0s métodos de laboratorio dircetos, como la mi:
croscopia, proporcionan informacion preliminar
acerca de las bacterias involucradas en infeccién,
si bien por lo comin se requiere crecimiento bacte-
fiano para la identificacién y caracteriz: n defini-
tivas, Este capitulo se centra en los principios y préc-
ticas del cultivo bacteriano, que tienen tres propisi-
tos principales:
a Facilitar el crecimiento y aislamiento de todas las
bacterias presentes en una infeccion
» Determinar cules de las bacterias que se desarro-
Nan es mas probable que sean la causa de la infee-
cidn y cuales son contaminates probables o coloni-
zadore
‘@ Obtener desarrollo suficiente de las bacterias rele-
vvantes en clinica para permitir su identificacién y
ccaracterizacion
PRINCIPIOS DE CULTIVO BACTERIANO:
El cultivo es el proceso de crecimiento de microor
ganismos mediante la toma de bacterias de un sitio
de infeccién {el ambiente in vivo) por métodos de re-
coleccion de muestra y crecimiento en un medio a1
biente artificial en el laboratorio (el ambiente in
tro). Una vez que los cultivos se desarrollan, Ia ma-
yoria de las poblaciones bacterianas pueden ser vi-
sualizadas sin microscopia y estan presentes en can-
tidades suficientes para permitir la realizaciém de
pruebas de laboratorio.
La transicién exitosa desde el ambiente in vivo al
ambiente in vitro requiere que se cumplan los reque-
rimientos nutricionales y ambientales de los patoge-
‘nos bacterianos. La transicién in vivo a in vitro no
siempre es facil para las bacterias. In vivo utiizan di-
versas vias metabélicas y fisioldgicas complejas desa-
rrolladas para la supervivencia sobre el huésped hu-
mano o dentro de él. Luego, en forma relativamente
subita, son expuestas al ambiente in vitro artificial
del laboratorio. Las bacterias deben adaptarse a la
‘supervivencia y multiplicacién in vitro. Fs importan-
“te destacar que la supervivencia depende de la dispo-
nibilidad de nutrientes esenciales y condiciones am-
bientales adecuadas.
Si bien es posible lograr condiciones de crecimien-
to para la mayoria de las bacterias patégenas, aun no
‘conocen Jo suficiente las necesidades de ciertas
iterias relevantes en clinica como para desatrollar
condiciones de crecimiento in vitro. Los ejemplos in-
cluyen Treponema pallidum (agente etioldgico de la
sifilis) y Mycobacterium leprae (agente etiolbgico de
la lepra).
REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
‘Como se mencioné en el capitulo 7, las bacterias
tienen numerosas necesidades nutricionales que in-
cluyen diferentes gases, agua, diversos iones, nitroge-
no, fuentes de carbono y energia. Estos dos tltimos
requerimientos son aportados en su mayoria por los
hidratos de carbono (p. ej. azticares y sus derivados}
y proteinas.
Conceptos generales de los medios
de cultivo
En el laboratorio los nutrientes se incorporan den-
tro de los medios de cultivo en el que desarrollan las
bacterias. Si un medio de cultivo cubre los requeri~
mientos de una célula bacteriana, ésta se multiplica-
ri en cantidades suficientes para permitir la visuali-
zacién a simple vista. De hecho, e! desarrollo bacte-
riano después de la siembra también requiere que los
medios sean dispuestos en condiciones ambientales
6ptimas.
Ya que algunas bacterias patogenas tienen necesi-
dades nutricionales diferentes, se desarrollaron di-
versos tipos de medios de cultivo para su uso en el
diagnéstico microbiolégico. En el caso de ciertas
bacterias las necesidades son relativamente comple:
jas y para su desarrollo deben utilizarse componentes
excepcionales en los medios. Las bacterias con este
tipo de requerimientos se denominan bacterias exi~
entes (con requerimientos especiales de cultivo [fas-
fidious}). A su vez, las necesidades nutricionales de la
mayoria de las bacterias importantes en clinica son
relativamente bisicas y sencillas, Estas basterias son
consideradas no exigentes (sin requerimientos espe-
Gales de cultivo [nonfastidious)).
Fases de los medios de crecimiento
Los medios de crecimiento son utilizados en dos
fases: liquida (caldo) 0 solida (agar). En algunos
S09 [p. c}., ciertos métodos de hemocultivos) se atiti-
2a un miedo bitasico que contiene una tase liquid y
otra solida,
En los medios liquidos los nutrientes se disuelven en:
agua y ef crecimiento bacteriano se manifesta conan Fig. 10-1
A. Caldo claro que indica ausencia de desarrollo bacteriano (izquierda] y caldo turbio que indica crecimiento bac-
teriano (derecha). B. Colonias bacterianas individuales que sa desarrollan en la superficie del agar luego de la incubacion.
cambio en el aspecto del caldo, de limpido a turbio. La
turbidez del caldo se debe a la deflexién de la luz por
las bacterias presentes en los cultivos (fig. 10-1).
Cuanto mayor es el crecimiento bacteriano, mayor es
la turbidez. Se requieren por lo menos 10* bacterias
para que la turbidez se observe a simple vista.
Los medios sdlidos se elaboran agregando un
agente solidificante a los nutrientes y al agua, La aga~
rosa, el agente solidificante més comin, tiene la pro-
piedad singular de fundirse a temperaturas elevadas
(295°C) pero sélo se vuelve a solidificar después que
su temperatura disminuye por debajo de 50°C. El
agregado de agar permite la preparacién de un me-
dio s6lido por calentamiento a una temperatura muy
clevada, que es la requerida para la esterilizaci6n, y
el enfriamiento entre 55°C y 60°C para la distribu-
ci6n en placas de Petri. Con el enfriamiento posterior
el medio que contiene agarosa forma un gel sélido
estable denominado agar. El agar contenido en la
placa de Petri se denomina agar placa. Los diferentes
- 10-2. Desarrollo de Legionella pneumophila en el me-
dio de enriquecimiento agar amortiguado con carbén-ex-
tracto de levadura (BCYE), uilizado en forma especifica pa-
ra el desarrollo de este género bacteriano.
medios con agar por lo comin se identifican de
acuerdo con los principales componentes nutritivos
del medio (p. ej. agar sangre de carnero, agar bilis
esculina, agar xilosa-lisina-desoxicolato).
En las condiciones de incubacién adecuadas, cada
célula bacteriana inoculada sobre la superficie del
medio sélido proliferara lo suficiente para ser obser
vable a simple vista (véase fig. 10-1). Se considera
que la poblacién bacteriana resultante deriva de una
sola célula bacteriana y se conoce como colonia. En
otras palabras, todas fas células bacterianas dentro
de una colonia son del mismo género y especie, lo
que otorga caracteristicas genéticas y fenotipicas
idénticas (es decir, son un solo clon). Los cultivos
bacterianos derivados de una sola colonia o clon se
consideran “puros”. Estos cultivos puros son necesa-
ros para los procedimientos ulteriores que se utilizan
para identificar y caracterizar las bacterias. La capa-
idad de seleccionar colonias puras (individuales) es
uno de los primeros y mas importantes pasos necesa-
rios para la identificacién y caracterizacién bacteria-
na (para mds informacién con respecto a las estrate-
Bias de identificacién bacteriana véase cap. 11)
Clasificaciones y funciones de los medios
Los medios se clasifican de acuerdo con su funcién
yuso. En el diagnostico bacteriolégico hay cuatro
tegorias generales de medios: enriquecimiento, apo-
yo, selectivo y diferencial °
Los medios de enriquecimiento conticnen nutrien-
tes especificos requeridos para el desarrollo de deter-
minados patégenos bacterianos que pueden estar pre-
sentes solos o con otras especies bacterianas en ana
muestra del paciente. Este tipo de medios se utliza
para favorecer el desarrollo de un determinado pato-
Beno bacteriano, a partir una mezcla de mictoorg2-
pee ee el uso de especificidad de nutriente. Un
ejemplo de estos medios es el agar amortiguado con
carpon y extracto de levadura que proporciona L-cis
feinay otros nutrientes necesarios para el crecimiento
I Legionella pneumophila, el agence etiologico de la
enfermedad de los legionarios le 10a. capiruto 10
CULTIVO Y AISLAKtIE F
A
Fig, 10-3. A. Desarrollo mixto intenso de bacilos gramnegativos E. coli (
de Enterococcus (flecha B) en el medio no selectivo agar con sangre de carnero (sheep blood ager - SBA)
‘medio agar con alcohol feniletilico (phenylethyl-aleahol agar; PEA) solo permite el desarrollo de los enterococos (fle-
chal.
Los medios de apoyo contienen nutrientes que fa-
vorecen el desarrollo de la mayoria de los microorgs
rnismos sin requerimientos especiales y sin brindar
ventaja alguna en el crecimiento de un microorganis-
mo en particular. Los medios selectivos contienen
uno 0 mas agentes que inhiben todos los microorga-
nismos excepto los que son buscados. En otras pala-
bras, estos medios seleccionan el crecimiento de cier-
tas bacterias ¢ inhiben el de otras. Los agentes inhi-
bidores utilizados para este propésito son colorantes,
sales biliares, alcoholes, acidos y antibidticos. Un
ejemplo de un medio selectivo es el agar con alcohol
feniletilico, que inhibe el desarrollo de bacilos gram-
negativos aerobios y anaerobios facultativos, y perm
te el crecimiento de cocos grampositivos (fig. 10-3).
Los medios diferenciales emplean un factor (0 fac~
) que permite que las colonias de una especie ©
bacteriano exhiban ciertas caracteristicas meta~
tor
tipo
. 10-4, Caractoristicas diferenciales del agar MacConkey
con los bacilos gramnegativos capaces de fermentar a lac-
tos, que aparecen de color purpura oscura (flecha A), mien-
tras que los que no fermentan la lactosa aparecen de color
08a pélido o relativamente incoloros (flecha B).
B
flecha A) y de cocos grampositivos de las especies
). B. El medio selec-
bolicas 0 de cultivos que pueden utilizarse para dife-
renciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo
agar placa. Un medio diferencial utilizado con fre-
‘cuencia es el agar MacConkey, que diferencia entre
Jas bacterias gramnegativas que pueden fermentar el
aziicar lactosa y las que no lo hacen (fig. 10-4).
Es importante destacar que muchos medios utiliza-
dos en el diagndstico bacteriol6gico cumplen més de
una funcidn, Por ejemplo, el agar MacConkey es tan-
to diferencial como selectivo, debido a que inhibe el
desarrollo de la mayoria de las bacterias grampositi
vvas, Otro ejemplo es el agar sangre de carnero. Este es
el medio de apoyo mas comiin utilizado en el diagnés-
tico bacteriolégico, debido a que permite el desarro-
Ilo de muchos microorganismos. Sin embargo, en mu-
chos casos este agar es también diferencial, porque la
apariencia de las colonias producidas por ciertas es-
pecies bacterianas es muy diferente (fig. 10-
Fig. 10-5. Diferentes morfologias de colonias en agar san-
gre de carnero, entre las que se incluyen estreptococos alfa-
hemoliticos (fecha A), bacilos gramnegativos (fecha 8), es-
treptococos betahemoliticos (flecha Q) y Staphylococcus au-
reus (flecha D). 140 panrew
les
Resumen de los medios artific
para la bacteriologia de rutina
Los diversos medios liquidos y sélidos que tienen
funciones de enriquecimiento, sclectivo, diferencial o
ambos, y que se utilizan con frecuencia para la hac
teriologia de rutina figuran en orden alfabético en el
cuadro 10-1. La bacteriologia para anacrobios (caps.
46 y 47), la micobacteriologia (eap. 48) y la mic
gia (cap. 53) utilizan estrategias de me
Ios detalles con respecto a estos medios figuran en los
capitulos correspondientes.
Existen muchos medios disponibles, en esta sec-
cidn se resumen séto los utilizados con mas frecuen-
cia en el diagndstico bacteriolégico. En la parte VIL
se analizan los medios que deben utilizarse para los
cultivos de bacterias provenientes de diversas mues-
tras clinicas, De manera similar, el capitulo 11 y
otros capitulos de la parte Ill se refieren a los medios
empleados para identificar y caracterizar microonga
nismos especificos.
INFUSION DE CEREBRO Y CORAZON (brain-heart in-
fasion; BHD). con alto contenido nutri-
cional utilizado para el desarrollo de diversos mi=
croorganismos, ya sea en forma de caldo o de agar,
con el agregado de sangre o sin él, Los ingredientes
principales incluyen Ia infusion a partir de diversas
fuentes de tejido animal, el agregado de peptona
{(proteina), buffer fosfato y una pequeiia concentra-
ci6n de dextrosa. El hidrato de carbono proporciona
una fuente de energia de facil acceso para muchas
bacterias. El caldo BHI a menudo se utiliza como
componente principal de los medios desarrollados
para el cultivo de bacterias a partir de la sangre del
paciente (véase cap. 55), establecer Ia identificacion
bacteriana y para ciertas pruebas empleadas para de-
terminar la sensibilidad bacteriana a los agentes an-
timicrobianos (véase cap. 16).
Acar cHocotare. El agar chocolate en esencia es
10 que el agar sangre excepto que durante la
in los globulos rojos son lisados cuando se
nutrien-
tes intracelulares como hemoglobina, hemina (factor
“X") y la coenzima nicotinamida adenina dinucled-
tido (NAD 0 factor “V") dentro del agar, para ser
utilizadas por las bacterias exigemtes, La lisis de los
glébulos rojos otorga al medio un color castaio-cho-
colate que da su nombre a este agar. Los patogenos
bacterianos mas comunes que para su desarrollo
quieren este medio enriquecido son Neissern yonurr-
hoeae, ol agente etioligico de la gonorrea, y especies
de Haemophilus, que causan infecciones del tracts
respiratorio y del ofdey medio. Ninguna de estas espe
cies se desarrolla en agar sangre de carnere,
COLUMBIA CNA con sant. FI Solum:
bia es un medio con una formula rica desde ef punto
de vista nutricional, que contiene tres fuentes de pep.
tona y sangre de carnero desfibrinada al $%. Fete
medio de apoyo también se puede utilizar para dite
BASES CIENTIFICAS Y DE LABORATORIO DE LA MICHOBIOLOGIA CLinic a
renciar colonias bacterianas de acuerdy con Las reac
ciones hemoliticas que producen. Chit we seliere a
os amibidticos colistina (C) y sicide nalidixico (NA),
que se agregan al medio para inhibi cl execimiente
de la mayoria de los microorganismos ssramnegatives
mientras permiten el desarrollo de bacterias grampo
sitivas, por lo tanto confieren propiedades selectivas
a este medio,
CALDO PARA GRAMNEGATIVOS (GN), Un caldo se-
lectivo, el caldo para geamnegativos (GN), es utiliz
do para Jos cultivos de patégenos gastrointestinales
(especies de Salmonella y especies de Shigella) a par
tir de muestras de materia fecal e hisopado rectal. FE
caklo comiene diversos ingredientes activos, como
citrato de sodio y desoxicolato de sodio (una sal bi-
liar) que inhibe los microorganismos grampositivos y
la multiplicacin temprana de los patégenos no ent
Ficos gramnegativos. Para optimizar su naturaleza
selectiva, el caldo GN debe ser subcultivado a las 6 a
8 horas después de la siembra ¢ incubacién inicial.
Luego los patégenos no entéricos comienzan a supe-
rar-el desarrollo de los patégenos,
AGAR Hrkroen enrénico (HE). El agar Hektoen
centérico (HE) contiene sales biliares y colorantes (azul
de bromotimol y fuesina dcida), para retrasar de ma-
nera selectiva el crecimiento de la mayoria de los ba-
cilos gramnegatives no patégenos encontrados en el
tracto gastrointestinal y permitir el desarrollo de espe-
cies de Salmonella y especies de Shigella. £1 medio
también es diferencial, debido a que muchos de los
Patogenos no entéricos que se desarrollan aparccen
‘como colonias de color anaranjado a salmén. Este as-
ecto de las colonias es el resultado de la capacidad
del microorganismo de fermentar la lactosa en el me-
dio, lo que produce la formacién de acido. Este dis-
minuye el pH del medio y causa un cambio en el azul
de bromotimol indicador de pH. Las especies de Sul-
monella y las especies de Shigella no fermentan |.
tosa, de modo que el cambio de color no se produce
¥ sus colonias mantienen el color original acul-verde
del medio. Otra caracteristica diferencial del medio es
que contiene citrato férrico de amonio, un indicador
para la detecciin de HLS, de modo que los microor.
Banismos que producen HS, como las especies de Sal,
monella, pueden visualizarse como colonias que tor:
man un precipitado negro (tig. 10-6),
AGAR MAcConkey, EL agar Mac
primario, selective yd
frecuencia, Este medi
cristal para inl
gramposi
ef desat
key es el agar
encial utilizado con mayor
contiene el ¢
bie el creeimi
sy de los hongos, %
allo de mauch sameg
mchos typos de bacilos gramney.
Wor de pH, rojo n fawn
edad diterencial. La ter
ictosa produce La formac
qque dhsminaye el ptt del med
doe ro neutte le contiera a las
un color rosa a rojo, Lay by
de acido
y have que el mdica™
coloniay bacterianas
"as no fermentadoras de la lactosa, como las especies de Shigella, permane-
cen incoloras y transhicidas (véase fig. 10-4).
AGAR ALCOHOL FENILETILICO (PHENYLETHIYI, ALCO-
Hot; PEA). El agar PEA es basicamente un agar con
sangre de carnero suplementado con alcoho
lico para inhibir el desarrollo de las bacterias gram
negativas. La sangre de carnero al $% en el PEA pro-
importancia clinica, excepto las mas exigentes. Ade-
mas, las morfologias de las colonias que se encuen-
tran con mas frecuencia en este medio son familiares
para la mayoria de los microbidlogos clinicos. EI me-
dio consiste en una base que contiene una fuente de
protcinas (p. cj. triptonas), digerido proteico de soja
(que contiene una pequeiia cantidad natural de bi-
rato de carbone natural), clorure de sodio, agar y
sangre de carnero al 5%.
Gertas bacterias producen enzimas extracelulares
‘que lisan los globules rojos en el agar (hemélisis). Es-
ta actividad puede producir una climinacién comple-
ta de los glébulos rojos alrededor de a colonia bac~
teriana (hemélisis beta) o solo una lisis parcial de las
células para provocar un cambio de color al verdoso
alredcdor de la colonia (heméliss alfa). Otras bacte~
rias no tienen efecto sobre los glabulos rojos y no se
produce halo alrededor de la colonia (hemlisis gam-
ma o ausencia de hemélisis). Los microbidlogos a
menudo utilizan la morfologéa de la colonia y el gra-
doo ausencia de hemdlisis como critetios para deter-
minar los pasos necesarios adicionales para la identi-
ficacién de un aislamiento bacteriano. Para leer con
precision Ia reaccién hemolitica sobre una placa de
Agar sangre el técnico debe sostener la placa hacia la
luz y observarla con luz que provenga de atris (es de-
«ir, luz teansmitida).
porciona nutrientes para los cocos geampositivos ¢o-
munes, como enterococ:
cocos (vase fig. 10-3)
s, estreptococos y estalilo-
AGAR CON SANGRE DE CARNERO, La mayor parte de
las muestras para baeteriologia se inocnan en placas
lc agar con sangre dle carnero, debido a que este me-
dio favorece el des las Bacterias de
rrollo de todas las bacterias de
AGAR THAYER-MARTIN. El agar Thayer-Martin es
tun medio de enriquecimiento y selectivo para el ais-
lamiento de Neisseria gonorrhoeae, el agente etiol6-
gico de la gonorrea y Neisseria meningitidis, una
causa de meningitis potencialmente fatal El medio es
enriquecido por los componentes basales y la sangre
lisada, mientras que cl agregado de antibidticos con-
fiere la propiedad selectiva. Los antibidticos incluyen.
colistina para inhibi ocras bacterias gramnezativas,
vancomicina para inhibir bacterias gramposiivas ¥
nistatina para inhibir la levaduras. También se agre-
ga el antimicrobiano trimeroprima para inhibie las
especies de Protens, que tienen una tendencia 2 inva
toda la superficie del agar y enmascarar la detec
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