Тема лекции:

Имунологические реакции.
Реакции AG-AC в vitro
 Иммунологический (иммунобиологический)
метод

Кожно-
Серологические реакции ( in vitro ) аллергическ
ие пробы:

Выявление антигенов
Методы
микроорганизмов: выявление
Выявление оценки
специ- иммунного
антител в
фической статуса
в чистой сыворотке
в пат. м-ле гипер-
культуре больного
(экспресс- чувстви-
(серол. (сероди-
диагности- тельности
иденти- агностика)
ка) (аллергии)
фикация)
 ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

• Иммунологические методы используют, как для

выявления титра антител в сыворотке крови
(серодиагностика), так и для обнаружения антигенов в
биологических жидкостях.

Общие закономерности иммунологических методов (ИМ):

• Исследование производится in vitro;
• Проявляются при иммунологическом соответствии
(гомологичности) антигена и антитела;
• Протекают в 2 фазы (невидимая и видимая).
• Для количественной характеристики иммунологических
методов исследования используют такие понятия, как
чувствительность и специфичность.
• В идеале чувствительность и специфичность
иммунологических методов приближается к 100%.
 Реакции антиген-антитело в vitro

Реакция Aг-Aт опрелеляется специфическим взаимодействием

между эпитопами Аг и паратопами Ат.

В данном процессе проявляются

4 типа связей:
• водородные связи,
• электростатические связи,
• силы Van der Waals,
• гидрофобные связи.

Связь Aг-Aт обладает тремя

характеристиками:
• бывает экзотермической,
• специфической
• обратимой.
 Иммунологические реакции

• Обнаружение в сыворотке крови больного антител к

возбудителю инфекции или соответствующего антигена
позволяет установить причину заболевания.

• Свойство веществ к интесивному реагированию (Avidite)

одного Aт к другому специфичному Aг характеризует с
какой скоростью проявляется реакция Aг-Aт
(появление осадка, агглютинация и т.д.).
Данная реакция зависит от:
• постоянной асоциации,
• валентности Aт,
• количества эпитопов,
• температуры,
• pH,
• ионной силы среды.

Важно:
один паратоп может скомбинирваться только с одним эпитопом,
называемым “специфичный”.
Таким образом, если известен хотя бы один из элементов
реакции - Aг или Aт, может быть определён другой.
• Сродство одного Aт к другому специфичному Aг
характеризует интенсивность межсвязовых сил в
комплексе Aг-Aт. Она зависит от стерической
комплиментарности между паротопом и эпитопом.
 Реакции Aг-Aт (серологические реакции)
имеют два практических пути к применению:

I. Сероидентификация:
Определение и дозирование Aг (неизвестный элемент -
выделенные микробные штаммы из определенных проб)
посредством известных специфичных Aт.

Возможны два источника Aт: Aт моноклонные,

абсолютно однородные, которые распознают
всего лишь один эпитоп и Aт поликолнные,
которые содержатся в имуных сыворотках
(антисыворотки), которые предполагают связи с
высокой захватываемостью (авидностью) с Aг.
• Имуные сыворотки получяются после введения(инекции)
лабораторному животному определеного известного Аг.

• После определенного периода сыворотка полученая от

данного животного будет содержать антитела против данного Аг.

• Но точная природа полученного Aт из данной сыворотки не

известна в полном объеме (это поликлональные Aт).

• Специфичность данной антисыворотки должно постояно

проверяться при этом нежелательные Aт должны
абсорбироваться.
II. Серодиагностика:
Определение и титрование Aт из сыворотки болного
(неизвестный компонент) по отношению к определенному
специфичному Aг (определенного после установки
диагноза).

Некоторые реакции Aг-Aт проявляются напрямую и могут

быть замечены исследователем:
к примеру:
• выпадение осадка или агглютинация комплексов
Aг-Aт,
• дезинтеграция (лизис) некоторых несуших клеток Aг на их
мембране (гемолиз, бактериолиз, и т.д.).
• Другие реакции Aг-Aт не проявляются “спонтанно” in vitro.

• В данном случае прибегают к искуственным процедурам,

таким как применение “меченным” Aт:

• Флюорохромом - меченные Aт: имунофлюоросценция.

• Радиоактвно-изотопно-меченные Aт:
радио-имунный анализ.

• Ферментно- меченные Aт :

имунноферментный анализ.
 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН-
АНТИТЕЛО

I. Специфическая фаза:
имеет место взаимодействие между Aг и соответствующим
специфичным Aт. Это быстротекущий феномен, невидимый,
общий для всех реакций Aг-Aт.
Протекает при температуре в 37 C, в присутствии электролита
(физиологический р-р).

II. Неспецифическая фаза:

видимая для реакции Aг-Aт, проявляется посредством
выпадения осадка, агглютинации, дезинтеграции и др. явлений,
зависящих от определенных условий (валентность Ac, размеров
Ag, и т.д.).
 Реакция агглютинации
из латыни – agglutinatio – склеивание
• Реакции агглютинации — это простые реакции
склеивания корпускулярных антигенов с помощью
антител.
• Различают:

— прямые реакции агглютинации, которые используют для

выявления антител в сыворотке крови больного.
Добавление взвеси убитых микробов к сыворотке больного
вызывает образование хлопьевидного осадка
(положительная реакция склеивания микробов антителами).
 РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ

• Реакция Aг-Aт может проявляться посредством

агглютинации тогда, когда антигенные детерминанты
проводяться фигурными частицами (нерастворимые,
корпускулярные Aг), при этом специфичные Aт являются
полноценными (по крайней мере бивалентные).

• Аглютинация определена формированием некоторой

рещетки между Aг и Aт, что позволит приблизить
достаточное количество фигурных частиц для получения
видимой не вооруженным глазом агглютинации.
Aт IgM с 10 эпитопами потенциально агглютирует более
эфективно чем Aт IgG.
• Классификация реакций агглютинации

1. “Активная” агглютинация, в которой фигурная частица

(корпускулярная Aг) непосредственно является
носителем специфичных антигенных детерминантов
(эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, спериатозоиды,
бактерии)

2. “Пасивная” агглютинация, в которой частица является

основой для закрепления на ней растворимого
антигенного детерминанта, который закрепляется на её
поверхности. Чаще всего в качестве основы
используются формалиновые эретроциты, частицы из
латекса или холестироловые кристалы.
 • Активная (непосредственная)реакция
агглютинации
• Качестенный аспект
Реакция может быть проведена на предметном стекле или в
пробирках.
Реакция на предметном стекле
Перемешиваются капля сыворотки и капля антигенной
суспензии в капле физ. раствора (электролит).
Наблюдение проводится под микроскопом или
невооруженным глазом.
В случае положительной реакции появляются аглютинаты, а
жидкость становится позрачной;
• О Аг соматический, термостабильные– мелкозернистый
осадок
• H Аг жгутиковый, термолабильные – рыхлые, крупные
хлопья
• В случае отрицательной реакции препарат остается мутным.
 Реакция аглютинации в пробирках

Для определения Ат в сыворотке крови больного. В ряде

пробирок производят серийное разведение сыворотки к
которой добавляют диагностикум (взвесь убитых м/о или
частицы с сорбированными Аг).

Позитивная реакция проявляется посредством образования

осадка в виде перевернутого зонтика на дне пробирки (через
20-24 часа) и осветления жидкости. Оценка интенсивности
реакции проводится по системе 4 плюсов (++++).

Неаглютинированнные клетки оседают на дне пробирки в

виде кнопки или кольца (негативная реакция). Изучение
проводится невооруженным глазом или с помощью вогнутого
зеркала микроскопа.
 • Количественный аспект
Метод последовательных разбавлений

Первоначально осуществляются последовательные

разведения сыворотки (1/50, 1/100, 1/200) в которую
вводятся впоследствии в равных количествах Aг.
Далее термостат – 2 часа и при комнатной температуре 18-
20 часов.

Оценка:
самое большое разведение сыворотки в которой
проявляется агглютинация по меньшей мере 3 “+” (+++)
называется титр антител агглютирования (титр
агглютированой сыворотки).

• Прямое агглютирование применяется при определении

группы крови или при диагностике инфекционных
болезней (сероидентификация Aг или выявление и
титрование Aт из сыворотки больного) .
 • Реакции пассивной агглютинации
(непрямые)
реакция агглютирования
• Пасивная агглютинация предпологает расположение
одного растворимого Aг (или одного Aт) на инертную
корпускулярную основу, которая не восприимчева к
реакции Aг-Aт. В качестве инертной основы могут
служить:
эритроциты,
латексные частицы,
кристалы холестерола.

• Суспензия обогащенная с Aг или с Aт частиц вступает в

контакт с имунной сывороткой (соответстенно с Aг), по
аналогии случая непосредстенного агглютирования.
• Плюсы косвенных реакций: простота в наблюдении и
высокая чувствительность.
 • Косвенная (пасивная) реакция
гемаглютинации – РHГА / PПГА

• Некоторые антигены полисахарного происхождения

присоединяются спонтанно на поверхности эритроцитов,
после короткого срока инкубации. Белковые присоединяются
лишь после предварительной подготовки эритроцитов (к пр.:
обработка танином, формол).

• РHГА проводят в лунке полиэстеровой пластины.

• Позитивная реакция проявляется посредством агглютинации
чувствительных эритроцитов (перевернутый зонтик
коричневого цвета на дне лунки).
 Реакция аглютинации

— реакция торможения гемагглютинации основана на

способности антител иммунной сыворотки нейтрализовать
вирусы, которые в результате теряют свойство склеивать
эритроциты. Используется для диагностики вирусных
болезней;
 Реакция латекс-агглютинации (РЛА)

• Носители антигенов или антител - частицы полистирольного

латекса, которые служат носителями антигена и при
образовании иммунных агрегатов играют роль “мостиков”
между молекулами антител.

• Латексные частицы являются как бы искусственными

эритроцитами, но более устойчивы к внешним воздействиям.
• Реакция латексной агглютинации используется для
идентификации ревматоидного фактора у больных, у
которых есть подозрение на ревматоидный полиартрит, в
бактериологии для быстрой идентификации м/o или их Aг
в анализе, или идентификация изолированных штаммов,
также для серодиагностике некоторых инфекций.
 Реакции преципитации

• Имуно - осаждение проявляется лишь в том случае когда

растворимый Aг смешиваемся с соответствующим Aт.

• Реакцию можно наблюдать в жидкой фазе или твердой и

носит или качественный, или количественный характер.

• Это специфичные реакции с низкой чувствительностью,

требующие значительного количества антител.

• Осаждение результирующих молекулярных комплексов из

связей Aг-Aт будет представлять трехмерную решетку из
Aг объединенных посредством Aт.
 Условия образования решетки
преципитации:

• Aт должен быть по крайней мере бивалентнным (Aт парные)

• Aг – многовалентнный (хаптены не могут выпадать в
осадок)
• Максимальное осаждение соответствует зоне
эквивалентности, в которой Aт и Aг обладают оптимальным
соотношением по концентрации, что позволяет осаждение
всех молекул Aт с соответствующими Aг.
При избытке Aг или Aт осадка не будет.

• Применение:
в мед. практике (видовая принадлежность различных белков:
кровь, сперма и т.д.), в пищевой гигиене (определение
пищевого фальсификата), при диагностике инфекционных
заболеваний и т.д.
 ОСАЖДЕНИЕ В ЖИДКОЙ СРЕДЕ

• Реакция кольцевой преципитации

В пробирке диаметром в 5 миллиметров вводят иммунную
сыворотку; пробирка наклоняется и на её стенки медленно
вводится раствор Aг, чтобы не перемешался с сывороткой.
Если Aт из сыворотки соответствует Aг, в отдельных зонах двух
жидкостей образуется белое кольцо, которое означает
осаждение комплекса Aг-Aт.
Преимущество метода – быстрота и простота.

Практическое применение:
Идентификация пятен крови,
Обнаружение фальсификации пищевых продуктов,
Обнаружение полисахаридного антигена агента
Сибирской язвы (реакция Ascoli).
 • Реакция флокуляции (по технике Ramon)

Проводится последовательное разбавление иммунной

сыворотки (Aт) к которой добавляются равные доли Aг.
Образцы помещаются в термостат и периодически
проверяются, чтобы выявить пробирку в которой появится
первичный осадок (зона экивалентности).

Применение: для определения количества токсинов,

антитоксинов, анатоксинов.
 Преципитация в твердой фазе (в геле)

• В данных реакциях Aг и Aт дифузируют один по

направлению к другому, перемешиваются посредством геля
и в зоне оптимальной концентрации этих двух реактивов
появляется осадок в виде бело-серых полос.

• Если в реакции присутствуют несколько комплексов Aг-Aт,

проявиться ряд линий осаждения.

• Может использоваться для качественного анализа состава

Aг в каком-то растворе.
 Двойная иммунодиффузия
(техники Ouchterlony и Elek)

Стеклянная пластинка покрывается агаром или наливается

агар в чашку Petri.
• В технике Ouchterlony Aг и Aт диффундируют из лунок
расположенных на расстоянии 15 mm один от другого.
• В технике Elek 2 реактива диффундируют с поверхности
бумажных полос расположенных на поверхности агара.
• Молекулы диффундируют в гель в зависимости от их массы и
образует линии осаждения для системы Aг-Aт,
соответствующие в зоне равновесия.
• Если 2 Aг идентичны, их линии объединяются, но если они
разные – отдаляются
• Применение – обнаружение токсинов (токсигенез),
антитоксин, белковые Aг
 • Контраммунноэлектрофорез (CIEF)

Полезна при исследовании комплексных антигенных

растворах. Изучение возможно после 90 минут.

Агар залит на стеклянную пластину, Aг и Aт представлены в

циркулярных резервуарах по 2 mm в диаметре, на
расстоянии в 10 mm.
Во время электрофореза Aг, заряженный отрицательно,
мигрирует к позитивному полюсу, встречая Aт которые
мигрируют к катоду.
В взаимодействии гомогенных Aг и Aт имеет место
образование линии осажденияare.
CIEF необходим для исследования компонентов Aг в
биологических жидкостях: LCR, моча, плевральная
жидкость и т.д.
 • Реакция COOMBS

Некоторые Ac (моновалентные) не аглютинируют в

нормальных условиях (пр.: антитела анти-Rh,
ответственные за плодо-материнскую несовместимость в
системе Rh).
Они могут быть выявлены благодаря тестам Coombs.

Возможны 2 техники, в зависимости от способа отбора проб:

кровь у новорожденого или у беременной женщины.
 - По основной технике Coombs.

- У новорожденного определяется наличие анти-Rh материнских

Aт закрепленных на эритроцитах, если мама является Rh-.
- К этим подозрительным эритроцитам добавляется человеческая
сыворотка анти-Ig.
- Это сыворотка не будет аглютинировать с нормальными
эритроцитами, а даже наоборот, вызывает аглютинирование
эритроцитов на которых закреплены анти-Rh Ac
 - Непрямая техника Coombs.

- У беременной женщины с Rh- , анти-Rh Aт присутствуют

в сыворотке.
- Изначально к данной сыворотке добавляются эритроциты
Rh+ (для формирования комплекса Aг-Aт), далее
применяется сывороткаapoi анти-Ig.
 Реакция нейтрализации
• Реакция нейтрализации основана на способности антител
иммунной сыворотки нейтрализовать повреждающее
действие микроорганизмов или их токсинов на
чувствительные клетки или ткани.
• При отсутствии повреждающего эффекта смеси антител и
микробов или их токсинов на культуру клеток говорят о
специфичности взаимодействия комплекса антиген-
антитело
 Серологические реакции с использованием
меченных Aт

В некоторых случаях невозможно обнаружить реакцию Aг-

Aт: некоторые Aт не осаждаются, другие и не осаждаются и
не аглютинируют, существуют комплексы Aг-Aт которые не
фиксируют C.

Для таких случаев могут использоваться меченные Aт, что

позволить распознать соответствующий Aг.
Комбинирование Aт с меченными не влияет на их
иммунологические свойства.

Данные реакции проводятся на жестких поверхностях

(лезвия, пластические пластины)
Наиболее часто Используемые маркеры:

- Флорохромы (родамин, флуоресцеин), которые излучают

красно-оранжевый или зелено-желтый свет при попадании в
UV излучение (Иммунно-флюорисцентная реакция)

- Ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза),

предрасположенные изменить цвет подложки (substrat)
(Иммунно-ферментная реакция)

- Радио-изотопы (125J sau 3H), которые соответственно

излучают гамма и бета лучи (Радио – иммунный анализ)
• Реакция иммунофлюоресценции
(RIF, reacţia COONS)
Прямой метод (только с целью сероидентификации).
Из материала, содержащего Aг (чистая культура, тканевая
биопсия) готовится мазок, на который применяют
специфическую иммунную сыворотку с Aт
маркированный флюорохромом .
Через 20 мин инкубации во влажной камере препарат
изучается под люминесцентным микроскопом.
В случае позитивной реакции обнаруживается местная
люминесценции.
Недостаток – потребность в иммунной сыворотке
маркированной специфично для каждой Aг.
• positive test for rabies • negative test for rabies
• Непрямой метод.

Используется для сероидентификации и серодиагностики.

На мазок с Aг наносят соответствующие немеченные Aт.
Через 20 мин тщательно вымывается препарат, далее
добавляется anti-Ig флорисцент, который комбинируется с Aт
из этого комплекса.
Данный реактив может использоватся неоднократно.
Anti-Ig получены иммунизацией кроликов (или других
животных) посредством Ig.
 Реакция с использованием меченых
антител или антигенов

Используют также ферменты, разлагающие не только

хромогенный, но и люмогенный субстрат.

В этом случае при положительной реакции появляется

свечение.

Подобно иммунофлюоресценции иммуноферментный

метод применяют для обнаружения антигенов в клетках
или титрования антител.
• Техника основанная на фиксации:
Флуоресцентный маркер- антикомплементная сыворотка,
которая будет связана с комплементом фиксированном на
комплексе Aг-Aт.

• RIF используется для быстрой идентификации Aг из

биосубстрата или для серодиагностики .
 Реакция с использованием меченых
антител или антигенов

В иммуноферментном анализе вместо

флюорохромов иммунную сыворотку можно метить
ферментом (пероксидазой хрена или щелочной
фосфатазой).
Реакцию оценивают по окрашиванию раствора в
желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый
(фосфотаза) цвет.
 • Иммуноферментная реакция (RIE, ELISA –
Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

Прямая RIE (метод sandwich).

- Используемая лишь в сероиндентификации Aг.
- В лунки из полиэстеровых пластинок в которых фиксированы
Aт ( известные Aт) наливается раствор с неизвестными Aг.
- Инкубируется 1час.
- После тщательного промывания добавляются
Aт маркированные ферментами Aт, которые фиксируются
на свободные эпитопы поливалентного Aг.
- После 30 мин-1ч инкубации, лунки снова моются. Наличие
комплекса Aт-Aг-Aт-маркированного обнаруживается с
помощью хромогенного субстрата (вначале бесцветное
вещество,но которое красится под действием фермента,
ex. Перекись водорода и ортофенилэндимин).
 - RIE непрямая.

- Применяется лишь при серодиагностики Aт.

В лунках на полистероловой поверхности в которых
зафиксированы известные Aг наливается раствор
неизвестного Aт.
- Далее 1час инкубации.
- После тщательной промывки лунок добавляю меченные
ферментами лиганды, (анти-Ig ) которые фиксируются на
Aт.
- После инкубации в 30 мин-1час сново промываются лунки.
- Присутствие меченного комплекса Aг-Aт-Aт определяется
при помощи хромогенного субстрата (бесцветное
вещество, которое меняет цвет под воздействием фермента,
пр. перекись водорода и орто-фенилендиамин ).
 ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent
Assay)
• Более чувствительная и быстрая чем ELISA
• Фермент (щелочная фосфатаза), конъюгированная с
антителами разлагает субстрат (MUP – 4-метил
умбелиферил фосфат) с образованием флуоресцентного
соединения (метил умбелиферил), которое может быть
обнаружено с помощью спектрофлуориметра
 Иммуноблоттинг

• применяют для выявления антител к отдельным антигенам

или «узнавания» антигенов по известным сывороткам.

Метод состоит из 3 этапов:

- разделения биологических макромолекул (например, вируса)

на отдельные белки с помощью электрофореза в
полиакриламидном геле

- переноса разделенных белков из геля на твердую подложку

(блот) путем наложения пластины полиакриламидного геля на
активированную бумагу или нитроцеллюлозу
(электроблоттинг
 Иммуноблоттинг

- выявления на подложке искомых белков с помощью прямой

или непрямой иммуноферментной реакции.

Как диагностический метод иммуноблоттинг используют

при ВИЧ-инфекции. Диагностическую ценность имеет
обнаружение антител к одному из белков внешней оболочки
вируса.
 Иммунологические методы

• Преимущества:
методы экспресс-диагностики, позволяющие определить
антигены возбудителей в течение нескольких минут или
часов.

• Недостатки:
- Несмотря на гибель бактерий после проводимой
этиотропной терапии, антигены возбудителей могут
персистировать в организме от 3 до 4 недель и выявляться
данными методами
 Недостатки:

- Существует широкое антигенное родство между родами и

видами внутри каждого семейства бактерий и даже среди
различных семейств. Это может привести к получению
ложноположительных результатов

- Определение антигенов бактерий не позволяет установить

чувствительность возбудителей к антибиотикам, что также
снижает значимость этих методов.
 Недостатки:

- Серологические реакции имеют лишь относительную

достоверность, так как могут быть неспецифическими или
положительными у лиц, перенесших соответствующую
инфекцию в прошлом (анамнестическая реакция), а также у
получивших профилактические прививки (прививочная
реакция).
 Молекулярно-генетическая диагностика

Возможности :

- качественный скрининг
- количественный анализ ( вирусная нагрузка)
- типирование
- прогноз заболевания
- терапевтический мониторинг
 Молекулярно-генетические методы
исследований
Среди большого многообразия гибридных методов
молекулярный анализ нуклеиновых кислот ( МАНК ) –
синоним ПЦР наиболее широко используется в
микробиологической диагностике.

В основе метода ПЦР лежит природный процесс -

комплементарное достраивание ДНК матрицы,
осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Эта реакция носит название репликации ДНК.
 Молекулярно-генетическая
диагностика
Естественная репликация ДНК включает в себя
несколько стадий:

• Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали,

расхождение нитей ДНК);

• Образование коротких двухцепочечных участков ДНК

(затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);

• Синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание

обеих нитей)
Спасибо за внимание!