Módulo 1 - Histórico

Parte 1
Métodos de sequenciamento de
ácidos nucléicos:
princípios e aplicações
Bióloga - Dra. Mariana Pires De Campos Telles

(CRBio: 30034/04-D)
Bolsista de Produtividade em Pesquisa do CNPq - Nível 1C
Mariana P C Telles Quem sou Eu!?
Bióloga CRBio:30034/04-D
Formação acadêmica
1997 2000 2005
Graduação Mestrado Doutorado
Ciências Biológicas - Agronomia (genética e

bacharelado melhoramento de plantas Ciências ambientais
Eugenia dysenterica Eugenia dysenterica Physalaemus cuvieri (ANURA:

(Myrtaceae) - cagaita (Myrtaceae) - cagaita LEPTODACTYLIDAE)
Atuação profissional
2000 2005 2008 2016

2015
Defesa
doutorado
Pesquisa e Formação de recursos humanos Orientações
concluídas
Nível Quantidade
Iniciação Científica 57
Genética de Ecologia
populações molecular
TCC 56
Mestrado 27
genômica filogeografia Doutorado 16

Pós-doutorado 6
Bolsista de Produtividade em Pesquisa
do CNPq - Nível 1C AT ou DTI 20
Programas de pós-graduação
Roteiro do minicurso
Histórico e contexto das técnicas de isolamento e manipulação

01 de genes e genomas
Metodologia de 1ª Geração de Sequenciamento (Sanger ou

02 Clássico)
Metodologias de 2ª e 3ª Geração de Sequenciamento (NGS ou

03 HTS)
04 Estudos de caso e exemplos de uso das metodologias

Objetivo de aprendizagem
✓ Relembrar aspectos da teoria básica e
geral da genética moderna
✓ Entender a relação das técnicas e
metodologias no contexto do uso das
metodologias de sequenciamento de
ácidos nucléicos
Aspectos gerais da fundamentação teórica
Princípios Básicos Marcadores

Genéticos
Genética Moderna
01
Genética clássica ou
mendeliana
estuda a variabilidade
e hereditariedade dos
caracteres
Genética molecular
estuda como os
genes se comportam
ao nível molecular -
DNA, RNA e
Genética de
proteínas
populações
estudo da variabilidade e 03 02
dinâmica dos genes,
entre e dentre
populações
Localização do material genético
Princípios básicos em genética
Ciclo celular  Passagem da informação entre
gerações
Expressão gênica
Estrutura do
ácidos
nucléicos
▪ Nucleotídeos: elementos construtores dos ácidos
nucleicos
Nucleotídeos
✓ Purinas
✓ Pirimidinas
nucleotídeo
Estrutura do
ácidos
nucléicos
Estrutura do RNA
ácidos
nucléicos
dupla hélice
e Estrutura do DNA
complementaridade
Antiparalelismo 
nucleotídeo
Modelo plano de uma molécula de DNA

▪ 1958 - A. Kornberg isola a DNA polimerase, enzima responsável
pela duplicação do DNA de Escherichia coli.
✓ RNA polimerase
especializada em
sintetizar um filamento
curto de RNA (primer)
atividade corretora
• atividades:
✓ exonucleotídica
✓ síntese
Níveis de controle da expressão gênica
✓ Modificações na cromatina
✓ Metilação do DNA/ acetilação de histonas
DNA ✓ Início da transcrição
Transcrição
✓ Rearranjos gênicos
RNAm
✓ Processamento do RNA
✓ Estabilidade do mRNA
Tradução
RNAi
N ✓ Estabilidade da proteína
C ✓ Localização da proteína
Proteína
✓ Modificação protéica
Origem do polimorfismo
 Mutações
Fenótipo = Genótipo + Ambiente
+...
Contexto histórico Tecnologia do DNA
1950 1956 1970 1978
recombinante (TDR)
1940 1953 1966 1972 2021
~1940– –Primeiras
1972 experiências
Experiências com DNA recombinante
com bacteriófagos
(Berg & Boyer)
1978 – –Isolamento
~1950 Diferenteseeficácias de infecções
caracterização pordeparte
de mais 200 dos
bacteriófagos. Variações entre estirpes bacterianas.
enzimas de restrição
1953 – Estrutura
Prêmio do Arber,
Nobel – W. DNA (Watson
H. SmithCrick)
e D. Nathans
1956 – Isolamento da DNA polimerase (Kornberg)
1966 – Isolamento da DNA ligase (Weiss & Richardson)
1970 – Purifica-se a primeira enzima de restrição tipo II: o
Hind II (Smith & Wilcox)
recombinante (TDR)
1971 – Kathleen Danna e Daniel Nathas
Início da Era do DNA recombinante

recombinante (TDR)
1971 – Kathleen Danna e Daniel Nathas Isolamento de uma enzima bacteriana
Uso da enzima para clivar o DNA viral Primeira fotografia publicada do DNA
cortado com tal enzima → enzima de restrição
recombinante (TDR)
Elucidação do mecanismo de ação das endonucleases de restrição
1978 - Prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia o suíço Werner

Arber os norte-americanos Daniel Nathans e Hamilton Smith
recombinante (TDR)
A partir da Década de 70
Enzima de restrição + inúmeros recursos
Desenvolvimento de várias técnicas

Criar moléculas de DNA recombinante
Replicar moléculas de DNA recombinante
Analisar moléculas de DNA recombinante
recombinante (TDR)
◼ Sentido restrito ◼ Sentido amplo
✓ Molécula de DNA criada em ✓ Tecnologia que é utilizada

laboratório, mediante união para criar e estudar
de sequências de DNA de moléculas híbridas
diferentes fontes biológicas
Poder extraordinário da tecnologia

Possibilita identificar e isolar um único gene ou
segmento de DNA de interesse, dentre milhares...
Tecnologia do DNA recombinante (TDR)
 Isolamento e clonagem fragmentos de DNA in vivo e in vitro
Produz cópia de DNA sem

células hospedeiras
Griffiths et al., 2012

✓ A tecnologia do DNA recombinante agrupa diversas técnicas laboratoriais
Métodos amplamente derivados da bioquímica dos

ácidos nucléicos, associada às técnicas genéticas
desenvolvidas para o estudo de bactérias e vírus
Método básico
envolve 7 etapas
✓ A tecnologia do DNA recombinante agrupa diversas técnicas laboratoriais
1. O DNA a ser clonado é purificado de células ou tecidos

2. Uso de enzimas de restrição para gerar os fragmentos específicos de
DNA. Essas enzimas reconhecem e cortam as moléculas de DNA em
sequências nucleotídicas específicas
3. Os fragmentos produzidos pelas enzimas de restrição são unidos a outras
moléculas de DNA que servem como vetores, ou moléculas
transportadoras. Um vetor reunido a uma fragmento de DNA é uma
molécula de DNA recombinante
4. A molécula de DNA recombinante é transferida para uma célula
hospedeira. No interior dessa célula, a molécula recombinante se replica,
produzindo inúmeras cópias idênticas, ou clones, da molécula
recombinante
5. Quando as células hospedeiras se replicam, as moléculas de

DNA recombinante que se encontram em seu interior são
transmitidas a toda sua prole, criando uma população de células
hospedeiras, cada uma carregando cópias da sequencia de DNA
clonada
6. O DNA clonado pode ser recuperado das células hospedeiras,
purificado e analisado
7. O DNA clonado, então, pode ser transcrito; seu mRNA, traduzido,
e o produto gênico, codificado , isolado e usado para pesquisa ou
para comercialização
Componentes importantes
◼ Enzimas de Restrição ◼ Vetores

As enzimas de restrição clivam o DNA em sequencias

de reconhecimento específicas
enzimas de restrição → produzidas por bactérias → mecanismo
de defesa contra infecções por vírus
Degradação do DNA dos vírus
Mais de 3500 enzimas de restrição já foram descritas
➢ Mais de 150 são comumente usadas em pesquisa

Especificidade e resultados da clivagem por enzima de restrição
A nomenclatura compõe-se das iniciais do nome da espécie e, às vezes, da sigla da linhagem da

bactéria que a produz.
Por exemplo a enzima EcoRI
E→ Escherichia (gênero)
co → coli (espécie)
R→ RY13 (estirpe)
I→ Primeira identificada (ordem de identificação da bactéria)
Sítio de restrição de Estrutura dos

Enzimas Organismo fonte
DNA bifilamentar produtos cortados
↓
5'-G-A-A-T-T-C- -G 5' A-A-T-T-C-
EcoRI Escherichia coli -C-T-T-A-A-G-5' -C-T-T-A-A 5' G-
↑
Fragmentos de restrição
Tamanho variável → determinado pelo número de vezes que a enzima corta o DNA
Exemplo
Enzimas de reconhecimento de 4 bases
AluI – reconhece a sequencia AGCT
➢ 4n = 44 = 256 (em média, a cada 256 pares de bases)

Produz muitos fragmentos pequenos (corte frequente)
Fragmentos de restrição
Exemplo
Enzimas de reconhecimento de 8 bases
NotI – reconhece a sequencia GCGGCCGC
4n = 48 = 65.536 (em média, a cada 65.536 pares de bases)

Produz menos fragmentos, porém maiores (corte raro)
Sequências de reconhecimento
Forma de simetria descrita como Palíndromo

A sequencia nuclotídica é lida igualmente em ambas as fitas do DNA quando a leitura é feita na
direção 5´ a 3´
SOCORRAM-ME, SUBI NO ONIBUS EM MARROCOS

✓ Cortes deslocados → produz extremidades de

fitas simples (coesivas)
Estrutura dos produtos Estrutura dos produtos

Enzimas Enzimas
cortados cortados
-G 5' A-A-T-T-C- -C-C-C G-G-G-

EcoRI SmaI
-C-T-T-A-A 5' G- -G-G-G C-C-C-
-C-T-G-C-A 3' G- -G-G 5' G-G

PstI HaeIII
-G 3' A-C-G-T-C- -G-G '5 G-G-
✓ Cortes não deslocados → produz extremidades de fitas “cegas”

Extremidades coesivas
Vetores:
Transportadores de DNA
Transportar e ajudar a replicar os fragmentos da DNA inseridos
Se diferenciam em função:
Célula hospedeira que consegue entrar

Tamanho do inserto que pode carregar
Número de cópias que pode produzir
Quantidade disponível de sequencia de reconhecimento
Número e tipo de genes marcadores que contêm
Os vetores carregam moléculas de DNA para serem clonados
Características importantes para um vetor:

Ser capaz de replicar-se independentemente
Ser capaz de replicar qualquer fragmento de DNA que carrega
Conter vários sítios de clivagem para enzimas de restrição que
permitam a inserção dos fragmentos de DNA que serão clonados
Conter um gene marcador (comumente um gene de resistência a
antibiótico)
Vetores recombinantes
Os vetores carregam moléculas de DNA para

serem clonados
Tipos de vetores:
Plasmideais
Fago lambda ()
Cosmideais
Cromossomos artificiais
Expressão
Plasmídeos modificados por engenharia genética
◼ Pequeno → pode carregar fragmento grande

(até 25 quilobases)
◼ Tem uma origem de replicação
◼ Numerosas sequencias de reconhecimento
para enzima de restrição – região de
policlonagem
◼ Fácil identificação
❑ Gene marcador – lacZ
◼ Colônias azuis
Plasmídeos modificados por engenharia genética
Etapas para a produção de uma molécula de DNA recombinante com vetor
plasmideal
Outros vetores...
Etapas para a produção de uma molécula de DNA recombinante com

vetor fago 
✓ Até 15 kb
Etapas para a produção de uma molécula de DNA recombinante com vetores

cosmidiais
Vetores híbridos
Parte do cromossomo
lambda e parte dos
plasmídeos
Podem carregar cerca de
50kb

vetores Cromossomos artificiais bacterianos (BAC)
Baseado do plasmídeo de fertilidade

(fator F) de bactérias
Podem carregar cerca de 300 kb

vetores Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
Produção de uma molécula de DNA recombinante com vetores

O DNA foi clonado primeiramente em células hospedeiras procarióticas
http://www.youtube.com/watch?v=x2jUMG2E-ic&feature=related

vetores Vetores de expressão
Destinados a ativar um gene clonado e

produzir muitas cópias da proteína
codificada por esse gene em uma célula
hospedeira
Bibliotecas recombinantes são coleções de

sequencias clonadas
Um conjunto de clones de DNA, originado de um
único indivíduo ou de uma só população, é
denominado uma biblioteca clonada.
Essas bibliotecas podem representar:
Um genoma inteiro ou parte dele: Bibliotecas genômicas
Um único cromossomo: Bibliotecas cromossomo-específicas
Um conjunto de genes que é expresso: Bibliotecas de cDNA
Bibliotecas recombinantes são

coleções de sequencias
clonadas - Bibliotecas Genômica
Teoricamente:
Contém pelo menos uma cópia de cada
sequencia do genoma de um organismo
O número de clones de uma biblioteca pode ser
calculado como:
N – número de clones necessários

P – probabilidade de recuperar uma
dada sequencia
f – fração do genoma em cada clone

clonadas - Bibliotecas
cromossomo-específicas

clonadas - Bibliotecas de cDNA
Como estudar
essas bibliotecas?
Clones específicos podem ser recuperados de uma biblioteca
Hibridização de DNA
Princípio: uma sequência alvo desnaturada e uma sonda de fita simples de
DNA ou RNA complementar formam um híbrido estável pela ação do calor
(Swinger e Tucker, 1996)
primeira técnica de hibridização in situ utilizando sondas marcadas com
radioisótopos
Diversos métodos permitem investigar uma biblioteca

Rastreamento da biblioteca
➢ Sondas – qualquer sequencia de DNA ou RNA que foi marcada de algum modo e é
complementar a alguma parte de uma sequencia clonada, presente na biblioteca
Tecnologias de microarranjos
Base do aprimoramento das

tecnologias de sequenciamento
As sequencias clonadas pode ser analisadas de diversos modos
O sequenciamento de DNA é o modo definitivo para

caracterizar um clone
Produz cópia de DNA sem

células hospedeiras
Griffiths et al., 2012

PCR - Reação em Cadeia da Polimerase

PCR - Polymerase Chain Reaction
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8f/DNA_replication_en.svg

1985 - K. Mullis desenvolve o método de PCR

✓ descrevendo um novo procedimento para detectar a mutação na
hemoglobina que causa a anemia falciforme
O aquecimento necessário para desnaturar o

DNA após cada ciclo de PCR inativava essa
polimerase, de modo que ela precisava ser
adicionada novamente- te após cada ciclo.
Cap. 7 - Estudando Genes – Cox et al.2012 Pg. 252

1987 - Utilização da DNA polimerase de

Thermus aquaticus (Taq polimerase)
possibilita a automatização da reação de
PCR
Cap. 7 - Estudando Genes – Cox et al.2012 Pg. 252


➢ Mullis & Falona 1987

➢ amplificação in vitro de fragmentos específicos
✓ A quantidade de DNA final segue uma função exponencial, onde:
N = N 0 . 2n
N = Número final de cadeias de DNA
N0 = Número inicial de DNA molde (template)
n = Número de repetições do ciclo
DNA molde
PCR
Nucleotídeos
Termociclador
Primer (iniciador)
AATGCTCAATTGCATGCC
ACTGATCATCATCGC
Taq DNA polimerase

Desnaturação
Reação em Cadeia
da Polimerase
(PCR)
Extensão do Anelamento
DNA do primer
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Fichier:PCR basic principle1.jpg — Wikipédia (wikipedia.org)


➔ Quantidade de nucleotídeos
➔Quantidade de Cloreto de Magnésio (pH ideal = 7,5)
➔ Concentração de oligonucleotídeos (primers)
➔ Temperaturas:
✓ desnaturação
✓ Anelamento do primer (Tm)
✓ extensão da molécula (72ºC - taxa = 150nucleotídeos por segundo por molécula

▪ Multiplex PCR
▪ Nested PCR
▪ RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction)
▪ PCR quantitativa ou em tempo real
▪ PCR de emulsão
▪ PCR de fase sólida Variações
mais comuns
▪ PCR Digital
▪ PCR LAMP
Variações  Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Multiplex Ligation-Dependent
Probe Amplification Analysis
(MLPA)
✓ 45 regiões específicas
Journal of Biomolecular Techniques RF 9:238–243 (2008)

✓ Nested PCR

✓ RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction)
PCR quantitativo – qPCR ou RT_PCR

detectar a quantidade (expressão) do gene na amostra
Análise Qualitativa (PCR comum)
detectar a presença ou não do gene
Variações  Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) PCR de emulsão
Um fragmento por bead: Cada molécula de DNA da

biblioteca se ligará a apenas uma bead. Estas serão
isoladas dentro de uma micela de óleo (emulsificação), no
meio aquoso, junto com os reagentes da reação de
PCR.
PCR de Emulsão: Todos fragmentos ligados

as beads são amplificados simultaneamente. Sendo
que cada bead apresentará varias cópias do
único fragmento ligado a ela inicialmente.
PCR de emulsão
PCR de fase sólida

PCR de fase sólida Cluster
amplificação
PCR Digital
LAMP – PCR (Loop-Mediated Isothermal Amplification)
https://www.neb.com/applications/dna-amplification-pcr-and-qpcr/isothermal-amplification/loop-mediated-isothermal-amplification-lamp
Literatura recomendada
Capítulo 3 - Nucleotídeos, Ácidos Nucleicos e Informação Genética - Voet

Capítulo 7 - Estudando Genes – Cox
Capítulo 10 - Isolamento e Manipulação de Genes - Grifiths
Capítulo 14 - Genomas e Genômica - Grifiths
Capítulo 7 - Técnicas de Biologia Molecular - Watson BioMGene
Capítulo 4 - Técnicas moleculares aplicadas ao diagnóstico de doenças genéticas - Otto
Capítulo 13 - Tecnologia do DNA recombinante e clonagem gênica – Kulg
Capítulo 8. Genomas, Transcriptomas e Proteomas - Cox
Capítulo 14 - Genomas e Genômica - Grifiths
Aspectos gerais da fundamentação teórica
Princípios Básicos Marcadores

Genéticos
Marcador genético
é uma característicaC Ifenotípica
A R O D R IGU E Z , PH ou
D
genotípica de um indivíduo, cuja

herança pode ser seguida por
gerações
Marcador genético
• todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um
Marcador gene expresso, como no caso de isoenzimas, ou
de um segmentoCespecífico
IA RODR deIGU
DNAE Z , PH D
(correspondente a regiões expressas ou não do
molecular genoma) - Ferreira & Grattapaglia, 1998
• Ao se verificar o seu comportamento de acordo com os princípios

básicos da herança mendeliana, um marcador molecular é
adicionalmente definido como marcador genético
Estudo do comportamento do marcador em uma população
segregante
Marcador genético
comparações
C I A R O D R IGU E Z , PH D
indivíduos populações espécies
Detecção da variabilidade genética

Marcador genético
Marcadores moleculares
Marcadores Marcadores Marcadores Marcadores de

morfológicos citogenéticos bioquímicos DNA e RNA
RRL / RAD-Seq / GBS
Marcadores baseados em NGS (Next Generation Sequence)
Era – Pós-Genômica Equipamentos de alto desempenho (2005)
SNPs em Chips
AFLPs em analisadores automáticos de DNA (1998) SNPs
Sequenciamento de Genomas completos
Era – Genômica Automação de sequenciadores de DNA (1996)
AFLPs(1996)
SCARS cDNA sequenciamento

RAPD (1990)
SSCPs
Microssatélites (SSRs 1989) CAPs (1993)
PCR loco-específico
Era – Síntese Oligos PCR (1986)
Pré – PCR RFLP (1980)
Era – Hibridização de DNA Enzima de restrição (1968) e Southern Blotting (1975)

Isoenzimas (1960)
Era - Proteínas Eletroforese em gel (1950)

Variantes morfológicas (Antes de 1950)
Fonte: adaptado de Henry, 2012

Marcador molecular
1 2 3
L1 Padrão binário
ou
Base genética “dominante”
A/A A/B B/B
1 2 3
B B B
Padrão
L1
“codominante”
A/A A/B B/B
A/A A/B B/B
Cromossomos contêm as L1 Padrão

unidades informacionais “haplótipo”
transferidas de uma
geração para a outra
Genética
forense
Diagnóstico
Taxonomia
molecular
Genética da
Marcadores Identificação
conservaçã
moleculares de espécies
o
Ecologia Processos
molecular Evolutivas
Melhoramento
Genético
Marcador molecular
Marcador molecular
single-nucleotide
polymorphism
next-generation
sequencing
fragment length
polymorphism
Ômicas
Transcriptômica Proteômica Metabolômica Fenômica

Genômica
DNA RNA Proteína Metabólitos Fenótipo

Bibliografia recomendada
Obrigada!
tellesmpc@gmail.com
@marianapctelles
Mariana Pires de Campos Telles
CRÉDITOS: Slidesgo

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Bióloga - Dra. Mariana Pires De Campos Telles

1997 2000 2005

Graduação Mestrado Doutorado

Ciências Biológicas - Agronomia (genética e

Eugenia dysenterica Eugenia dysenterica Physalaemus cuvieri (ANURA:

2000 2005 2008 2016

genômica filogeografia Doutorado 16

Histórico e contexto das técnicas de isolamento e manipulação

Metodologia de 1ª Geração de Sequenciamento (Sanger ou

Metodologias de 2ª e 3ª Geração de Sequenciamento (NGS ou

04 Estudos de caso e exemplos de uso das metodologias

Princípios Básicos Marcadores

Modelo plano de uma molécula de DNA

Início da Era do DNA recombinante

Elucidação do mecanismo de ação das endonucleases de restrição

1978 - Prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia o suíço Werner

Enzima de restrição + inúmeros recursos

Desenvolvimento de várias técnicas

✓ Molécula de DNA criada em ✓ Tecnologia que é utilizada

Poder extraordinário da tecnologia

Produz cópia de DNA sem

Griffiths et al., 2012

✓ A tecnologia do DNA recombinante agrupa diversas técnicas laboratoriais

Métodos amplamente derivados da bioquímica dos

✓ A tecnologia do DNA recombinante agrupa diversas técnicas laboratoriais

1. O DNA a ser clonado é purificado de células ou tecidos

5. Quando as células hospedeiras se replicam, as moléculas de

◼ Enzimas de Restrição ◼ Vetores

As enzimas de restrição clivam o DNA em sequencias

Degradação do DNA dos vírus

Mais de 3500 enzimas de restrição já foram descritas

➢ Mais de 150 são comumente usadas em pesquisa

Especificidade e resultados da clivagem por enzima de restrição

A nomenclatura compõe-se das iniciais do nome da espécie e, às vezes, da sigla da linhagem da

Sítio de restrição de Estrutura dos

Especificidade e resultados da clivagem por enzima de restrição

AluI – reconhece a sequencia AGCT

➢ 4n = 44 = 256 (em média, a cada 256 pares de bases)

Especificidade e resultados da clivagem por enzima de restrição

NotI – reconhece a sequencia GCGGCCGC

4n = 48 = 65.536 (em média, a cada 65.536 pares de bases)

Especificidade e resultados da clivagem por enzima de restrição

Forma de simetria descrita como Palíndromo

SOCORRAM-ME, SUBI NO ONIBUS EM MARROCOS

✓ Cortes deslocados → produz extremidades de

Estrutura dos produtos Estrutura dos produtos

-G 5' A-A-T-T-C- -C-C-C G-G-G-

-C-T-G-C-A 3' G- -G-G 5' G-G

✓ Cortes não deslocados → produz extremidades de fitas “cegas”

Célula hospedeira que consegue entrar

Os vetores carregam moléculas de DNA para serem clonados

Características importantes para um vetor:

Os vetores carregam moléculas de DNA para

◼ Pequeno → pode carregar fragmento grande

Etapas para a produção de uma molécula de DNA recombinante com

Etapas para a produção de uma molécula de DNA recombinante com vetores

Etapas para a produção de uma molécula de DNA recombinante com

Baseado do plasmídeo de fertilidade

Etapas para a produção de uma molécula de DNA recombinante com

Produção de uma molécula de DNA recombinante com vetores

O DNA foi clonado primeiramente em células hospedeiras procarióticas

Etapas para a produção de uma molécula de DNA recombinante com

Destinados a ativar um gene clonado e