efficace. Type de auitire —_Récolte Vins Ge de vins céeéales sogho vin de lars’ et dt renisre du mais potyvins céréales big vins de Ja messique ds tebarrovinus Dig et virus de la massive bremmovinus Produit des charrps du brome cet plantes fourra- gees heme —vins de la mosaique de la Vins oe la moscique iuzerme ce la hweme vis latent de Ja heme —_cartavins Prochit des champs et vis de jaunisserent de La . a betterave clostérovinss planes fouragires betterave TOS tae de la betterave poryvinss " ra virus de la mosaique et du renisre du mals poryvinss : soja vins de la moscique du soja potyvinus Légures cruciféres virus de Ja msaique du navet_ potyvines W10 15 20 25 30 35 Type_e cute ‘Legumes’ Plantes domement Plantes darerent. Plaines domerrent Plantes domerrent Récolte courges toate ceillet erchidées TABLEAU (suite). Vins ving de la mosalque de la pastée Let2 virus de la mosaique du con contre Vins de la mosaique de ka faitue agent de la grande nervure & fa bine vins de la grawre de la tomate vins Y de la toate vinss de la merbrure des nerves du poivre vins de la marbrure du oivre vinss de la mosaique du con conbre virus de fa mosaigue du tabac Vins de la mosaique de la tomate Vins dasperrie de la tomte vinws de la maladie bronaée: ce la tomate Vins de la gavre du tabac vinss entraihant des tachetures nécrotiquss chez Hocilet vis de la marbrure de Tocilet Vins de la mosaique de Wiis aristé vin de fa rossique et du Jatnisserent de la féve Vius sans syrptres du fis Vins de la mosaique du cconcernire Vins entrathant des taches vannulaires’chez Yordontogiossum vins de la mos du ombicium Groupe de vinss Potyvinss ‘cucumovirus vins non groupe potyvires potyvins porwins potyvius cucurpvirus ‘ebamovies ‘tobarovinus qucurovins virus de la muladie broruée de la tomate otyvires clostérovinss potyvirus poyvines carlavines quurovines potexvires ff10 20 25 30 35 TABLEAU (suite). Type de aiure — Récolte Vins Groupe de vinws Piantes eeerrent reses virus de fa mosaique de ka pore idavirs Vins entrant des taches annulires nécrotiques chez kes fruits & noyaure irvirus Attres snitiers pone virus entrant des taches chlorotiques chez la pone clostérovires vinws it des carne dures cers la queve de la pone lostérovirus vis de la mossique de la pone "Tulare!" itavins vins de la mossiiue de la pore ilarvins Atbres fitiers cere virus entrahant des taches nécrotigues chez les frits 2 noyaux ilarvins vis de la. dipénérescence di pir ilarvines Atbres nitions agumes vin de la tristeza des agrures chostérovinss Légmes pone de vins X de la tere porme de terre potexvirus virus Y de Ja perme oe tere potyvinus ins S de la porme ce terre carlavirus Lors d'une étude, on a testé I'activité antivirale de la ribavirine contre le virus de la mosaique du tabac (TMV) et le virus de la marbrure chlorotique du pois de vache (CCMY). On main- tient une souche UI de virus de la mosaique du tabac dans des plantations de tabac (Nicotiana Tabacum L. "Xanthi") et on examine Iinfectivité sur du tampon phosphate de potassium 0,01 M de pH 7,0 et de la célite (1%) par la méthode & la demi-feuille sur Nicotiana Tabacum L. "Xanthi Nc", 6 & 12 reproductions de chaque produit d'inoculation étant réalisées suivant un modéle du type désordonné. On maintient10 15 20 25 30 35 10 le virus de la marbrure chlorotique du pois de vache dans des planta- tions de pois de vache (Vigna Unguiculata L. Walp "California Black- eye")et on exarrine Iinfectivité de la sve diluée par le tampon précité par la méthode & la demi-feuille sur du soja ( Glycine Max L.). Apres quatre heures d'inoculation mécanique, on découpe des disques de 7 mm de diamétre des feuilles inoculées. Dix disques par traite- ment sont infiltrés sous vide au moyen de la solution chimique appropriée et on les laisse ensuite sécher sur des tissus en papier pendant 10 & 15 minutes. Les disques sont mis & flotter sur la solution chimique dans des boites de Petri de 3,5 cm dans une chambre de croissance pour plantes 8 25°C avec une photopériode de 14 heures d'approximati- vement 15.000 Ix. On traite des disques témoins de fagon similaire par de l'eau distillée. Aprés 96 heures d'incubation, on enléve tous es disques des solutions chimiques et on les congéle & -20°C jusqu'au moment d'examiner leur infectivité. L'infectivité des disques traités chimiquement est comparée & celle des disques traités & l'eau. Chaque solution chimique est testée 4 2-4 concentrations différentes différant de 5 fois et chaque expérience est répétée au moins deux fois. Le milieu standard pour favoriser la croissance du calus de tabac est formé de sels de Murashige et Skoog additionné de 3 mg/litre dlacide indole acétique, de 0,3 mg/litre de kinétine et de 40 g/litre de sucrose dans de Magar (0,8%). Le milieu de régénération est le méme excepté quill contient 0,3 mg/litre d'acide indole acétique avec l'addition de 10 mg/litre de Né-isopentényl dénine. Le tissu de calus est produit au départ de tissus médulleux de tabac infectés par le TMV. Les produits chimiques sont stérilisés par filtration et ajoutés au milieu aprés mise en autoclave. Les aires périphériques de calus qui croissent en présence des produits chimiques sont séparées de maniére A éviter la prise des calus de semences de départ examinés pour I'infectivité de TMY. Les nouvelles pousses qui se développent sur les milieux contenant les produits chimiques sont enlevées et examinées de facon similaire. I se révéle que la ribavirine inhibe la multiplication de TMV et de CCMV dans ces systémes. La multiplication de CCMV est plus sensible & la ribavirine que ne I'est le TMV. Les calus de tabac croissent et se différencient lorsque lon utilise une concentration10 15 20 30 35 de ribavirine du double de celle requise pour inhiber la multiplication de TMV dans les disques de feuille. Toutefois, les calus ou pousses de tabac nouvellement développés contiennent encore du TMV. La concentration en ribavirine requise pour inhiber 90% de la multiplica- tion virale dans les disques de feuille est de 0,2 mM pour Iinhibition du TMY et de 0,1 mM pour Minhibition du CCMY. On a réalisé d'autres expériences avec le Lilium Longi- florum "Arai", qui a été décrit comme étant difficile d'obtenir sans virus, et avec le Lilium "Enchantment", contenant tous deux un virus sans symptéme du lilas (LSV) et un virus de la panachure de la tulipe (TBY). Les mérist8mes, induits sur des milieux avec ou sans ribavirine, sont isolés et cultivés ensuite sur un milieu sans ribavirine. Le nombre de mérist8mes formés de fagon adventive et le poids de bulbe moyen ne sont pas sensiblement influencés par la ribavirine aux concentrations de 0,0-40,0 M.A la concentration de 400,0 WM, la croissance des bulbes est sensiblement réduite. Des échantillons de feuilles des plantes sont examinés pour ce qui est de la présence de LSV et de TBV au moyen de lessai ELISA, de I'essai de chute d'immuno-diffusion et de la microscopie électronique. Le pourcentage de plantes de L. Longiflorum "Arai" infecté par le LSV et/ou le TBV est réduit par la ribavirine & 40,0 pM, tandis que pour le L. "Enchantment", effet est moins clair. Ces expériences permettent de conclure que la ribavirine peut @tre un instrument intéressant pour augmenter Je rendement de plantes sans virus lorsque Ion applique une culture de mérist8mes & des bulbes de fleurs. Une autre étude a permis d'examiner Iefficacité de la ribavirine en combinaison avec de l'adénine arabinoside sur le virus de la mosaique du tabac dans des cultures de tissus du tabac. Les cultures de calus du tabac infectées par le TMV sont exposées & différentes combinaisons de ribavirine et d'adénine arabinoside dans un milieu solide induisant des pousses pendant 1 mois, les nouvelles pousses tant examinées pour le virus. La présence des produits chimiques dans le milieu réduit a fréquence de la production de pous- ses. Toutefois, dans plusieurs combinaisons, les pousses régénérées qui sont examinées, sont exemptes de TMV décelable. — Lorsqu'on10 20 25 30 35 12 Jes transfére dans un milieu sans produits chimiques, les pousses restan- tes continuent & croftre et ne développent les symptémes du TMV qlaprés qe les plantes aient quatre & cing feuilles plus Jongues que 1 cm, On fait pousser certaines des plantes jusqu'A leur dimension totale en serre, ces plantes se révélant sans TMV lorsqu'elles sont examinges & des fins d'infectivité. La ribivarine et I'adénine arabino- side inhibent d'une maniére efficace la multiplication de TMV lorsque Hon examine Winfectivité. La ribavirine et I'adénine arabinoside inhi- bent d'une manigre efficace la multiplication de TMV dans les cellules des feuilles lorsque I'on commence le traitement aussit6t aprés Iinocu- lation, Lorsque des cellules de calus non organisées sont inoculées avec le TMV et traitées par la ribavirine ou ladénine arabinoside, la multiplication de TMV n'est jamais inhibée. Toutefois, lorsque Hon utilise de la ribavirine en une concentration de 0,5 & 1,0 mM en combinaison avec de |'adénine arabinoside en une concentration de 0,1 & 1,0 mM dans des cultures de tissus du tabac, la présence de TMY est contrélée. Diautres études effectuées sur des plantes d'ornement, telles que les orchidées montrent que la ribavitine élimine d'une ma- nigre efficace le virus pathogéne usuel des cymbidiums, la souche dlorchidée du virus de la mosaique du tabac (TMV-0). Des concentrations de ribavirine allant de 30 & 1000 ppm ont été incorporées dans des milieux de culture de tissus dans lesquels les orchidées sont clonées, et utilisées pour arroser et vaporiser des plants d'orchidées entiers d'une maniére contrélée. Les titres de virus sont déterminés par des essais de micrographie électronique de transmission et de sérologie @'ELISA. Afin d'accroftre 1a pénétration de la ribavirine, on incorpore 200 ppm de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans tout le traitement, y compris les témoins. Les études montrent que les cultures de tissus dlorchidées du type .cymbidium peuvent @tre dépourvues A volonté de la souche dlorchidées du virus de la mosaique du tabac . Les cultures se développant sur les quatre concentrations de ribavirine utilisées dans l'étude (30, 100, 300 et 1000 ppm) donnérent lieu & une nouvelle croissance sans virus. Tous les tissus développés sous ces conditions sont exempts de virus : les pousses, les racines et Jes corps du type protocormes"non différenciés", y10 15 20 25 30 35 13 Des plantations méres de cymbidium infectées par Je virus entrainant des taches annulaires chez 'edontoglossum (ORSV) sont régénérées en présence de ribavirine. Les méristames ou proto~ cormes des cymbidiums sont cultivés sur un milieu de Knudson C liquide ou solide (0,7% d'agar), tels que modifiés pour les orchidées Par Morel. Des expériences ont montré que les protocormes de cymbi- dium en bonne santé provenant de semences poussent bien sur des milieux contenant 0,10 ou 25 ppm de ribavirine, mais deviennent nécrotiques aprés quatre semaines de culture sur un milieu contenant 50 ppm de ribavirine. A partir de la sixiéme sous-culture, le virus n'est plus décelable par I'essai d'Elisa. Un autre essai montre que des plants de pommes de terre infectés par le virus Y de la pomme de terre peuvent étre régéné- rées par la culture de bouts de méristémes. Bien que la proportion de plantes en bonne santé obtenues par cette technique soit habituelle- ment élevée, elle requiert des milieux complexes et la vitesse de Fecroissance de fragments de plantes méristématiques est lente. Les méristémes sont cultivés sur un milieu de Murashige et Skoog additionné de vitamine B5 et de substances de croissance. D'autres fragments de plantes (pousses, fragments de pousses et fragments de tige) sont mis & croitre sur un milieu de Murashige et Skoog sans addition de substances de croissance. La présence du virus de la Pomme de terre Y dans les fragments de plantes est contrdlée avant et aprés la culture in vitro, au moyen d'une classification biologique sur des plants d'essai de tabac, ou par sérologie (Elisa). Les résultats ainsi obtenus confirment I'élimination du virus Y de la pomme de terre des plantes infectées par la culture de méristémes. L'addition de ribavirine (10, 25 et 50 ppm) accroft la vitesse de régénération, mais la phytotoxicité aux concentrations d'inhibition du virus rend ce produit chimique inapproprié comme inhibiteur de virus avec la culture de méristémes & partir de pommes de terre infectées par Je virus Y de la pomme de terre. Toutefois, pour d'autres types de fragments de plantes (pousses, morceaux de pousses et fragments de tige), la ribavirine & une concentration de 25 ou de 50 ppm 710 15 20 25 30 35 1h accroit sensiblement le nombre de plantes sans virus obtenues aprés une culture in vitro pendant 3 & 4 semaines. Des protocormes de cymbidium infectés par Je virus entratnant des taches annulaires chez Hodontoglossum sont placés & des fins de prolifération sur un milieu de Knudson C liquide contenant 0, 10, 25 ou 40 ppm de ribavirine. Aprés des sous-cultures trimensuelles effectues sur le méme milieu, la ribavirine & une concentration de 10 ppm ne laissait plus I'ORSV se multiplier, tandis que la concentration virale diminuait progressive- ment dans les protocormes obtenus avec 25 ppm de ribavirine. Crest ainsi que invention traite d'un agent antiviral qui s'avére efficace contre certaines maladies virales ou induites par un viroide chez les plantes. Il doit @tre entendu que la présente invention n'est en aucune fagon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y étre apportées sans sortir du cadre du présent brevet.10 5 20 25 30 35 15 REVENDICATIONS. 1. Composition de traitement des plantes pour empécher ou arréter les maladies virales ou induites par un viroide, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de 1-B- D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide ou du dérivé 2,3,5-triacé- tylique ou 5'-butyrylique de celui-ci. 2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle contient le 1-P-D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxa- mide ou le dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique de celui-ci en combinaison avec une quantité efficace d'un agent pénétrant, tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou d'autres agents pénétrants et tensio-actifs. 3. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce quielle comprend le 1-P-D-ribofurannosyl-1,2,4- ‘triazole-3-carboxamide ou son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique en une concentration d'environ 100 & environ 2000 ppm. 4. Composition suivant la revendication 2; caractérisée en ce qu'elle contient le 1-B-D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxa- mide ou son d ivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique en une concen- tration d'environ 100 & environ 2000 ppm. 5. Composition suivant I'une quelconque des revendica~ tions 1 a 4, caractérisée en ce que & 1-B-D-ribofurannosyl-1,2,4-tria- zole-3-carboxamide ou son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'butyrylique est sous la forme d'une solution aqueuse. 6. Composition suivant "une quelconque des revendica- tions 1 8 4, caractérisée en ce que le 1-B-D-ribofurannosyl-1,2,4-tria~ zole-3-carboxamide ou son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique est sous la forme d'une solution d'eau et d'alcool (environ 5% & environ 15% en volume). 7. Composition suivant Mune quelconque des revendica~ tions 1 8 4, caractérisée en ce que le 1-B-D-ribofurannosyl-1,2,4-tria- 2ole-3-carboxamide ou son dérivé 2,3,5- thiacétylique ou 5'-butyrylique est sows la forme d'une solution d'eau et de diméthylformamide (environ 5-25% en volume).10 15 20 25 30 35 16 8. Procédé de traitement des plantes pour empécher ou arréter Jes maladies virales ou induites par un viroide, caractérisé en ce qu'il comprend I'application d'une quantité efficace de 1-B- D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide ou de son dérivé 2,3,5- triacétylique ou Stbutyrylique. 9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que la maladie virale ou induite par un viroide est provoquée par un virus choisi dans Je groupe comprenant les tobamovirus, clostéro- virus, tombusvirus, carlavirus, cucumovirus, potexvirus, _ilarvirus, potyvirus, bromovirus, tymovirus, virus de la mosaique de la luzerne et virus de la maladie bronzée de la tomate. 10. Procédé suivant I'une ou Iautre des revendications 8 et 9, caractérisé en cé que I'on applique une quantité efficace de ce I-P- D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide ou de son dérivé 2,3,5-triacétylique ou S4butyrylique sous la forme d'un arrosage du sol « 11, Procédé suivant Mune ou autre des revendications 8 & 9, caractérisé en ce que l'on applique une quantité efficace de ce_1-B-D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide ou de son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique par pression ou injection par gravité. 12. Procédé suivant I'une ou l'autre des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que l'on applique une quantité efficace de ce 1-P-D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide ou de son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique sous la forme d'une vaporisation foliaire. 13, Procédé suivant l'une quelconque des revendications 8 812, caractérisé en ce qu'on utilise le 1-B-D-ribofurannosyl-1,2,4-tria- zole-3-carboxamide ou son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique en combinaison avec une quantité efficace de diméthylsulfoxyde (DMSO) comme agent pénétrant ou d'autres agents pénétrants et agents tensio-actifs. 14, Procédé suivant I'une ou l'autre des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que lon incorpore une quantité efficace i/10 Is 20 25 30 35 7 de_1-8-D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide ou de son dérivé 2,3,S-triacétylique ou 5'-butyrylique dans des cultures de tissu utilisées pour la propagation de plantes. 15. Procédé de traitement de plantes pour empécher ou arréter les maladies virales ou induites par un viroide, caractérisé en ce qu'il comprend I'application d'une quantité efficace de 1-PD-ribo- furannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide ou de ses dérivés 2,3,5-triacéty- lique ou 5'-butyrylique, combinée avec un humus réfléchissant pour Fepousser les vecteurs aériens qui transmettent les maladies virales aux plantes. 16. Procédé pour empécher les maladies virales ou induites par un viroide chez les plantes, caractérisé en ce qu'il comprend lapplication d'une quantité efficace de 1-D-ribofurannosyl-1,2,4-tria- zole-3-carboxamide ou de son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyryli- que a des mauvaises herbes cibles connues comme étant des réservoirs de virus pour culture. 17, Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que l'on applique le 1-P-D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carboxa~ mide ou son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique en une concen- tration d'environ 100 8 environ 2000 ppm. 18. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que !'on applique Je 1--D-ribofurannosy!-1 ,2,4-triazole-3-carboxa- mide ou son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique en une concen- tration d'environ 100 & environ 2000 ppm. 19. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que Hon incorpore Je 1-P-D-ribofurannosyl-1,2,4-triazole-3-carbo- xamide ou son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique dans. les cultures de tissu précitées en une concentration environ 10 & enviren 400 pL 20. Procédé de traitement de plantes pour empécher ou arréter la maladie virale induite par le virus de la mosaique du tabac dans des cultures de calus de tabac, caractérisé en ce que du 1-B-D-ribofurannosyH2,4-triazole-3-carboxamide ou son dérivé 2,3,5- triacétylique ou 5'-butyrylique en une concentration de ordre d'environ 0,5 & environ 1,0 mM et de I'adénine arabinoside en une concentration dlenviron 0,1 & 1,0 mM sont incorporés dans un milieu d'induction10 15 20 25 30 35 18 de pousses solide . 21. Procédé pour empécher les maladies virales ou induites par un viroide chez les plantes, caractérisé en ce qu'il comprend Mapplication & une souche de semences végétatives d'une quantité efficace de 1-B-D-ribofurannosy!- 2,4-triazole-3-carboxamide ou de son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique. 22, Procédé pour empécher les maladies virales ou induites par un viroide chez les plantes, caractérisé en ce qu'il comprend Hincorporation d'une quantité efficace de 1-f-D-ribofurannosyl-1,2,4- triazole-3-carboxamide ou de son dérivé 2,3,5-triacétylique ou 5'-buty- rylique dans de la terre en pot destinge & étre utilisée en serre ou dans des patcelles de terrain pour plantes expérimentales comme agent prophylactique. — ~ 23, Procédé suivant l'une ou l'autre des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que l'on applique le 1-P-D-ribofurannosyl- 1,2,4-triazole-3-carboxamide ou ses dérivés 2,3,5-triacétylique ou S'-butyrylique sous la forme d'une solution aqueuse. 24. Procédé suivant Mune ou autre des revendications 8 et 9, caractérisé en ce que l'on applique le 1-P-D-ribofurannosyl-1,2,4- triazole-3-carboxamide ou ses dérivés 2,3,5-triacétylique ou 5'-butyrylique sous la forme d'une solution d'eau et d'alcool (environ 5% A environ 15% en volume). 25. Procédé suivant I'une ou l'autre des revendications 8 et 9 caractérisé en ce que l'on applique le 1-P-D-ribofurannosyl- 1,2,4-triazole-3-carboxamide ou ses dérivés 2,3,5-triacétylique ou S'-butyrylique sous la forme d'une solution d'eau et de diméthylforma- mide (environ 5-25% en volume). 26. Compositions et méthodes de traitement des maladies virales chez les plantes, telles que décrites ci-dessus, notamment dans les exemples donnés. Dessins ; i we. planches ~A_peges dont garde description Luxem: 5 Le mandaisire 74M 88 Me Alain ee ef