BIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE ‘Humberto Escalante H. Carolina Guzman L. Claudia C. Ortiz L.OS BIOTECNOLOGICOS La biotecnologia es un conjunto de técnicas aplicadas y desarrolladas por diferentes disciplinas, con el dnimo de utilizar las capacidades de los seres vivos para obtener bienes y servicios. La biotecnologia ha estado unida al desarrollo evolutivo del hombre para la obtencién y conservacién de alimentos, antibidticos y productos que le han ayudlado a mejorar su condicion de vid. Por ejemplo el pan es un alimento elaborado mediante la fermentacién del trigo con levadura (Foto |). Las bebidas alcohdlicas se obtienen por la transformacién de los azticares presentes en las frutas, mediante la accién de microorganismos especificos. La bacteria Zymomona mobilis (Foto 2) se utiliza a para la produccién de etanol, a partir de carbohidratos, generando un impacto Foro I. Saccharomyces cerewsiae utzada ba i para preducic pan positive en el drea de los biocombustibles.BIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE Foto 2. Zymamonas mobils utlizada para producie bebidas alcohicas La bioquimica es a ciencia que se encargadel estudio detallado del metabolismo de las células en los diferentes procesos industriales. Los bioprocesos son operaciones ingenieriles que conlleva la transformacién de una sustancia, mediante el metabolismo de microorganismos, células animales © vegetales, para la obtencién de diferentes productos. Asi mismo, Penicillium chrysogenum, Bacillus subtilis, y Streptomyces erythreus son ejemplos de bacterias utilizadas para la produccién de antibidticos. Algunas especies de algas se pueden cultivar para la produccién de biocombustibles (Foto 3). :CNOLOGICOS PROCESOS Bh ‘ortesia Grupo CIDES-UIS) Foto 3. Cultivo de Chlorella vulgaris a escala de lnboratori (Cé En un bioproceso se denomina sustrato 2 la materia a transformar. El metabolismo microbiano consiste en el consumo dol sustrate par hacterias, levaduras u hongos y su transformacién a otros productos, mediante una serie dereacciones bioquimicas llevadasa cabo por sus enzimas (Figura I). El proceso de bloconversién involucra el rendimiento del praducto, la produccién de calor ‘ome la influencia de variables fisicoquimicas (pH, yla demanda de oxigeno, temperatura, agitacién y nutrientes) que afectan las condiciones de operacion. Bacterias, CH.O,S.R eet “Microorganisms | tevaduras, | | metsles, | hecreneaee > + hrongos vicaminas, ete ‘onigeno disualto, Productos figura |. Exquera de la bioconversion de sustratos industriesBIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE Para que el sustrato pueda ser asimilado por un microorganismo es necesario que tenga ciertos elementos minimos consticutivos como vitaminas, cofactores ¥ macromoléculas, los cuales son esenciales para su crecimiento (Tabla 1). Tabla I. Elementos quimicos constituyentes esenciales de las eélulas 20 30 4 0.03 PROCESOS BIOTECNOLOGICOS Histéricamente, el hombre ha obtenido un gran nimero de productos mediante procesos biotecnolégicos [El-Mansi et al, 2006; Nauka, 2007; Centelle et al. 2008} (Tabla 2). ‘Tabla 2, Ejemplos de microorganismos y productos obtenidos por procesos biotacnolégicos Bebidas alcohdlicas,levadura, aa Saccharomyces cerersie, alimentos fermentados SAN _| Saccharomyces carkbergenss ‘Alcala buica, acatnna Hacterin | Clotridm acetchutyleven Eean Levadura | Zymomonas mobili Peniciina Hongo | Penicillium notatum Acido acético Bacteria [Acetobacter sp. Insulina Bacteria | Escherichia coll an Bacterias, hongos y |Pencilium sp., Candida sp. Saat tevaduras__|Steeptococcus acts Protaina unicelular Levadura | Kluyveromyces mardanus insecticidas Bacteria__| Bacillus thuringiensis Bacteria | Lactobacillus sp.. Leucanostoc sp. Bacteria |emebecterm sp. Brevibacterlum sp. Enimas: proveasas, ipasas, pectinasas, amilasas, et. Bacterias y hongos Pseudomonas sp., Aspergitus niger ‘Compuestos quimicos degradados Bacterias [Peeudomanas sp., Spirilum sp, Thiobacius sp.y fisiologicas (Tabla 3). Escherichia col utiizada en la produccién de queso (Foto 5). Foto 4. Microfotograllaelectrdnica de BIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE Una bacteria es el mas simple y abundante de los organismos; puede vivir en tierra, agua, materia orgénica o en plantas y animales. La vida en nuestro planeta no existiria sin bacterias, puesto que ellas realizan muchas de las funciones esenciales de los ecosistemas. Las bacterias son organismos unicelulares sin clorofila que pertenecen a la clase procariota [Madigan et al, 2003] y se clasifican en diferentes tipos de acuerdo con sus caracteristicas fisicas, quimicas Escherichia coll puede causar infecciones intestinales, sin embargo, se Ia utiliza en fa produccién de insulina (Foto 4). Lactobacillus rhamnosus es una bacteria Foto 5, Coloraciin de Gram de Lactobacillus hhamnosus PROCESOS BIOTECNOLOGICOS: bla 3, Clasiieacén de los ricroorgaismos. seg nintuencla de variables Pscoqureas sles Cocos Formay ——_‘(Aargscas Bacos rgupacén {Coma i aetones sc saa ESE sia Eairos y EaproeEE [Conpencée de Gram = Se visafian de color morada fae Gram = |Se visualizan de color rosado- (pared x a |Aarobia |Necesitan O, para su crecimiento. oxigen Requerimiente de| microneréftas [Crecen en presencia de bajas concentraciones de, us 3, (Anaerobia facultativa [Crecen en presencia o ausencia de ‘Kracrobia estrieta [Se desarvollan en ausencia total de O, __| “Trarmétias [recon nara 45 y 80°C Requerimientn [Meséfilas [Cracen ercre 20 y 45°C ide calor Psicrfilas, [Crecen entre -5 y 20°C eidafias [Se desarrollan con ptt entre Ly 6.0 Requerimiento | suatlas [Se desarrollo con pH entre 6.07 8.0 joe eH Basofilas [Se desarrollan con pHi entre 80 y 14.0 _ zi i a Para fabricar su alimento las autdtrofas fotosintéticas | Auseroas utilizan ta luz del sot y CO, Forma de quimiosintéticns |. fabricarsualimentolasautétrofas quimiosintéticas nutricién etree utilizan compuestos inorgdnicos (azufre) y CQ,. Hererderofas Requieren de carbone orginico (hidratos de carbone 4cidos grasos) para su nutricién aqua (a,) Presién osmética| ly actividad de! eréfilos [Aleamence resistentes a bajos a_(0.60 — 0.85) No esméfilos [Osmotolerante [No necesiean presiones altas pero las tolevan, [No soportan altas presiones. Requieren altos aw (0.98 -1.00)BIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE Los microorganismos a utilizar industrialmente deben crecer répidamente en un medio de cultivo relativamente econémico y disponible en grandes cantidades; generar el producto deseado en un periodo corto de tiempo; ser genéticamente estable ya su vez, susceptibles de manipulacién genética (Foto 6). Un mejor rendimiento del bioproceso se consigue cuando se controlael pH, la temperatura y la agitacién,BIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE La digesti6n anaerobia es un bioproceso que se realiza en ausencia de oxigeno, con microorganismos especificos y que ha sido ampliamente utilizada para la obtencién de biocombustibles [Escalante, et al., 2009}. LA DIGESTION ANAEROBIA, 7 GESTION ANAEROBIA La digestién anaerobia es un bioproceso en el cual un consorcio de microorganismos utlizalamateria orginicadeun residuo como fuente decarbono ya su vez como fuente de energia (Ward et al, 2008). La digestion anaerobia permite hacer un aprovechamiento energético de diferentes tipos de residuos agropecuarios, dado que maximiza el reciclaje de nutrientes como nitrégeno y f6sforo; estabiliza el residuo; disminuye su impacto ambiental (reduccién de olores y emisiones de efecto invernadero) y presenta un bajo costo operacional, dando lugar a un balance de energia positive (Jingura & Matengaifa, 2009). El biogas obtenido es producto de una serie de reacclones en cadena, a partir del carbono que posee el sustrate. Los carbohidratos se convierten en aziicares simples, las grasas en cidos grasos y glicerol y las proteinas se hidrolizan hasta péptidos y aminodcidos, liberando diéxido de carbono (CO,) « hidrégene (H,) para finalmente llegar a metano (Appels et al., 2008) (Figura 2). Compuestos ‘orginicos simples: e=> aminodcidos, éeidos = grasos, azticares cide férmico, _propingico Gee ee ao pee Figura 2, Esquema de ls degradacién secuenctal de compuestos orginicos complejos durante la digestion anaerobiaBIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE Caracteristicas del biogas El biogas es un gas producto del resultado de la degradacién anaerobia de ‘materia orgénica; esta compuesto aproximadamente por 60% de metano y 40% de diéxido de carbono: y contiene minimas cantidades de dcido sulthidrico. El biogas es un poco mis liviano que ef aire, posee una temperatura inflamacién de 700 °C y su llama alcanza una temperatura de 870 °C. El biogis obtenido en la digestién anaerobia puede sustituir cualquier otro tipo de combustible (Figura 3). Figura 3. El blogs de dligestién anaerobia puede ser una fuente enorgética complementaria para al hombre LA DIGESTION ANAEROBIA joquimica de la digestién anaerobia La digestién anaerobia es un proceso bioquimico complejo que involucra cuatro etapas: a) la hidrélisis de las macromoléculas como polisacéridos, lipidos ¥ proteinas b) la acidogénesis de los monémeros, ¢) la acetogénesis y d) la metanogénesis (Figura 4). ee ‘Aas rss Wes AS) drt ‘ater fadoaors AN) Figura 4. Esquema de las etapas de la digestién anaerobia Estas etapas son realizadas por consorcios microbianos conformados por rr variedad de diferentes poblaciones de microorganismos que pueden u sustrates y que actian en sintrofia, Los productos generados en una etapa constituyen el sustrato de otra, con lo cual el trabajo sinérgico de los grupos tr6ficos lleva a afadir la energla necesaria para mantener las células y ademas de liberar productos de gran interés industrial (Nduka, 2007)BIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE Etapa de hidrélisis Las bacterias hidrolizan la celulosa, fos almidones, las proteinas y las grasas, transformandolos en carbohidratos simples, Acidos grasos y glicerol, péptides y aminoacidos, entre otros compuestos. Etapa de acidogénesis Los monosacdridos producidos en la etapa anterior son convertidas en acidos orginicos como acetato, propionato, butirato y valerato. Etapa de acetogénesis El Acido acético (CH,COOH) y el propiénico (CH,CH,COOH), principales compuestos de los acidos grasos volatiles (AGV), producidos en la etapa anterior son transformados en acetato, hidrégeno y diéxido de carbono (co) [Lawrence et al., 2008]. Etapa de metanogénesis En esta etapa ocurre la estabilizacién final del residuo. El CO, y CH,COOH. generados en la etapaanterior son metabolizados por las bacterias metanogénicas para la formacién de metano. LA DIGESTION ANAEROBIA, El proceso de digesti6n anaerobia requiere de un balance y equilibrio de las condiciones de operacién en cada una de las etapas, para que las poblaciones bacterianas puedan seguir sus respectivas rutas metabélicas. Segiin Mashendete, et. al, (2004) las principales reacciones bioquimicas que se llevan a cabo en el proceso de digestién anaerobia se presentan en la Tabla 4. Estas reacciones no ocurren de forma espontnea y son favorécidas por la sintroffa que existe entre los microorganismos. “Tabla 4. Reacciones quimicas que ocurren en la digestion anaerobia Fermentacién de 3 Ghcom + #H0-—> ch,coo'+ HY + 4, | sucosaaacetato § Fe tacién de fa et aan “Ghucosa + 24,0 ——> CH, ©, + HCO; + 5H +24, a glucosa a butirato fo reaitas Butinto +24,0—P 2CH,COO+ HY + H, B | wuiratascetato eH 5° [Fermentacién del 3 Z veo Propienate + 3H,-—> CH,COO-+ HCO, +H +H, propionato a acetato eee JH, + HCO" CH,coo'+ 24,0 dol H, y CO, Metanogénesis partir del CO, y Hy Metanogénesis a partir Metanogénesis | Acetogénesis del aceratoBIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE Durante la digestién anaerobia el volumen de biogas producido esta directamente asociado al tipo de residuo, y por ende a sus caracteristicas fisicoquimicas, este hecho influye sctamente sobre la cantidad y concentracién del metano producido [ Ward et al, 2008] (Tabla 5), Tabla 5. Elemplos de residuos utilizados para digestién anaerobia RIGENIDEMRESIOUO | ‘Carne cocida Alimentos mezclados Arroz cocido Residuos sélidos Papel de oficina urbanos (RSU) Papel periéuico RSU + ensilaje RSU + estiércol RSU + lodo digerido Semillas oleaginosas Paja Maiz (ensilado) Agro industriales Hojas de remolacha Girasol Sisal + desechos de pescado Sisal _Céscara de plitano Mango ‘Tomate podrido Cebolla Frutas y vegetales LA DIGESTION ANAEROBIA La digestién anaerébica, como proceso biotecnolégico, contempla dos aspectos én de la biomasa residual y del consorcio microbiano que metabolizaré el sustrato industrial. En cuanto al sustrato, se pueden utilizar residuos agricolas ¢ industriales, excretas y orina de vacas, cerdos y aves de corral {Monou et al., 2009] y desperdicios de las plantas de produccién de alimentos y plazas de mercado [Kivaish & Rubindamayugi, 1996]. Los residuos agricolas de cosecha y los estiércoles avicolas, bovinos y porcinos poseen una elevada concentracién de carbono, que los convierte en una fuente de energia residual (Fotos 7 y 8).LA DIGESTION ANAEROBIA BIOGAS & PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE Los tratamientos a la biomasa pueden ser: |. Tratamientos fsicos: pirélisis,tamizaje, reduccién del tamafio de particula {i “Tratamientos quimicos: alcalinizacién. l : i Ill, Tratamientos bioldgicos: aplicaci6n de enzimas. 05 residuos sdlidos orginicos de plaza de mercado son considerados biomasa residual y pueden ser aprovechados energéticamente mediante digestion En cuanto a la seleccién del consorcio microbiano, existen diferentes indculos 19 anaerobio. Entre ellos el liquido ruminal, el estiércol anaerobia (Foto 9). con potencial fermentativ de cerdo y vaca y el lodo proveniente de las plantas de tratamiento de agua residual. Su afinidad por los diferentes sustratos naturales esta relacionada con strato y ta la fuente de carbono y nitrégeno presentes, la disponibilidad del sus concentracién de éste. Foto 9. Rosiduos sBlidos orginicos de plaza de meceadorsustrato para digestion snaarabia Las caracteristicas de la biomasa residual determinan el requerimiento de pre-tratamientos para sti posterior aprovechamiento por parte de los microorganismos.BIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE erasers BIOLEC Luego de la seleccién del consorcio microbiano y Ia estabilizacién de la biomasa residual a fermentar, el disefio del bioreactor es otro factor que influye en el proceso de obtencién de un producto de interés econémico. La digestién anaerobia se realiza en tanques de seccién transversal circular, con minima agitacién y se disefia para que todas las etapas del proceso se leven a cabo ala vex (Figura 5 ) [Nizami & Murphy, 2010]. ra] Figura S. Esquema de un biorreactor para digestion a anaerobia Eltanque reactor debe estar provisto de ductos para la alimentacién del residuo, ta descarga de residuos, la recoleccién del biogés generado, la toma de muestras, a adicién de nutrientes y el contro! del pH. za ) UA DIGESTION ANAEROBIA Parc SASOBSIIRS Pardmetieside eperdcl Las condiciones de fermentacién son determinantes para el éxito dela seleccién de la ruta metabélica seguida por el microorganismo y para la obtencién de un producto de interés econémico. Capacidad de carga La estabilidad del proceso de digestién anaerobia y la velocidad de produccién dei biogés dependen de la carga orginica con que se alimente el reactor, En los procesos de digestion anaerobia la carga organica de! biorreactor se expresa en funcién de sélidos volatiles (kg SV/rr? de reactor/dia) [Lawrence et al., 2008}. Temperatura de operacién Para producir metano ta digestién anaerobia de un residuo puede tlevarse a cabo en un rango de temperatura de 30°C a 39°C. La digestién anaerobia realizada en ef rango de temperaturas terméfilas (48°C a 57°C) tiene excelentes resultados, sin embargo, no se recomienda su implementacién debido a los costos adicionales para el calentamiento del biorreactor [Lawrence et al,,2008].BIOGAS A PARTI BAGAZO DE FIOUE Tiempo de operacién El tiempo requerido para obtener un determinado grado de estabilizacién del proceso en |adigestién anaerobiaes de aproximadamente treinta dias. Sin embargo, cen algunos digestores de velocidades altas y permitiendo la agitacién de la carga orginica durante los primeros dias, es posible obtener producciones significativas de metano en un tiempo de retencién de sélo quince dias [Lawrence et al., 2008). Productividad La productividad de un bioproceso se define como fa concentracién final de producto por unidad de volumen y tiempo de operacién (mr biogis/rn? reactor/ dia) [Gaden, 1959]. Rendimiento El rendimiento (Yps) de un sustrato en praducto, durante el proceso de digestién anaerobia se expresa como la relacién de masa de metano formado por unidad de masa de sustrato consumido (kg CH/SV de sustrato]. El producto formado se expresa en gramos de metabolito sobre la cantidad consumida de sustrato [Gaden, La DIGESTION ANA De acuerdo con Monou et al., (2009) Ia digestién anaerdbica de residues industr $ riales es favorable debido a que: Permite una reduccién significativa de la carga organica del residuo. Incrementa la deshidratacion del residuo. No se requiere el suministro de oxigeno. El consumo de nutrientes es bajo. Se requiere un minimo de agitaciin (reduccién de costos energéticos). Se favorece la destruccién de microorganismos causantes de enfermedad (patégenos). Se genera biogis con potencial energético a expensas del metano. . Hay reduccién del volumen del residuo.BIOGAS A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE METANO A PARTIR DE BAGAZO DE FIQUE Actividad hidrolitica La actividad hidrolitica indica la habilidad inherente de una poblacién microbiana El inéculo es la fuente de microorganismos que llevan a cabo el proceso de para degradar fuentes de carbono como la celulosa. Este parimetro se cuantifica la biometanizacién. La seleccién de un ind ‘opiado pare dr in culo apropiado para la degradacién en funcién de la velocidad de consumo de sustrato (Miller, 1959; Zhen-Hu, & metabélica de un sustrato hacia metano depende de su actividad hidrolitica, Han-Qing, 2004; Ward et al., 2008). actividad metanogénica y afinidad por el sustrato [Labatut et a., 201 1] Actividad metanogénica Actividad hidrolitica (AH) Actividad metanogénica Habllidad de la poblacién microbiana para especifica (AME). Laactividad metanogénica se refiere a la capacidad de los microorganismos para dogradar fuentes de carbone (celulosa, almidén, Capacidad de la poblacién tc.) se cuantiiea como la velocidad especiicn ‘hicrobiana’ para trans(ortror a transformar la materia orgénica en metano y se expresa en términos de g DQO de consumo de sustrato [Miller, 1959; Mshandete ‘materia orgénica en metano; se CH,/g SSV/dia [Le Hyaric et al., 2011}. et al, 2005; Zhen-Hu, & Han-Qing, 2006] y se expresa como expresa como g QO Glucosalg SSV/dia 2DQO CH/g SsVidia [Le Hyaric et al, 2011] Potencial de biometanizacién Potencial de biometanizacién (PBM) Hace referencia a la habilidad que tienen los microorganismos para producir Habilidad de fa poblacién microbiana para producir merano a partir de un metano a partir de un sustrato determinado. Se expresa como la cantidad de residuo expecifico, [iP CH,/ kg SV de sustrato} [Angelidaké et of, 2009) metano producido por masa de sustrato (mm? CH,/ kg SV sustrato) [Angelidaki, et al., 2009)16 Produccién de Acido citrico 1. W, Marison 16.1 INTRODUCCION El dcido cfirco es un few tricarbexstico con 6 duwmius de carbon el euat fue aisiado iniciatmente a partir del jugo de limdn y cristalizado por Scheele en 1784, Es un componente natural de muclas frutas cftricas ‘Aunque desde 1893 Wehimer habia mostrado que ciertos mohos del género Penicilivn ¥y Mucor podian producir dcido citrico en un medio con sucrosa, hasta tos inicios det Siglo XX el Acido citrico se provucla prineipalments a partir del jugo Ue fiméa, En la actualidad, et dcido eitrico se produce mediante fermestaciones fiingicas ‘Aunque es posible la sintesis quienica no se ha creado, ningiin proceso comercial basado tw ella, que sea mAs eficaz, que kas fermentaciones. Aproximadamente ef 70% del decido ciirico producido se usa en la industria de los alimentos y bebidas: el 12% en productos farmacéuticas y cerca del 18% para otcos usos industriales. En fa industria alimentaria se usa principalmente como acidulante debido a su alta solubitidnd, su extremadamnente baja toxicidad y su sabor agrio ageadable (tabla 16.0). ‘La produccign de acide efttico se ha incrementado considerablemente en aiios recientes dcbido a su fil biodegradabitidad, 1o cual permite usarlo en lugar del Fostato fen ta industria de detergentes, y para la remosidn de azufce de los gases de chimenea en testaciones de energia, etc, El aumento de In demanda ha estimutado ta creacién de ‘procesos mds eficnces. La demanda aetual es de casi 220,000 roneladas métrieas por ato. Estados Unidos es el principal produetor (180 000 toneladas por aflo) con Pfizer y Mites Lab Inc. como las compaiifas mayores. En el Reino Unido, Sturge Ltd de Birmingham es el mayor productor. Las compaitfas productoras guardan en excesivo secreto sus métodos ¥ se dispone de fpoca informacién publicada retactonada con los ‘procesos industries usados. ‘Aunque se han seleccionade un gran nimero de bacterias, levaduras y honge: superiores para la producciga de deido eitrico, Aspergillus niger a sido el organise dé334 Prodiuceidn de écidoeltrico (Cap. 16 ‘Tabla 16.1 _Usos del seid citric. Thduatria = sos De babidae General Saborizanie Conservadar liminador de turbidea Previene el deteriora Vina Previene la uihides Inhibe la oxieacién Bebidas Stbor “Iresco" esthonstadss| Ayeila ol carbonstacién Alimentaria Conteccisn Seborizante Alimentos congeiados ‘Antioxidante Pradactosleteos ‘Mejaraniento de eator Regular de pit Inseivs metals ava Emulsionador Farmacsiaica Disolventey vaborizante Efervescenie con #00) De coométicos ‘Antioxidante y sinergirico O1ras Recubrimiena electraitico de metales, ata ‘sealers En detergentes Cu “Textiles wo de agua 16.2 PRODUCCION FUNGICA DE ACIDO CiTRICO Wehmer fue primero en desnostrar, en 1893, Ia praduccidin de deido eftico com especies de Peniciliiun desarrolladas en medios que coptenfan azdcares y stles inorgénicas. Mas ade, en 1917, Curie teport6 la produecisa de Scido cftrico poe A, ager desarroliado en smios con azicares a pH tajo, A pH alo, A, niger produce Acido oxalic, Las razones del dorninia de A, niger sobre ctros organisms son 1) facitidad de manejo; 2) el uso de materia prima, barata como s 3) rendimientos altos y consistent 4) econéimicamente convenient has paral prduccicn de Scido etreo se muestran en ke tabla 16.2, 163. TIPOS DE FERMENTACION Hay eas bdsieas Ue procesos de fermentacidin pura cl Acido ctriew Seee, 16.31 Tipos de fermentacién 335 ‘Tabla 16.2 Hongos productores de Acide cio, Avniger Penicillion jarshineltam A awanorl P- restrict ‘A fonrecacue Trichalema viride Ac luchensi Mucor piiformis A. wrentié Ustaina vulgaris Acsaitoi Botryis $9, A. sani Ascockyte sp. A fimaricus “Absitia sp. A. phoenicns Talaromyces sp. Aclanosus Acremoniuon £9. A flavus Expenicilinm sp 1) eultivo de Penicillian y Aspergillus estacionario 0 de supertie 2) cultivo sumergido (>1930}; A. niger: 3) cultivo en estado s6lido, cultive continuo, en etapas mailtiples. 16.3.1 Cultivo de superficie Se permite que un medio esiéril con aziicar Nuya en recipientes de avero inoxidable 0 de aluminio, arreglados en fila en edimaras de fermentacién esiérites (Ggura 16.1). La mayoria de las ecmaras controlan fa temperatura, la humedad relativa y fa circulacisn del aire, El medio se inocula con esporas de A, niger a una temperatura constante de 28-30°C con una humedad relativa de 40-60% durante 8-12 dias. El organismo crece y se extiende sobre la superficie acidificando ef medio, Al fiual de la fermentacién, se- aida mediante ta mediciéa del pH del medio, el licor se drons y cl fide citrico se exstaliza, Et micelio puede reutitizarse alicionando medio evo. Et proceso de superticie es el mécodo ms antiguo y, aunque adn se utiliza, ha sido rcemplazado en gran medida por los procesos sunergidos. 163.2 Proceso sumergido fixe es el principal proceso en uso en el que se inocu el medio seguido por Ia agitacién 4 neraciin vigorosas y contra en grandes fermentadoces (STRS) (igor 162). Fl pevfodn ue fermentacdn se reduce hastante 3-F eas) a 25-K0°C. Después, el hieor se Crna para a exizaccign dl deido circ y e mivetio se puede reuiza Un modiicacion de este métedo tiene un proceso en dos etapas en los cuales Inicialmente ef medio se inocula primero con esporssy despa Je 3 64 asl micetio se separ y adigiona al medio de procuceisn, Después tle 3 6 4 més a 28-30%C eon cosigenacidn, se extra el fd cto. {6.33 Fermentacién an estado séitdo Me proces se ha empleado industrialmeate a ning g {ue deserita inicistimente por Cabn en 1935, pero a pesar de su poiencial a ido importante debide a ss laborsProducctén de fcido citrico (Cap. 16 rads ne oe 4 oe FERwEnTACION | | Figura 16.1 Cultivo de supsricie de A. niger pata la producein de Seid cite, El medio de fermentacién se impregna en materiales porosas como cl bagazo de cafia de azicar, pulpa de papa 0 de remolacha, pulpa de pia, tc, en una proporcién apcopiada, se esicriliza € inocula con una suspensicn de esporas. La masa se incuba en recipiente: a 25-30°C dure 6-7 uns y luego we extme con agua, se concentra y se xtra el & ctuico, Recientemente se han patcatado procesos semicontinuos, continuds y de etapas ‘miltiples, pero no se dispone de datos completo, Sece. 16:3) ‘Tipos de fermentacisn 337 Pee) Sete ett [2 ' Figura 16.2 Cultivo sumergida de A. niger pars ts producciin de sede eitico En un proceso continuo de etapas mitiples (Zhuravshi, 1974) el medio uye hacia et primer recipiente a una tasa de dilucién de 0,042 h-! (j= 24 h). La salida de fa primera ‘etapa entra a fa segunda, en la cual ef medio es aerado graduatmente desde 20 a 30 mi xh, Sealilade sosa cfustica para neuializar un tercin del dcido citrico (figura 16.3), Los procesos semicontinuos son en su mayoria métodas de reemplazamiento en tos cules parte del medio es retirado después de la fermentacidn y reemmplazado con medio estéril, haciendo uso, por tanto, del hecho de que la producciGn de Acido citrico ocutre en las células que no estén crecicndo activamente. Aunque son econémicos, los rendi- ‘nicatos no son tan altos como con los procesos continuos. Los procesos sumergidos y de superficie son los mas usados para la produockén en gran escala y se tendrdn que crear las condiciones apropiaelas paca la cepa fumgal en pat- ticular empleada,338 Produceién de fcido citticn (Cap. 16 eee EEC sense CC £200, tH Figura 163 Caltivo continuo de etaps msltples para la protein de ido tien 164 CONDICIONES DE CULTIVO 164.1 Macrocomponentes Las condiciones de eultivo varian de cepa a cepa y es importante determinar ef mejor substato puesto que las cepas que crecen eficientemente sobre una fuente de carbone con buena produccidn de deido cftrieo, a menado no lo harén en ota. Ademés, las cepas con alta producciOn de dcido durante el cutivo en superticie con frecueneia no lo hart ‘bajo condiciones sumergidas. ‘En las primeras fermentaciones Ue Penicillium a menudo se usta 10-20% de ghacosa ‘con tiempos de incubaciGn de 4 a.6 semanas entre 15 y 20°C. Aproximadariente SO% de la glucosa era convertida a Scido citrio. Sece. 16.4) Condiciones de cultive 339 La produccién eficiente de Acido citrico ocurre en medios sintéticos simples. En tnedios complejos, a menudo, los rendimentos son bajos Uebido a fa influeacia de tos. metales y otros componenies. ‘Actualmaente se usan distintas fuentes de carbono que incluyen glucosa, sucrosa, imelazas eftricas, jugo de catia, almidén, y melazas de calla y de remolacha, siendio ta ssucrasa y Ins metazas fos substratos profetidos, La concentraciGn inicial de azdear es importante para determinar el rendimiento de fcido eltrico y de otras fecidos oeghnicos formados por A. niger. Usualmente, A. niger fequiere concentraciones iniciales altas (15-18%). A bajas concentraciones se acumula ficido oxlico y las renditnientos de écido eltrica son bajos, micntras que a altas concen- twactones queda aiicar residual y el proceso es menos econsimico. ‘Las melazas constituyen el licor residuat que queda después de a cristalizacion de Ia sucrasa a partir del jarabe de cafla concentrado y coatiene 50-60% Ue sucrosa, Hay ‘varios tipos de melazas, cesiduales refinadas,elc,, pero ana desventaja, que todas ellas poseen es su alto contenido de cenizas que inbibe la produccién de fcido citico. ‘La melava se diluye al 15-20% y sa le agrega fcido sulfirico para alcanzar un pit de 5.6-6.5. Se aviaden otros nuitrientes esenciales y et medio se esteritiza durante 30 min, cewentemente la melaza se pretrata para remover metales paséndola a través de resinas de iniercambio iénico, Pueste que la produecién de ficido eftrico por A, aiger necesita “etupa de erect ‘mienta” y una “otapa de produccién” el balance de 10s distintos componentes del medio, ‘en particular ef nittdgeno, fisforo, azure y varios elementos traza, tiene un efecto pronuuciado sobre el rendimiento de acido efirico. A menudo se usin fuentes de. hileSgeno inorgdnicas como (NH4)2 Sg, NHyNOs, NaNOs, KNOs, urea, ete. Sin embargo, el tino ¥ la concentraciGt de In fuente de nitrégeno es importante. Ast, el (N42 SO, prolonga el crecimiento vegetativo, en tanto que el Nily NOs lo reduce. Sin cenbargo, concentraciones de NHlNO3 mayores que 0.25% producen acumulacion de ficido oxdlico, En general, mientras mayor es la concentracisn de la fuente de nitrégeno, sds largo es el perfodo de crecimiento vegetativo con un retardo consecuente del inicio Ue la producciéa, El KNO, y el NalNO3 son mas efectivos que el NHyNO} para la producciéa de Seido eftrico con A. niger. ‘La cancentracign de fosfato en el medio afecta profundamente a cantidad de dcido ciizico Formals, Las conceatraciones altas promueven ef crecimiento y reducen la produe- ign de Acido. Por lo general, se usan concentraciones de fosfato de 0.1-0.2%, aunque se ‘ha informnado que la linitaci6n de fostato estimula la produccicn de dcido cftrio, 1642 EI lementos traza Aungae A, niger coquiese viiosentionesdivatentes para el crecimiento y ta produccisn Mi y Mg), la concenuacién relativa de estos iowes metaticos es probablemente el Unico factor mas importante que determica la prvdaceidn de Acido ctico, EI Mg? se requiere par sciones enzimétieas, por ejampro, las cinasas que imervienen tte en of erecimicnto micetial como en ka produeciGn de éeide eftien. La ‘eancentracig dptinea para obtener Ia xima producci6n es de 0.02-0.025%. {51 Fel y el Za? ignen una funciéa crea en la determitacién de la efickencia de la sneniacion, Ls eancentraiones dprimas vavian de una cepa a ola, peso en general las340 Product (Cap. 16 ‘concentraciones deben ser bajas, puesto que, a concentraciones altas, et crecimiento ogetativo es estinulado a expensas de la produccién de feido ciico. La produccign de ‘eido eftrico durante cl cultivo de Aspergillus niger sobre meluzas en cultivo sumergido gra iniciado con concentraciones de Fe2* tan bajas como 0.2 ppm. Sin embargo, se fencontré que ka adicién dle Cu a 0,1-500 ppm af momento de Ia inoculacida o durante las primeras 50 horas de la fermentacién, contraresinba el efecto inhibitorio del Fe? efecto del Zn2* tnbién es eric con wna concenracion de 1-2 4M gue estima fa {ase de erecimiento, en tanto que menos Je 1 UM restringe e] crecimiento y estimu: ia Ia produccién de Acido citrico. La adiciOn de Zi durante tn fase Je produccién inhibe la formaci6n de deido citico y recomienza el crecimiento. Porto tanto, s© fi postulado que el Zn? tiene una funcidn importante en la regulacién del erecimiento y fa producciéa, con fa deficiencia de Zn? que setiala Ia ransicién de ta fase de crocimionto a la fase de produccis, Este efecto se puede deber af papel del Z2* en el Fancionamiento det AMP ciclico (AMPo), puesto que Ia adicidn de AMPe mejora la produccidn mientias que la retarda fa adicién de Za?*, También otros elements traza Como el Ba’, AP, ete, jucgan un papel unportante pero no se eniende adn ta natu raleza de sus efectos. 164.3 Pretratamiento de materia prima Debido a la sensibitidad de la produceisn de éeide efteica a In presencia Ue tones rmetiticos, esta ultima debe ser controlada cuidadosamente, en particular cuando se usa Substratos complejos de composicién variable mal definidos como las melazas. La liminacién completa de estos elementos es précticanente impesibte, sin embaago, es ‘comin usar dos aproximaciones: 1) ef pretratamiento del medio con productos quiinicos o resinas de intercambio ‘nico para reducir la concentracién de los elementos traza; 2) el desarrollo de. cepas miccliales capaces de producit dcido citrico en presencia de altas concentraciones de fones metic, El fervicianuro de potasio se usa frecucntemente para reducir el comenido de Fe fen melaza, ec, en una de dos forinas: 1) por adicin directa af medio de fermenticion fa cancentraciones poco inhibitorias 0 2) por tratamiento del medio antes de tt inoculacién con altas concentraciones de ferricianuro de potas. “La concentracign de ferricianuro requerida para ta clarficactén de metazas depende. del tipo de metaza y varia entre 0.04 10.6% a pH de 2.2, Sin embargo, mientras que las oncentraciones mas altas soa tGxicas para Tos hongos, dan como resultado la precipi- tacidn de Fe% y Zn, conduciendo a una deficiencia que estimula ta produccin de Acide citieo. ‘La concentracion do fersicianuco tolerada por A. niger depende We In etapa de erect niente, Ast ducante i etapa de crecimiento inieia tlera 10.2 200 mg x mb, en tanto fqve dusante la fase de producci6n la concentracicn debe: see menor que 20 sng x nt! EL _ferricianuto no afecta ef contenido de carbon, mitrégeno o (foro del medio, Tainbién | ge han usndo otros agentes quetantes como et EDTA, poliilenaimina y compuestos de - amonio cuaternario, para reducie la concentracion de elementos taza eas mclazas. Sece. 16.4] Condiciones de cultive ot Es claro que se debe tener cuidado en el uso de agentes quimicos puesto que después de la precipitacién o Ia quelacién, se debe eliminar et ferricianuro 0 los complejos antes de Ia inoculacién. En consecuencia, las resinas de intercambio idnico se han usado ‘comiinmente para eliminar elementos traza aunque no produzcan clarificacién, 1644 Blecto det pil En general, el pH del medio inicial se ajusta entre 1.4 y 3.0 con A. niger que crece sobre rmelazas con el fin de reducir la contaminaciGn y suprimir la formacién de Acido oxilico, ‘aunque el pH exacto depende det tipo de metaza usada, La etapa de crecimiento requiere tun pH ligeramente mayor que la etapa de produccién, Durante ésia, a menudo se petmite que el pH disminuya puesto que los hongos pueden tolerar acidez considerable, Sin embargo, para mantener fa productividad es comin afiadir CaCO; o NaOH para ‘mantener un pH constante de alrededor de 20, 1645. Indeulo I inéculo para la fermentacién puede ser ya sea esporas o micelio. Si se usan esporas, se prepara una suspensiGn nueva de esporas adicionando 0.1% de ‘Tween 80 a un cultivo ‘esporulante y se afiade suficicnte cantidad de esta suspensicu al fermentadur ja Gt une cconcentracién inicial de 105-10? esporas x ml, Después de terminada fa fermentacién, cl micelio se puede reutilizar en lugar de reinocular con esporas. Si se usan paquetes ‘micelles como indculo en el fermentador, se permite que las esporas crezcan sobre medio ‘nyevo durante 2-3 dias antes de inocular el fermentador de produecién mayor. La edad de Jas esporas es importante puesto que las de mas de 7-8 dfas de edad con frecuencia sgermainan pobremente, causando bajos rendimientos de Acido cftico, 16.4.6 Acracién y agitactén La fermentacién del dcido citrico es esencialmente un proceso aerobio y, por fo tanto, necesita una oxigenaci6n apropiada, El grado de agitacisn y aeraciéa depende del organismo, el mato del fermentador y et medio. En general se acepta que ta demanda de oxigeno del cultivo es mayor que ia rapides. de (ransferencia de masa del oxigeno hhacia ef medio de cultivo a partic dela fase gaseosa, Hay tres formas mediante las cuales se puede asegurar la seraciOn: 1) por cultivo de superficie, en el cual el ox(geno se difunde a través de la superficie del cultivo estético; 2) por acracin sumerghda, com are o are estéril enriquecido con ox{geno; 3) por cultivo agitado (no usado a escala industrial), el cual es una mezcla de aeracidn sumergida y de ditusiGn en la superficie. __ En la demacién de la superficie ta rapids de ditusin limita ta rapidez de formacic, _ de Aeido cftico, sin embargo, la agitacién suave de tos recipientes produce tna produc ‘cin menor. La aplicacién de aire 0 de aire enriauecido con oxfeeno sobre Ia sunerficie342 Produccién de dcide cftriea (Cap. 16 En fos cuitivos stmergidos se usn ya sea aire comprimido o aire enriquecido con ‘oxigeno junto con la agitacida, Sin embargo, especialmente en el exso del oxfgeno, el aumento en tos costs obliga a rocictar el gas, El oxigeno se necesita no solo para el crecimiento sino también para ta excrecion arlecunda del ilo eivien, Ast, el eégimen acraci6n-agitaci6n ayuda a que I ditusién del feido citrico se aleje ue las pavedes miceliales, donde ta acumlacién darta por fesultado la inbibicién ue In provaccidn, Adem, si el aporte de oxigeno se vuelve Timitante durante la fase de praduccidn, el dcido cfsico es tomado del medio por et organism y es metabolizado. ‘La temperatura dptima para la produccién del Acido cfirico esté entre 25 y 30°C. “Temperaturas mayores que ésas retardan ef crecimiento y estimutan fa produccion de Acido oxatic, El perfodo éptimo de la fermentacién vara de 7-10 dias para cltvos de superficie a 4.5 das para cultives sumergids, Este perfodo es necesaro para permit tanto la etapa de crecimiento como ta de produccis; est tinitado por el crecimiento relativamente Jento de los hongos. 164.7 Aditivos Se ha mostrado que algunos corapuestos estimulan fa produesi6n de Acido eftrico mediante A. niger en eultivos de superficie, sumergidos oesiticos. El mts importante de 4stos es el metanoly, en menor grado, el etanol, Cuando se aade metancl al medio de cultivo ana concentracida de 3-4% antes deta inocutaci6n, ocasiona un retard del ‘erecmiento, rasa la esporuacin y aumenta el rencimiento de cdo cic. Se piensa que 1 metanol aumenta la tolerancia de los hongos al Fe?*, Za? y Mu? y aumenta ta petmneatitida del ricetio para peritc la excrecin del fcido etc. "Adems, se ha mosirado que varios de fos compucstos no metabotizables como el CaF, NaF y KF, a una concentracién de 10-4 estimulan Ia producciéa de dcido etrico al inhibi | metabolismo de crecimiento, Recientemente, el AMP cfctica ha sido de gran interés para ta estimulacion de ta rrovdocisn de Acido cco, AS A, niger muestra mayor productvided cua la conce traci de AMPc en el meoes mayor de 10-#M, El ATP, el GTP y la adenosina también estimolan ia produceiin ariba de 10-M, mientras qe el AME, el GMP y Ta guaosina, 10 tienen efecto o bien inhiben muy poco la productivid. 16.5 PRODUCCION DE ACIDO CfTRICO POR LEVADURAS Hasta hace poco toda In producci¢a de Acido eftrico inclufa el uso de hongos. Sin embargo, se sabe que varias clases de levaduras acumulan Acido cfrico en et medio de crecimiento (tabla 16.3). ‘Las especies de Candida son las ms cominmente usadas que erecen en una amplia, variedad de sabstratos que incluyen glucose, acetato, hidrocarburos, melazas, alcohotes, eidas grasos y accites naturales. seee, 167) Recuperacién del Scio citric 383 ‘Fabla 16.3 Levaduras produetoras de dcido eftico, Candida sp. Rhodororala sp Hansen sp. Sporobolomyces sp, Pichia sp. Entomyces sp. Debaronyees 3. Nocardia sp Torutopsis xp Saccharomyces sp. Klocekera sp 2ysosaccharomyces sp ‘Trehosporon sp. Goneralmente fa fermentaciGn es de tipo sumergido con aeracin agitacion altas a 22-30°C, pH 4.5 y un periodo de fermentacidn de 3-6 dias. Una caractetstica in- teresante de ciertas levadaras ts su capacidd para usar wna ampliavariedad de substratos ‘de crecimiento para la produccida de écido etrico, incluyendo n-parafinas, naleanos y alquenos (C.lipolytice). ‘Al igual que con A. niger, ta concentracién de Fe2* en el medio afeeta la produccion de Acido cttrico, Las levaduras generalmente producen una mezcla de Acido cftrico y Acido isocitsico, y ls proporciones relativas formadas se pueden controlar en cierto grado al ajustar fa concentracién de Fo? Las ventajas principales del uso de levaduras comparado con el uso de hongos filamentorot, son 1) velocidades de crecimiento mayores 2) facilidad de manejo; 3) amplia variedad de substratos de crecimientos; 4) potencial para la realizacién de procesos continuos, 16.6 ,ODUCCION DE ACIDO CITRICO POR BACTERIAS Aunque se conoce una amplia variedad de bacterias que producen Scido citrico a partir de. varios substratos, se ha enfocado muy poca atencién hacia su uso industrial. Tales bacterias incluyen a Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Brevibacterium sp. y Cornyebacierium sp. 16.7 RECUPERACION DEL ACIDO CfTRICO, Los métodos usados no han cambindo por mis de 25 alos, Se requiere extraer el licor crudo seguido por filtracidn para eliminar el micetio, células y otras impurezas. El Acido oxéilico se precipita al calentar a 80-90°C en presencia de pequetias cantidades de cal. Asi, 1 dcido eftico precipita como citrao de calcio usando 1 parte de cal hidratada por cada 2 partes de licor afiadido durante un perfodo de 1 hora con un aumento gradual de temperatura hasta 95°C. El citrato de calcio precipitado se filtra, se lava con agua y se acidifica con HSOy: luego se filtea para eliminar el CaSO4, Este licor, que contiene Acido eftrco, se decotorade fcido eitrico (Cap. 16 |. “ me} pay ‘en eta Ea, cairn, aba Praipacin dn ido [eer] 1480, | (iets J —-— | a0, i cornea } Coase) 1 Hipura 16.4 Diagrams de flujo del crecimiento de A, niger a exteaceisn y la pusifieaciéa det cidoeftieo, Sece. 168] Provesos cos de la formentactén del écido eftrico 345; con carn vege y se pasa a wavés de columnas con resinas de intercaunbio i6nico, en seguida se concentra bajo vacio y se paso a cristalizadores con baja temperatura donde se obtienen cristales ve dcido citrica monohidrato (figura 16.4). Aunque este es ef mgtodo usado més comminmente a gran eseata, recientemente se ha creado otro procedimiento que utiliza la extracciGn con disolventes, En este méiodo el Acido citrica se separa del medio de fermentacién mediante una extraccién de dos fases, usando trideciclamina o triisononitamina y un éster insoluble en agua, cetona 6 alec, Las sales de dcido eftico se sepnean entonces de la mezcla de disolventes con NHOH, carbonatos 0 bicarbonaios. En las fermentaciones con tevaduras el Acido isoctrico, que también se produce debe ser separado primero por preciitacidn con Ca(OH), 168 PROCESOS BIOQUIMICOS DE LA FERMENTACION DEL ACIDO. cfrrico i El Acido citrico es un intermediario estindar del ciclo TCA (iguea 16,5) (capitulo 6) se produce como un producto de exceso debido a una operaeién incorrecta del mismo. Dos enzimas claves son importantes en la fermentacidn det dcido citrico, la aconitasa y Ja isocitrato deshidrogenasa. Las actividades de estas enzimas disminayen a niveles muy bbajos durante la ctaja de ynoduccidu, en ume que aumenui Ki actividad de la eitrato siniasa, Puesto que para la sintesis del Acido eftrico se necesita la condensaciéa de una unidad e acetilo con oxalacelato, es necesario generar aceplor suficiente (oxalacetato) para que la produceién continde. Esto incluye cuatro mecanismos: 1) Ia carboxitacién directa del piruvato catalizada por Ia enzima mélica; esta Feaccién produce malato, el cual se oxida fécilmente & oxalacetato; 2) la carboxilacién del piruvato catalizacla por fa pinuvato carboxilasa: Me D> oxalacetato + ADP +P; Pirwvato + CO) +#1,0 + ATP 3) la carboxitaciéa det fosfoenolpiruvato(PEP) catalizada por la PEP carboxicinasa: PEP + ADP + CO) oxalacetato-+ ATP 4) a via det glioxalato que ulifiza las enzinas clave isocitratoliasa y matato sintasa, La aconitasa es una de las dos enzimas clave, ya que es sensibte a altas concentraciones de jones metslices como el Fe; la restriccign de Ia actividad de esta enzima es la clave para tener éxito en la fermentacién del Scido cttico, Sin embargo, la produccién de Acido clwrico y su excrecién por las células Som dos problemas completamente separados. Asi, es importante no solamente regular fa actividad de las enzimas clave del ciclo TCA por medio de fos elementos taza, sino también hacer pecmeables a las membranas para que346, (Cap. 16 Y rv —— rrinwaio 084 Prrwate m Py ‘ nase — ave ee Figura 165 Ciclo del ido citrico. racién intracelular de feido citrico permanczca baja, previniendo ast la de su sitesi, y facilitar la extraccisn del producto. del isocitrato se puede reducie adicionanda inhibiddores de ta mic el ferroctanuro de potasio o por deficiencia de tiamina, Cap. 16) Ribliogratia 3d7" 16.9 MEJORAMIENTO GENETICO Se han informado de muy pocas mejoras relacionadas com el uso de la genética para umentar la producci6n Ue deido cfisico por las cepas productoras. ‘La técnica principal ti sido In mutacin de esporas y la scleceién de mutantes con mayor rendimiento, Desaforiunadainente es dificil idear un sistema para seleectonar tos mejores productores que sea espectfico para et citrato. ‘Un area importante ha sida la seteccign de mutantes que son menos seasibles a la presencia de clementes taza como el Fe?*. Esto ayudaria a obtener la capacidad de usar tmedios complejos baratos en los que la concentracion de estos metales no pueda ser controlada fcitmenie. ‘Con levaduras se ha intentado aslar mutantes con bajas actividades de aconitasa y de isocitrato deshidrogenasa para reducir la sintesis de isocirato y numentar ta products de feido ctsico, . BIBLIOGRAFIA Banik, A. K, (1975) Fermentative production of citric acid by A. niger. Strain selection ‘and optimum conditions for ienproved citric acid production. J. Food Sei. Technol., 12, U1. Cauchary, A. Q. and Pin, 8. J, (1966) The influence of metal complexing agents on citric acid production of A, niger. J. Gen, Microbiol, 43, 70-81, Lockwood, L. B. (1979) In, Microbial Technology, Vol. 1H. 3. Peppler and D. Perlman (eds.). Academic Press, pp. 356-367. Kapoor, K. K., Chaudhary, K, and Tavro, P. (1982) faz Prescot & Dunn's Industrial ‘Microbiology 4th edn. G. Reed (ed.). Macmilan Publishers, pp. 709-745. Wold, W. S. M, and Suzuki, {. (1976) The citric acid fermentation by A. niger. ‘Regulation by size of growth and acidogenesis. Can. J. Microbiol., 22, 1083-1092. Wold, W. S. M. and Suzuki, 1, (1976) Regulation by zine and adenosine cyclic monophosphate of growth and citric acid accumulation in A. niger. Can. J. Microbiol, 22, 1093-1101