TEMA 3: MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETERMINAR LA

PUREZA Y CUANTIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

· Detección: localización y seguimiento del compuesto → fotometría UV y fluorescencia
· Análisis de pureza: grado de pureza y detección de contaminantes → fotometría UV y electroforesis
· Cuantificación: rendimiento del proceso y estimaciones cuantitativas → fotometría UV y electroforesis
· Caracterización: determinación de parámetros estructurales → electroforesis y otros

1. Fotometría UV
·Es una de las técnicas más utilizadas debido a su sencillez, precisión y rapidez. Se basa en la presencia de
sustancias cromóforas que tienen capacidad de absorción de energía. En el caso de los ácidos nucleicos, son las
bases nitrogenadas (planas, aromáticas y asimétricas)los cromóforos más significativos que contribuyen al
espectro de absorción UV (máximo de absorción en 260 nm).
·La cantidad de ácido nucleico es directamente proporcional a la absorción a 260 nm, por lo que la fotometría
UV se utiliza para la cuantificación y el análisis de pureza de las soluciones con ácidos nucleicos. Esto se basa en
la ley de Lambert-Beer, que relaciona la absorbancia con la concentración.
A = ε·c·L
·Donde ‘c’ es la concentración de ácido nucléico, ‘L’ la longitud en cm de la cubeta atravesada por la radiación y
‘ε’ el coeficiente de extinción molar, que va a variar en función al tipo de ácido nucleico, el que estén más
expuestas las bases nitrogenadas hará que puedan absorber más radiación por lo que:
εRNA ≈ εssDNA > εdsDNA
·Estas relaciones sólo se mantienen si las soluciones son puras, una mezcla de ARN y ADN tendrá un valor
intermedio. Esta medida no permite distinguir entre el ARN y el ADN, y hay que tener en cuenta que la
absorbancia del ADN varía con la temperatura, ya que se desnaturalizan las hebras y se exponen más las bases
nitrogenadas y el coeficiente de extinción varía, normalmente se mide a 25ºC.
·Cuando L = 1 se denomina densidad óptica (DO)

Análisis de la pureza del ADN mediante espectrofotometría

·Las proteínas también tienen cromóforos, principalmente el triptófano y la tirosina (aromáticos, planos y
asimétricos) son los que contribuyen al espectro de absorción, con un máximo a 280 nm.
·Teniendo en cuenta esto, se puede estimar la pureza de una preparación de ácido nucleico a partir de la forma
de los espectros de absorbancia. Para ello, debido a la complejidad de los espectros, se suele medir el valor de
las siguientes razones:
- A260nm/A280nm (más utilizado, mide la contaminación por proteínas)
- A260nm/A230nm (mide la contaminación por carbohidratos y otras cosas que absorben a 230nm)
·Valor de A260nm/A280nm: para una solución pura de ADN 1.8 - 1.9, y para una solución pura de AR 1.9 - 2.1. El
ARN tiene un valor ligeramente mayor debido a que el uracilo absorbe más que la timina. Si los valores
obtenidos son diferentes, suelen cambiar para abajo, la medición de la concentración que determinemos no es
fiable y es indicativo de que la solución tiene impurezas. Podemos pensar que tiene contaminantes y tomamos
una decisión de si esa contaminación puede provocarnos problemas en nuestro posterior trabajo o que.
·Hay que tener en cuenta que tenemos que trabajar en pH constante, trabajamos con tampones, ya que este
hace variar la relación. Soluciones básicas presentarán ratios menores y básicas ratios mayores.
·Este cociente es muy sensible a la presencia de ADN pero muy poco a la de proteína, ya que los ácidos
nucleicos tienen más capacidad de absorbancia que las proteínas, entonces, aunque hemos dicho que es el más
usado, no nos sirve para ver todas las contaminaciones. Para que haya un cambio sustancial en
A260nm/A280nm tiene que haber una alta contaminación de proteína, por lo que no nos servirá mucho si
queremos ver contaminaciones de proteína en nuestra solución de ADN. Pero si es muy bueno si queremos
saber si una solución de proteína está contaminada por ADN, es más sensible a este. Aunque es poco útil para
detectar la contaminación de proteínas en soluciones de ADN es una medida muy popular para determinar la
pureza de las soluciones de ADN porque es sensible a otros contaminantes, ej fenol
·El otro ratio que se utiliza ,A260nm/A230nm (2 - 2,2), varía si tenemos otros contaminantes, en general estas
mediciones directas se están quedando obsoletas y en los laboratorios, al menos en los de ingeniería genética,
se utilizan menos. Lo que se utiliza son los espectros de absorbancia, en vez de medidas discretas obtenemos
un barrido de absorbancia a las diferentes longitudes de onda.
* el nanodrop es lo que usamos para obtener la concentración de ácidos nucleicos en nuestra solución y los
valores de los parámetros descritos

2. Fluorescencia
·La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia que caracteriza a las sustancias que son capaces de
absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de
radiación pero de longitud de onda diferente (fluoróforos). Todos los fluoróforos son cromóforos pero no al
revés.
·Los ácidos nucléicos tenían cromóforos (absorben radiación) pero no fluoróforos (no la emiten), entonces estos
no presentan fluorescencia, pero pueden interaccionar con moléculas fluoróforas ofreciéndoles un entorno
físico y químico diferente que modifica notablemente sus características de emisión. Los ácidos nucleicos van a
modificar las propiedades de las sustancias fluoróforas con las que interaccionen, por lo que los identificaremos
de forma indirecta.
·Estas sustancias fluoróforas con las que interaccionan se llaman agentes intercalantes del ADN, el más utilizado
es el catión de etidio (normalmente en sal: bromuro de etidio, que cuando se disuelve da la sustancia activa).
Esta es una sustancia poco fluorescente que cuando se intercala entre la hélice de los ácidos nucléicos, entre las
bases complementarias y las contiguas, (especialmente dsDNA pero también ssRNA o ssDNA) se transforma en
una sustancia altamente fluorescente, cuando lo excitamos a 260 nm (UV) emitirá a una mayor longitud de
onda, en la parte naranja del espectro.
·La fluorescencia del BrEt y otros agentes intercalantes se utiliza universalmente como método de tinción y
revelado de bandas tras la electroforesis

Alternativas al BrEt para teñir los ácidos nucleicos

·Aunque es el fluoróforo más usado para teñir los ácidos nucleicos porque es bastante potente y económico,
también presenta algunas desventajas, y es que es tóxico, necesita equipo de UV que también es tóxico,
equipamiento de seguridad y tratamiento de residuos.
·Por eso también existen alternativas al BrEt menos tóxicas, aunque toda molécula capaz de unirse al ADN muy
afínmente es un carcinógeno potencial.
·SYBR Green tiene las mismas propiedades que el BrEt pero no necesita lámpara de UV, ya que absorbe luz
azul visible y emite verte. No se usa tanto, por su alto corte, para teñir ADN pero se utiliza más en la
PCR-cuantitativa, que usa un detector acoplado de especies fluorescentes.
3. Electroforesis
·La electroforesis es el movimiento de las partículas dispersas en relación a un fluido bajo la influencia de un
campo eléctrico uniforme espacialmente. Lo que vamos a hacer es tener una solución de moléculas cargadas
sometidas a un campo eléctrico que se van a separar en función a su tamaño, carga… Se suele acoplar a la
fluorescencia.
·Esta separación se hace en una matriz que ayuda a separar las moléculas, una especie de matriz celular. Como
soporte podemos usar geles de agarosa o de poliacrilamida

3.1 Agarosa como soporte de electroforesis

·La agarosa sustancia natural extraída del agar, un polisacárido formado por repeticiones del disacárido
agarobiosa. Es soluble en agua a temperaturas > 65ºC, y forma una matriz inerte y no tóxica, con muchos usos
en biología molecular. Es con diferencia el soporte más usado para la electroforesis de ADN.

Sistemas de electroforesis
- Las cubetas de electroforesis (tanque) son el soporte en el que se lleva a cabo la electroforesis. Son
planas y contienen la bandeja donde se coloca el gel y el peine.
- Fuente de alimentación: corriente continua.
- Dos electrodos: cátodo - y ánodo +, las moléculas de ADN (cargadas -) se desplazan hacia el ánodo.
- Tampón de electroforesis: un líquido con cargas para que puedan fluir las moléculas.
- Soporte electroforético (gel): se prepara previamente en unos moldes.
*poner ánodo (+) siempre en el lado opuesto a los pocillos.

Factores que afectan a la electroforesis

- El tampón: es el encargado de mantener el pH, contribuye a la estabilidad de las cargas que son muy
importantes en el proceso, necesitamos que sean constantes. Este aporta la conductividad, si hay una baja
concentración de sales (poca fuerza iónica) la movilidad será baja, y si la concentración de sales es alta (fuerza
iónica) se produce una subida de temperatura. Ej: TAE (el más usado) o TBE.
- La matriz o soporte reticulado: en este caso es la agarosa, que es la más usada con ADN pero no sirve
para otras moléculas como las proteínas. Según la concentración de agarosa nuestra matriz será más o menos
tupida dependiendo del tamaño de las moléculas que vayamos a analizar. A más concentración, menores son
los poros.
- El campo eléctrico: voltaje de corriente continua, con un máximo de 10 V/cm de separación entre polos,
se suele poner un voltaje en función del tamaño de la cubeta. A voltajes altos, mejor separación de bandas
pequeñas, y a voltajes bajos, mejor separación de bandas grandes (lo malo es el tiempo, se alarga mucho la
separación), por lo que esto dependerá de la muestra que queramos separar.
- Temperatura: normalmente es mala en la electroforesis, a altas temperaturas puede deshacerse el gel y,
aunque no se llegue a disolver, aumenta el tamaño de los poros en función del tiempo. Esta aumenta debido al
paso de la corriente y modifica las cualidades del tampón, el soporte y de las propias moléculas separadas, por
lo que se distorsiona la carrera, y para evitar esto se acoplan sistemas de refrigeración e incluso se mete el
equipo en una habitación fría.
- Estructura y naturaleza de las sustancias a separar: en principio la carga no va a influir, ya que el tampón
controla el pH, y la secuencia de nucleótidos tampoco afecta. Por lo tanto, separamos moléculas en función de
su tamaño, lo que sí afecta es la topología de las moléculas (ADN lineal o circular, bicatenario).
Los fragmentos de ADN bicatenario y lineal no se separan de forma lineal, lo hacen con una velocidad
inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño (entre ciertos límites), lo que hacemos es añadir un
marcador de peso molecular para comparar nuestras bandas con el. La distancia también depende de la
densidad de la matriz (% agarosa).
Las bandas muy pequeñas se separan muy bien (ej separar banda de 50 y 100), pero las bandas muy grandes
no, si queremos diferenciar entre dos bandas muy grandes que se diferencian en pocos pb no vamos a poder
diferenciarlas, se solapan. Por electroforesis vamos a separar bandas de 50 - 1000 pb.
La topología del ácido nucleico afecta dramáticamente al desplazamiento de las moléculas de ADN, sólo el
ADN de doble cadena lineal corre en la electroforesis según su tamaño. La topología es especialmente
importante en el caso de los plásmidos, debido a los diferentes grados de superenrollamiento, puede adquirir
estructuras topológicas más complejas. Para evitar esto lo hacemos lineal usando enzimas de restricción.

Electroforesis desnaturalizante
·Permite linealizar moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos (ssDNA, RNA) para que la topología de estas
no impida poder separarlas, por sus interacciones moleculares. Requiere de agentes desnaturalizantes que
linearizan las moléculas (ej formaldehído) y/o tampones especiales (ej MOPS).
·Se puede evaluar la integridad del ARN mediante un gel de agarosa desnaturalizante. Las ARNasas son muy
activas y difíciles de inactivar, entonces la contaminación con ARNasas será igual a la degradación. Analizamos
la integridad total del ARN mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de agarosa teñidos con bromuro
de etidio. Esto es que no lo entiendo muy bien la vd decirle a alguien que me lo explique.
·Cuando metemos una muestra de ARN, en realidad es una mezcla de diferentes tipos de ARN. El ribosómico es
el más abundante, va a estar sobrerrepresentado, aunque creamos que es ARNm, de este hay muy poco.

3.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida

·La poliacrilamida es un polímero formado a partir de acrilamida y N,N’-metilenbisacrilamida (tóxico cuando
está en polvo pero no en gen. La polimerización es química, no por temperatura como en la agarosa.Es menos
usada porque es tóxica si se inhala cuando está en polvo.
·Se usan menos que los anteriores para analizar ácidos nucleicos, son especialmente buenos para proteínas.
Aunque tienen un mayor poder de separación que los de agarosa y pueden aplicarse para la resolución de
tamaños pequeños. Pueden llegar a discriminar moléculas de hasta un nucleótido de diferencia: geles
desnaturalizantes de secuenciación.