Hiperpolariziraniji potencijal unutarnje mitohondrijske

membrane kod tumorskih stanica i izgledi za terapiju u borbi

protiv stanica raka

Uvod – mitohondrij

Mitohondriji igraju ključnu ulogu u proizvodnji metaboličke energije u eukariotskoj stanici. Odgovorni
su za stvaranje najvećeg dijela uporabljive energije oslobođene razgradnjom ugljikohidrata i masnih
kiselina koja se procesom oksidativne fosforilacije pretvara u ATP. Glavni proteini mitohondrija
sintetiziraju se na slobodnim ribosomima citosola, a u organele se usmjeruju specifičnim signalima za
navođenje. Mitohondriji su jedinstveni među citoplazmatskim organelima jer sadržavaju vlastitu DNA
koja kodira transportne RNA (tRNA), ribosomske RNA (rRNA) i neke od proteina mitohondrija.
Mitohondriji su stoga izgrađeni dijelom od proteina kodiranih vlastitim genomom i sintetiziranih
unutar organela, a dijelom od proteina kodiranih genomom jezgre i unesenih iz citosola.

Mitohondriji su okruženi dvostrukim sustavom membrana, sastavljenim od unutarnje i vanjske

membrane koje su odijeljene međumembranskim prostorom. Unutarnja membrana mitohondrija
oblikuje brojne nabore (kriste), koji se protezu u unutrašnjost (matriks) organela. Svaka od tih
komponenata ima različitu funkciju, a zajedno s matriksom i unutarnjom membranom predstavljaju
glavne radne odjeljke mitohondrija.

Stanično disanje

Sve naše stanice dobivaju energiju nizom kemijskih reakcija koje su dio našeg metabolizma.
Metabolizam se može promatrati kao ravnoteža anabolizma (sinteze) i katabolizma (razgradnje).
Ugljikohidrati, proteini i masti koje unosimo hranom metabolički se pretvaraju u energiju (ili adenozin
trifosfat). Ugljikohidrati se, primjerice, razgrađuju do glukoze koja se glikolizom pretvara u piruvat te
kasnije u acetil-koenzim A (CoA), koji se kasnije metabolizira putem ciklusa limunske kiseline 1. Tim
ciklusom nastaje NADH koji procesom oksidacije (u NAD + + H+ + 2e-) sudjeluje u uspostavljanju
elektrokemijskog protonskog gradijenta.

Oksidacijska fosforilacija – „lanac prijenosa elektrona“ i ATP sintaza

Cijeli metabolički put stvaranja energije za sintezu ATP-a oksidacijom hranjivih tvari zove se
oksidacijska fosforilacija. Sastoji se od kemijskih reakcija koje oslobađaju energiju i onih koji troše
energiju. Protok elektrona „lancem prijenosa elektrona“ od elektron donora, poput NADH-a, do
elektron akceptora, poput kisika, oslobađa energiju, a sinteza ATP-a se odvija uz utrošak energije. Ta
dva seta reakcija rade u skladu te ako jedan od setova nedostaje, ATP se neće sintetizirati.

Lanac prijenosa elektrona se sastoji od enzima koje čine kompleksi I do IV i njima se odvija niz
procesa redukcije i oksidacije. Na taj način se pomoću visokoenergetskih elektrona koji su nastali
oksidacijom NADH i FADH2 oslobađa energija za prijenos protona u međumembranski prostor.
I transportni lanac elektrona (sastavljen od enzim) i ATP sintaza nalaze se na unutarnjoj
mitohondrijskoj membrani, a energija se prenosi iz transportnog lanca u ATP sintazu samim
kretanjem protona kroz membranu procesom zvanim kemiosmoza. 2

Mnogi enzimi su prekrasne složenosti, ali mitohondrijska ATP sintaza (ili kompleks V) nedvojbeno je
remek-djelo majke prirode među svim kompleksnim enzimima. Uz to, jedan je od najvažnijih, a i
najneobičnijih enzima u ljudskom tijelu 3. Sastoji se od dvije funkcionalne domene: F 1, koji se nalazi u
mitohondrijskom matriksu, i FO, koji se nalazi na unutarnjoj mitohondrijskoj membrani. Glavna
funkcija mitohondrijske ATP sintaze je fosforilacija ADP-a u ATP, a za taj proces koristi protonski
elektrokemijski gradijent, odnosno električni potencijal između međumembranskog prostora i
matriksa mitohondrija4.

Prijenos protona i membranski potencijali

Transport elektrona kroz komplekse I, III i IV združen je s transportom protona iz matriksa

mitohondrija u međumembranski prostor. Na taj način se slobodna energija oslobođena prijenosom
elektrona iskorištava za uspostavljanje gradijenta protona kroz unutarnju membranu. Kompleksi I i IV
djeluju kao protonske crpke koje kao rezultat konformacijskih promjena potaknutih transportom
elektrona prenose protone kroz membranu. Tako primjerice, kompleks I i kompleks III prenose po 4
protona kroz membranu po jednom paru elektrona.
Kako su protoni električki nabijene čestice, potencijalna energija pohranjena u gradijentu protona po
svojoj je prirodi i električna i kemijska. Električna komponenta odgovara razlici napona kroz unutarnju
membranu mitohondrija (matriks je negativno, a međumembranski prostor pozitivno nabijen).

Odgovarajuća slobodna energija je prikazana jednadžbom:

∆ G=−F ∆ V =RTln ¿¿ ¿

gdje su ¿ ¿ i ¿ ¿ koncentracije protona unutar i izvan mitohondrija 5.

Zašto je važno da membrana bude hiperpolarizirana (da postoji razlika potencijala)?

Svi prethodno navedeni procesi prijenosa protona kroz membranu su glavni uzroci razlike potencijala
membrane.

Eukariotska stanica mora održati hiperpolarizirani napon unutarnjih membrana. Ako taj napon
nestane, otvoriti će se pore osjetljive na razliku potencijala što će omogućiti tvarima koje potiču
apoptozu (npr. citokrom c) da prođu do citoplazme i započnu staničnu smrt 6.

Potencijali mitohondrijske membrane u normalnim stanicama i u stanicama raka

U normalnim stanicama, mitohondrijski membranski potencijal Ψ IM iznosi između -108 i -159 mV.
Optimalni iznos za maksimalnu proizvodnju ATPa u svim živim organizmima varira između -130 i -140
mV7. U stanicama raka, mitohondrijski membranski potencijal je hiperpolariziran za razliku od
normalnih stanica. Takav potencijal može biti veći više od 50% od optimalnih vrijednosti, pa čak i do
dva puta više, te takav potencijal nije optimalan za proizvodnju ATPa 8. Istraživanja nisu potpuno
dokazala zašto je to tako, ali veliku ulogu u proučavanju zasigurno ima to da stanice raka ne koriste
aerobno disanje niti membranski potencijal kao normalne stanice.

Aerobna glikoliza

Stanice raka aktiviraju glikolizu u prisustvu kisika skoro cijelo vrijeme. Taj fenomen naziva se
Warburgov efekt, a smatra se posljedicom oštećenja u oksidativnoj fosforilaciji (OXPHOS). Iako
oksidativna fosforilacija stvara više ATPa po molekuli glukoze nego glikoliza, glikoliza se odvija brže
stoga je sposobna brže proizvesti ATP ukoliko ima neograničene količine glukoze. To pogoduje brzo
rastućim stanicama, odnosno povećanoj staničnoj proliferaciji. Time se smanjuje potreba za sintezom
ATPa, OXPHOS-om, te potrošnjom kisika. Taj fenomen je nazvan Crabtree efekt 9. Daljnja istraživanja
dokazala su da stanice raka imaju normalni mitohondrijski membranski potencijal kada su u stanju
aerobnog disanja, umjesto aerobne glikolize, što djelomično objašnjava njihovu hiperpolariziranost.

ANT u normalnim stanicama i u stanicama raka

Ono što razlikuje stanice raka od normalnih je i inverzno orijentiran ANT. ANT, ili izmjenjivač
adeninskih nukleotida, je mitohondrijski protein koji olakšava razmjenu ADPa i ATPa kroz unutarnju
membranu mitohondrija, a ima bitnu ulogu u staničnom metabolizmu energije. Reverzibilan je, kao i
ATPsintaza, pa može izvoziti ATP kako bi uvozio ADP ili obrnuto. Ljudski ANT predstavlja 4 izoforma,
svaki sa speficičnim izražajem: ANT1, ANT2, ANT3 i ANT4. U diferenciranim odraslim stanicama, ANT1
je visoko izražen, dok je ANT2 minimalno izražen. U stanicama raka situacija je obrnuta, ANT2 je
visoko izražen, a ANT1 minimalno10. ANT1 i ANT3 povezani su s aerobnim disanjem. Oni izvoze ATP
proizveden tijekom oksidativne fosforilacije iz mitohondrija u citosol, a uvoze ADP. Također, ANT1 i
ANT3 induciraju staničnu apoptozu u stanicama raka prekidanjem membranskog potencijala. S druge
strane, ANT2 je povezan s aerobnom glikolizom. Ekspresija ANT2, koja je povezana sa brzinom
glikolitičkog metabolizma, važan je pokazatelj kancerogeneze. Kada je oslabljena aktivnost OXPHOS-
a, ANT2 uvozi glikolitički proizveden ATP u mitohondrij. U matriksu kompleks ATP-sintaza hidrolizira
ATP, ispumpavajući protone u međumembranski prostor. Obrnute operacije ANT2 i ATP-sintaze u
glikolitičkim uvjetima doprinose održavanju potencijala mitohondrijske membrane, osiguravajući
opstanak i proliferaciju stanica raka. ANT2 ne inducira staničnu apoptozu, već je on svojevrsni
inhibitor PTP funkcije (propusno-prijelaznih pora) ANTa. Ukoliko bi se izgubila polarizacija membrane,
došlo bi do otvaranja PTP i stanične apoptoze.

Inverzna reakcija ANTa2

U stanicama raka, ANT2 je suprotno orijentiran od ANT1 i ANT3. Zbog toga ANT2 više je usmjeren
izvozu ADP i uvozu ATP nego obrnuto kako rade ANT1 i ANT3. U takvoj situaciji, mitohondrij u
stanicama raka izvozi fosfatne ione Pi, potrebne za proizvodnju ATPa, u međumembranski prostor i
više ih ne uvozi, povećavajući tako polarizaciju ATP-sintaze kod tumora. Izvozni ADP, kojeg pospješuje
ANT2, i fosfatni ioni Pi prolaze kroz VDAC (anionski kanal vanjske membrane ovisan o naponu) u
citosol, gdje se njihovim spajanjem sintetizira ATP 11.
Izgledi za terapiju u borbi protiv stanica raka

Dosadašnja istraživanja o mogućoj terapiji protiv stanica raka daju nekoliko rješenja kako dovesti
takve stanice do stanične apoptoze. Jedan od slučaja ima direktnu vezu s hiperpolariziranošću
mitohondrijske membrane. Delokalizirani lipofilni kationi (DLC) mogu proći kroz mitohondrijsku
membranu, a zbog pozitivnog naboja, privučeni su negativno nabijenim matriksom. No, kako stanice
raka imaju puno veću polariziranost mitohondrijske membrane od normalnih stanica, DLC su puno
jače privučeni tim matriksom. Zbog toga DCL otrovi više ciljaju na stanice raka te se mogu
potencijalno koristiti u terapiji, budući da normalne stanice ne oštećuju. S druge strane, kako bi se
stanice raka mogle razvijati uz pomoć ANTa2, ali i izbjeći apoptozu zbog njegove povećane aktivnosti,
ulaze u proces aerobne glikolize pomoću koje hidroliziraju i koriste ATP, ispumpavaju protone u
međumembranski prostor i održavaju potencijal stanice. Potencijalna terapija za takvu vrstu
organizacije stanice je inhibicija rada ANTa2. Mogući izgledi uspješnosti pridodaju se selektivnim
lijekovima. Budući da je ANT2 inverzno orijentiran u membrani mitohondrija, pripadni lijekovi morali
bi dospjeti do točno određene strane ANT2, c-strane prema matriksu ili m-strane prema
međumembranskom prostoru. Takvi lijekovi bi upravo zbog toga inhibirali samo rad ANTa2, a ne
ANTa1 i ANTa3. Ti mogući lijekovi su lijekovi (topljivi ili netopljivi u mastima) koji se vežu za m-stranu
ANTa2 u kiselom okruženju, DLC lijekovi koji se vežu za c-stranu u lužnatom okruženju, lipofilni anioni
koji se vežu za m-stranu ANTa2 ili antitijela protivna m-strani i c-strani ANTa2 12. Treće moguće
rješenje za terapiju su lijekovi koji inhibiraju ATP sintezu, kao i popratne reakcije, bez utjecaja na
transportni lanac elektrona i ATP-sintazu 13. To su lipofili, a mogu biti kationi ili anioni. I oni će također
biti jače privučeni u mitohondrije kod stanica raka, nego kod normalnih stanica. Poznati takvi lijekovi
su 2,4-dinitrofenol (DNP) i FCCP. U stanicama raka uzrokuju zaustavljanje staničnog ciklusa u malim
dozama i staničnu apoptozu u velikim dozama. Tako depolariziraju mitohondrijsku membranu, pri
čemu se otvara PTP. DLC lijek F16, kao i nemorozon ubijaju stanice raka, a normalne stanice
ostavljaju neoštećenima. Posljedica je to jačeg privlačenja tj. afiniteta tumorskih stanica prema
nabijenim lipofilnim protonoforima. Osim nabrojanih, postoji daljnji niz lijekova koji djeluju na ovom
principu, principima sličnim ostalim opisanim ili novim principima uzimajući u obzir inhibiciju
određenih molekula pomoću DNA/RNA. Istraživanja napreduju, a nadamo se kako će se u budućnosti
pronaći načini terapija slični ovima koji bi mogli djelovati na stanice svakog tumora, ne oštećujući
zdrave stanice, te tako podignuti onkološko liječenje na novu, moderniju i sigurniju razinu.
1
Kalyanaraman B. Teaching the basics of cancer metabolism: Developing antitumor strategies by exploiting the differences
between normal and cancer cell metabolism. Redox Biol. 2017 Aug; 12: 833–842.
2
Mitchell P, Moyle J. Chemiosmotic Hypothesis of Oxidative Phosphorylation. Nature. 1967 Jan;213(5072);137-139.
3
Boyer PD. The ATP synthase—a splendid molecular machine. Annual review of biochemistry. 1997 Jul;66(1):717-49.
4
Jonckheere AI, Smeitink JA, Rodenburg RJ. Mitochondrial ATP synthase: architecture, function and pathology. J Inherit
Metab Dis. 2012;35(2):211–225.
5
Cooper GM, Hausman RE. Stanica. 5. izd. Zagreb: Medicinska naklada; 2010. 447-449 p.
6
Zamzami N, Kroemer G. The mitochondrion in apoptosis: how Pandora’s box opens. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001;2:67-71
7
Bagkos G, Koufopoulos K, Piperi C (2014) ATP Synthesis Revisited: New Avenues for the Management of Mitochondrial
Diseases. Current pharmaceutical design 20(28):4570-4579
8
Bonnet S, Archer SL, Allalunis-Turner J, Haromy A, Beaulieu C et al. (2007) A mitochondria-K + channel axis is suppressed in
cancer and its normalization promotes apoptosis inhibits cancer growth. Cancer cell 11(1):37-5
9
Bojana Križnik. Warburg efekt: metabolizam stanica raka [završni rad na internetu]. Zagreb (HR): Sveučilište u Zagrebu;
2011. [citirano 2019 Pro 16]. Dostupno putem: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:217:134758
10
Chevrollier A, Loiseau D, Chabi B, Renier G, Douay O, Malthièry Y, Stepien G (2005) ANT2 isoform required for cancer cell
glycolysis. Journal of bioenergetics and biomembranes 37(5):307-317
11
Chevrollier A, Loiseau D, Reynier P, Stepien G. Adenine nucleotide translocase 2 is a key mitochondrial protein in cancer
metabolism. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. 2011;1807(6):562-567
12
Pebay-Peyroula E, Dahout-Gonzalez C, Kahn R, Trezeguet V, Lauguin GJ, Brandolin G (2003) Structure of mitochondrial
ADP/ATP carrier in complex with carboxyatractyloside. Nature 426:39-44
13
Terada H. Uncouplers of oxidative phosphorylation. Environ Health Perspect. 1990;87:213-8