Sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS)

Los organismos aerobios pueden captar una proporción mucho mayor de la

energía libre disponible de los sustratos respiratorios que los organismos anaerobios.
La mayor parte de este proceso tiene lugar dentro de las mitocondrias, que se han
denominado las “centrales de energía” de la célula. La respiración está acoplada
a la generación del intermediario de alta energía, ATP, por medio de fosforilación
oxidativa. Diversos fármacos como el amobarbital y algunos venenos como el
cianuro y el monóxido de carbono, inhiben la fosforilación oxidativa, por lo general
con consecuencias mortales. Se han señalado varios defectos hereditarios de las
mitocondrias, que afectan componentes de la cadena respiratoria y la fosforilación
oxidativa. Los pacientes muestran miopatía y encefalopatía, y suelen tener acidosis
láctica.

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Conceptos
Cadena respiratoria o Cadena de transporte de electrones
Casi toda la energía que se libera durante la oxidación de carbohidratos, ácidos
grasos y aminoácidos queda disponible dentro de las mitocondrias como
equivalentes reductores (H o electrones). Las enzimas del ciclo del ácido cítrico y
la β­oxidación, los complejos de la cadena respiratoria, y la maquinaria para la
fosforilación oxidativa, se encuentran en las mitocondrias. La cadena respiratoria
reúne y transporta equivalentes reductores, y los dirige hacia su reacción final con
oxígeno para formar agua; la fosforilación oxidativa es el proceso mediante el cual
la energía libre liberada se atrapa como fosfato de alta energía.

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Fosforilación oxidativa
La fosforilación oxidativa se define como la formación de ATP generada por la
transferencia de electrones. Todas las rutas catabólicas, en los organismos aerobios,
convergen para permitir el flujo de electrones hasta el oxígeno, produciendo
energía para la generación de ATP constituíyendo la etapa final del catabolismo
de todas las biomoléculas.

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La mitocondria
La estructura de la mitocondria es crucial para su funcionamiento. La mitocondria
se compone de dos membranas: la externa y la interna

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La membrana externa que separa a la mitocondria del citoplasma, es una bicapa
lipídica con canales de porina, que hacen que esta membrana sea más
permeable permitiendo el paso de moléculas menores de 10 kDa (kilodalton) y el
paso de moléculas hidrofílicas a través de ella. Debido a la poca selectividad de la
membrana externa, el espacio intermembrana es químicamente similar al
citoplasma. Recientemente se han demostrado, en la membrana externa, zonas
de interacción con el retículo endoplasmático, conocidas con el nombre de
“membranas asociadas a mitocondria”.
La membrana interna, que define el espacio intermembrana y la matriz
mitocondrial, es mucho más impermeable debido a su alto contenido en
cardiolipina. Esta impermeabilidad, necesaria para la generación del gradiente de
protones, impide el paso de iones, por lo que la entrada de proteínas, sustratos e
iones a la mitocondria depende de la presencia de proteínas de transporte
específicas, que aprovechan el gradiente de protones y el ATP para llevar a cabo
su función.
En la membrana interna es donde se encuentra la Cadena de Transporte de
Electrones (CTE), que junto a la ATP sintasa se la conoce como el Sistema de
Fosforilación Oxidativa, o sistema OXPHOS, y presenta un gran número de
invaginaciones, para aumentar la superficie y permitir la inclusión de un mayor
número de proteínas.
Recientemente se ha demostrado que estas invaginaciones, denominadas crestas,
poseen una composición diferente con respecto a la membrana interna. En las
crestas es donde realmente se sitúan los complejos del sistema OXPHOS, mientras
que en el resto de la membrana interna es donde se localiza la maquinaria de
importe. La diferente distribución proteica pone de manifiesto, que las crestas y la
membrana interna mitocondrial son distintos subcompartimentos funcionales.
Además, se ha visto que las crestas están conectadas con la membrana interna
por uniones de un diámetro de entre 12 y 40 nm. Estas uniones reducen la
continuidad entre el espacio intercrestal y entre la membrana mitocondrial interna
y la membrana externa, limitando la movilidad del citocromo c y de los protones
necesarios para la síntesis de ATP.

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Cadena Respiratoria
La cadena respiratoria está formada por estructuras que transportan electrones,
localizadas en la membrana mitocondrial interna.
La cadena respiratoria de la mitocondria de mamíferos, es la más compleja
estructuralmente y es un sistema de más de veinte transportadores electrónicos, a
través de los cuales viajan los electrones desde donantes como el NADH o el FADH2,
hasta ser cedidos al oxígeno.
La oxidación del acetilCoA, proveniente de la oxidación del piruvato generado en
la glucólisis, del metabolismo de aminoácidos y de la β-oxidación de los ácidos
grasos, en el ciclo de Krebs genera los equivalentes de reducción NADH y FADH2
que son el sustrato de la cadena de transporte de electrones y serán utilizados
como dadores de electrones, para la obtención de energía, en el proceso
conocido como fosforilación oxidativa, que es muy rentable energéticamente
para la célula, ya que la oxidación completa de una molécula de glucosa conlleva
la producción de 32-34 moléculas de ATP frente a las 2 moléculas de ATP
producidas por la glucólisis anaerobia.
Los electrones procedentes del NADH son transportados secuencialmente
mediante una serie de reacciones redox a través del complejo I, la ubiquinona, el
complejo III, el citocromo c, para llegar finalmente al complejo IV, dónde se los
cederá al oxígeno molecular generando H2O.

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De forma alternativa, los electrones del FADH2, producto final de la succinato
deshidrogenasa o complejo II, y de otras enzimas como la glicerol-3-P
deshidrogenasa, la ETF-ubiquinona oxidorreductasa o la dihidroorotato
deshidrogenasa, pasan a la ubiquinona y son canalizados mediante el complejo III,
citocromo c y complejo IV para que lleguen hasta la reducción del oxígeno
molecular.
Acoplado al transporte de electrones, los complejos I, III y IV de la cadena
bombean protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana,
generando un potencial de membrana que es aprovechado por la ATP sintasa o
complejo V para impulsar la síntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgánico,
cuando los protones reingresan a la matriz mitocondrial a través del complejo V,
completando así, el proceso de fosforilación oxidativa. El potencial de membrana
también es utilizado como fuente de energía para el importe de proteínas y otras
moléculas, además de producir calor para mantener la temperatura corporal, en
el caso de que los protones reingresen a la matriz mitocondrial a través de las
proteínas desacoplantes UCP (Termogénesis).

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Estructura de los complejos respiratorios
Los transportadores electrónicos de la cadena respiratoria están agrupados en
forma de cuatro complejos supramoleculares independientes, y de dos
componentes de bajo peso molecular, una hemoproteína (el citocromo c), y una
quinona (la ubiquinona), que actúan como transportadores de electrones entre
estos complejos.
Los cuatro complejos supramoleculares se designan con un número romano del I al
IV, y cada complejo representa un segmento definido de la cadena de transporte
electrónico.

Cambio
Los complejos I, III y IV, actúan cómo bombas de protones impulsadas por energía
redox, mientras que el II no transloca protones, y es el que contiene la actividad
succinato deshidrogenasa del ciclo de Krebs, convirtiéndose así en un punto de
intersección de ambas vías metabólicas. Cuatro de los complejos, junto con la
ubiquinona y el citocromo c, forman la cadena respiratoria mitocondrial, mientras
que un quinto complejo corresponde a la ATP sintasa.

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Las cadenas de transporte electrónico contienen una cantidad similar de hierro no
hemo comparado con el hierro hemo. Este hierro no hemo aparece en la forma de
centros ferrosulfurados ligados a proteínas, los cuales pueden contener 1, 2 o 4
átomos de hierro por centro.
Los centros de 2 y 4 átomos de hierro también contienen cantidades
equimoleculares de azufre inorgánico lábil al ácido. Se designan como [2Fe-2S] y
[4Fe-4S], que indica el número de átomos de hierro y el azufre presentes en cada
centro. Cada hierro en el grupo [2Fe-2S] tiene una geometría de coordinación
aproximadamente tetraédrica, y está rodeado de cuatro ligandos de azufre, dos
provenientes de azufre inorgánico y dos de cisteínas. Los grupos [4Fe-4S] son
aproximadamente cúbicos, con cada hierro rodeado por cuatro ligandos de
azufre, que en este caso provienen tres de azufre inorgánico y uno de la cisteína.
En la cadena respiratoria existen numerosos centros ferrosulfurados en proteínas
intrínsecas de membrana, que presentan una considerable variedad de
potenciales redox.

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En cuanto a los citocromos, también presentan una considerable variedad de
potenciales redox y se clasifican según sus características espectroscópicas; la
protoporfirina férrica IX, es el precursor de otros grupos hemo, es decir, citocromos
tipo b, mioglobina, hemoglobina, catalasa y peroxidasa. Los cuatro nitrógenos
pirrólicos de las porfirinas sirven como ligandos del hierro en el mismo plano. El hemo
tiene, además, dos ligandos más en las posiciones axiales, perpendiculares al plano
del anillo tetrapirrólico. El grupo hemo puede estar unido a la proteína no
covalentemente (citocromos a y b), o covalentemente (citocromo c). La mayoría
de los citocromos son proteínas integrales de membrana, aunque los del tipo c son
de ambos tipos (integrales y periféricas).
Los citocromos tipo c solubles son proteínas periféricas de membrana, situadas
sobre la superficie externa de la membrana interna mitocondrial, con pesos
moleculares que oscilan entre 10.000 y 15.000 D. Su estructura contiene un hemo c
unido covalentemente mediante dos enlaces tioéter a una única cadena
polipeptídica.

Cambio
Cada uno de los complejos respiratorios contiene un número determinado de
transportadores redox, de manera que cada uno de ellos es una minicadena de
transporte electrónico. Realmente cada uno de los componentes de la cadena
respiratoria representa su ubicación dentro de cada complejo y los diferentes
donadores de electrones.

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Según el modelo de “estado fluido”, los complejos I al IV difunden libremente en la
membrana interna mitocondrial, de forma que la transferencia de electrones se
produce gracias a las colisiones que, aleatoriamente, ocurren entre los diferentes
complejos. El hecho de que los cinco complejos respiratorios puedan ser purificados
fisiológicamente activos y mediante experimentos de dilución lipídica a partir de
membranas mitocondriales aisladas, apoya este modelo.
El otro modelo propuesto, el denominado modelo de “estado sólido”, difiere
radicalmente del modelo anterior y propone una nueva organización de la
cadena de transporte electrónico en la que los complejos I, III y IV se encuentran
agregados en supercomplejos que contienen diferentes proporciones
estequiométricas de cada complejo individual. La existencia de este modelo de
“estado sólido”, propone que todos los complejos, excepto el complejo II se
asocian en una estructura supramolecular, llamada respirasoma, y se apoya en
muy diversas observaciones experimentales que no pueden ser explicadas por el
modelo de “estado fluido”; entre ellas podemos citar
1. La mutación de genes estructurales de un determinado complejo afecta a
la estabilidad de otros complejos respiratorios. Así, mientras que el complejo
III es indispensable para la estabilización del complejo I y la formación de
supercomplejos, el complejo IV no interviene en la estabilidad de los
complejos I y III, aunque sí en los niveles relativos de los mismos. Cuando el
complejo I no está presente, aunque no es posible la formación del
supercomplejo, los complejos restantes pueden ensamblarse y estabilizarse;
estudios cinéticos basados en el control de flujo indican la existencia de
unidades funcionales mayores que los complejos respiratorios individuales.
2. Análisis mediante electroforesis en geles nativos o mediante centrifugación
en gradiente de sacarosa, y estudios de microscopía electrónica
demuestran asociaciones de los diferentes complejos y la formación de
supercomplejos respiratorios.

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Reacciones del transporte elctrónicos
El complejo I o NADH reductasa: Las reacciones que tienen lugar en este nivel, son
una serie de reacciones redox, en las que intervienen una coenzima flavínico (FMN
o flavina mononucleótido), y un centro ferrosulfurado en el que el átomo de hierro
es el que realiza el intercambio electrónico para cederlos a la coenzima Q. El flujo
de dos electrones desde el NADH hasta la ubiquinona, da lugar al bombeo de
cuatro hidrogeniones a través de la membrana mitocondrial interna, desde la
matriz hacia su cara citoplasmática.

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El complejo II o succinato-reductasa: Se encuentra a nivel de la membrana, y uno
de sus componentes es una enzima del ciclo del ácido cítrico, la succinato
deshidrogenasa, que cataliza la reacción de succinato a fumarato. Uno de los
productos de la reacción, la coenzima reducida FADH2 no abandona el complejo,
transfiriendo los electrones en el interior del mismo a un centro Fe-S, para
posteriormente ser cedidos a la ubiquinona. Esta es la única enzima del ciclo del
ácido cítrico que no se encuentra libre en la solución de la matriz mitocondrial, sino
que está fuertemente unida a la membrana mitocondrial interna. Por otro lado,
algunas de las enzimas mitocondriales que utilizan FAD, no introducen sus
electrones a la cadena de transporte electrónico a través del complejo II, sino
mediante una flavoproteína transportadora de electrones, la ETFP- ubiquinona
reductasa, que reduce directamente la ubiquinona o coenzima Q. El potencial de
transferencia electrónica es menor en este complejo que en el anterior, y el
desprendimiento energético no es suficiente para el bombeo de hidrogeniones, lo
que se traducirá en un menor rendimiento de ATP, comparado con el obtenido
cuando los electrones penetran en la cadena utilizando el complejo I.

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El complejo III o citocromo-reductasa: Aquí se sitúa la segunda boba de
hidrogeniones, que se caracteriza principalmente por disponer de grupos
prostéticos hemo, similares a los de la hemoglobina, con un átomo de hierro que se
alterna entre su estado reducido o ferroso (Fe2+) y el estado oxidado o férrico
(Fe3+). A través de la siguiente secuencia de reacciones los electrones son
transferidos hasta el citocromo c, este flujo genera un potencial suficiente para
bombear 2 hidrogeniones hacia el lado citoplasmático. La diferencia de potencial
de transferencia es menor que en el complejo I y por lo tanto la capacidad de
mover los hidrogeniones también es menor.

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El complejo IV o citocromo-oxidasa: Este complejo acepta cuatro electrones del
citocromo c, uno cada vez, a través de dos grupos hemo que utilizan átomos de
cobre y los transfiere a una sola molécula de O2 formando dos moléculas de H2O.
Se estima que el 90 % del consumo total de oxígeno de las células es realizado por
la citocromo-oxidasa. El oxígeno molecular es un aceptor de electrones con un
fuerte carácter oxidante, una alta tendencia a captar electrones, pero reacciona
muy lentamente a menos que sea activado catalíticamente. Esta activación es
realizada por este complejo, el cual también funciona como una bomba de
protones, realizando un movimiento neto de 4 hidrogeniones hacia el espacio
intermembranoso.
Cambio
Síntesis de ATP
La ATP sintasa es un complejo enzimático de gran tamaño, observable a
microscopía electrónica. Está formada por dos subunidades F0, una porción
hidrofóbica que atraviesa la integridad de la membrana mitocondrial interna,
formada por cuatro cadenas polipeptídicas y que funcionalmente constituye el
conducto de protones. La otra subunidad F1 protruye en el lado interno de la
membrana, y está formada por cinco clases de cadenas polipeptídicas, α3, β3, γ,
δ y ε. Su papel funcional es catalizar la formación de un enlace de alta energía,
sintetizando ATP. El cuello intermedio que une ambas subunidades está formado a
su vez por varias proteínas reguladoras. La ATPasa es inhibida por diversos
compuestos; entre ellos, los más específicos son la oligomicina y la
diciclohexilcarbodiimida.

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se realiza lejos del sitio catalítico de síntesis de ATP, efectuando una secuencia
cíclica de protonaciones y desprotonaciones en las subunidades c de la fracción
Fo. Esto causaría que Fo experimentara una serie de cambios conformacionales
que a través de la subunidad g inducirían cambios coordinados en la afinidad por
los nucleótidos de los tres centros catalíticos de F1, lo cual sería la clave del
acoplamiento energético. El flujo de protones a través de Fo causa que el cilindro
de subunidades c y la subunidad g unida a ellas roten alrededor del eje g, que es
perpendicular al plano de la membrana. La subunidad g pasa a través del
esferoide a3 b3, el cual se mantiene estacionario con relación a la superficie de la
membrana por las subunidades b. Con cada giro de 120°, g entra en contacto con
una subunidad b diferente, forzándose de este modo el cambio del centro
catalítico a una de las tres conformaciones posibles. Las tres subunidades b
interaccionan de tal manera que cuando una asume la configuración b-vacío, la
que está a un lado tiene que asumir la configuración b-ADP y la otra la
configuración b-ATP. Así, una rotación completa de la subunidad g causa que
cada subunidad b se cicle a través de las tres configuraciones posibles y, para
cada rotación, se fabriquen y liberen de la enzima tres moléculas de ATP.
Como puede observarse, la clave de todo este proceso está en que el paso que
requiere energía no es la formación del ATP, sino su liberación del centro
catalítico.

La rotación es en una dirección cuando se sintetiza ATP, y en la contraria cuando

se hidroliza. A partir de una serie de cálculos energéticos se ha podido establecer
el rendimiento energético de esta enzima, que es casi del 100%. La ATPasa es, de
hecho, un magnífico ejemplo de lo que hoy en día se denominan motores
moleculares, es decir, moléculas que realizan una función con movimientos
mecánicos, de forma similar a como lo haría una máquina.
Cambio
El sistema mediante el cual funciona este complejo, ha permitido observar que el
ATP se forma rápidamente, aún en ausencia de gradiente a través de la misma,
pero la carencia de fuerza protomotriz no permite la separación del ATP formado,
que permanece unido a la sintasa. Sólo el flujo de protones, la estimación es de
forma aproximada de tres hidrogeniones, origina la liberación de un ATP. Cada par
de electrones proveniente del NADH, genera un flujo neto de protones a través del
complejo I, III y IV de 4, 2 y 4 protones respectivamente, lo que se traducirá en la
síntesis de 3 ATPs, la entrada de electrones a través del FADH2 genera un flujo de
protones a través del complejo III y IV de 2 y 4 respectivamente, que permitirá la
formación de 2 ATPs.