Células de Mamíferos

Transfeção – método não viral de entrega de DNA nas células (metodologias físicas e químicas).
Infeção – método viral de entrega de DNA, no qual os vírus se associam às células e injetam a sua carga de DNA.
Metodologias:
› Física
Microinjeção – emprega na célula por perfuração com uma agulha (aplica pressão); Requer aparelhos específicos
e técnicos especializados;
Eletroporação – aplicada em bactérias e leveduras; consiste na aplicação de um campo elétrico, as moléculas de
DNA carregadas migram na direção do ânodo (positivo); cria poros na membrana e o DNA pode entrar; ao desligar
o campo elétrico, os poros voltam a fechar e a célula reconstitui a membrana;
Biolística – o que medeia esta transferência é uma partícula em espécie de bala que tem o DNA misturado com
metais pesados (tungsténio ou ouro) que se ligam ao DNA carregado negativamente. A bala é disparada e para
abruptamente na extremidade, fazendo as partículas de DNA-metal sejam disparadas a grande velocidade e
penetrem o DNA na parede celular.

› Química
Transfeção com fosfato de cálcio – necessário uma solução de cloreto de cálcio (fonte de iões Ca 2+), e um tampão
HEPES (fonte de iões fosfato). O cloreto de cálcio é misturado com células que vão ser transfetadas e depois o tampão
é adicionado. Quando as soluções se combinam, os iões cálcio (positivos) e os iões fosfato (negativos) formam um
precipitado na superfície das células.
Transfeção com base em lípidos (lipofecção) – formação de moléculas lipídicas de gordura solúveis (lipossomas)
que incluem o DNA que depois vão ser endocitados ou fundidos com a membrana da célula, permitindo a entrada do
DNA;

› Viral
Envolve a produção de um vírus; Pode ser feito in vivo ou in vitro; O vírus é o veículo que vai transferir o DNA que
está encapsulado dentro do vírus – liga-se à superfície e injeta o DNA.
Os vírus são defeituosos – não tem capacidade de se multiplicar no hospedeiro. Para produzir em larga escala, é
necessária uma linhagem de células que consegue fornecer ao vírus o que ele necessita para se multiplicar;
Lentivírus; Adenovírus; Vírus adeno-associados; Vírus herpes simplex; Adenovírus canino.

Plasmídeos Repórter
Cromoproteínas, proteínas fluorescentes, proteínas com reação calorimétrica;
O produto é fácil de detetar e monitorizar.
São usados para verificar se um gene foi inserido na célula, localizar o gene ou quantificar a expressão génica.
Ex. GFP, dsRed (green or red fluorescent protein), Luciferase, LacZ (β-galactosidase)
O gene a medir e o gene repórter têm de estar sobre o controlo do mesmo sistema de tradução.
- Fusão de Transcrição – Origina duas proteínas diferentes;
– Cada gene tem o seu RBS;
– O promotor do gene de interesse controla os dois RBS;
– O gene reporte é quantificável, mas não dá informação sobre a localização.
- Fusão de Tradução – Origina uma proteína de fusão (interesse + repórter);
– A expressão do gene repórter está sob controlo do promotor e do RBS do gene;
– Permite quantificar e localizar.
Estas proteínas de fusão podem também ser usadas para facilitar a extração das proteínas alvo, por exemplo ao
diminuir a permeabilidade da membrana.

5’ UTR K S T P GOI SC 3’ UTR

K (Sequência Kozak);
S (Sequência Sinal) – para excreção da proteína para fora da célula;
T (Tag de afinidade da proteína) – facilita o isolamento da proteína por coluna de afinidade;
P (Local de corte proteolítico) – por ação de uma protease, será clivada neste local - separa a proteína da cauda de
aminoácidos de afinidade;
SC (Codão stop).
 Plasmídeos Virais como Vetores
 Fagemídeo (Phagemid)
› Contem componentes de cromossomas de fagos e de plasmídeos (duas ORI – em E. coli e do fago);
Replicam em E. coli como plasmídeos de dupla cadeia;
A adição de um fago auxiliar leva a que o fagemídeo altere para o modo de replicação dos fagos,
resultando no empacotamento do ssDNA no interior das cabeças do fago;
- O tamanho da partícula do fago é controlado pelo tamanho do DNA viral e por isso não é uma
limitação no empacotamento.
 Ciclo de Vida dos Bacteriófagos Ff
› F specific filamentous phagues (F1, Fd, M13…)
› Infetam as células a partir do pilus F;
› A cadeia positiva é copiada na cadeia negativa; A
cadeia simples é empacotada em proteínas do manto
do fago e sai da célula sem causar lise celular;
- pVIII: ~2700 cópias
- pIII: 3-5 cópias
 Tecnologia de Phague Display
› O fagemídeo é um vetor de clonagem com:
Duas ORI, Marca de resistência; Proteína de fusão:
Promotor;
Peptídeo sinal - indica que as proteínas devem ser deslocadas para o espaço periplasmático;
Peptídeo para colocar na superfície do fago;
Proteína do manto do fago – VIII ou III dependendo da abundância de peptídeo desejada.
› O fasmídeo é transformado em E. coli (TGI), que depois é infetada por um fago auxiliar;
O fago auxiliar providencia componentes virais que não existem no plasmídeo (p.ex. proteínas
necessárias para o ciclo celular do fago filamentoso – replicação e empacotamento)

› Sistemas:
One-gene – o fagemídeo inclui apenas uma proteína de fusão;
Two-gene – o fagemídeo é transformado e inclui duas proteínas de fusão, ou o fago auxiliar inclui outra
proteína de fusão

› Aplicações:
Biologia Tumoral e Imunoterapia - Estudo e caraterização da heterogeneidade de tumores
Seleção de peptídeos e fragmentos de anticorpos para diversos alvos, incluindo células cancerígenas,
células imunitárias e citocinas;
- Peptídeos selecionados de fagos usados para guiar peptídeos líticos, drogas citotóxicas e
nanopartículas para células cancerígenas com o objetivo de obter terapias mais eficientes e menos tóxicas;
Anticorpos desenvolvidos pela Phague Display em tratamento de doenças autoimunes e em alguns
cancros metastáticos.

› Seleção por Afinidade

Protocolo com Linhagem Celular: Incubação da biblioteca de fagos com células alvo; Lavagem para
exclusão dos fagos com menor afinidade para o alvo; Variar as condições de incubação para reverter a
ligação fagos-alvo (pH, salinidade, competidores) e eluição; Amplificação em E. coli; Análise da sequência
e caraterização; Repetição do processo.
Protocolo In vivo: Injeção da biblioteca (intravenosa – rápida circulação) em animais e mantida em
circulação por poucos minutos; Recuperação dos fagos a partir dos órgãos alvo; Amplificação (dos fagos
ou dos tecidos) em E. coli; Repetição do processo
 Recombinação Especializada
Envolve a reação entre a reação entre dois sítios específicos.
- Os locais alvo são curtos (14-50pbs);
- Os dois locais podem ter a mesma sequência ou podem ser não homólogos.
A enzima que catalisa a recombinação específica são as recombinases.
 Sistema Cre-Lox
› Encontrado no bacteriófago P1
A recombinase Cre catalisa uma recombinação específica entre dois locais lox idênticos, libertando o
DNA entre eles.
- Recombinase Cre é independente (não necessita de auxiliares);
- Locais lox são sequências de cerca de 30pbs, palindrómicas (lê-se igual numa direção (→) numa cadeia
e na direção oposta () na cadeia complementar).

› Possíveis Resultados:
Inversão – Ambos os lox estão na mesma cadeia, mas em direções opostas; A recombinação resulta na
inversão do gene;
Translocação – Os lox estão em cromossomas diferentes; A recombinação resulta numa troca recíproca
entre ambos os cromossomas;
Deleção – Os lox estão na mesma molécula com a mesma direção; A recombinação resulta numa
circularização (que inclui o gene), havendo excisão de informação;
Ex. de utilização da técnica de
recombinação nos slides.

› Aplicações:
Cre-dependent gene expression – colocar um codão stop com locais loxP em qualquer lado (cassete "lox-
stop-lox" ou "LSL") a montante do gene de interesse irá prevenir a expressão do gene na ausência de Cre.
Na presença de Cre, o codão stop é excisado e a expressão do gene prossegue.
Cre-dependent gene knockout – colocar locais loxP em ambos os lados de um gene (denominado
"floxing", para "flanqueado por loxP") para expressão do gene. Assim que é adicionada Cre, o gene será
interrompido ou excluído.
Selection marker removal – no targeting convencional de ratos, os clones são selecionados por usar um
marcador de resistência. No entanto, muitas vezes é desejável remover o marcador após o processo de
seleção inicial.
Regulated Cre expression – colocar a Cre a jusante de promotores que são ativos apenas em certas
condições (tipos de células/tecidos, certos estágios de desenvolvimento), ou tornando o Cre induzível, a
recombinase Cre apenas poderá ser expressa em células ou em estágios específicos.

› Como se faz?
Usando dois ratos (um possuindo LoxP e outro Cre), é feito o cruzamento e obtém-se uma geração que
possui ambas as caraterísticas.
Foi substituída (em grande parte) pela tecnologia de CRISPR-Cas9.
 Plasmídeos de Engenharia de Genomas
 Edição de Genoma com CRISPR-Cas9
› Sequências CRISPR aparece em ~50% das bactérias e quase 90% de Archaea;
› Pertence a um sistema de imunidade adquirida, em bactérias;
› Existem sequências palindrómicas repetidas (cicatrizes) que são fragmentos de DNA de bacteriófagos que
infetaram previamente as bactérias. – Permite que a célula consiga reconhecer e destruir bacteriófagos
semelhantes que tentem infetar as células.
› Cas9 – Utiliza as sequências CRISPR para reconhecer a sequência PAM (NGG) e clivar o DNA;
› O reconhecimento do DNA é feito por uma molécula de RNA guia – sequência scaffl que permite a
associação da proteína Cas9 e uma sequência que se associa à sequência do genoma perto da sequência
PAM, onde se quer clivar.

› Essencial para: Sequenciação e Estruturação do DNA; Desenvolvimento de enzimas de restrição; PCR;

Edição de Genoma.

› Aplicações
Engenharia de Linhas Celulares e Organismos vivos;
Biologia Sintética e Engenharia a Nível do Genoma;
Edição de Genoma para fins terapêuticos.
Indel (Mutações por inserção ou deleção) – faz pequenas inserções ou deleções no genoma; NHEJ.
Deleção no cromossoma – deleção de uma sequência mais longa; NHEJ.
Inserção transgénica – inserção de um gene de um plasmídeo; HDR.
Inserção de uma pequena sequência – HDR.
Translocação cromossómica – Troca de genes entre cromossomas; NHEJ.
* NHEJ - reparação do DNA não homóloga e por recombinação das quebras do DNA;
* HDR – reparação do DNA homóloga

› Outras tecnologias de Edição de Genoma:

Baseadas em Endonucleases Zinc fingers (Megaendonucleases) – a enzima FokI reconhece uma certa
sequência de DNA – a enzima possui uma cauda de módulos, cada um reconhecendo uma pequena
sequência;
Nucleases com Efetores ativadores da transcrição (TALEN) – a enzima FokI possui uma cauda de módulos
que reconhecem sequências mais específicas. A especificidade é modular, baseada em fatores ativadores
de transcrição.
*Estas são ambas à base de proteínas que reconhecem DNA, enquanto a CRISPR utiliza RNA que
emparelha ao DNA
› Resultados da Edição de Genomas:
Dependem do tipo de quebra do DNA em cadeia dupla, e existem diferentes meios de reparação do DNA;
Na ausência de um template dador – NHEJ (inativação, deleção ou inversão de genes)
Na presença de DNA dador – HDR (integração de genes no genoma ou reparação de genes)
 Cosmídeos
› Não ocorrem naturalmente;
› Consegue carregar inserts até 45kb;
› Vantagens: Bibliotecas de genomas; Fácil de preparar o DNA a partir de clones
› Desvantagens: Nem sempre são estáveis.
› Construídos com caraterísticas de plasmídeos e fago λ. Um plasmídeo de E. coli com:
ORI em E. coli;
Polylinker;
Cos site – permite a re-circularização, essenciais para o empacotamento das partículas virais; Possuem
uma sequência Cos-N que é o local de clivagem por uma terminase, formando DNA linear com
extremidades coesivas;
Marcador de seleção/resistência – p.ex. Amp;
Local de restrição para clonagem.
- Depois é empacotado num fago λ.
 YAC – Yeast Artificial Chromosomes
› Clonagem de fragmentos de DNA compridos até milhões bases de pares (> 1Mbp);
› Capacidade de autorreplicação;
› Conseguem replicar qualquer DNA inserido através da sua transferência para as células de leveduras;
› Vantagens: Bibliotecas de genomas; Requer poucos clones;
› Desvantagens: Muito propenso a rearranjos; Difícil de construir; Não são muito estáveis;
› Possuem:
Tel – Telómeros;
Cen – Centrómeros (ex. CEN4);
ORI;
Marcadores de Seleção (ex. TRPI, URA3, SUP4 (semelhante ao white/blue screening));
Sítios de Reconhecimento de Enzimas de Restrição;
Sequência de replicação autónoma (ex. ARS).
 BAC – Bacterial Artificial Chromosomes
› Clonagem de fragmentos de DNA compridos;
› Origem de Replicação de poucos números de cópias;
› Vantagens: Bibliotecas genómicas; Requer poucos clones; Muito estável;
› Desvantagens: ORI de poucos números de cópias, e por isso difícil de preparar;
› Baseado no plasmídeo F, e usado para transformar células bacterianas por eletroporação;
› Genes Par – necessário para a partição do plasmídeo para as células filhas.

Gibson Assembly
Método de montagem de diversos fragmentos de DNA linear → Independentemente do comprimento ou
compatibilidade das extremidades, os diversos fragmentos sobrepostos
podem ser montados numa única reação isotérmica, com ajuda de 3
enzimas.Formação de extremidades 3’ estendidas;
 T5 exonuclease – cria ssDNA 3’ estendido ao remover bases da
extremidade 5’. Instável aos 50ºC, desnatura
2. Hibridação dos terminais dos fragmentos (são complementares);
3. Preenchimento das regiões em falta;
 Phusion DNA polimerase de alta fidelidade – liga-se às extremidades 5’
e preenche a região em falta
4. Ligação entre regiões da mesma cadeia.
 Taq DNA ligase – liga as regiões 5’ sintetizadas à extremidade 3’ do
terminal hibridado
 Vetores Virais
Lentivírus – vetores que se integram no genoma, provocando uma modificação celular;
Adenovírus – expressão transitória, sempre acompanhadas por uma resposta imunitária em peso;
Vírus Adeno-associados (AAV) – carregam inserts muito curtos.
Adenovírus Lentivírus AAV
Eficiência de transfeção >90% ~30% 30-40%
Integração no genoma hospedeiro Não Sim Sim
Capacidade de insert Até 34kb 8.5kb 4KB
Título Viral Alto* Sim Não Não
*Número de células virais capazes de causar infeção
 Lentivírus – Vetores retrovirais
› Vetores retrovirais são usados para introduzir genes novos ou alterados no genoma de células
animais/humanas;
› Retrovírus são vírus de RNA – O RNA viral é convertido em DNA por transcriptases reversas virais e depois
é integrado de forma eficiente no genoma hospedeiro;
› Qualquer gene hospedeiro estranho ou mutado inserido no genoma do retrovírus será integrado no
cromossoma hospedeiro e pode permanecer indefinidamente;
› Vetores retrovirais são muito usados para estudar oncogenes e outros genes humanos;
› Conseguem infetar células que se estão a dividir ou não – não requerem eventos mitóticos para integração
do gene;
› Codificam 3 genes semelhantes em toda a família, sempre flanqueados por sequências LTR;
› Lentivírus pode carregar genes CAR (codifica recetores quiméricos de antigénios – permite que as células
imunitárias se dirijam para células específicas) ou genes saudáveis (as células são transplantadas em
indivíduos com doenças génicas que possuem o gene defeituoso).

› O lentivírus não consegue se replicar dentro do hospedeiro, por isso são utilizadas packaging cells onde é
inserido um packaging mix com o transgene e plasmídeos que fornecem os genes necessários para
replicação do lentivírus (integrase de transcriptase reversa e proteínas do envelope e cápsula viral);
› Na célula alvo, é feita a transcrição reversa para DNA em cadeia dupla e depois integra-se no DNA
hospedeiro;

› Vantagens:
Não é necessário reagente de transfeção; Integração estável do gene no genoma hospedeiro; Transdução
eficiente na maioria das células de mamíferos; Infetam linhagens celulares “difíceis de transfecionar”; Baixa
imunogenicidade quando usado in vivo.

› Aplicação: Imunoterapia e Terapia Génica;

 Adenovírus
› Vírus de DNA em cadeia dupla que conseguem infetar uma grande variedade de tipos de células incluindo
células em divisão ou não, e por isso são usados como veículos de entrega de genes.
› Possuem dois tipos de genes – Genes E, expressos numa fase precoce no desenvolvimento viral, e os Genes
L que só são necessários numa fase mais tardia, mais relacionados com o empacotamento.
› Os vetores são feitos para serem defeituosos na replicação – removidos os genes E1 e E3;
› O vetor não se integra no genoma hospedeiro;

Aplicações da Engenharia Genética

› Engenharia de Proteínas;
› Microrganismos Recombinantes;
› Plantas e Animais Transgénicos.
 Engenharia de Proteínas
› Aplicações: Análise da função e da estrutura da proteína, e Engenharia da proteína;
Mutagénese – Modificação da sequência de DNA;
- Mutagénese Dirigida – requer conhecimento à cerca da sequência e estrutura; Restringida a análise de
regiões específicas
- Mutagénese Aleatória – possível sem conhecimento à cerca da sequência ou estrutura; Geração de uma
biblioteca de mutantes → requer tecnologias eficientes de screening;
- Mutagénese Dirigida – Overlap PCR ou Método baseado em PCR:
1. Gene clonado num plasmídeo;
2. Criação de primers complementares a ambas as cadeias, contendo a mutação desejada;
3. Desnaturação do plasmídeo e Annealing dos primers;
4. Com uma Pfu Turbo DNA polimerase, há extensão das cadeias a partir dos primers, resultando em
cadeias circulares abertas;
5. Digestão do DNA com uma DpnI que apenas digere o DNA mutilado – digere o DNA incial (não
mutado);
6. Transformação do dsDNA circular aberto em E. coli.
*2-4 com auxílio de ciclos de temperaturas.
- Evolução Dirigida – Forma de acelerar a evolução, in vitro. É feita uma mutagénese ao acaso, e criação
de uma biblioteca de genes mutantes, que por sua vez codificam para proteínas mutantes. Depois é
necessária uma tecnologia de seleção da proteína de interesse.
- Mutagénese Aleatória
Error Prone PCR: Alterações em quantidades de dCTP, dTTP, dATP, dGTP, Mg2+, Mn2+.
DNA shuffling: baralhar os diferentes fragmentos de DNA – utilização do mesmo gene de diferentes
espécies e tratá-lo com DNAse I (corte pouco específico). Cria fragmentos aleatórios que são colocados
em PCR para hibridar aleatoriamente uns com os outros, resultando num conjunto de genes quiméricos.
Permite criar a proteína do gene original com diferentes caraterísticas.

› Enzima Subtilisina
Protease alcalina – utilizada em detergentes para lavagem de roupa;
Alteração de Asp para Ser na posição 99 (perto do centro ativo) fez aumentar a atividade a pH mais
elevado;
Vantagens: Aumento da resistência a temperaturas altas (WT até ~70ºC) e atividade a pH mais alto;
Aumento da resistência a agentes oxidantes;
Resistente à desnaturação por detergentes não-iónicos;
Não requer iões metálicos;
 Microrganismos Recombinantes
› Aplicações na Indústria e no Ambiente:
Endonucleases de Restrição e Moléculas Biológicas de pequena dimensão;
Degradação Microbiana de Xenobióticos;
Utilização de Celulose e Hemicelulose;
Utilização de Açúcares e Amido;
Lípidos de cianobactérias;
Produção de Hidrogénio.

› Enzimas de Restrição – Alguns micróbios são difíceis de cultivar. Pode-se clonar o gene para a enzima de
restrição de um micróbio em E. coli, juntamente com os genes para as modificações necessárias (metilação
– metilase DdeI) para proteção dos genes em E. coli.
- E. coli é fácil de cultivar. Em gram negativas, é necessário proteger o DNA, além de que a localização
das enzimas de restrição (periplasma) é diferente da localização das enzimas de proteção (citoplasma).
› Degradação e Biorremediação Microbiana de Xenobióticos
- Biorremediação – uso de agentes biológicos para remover lixos tóxicos do ambiente
- Xenobióticos – químicos não naturais como herbicidas, pesticidas, refrigerantes, solventes, petróleo, e
outros compostos orgânicos.
- Pseudomonas conseguem naturalmente degradar alguns xenobióticos. Essa capacidade é conferida por
dois grandes plasmídeos que possuem.

 Plantas Transgénicas
› Metodologias:
Transformação de plantas com Plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens;
Sistemas de vetores derivados do Plasmídeo Ti;
Engenharia de Cloroplastos;
Bombardeamento de Microprojéteis;
Uso de genes repórter em células de plantas transformadas;
Manipulação da Expressão Génica em plantas;
Produção de plantas transgénicas livres de marcas;

› Razões para Engenharia Genética em plantas:

Melhorar o valor da planta na agricultura, horticultura ou ornamentação;
Servir como bioreator vivo na produção de proteínas ou metabolitos economicamente importantes;
Produção de vacinas ou anticorpos para a saúde humana;
Providenciar uma fonte de energia renovável;
Estudar os papeis dos genes (e os seus produtos) no crescimento e desenvolvimento das plantas.

› Engenharia Genética com o Plasmídeo Ti

A. tumefaciens é uma bactéria do solo, gram negativa, patogénica;
Forma tumores (crown gal tumor) na base do caule das plantas, como consequência da expressão de
genes do Plasmídeo Ti (tumor inducing). Principalmente em dicotiledóneas;
O Plasmídeo Ti possui um gene para o catabolismo de Opinas – sintetizadas no interior dos tumores para
serem usadas como fonte de carbono ou azoto pelas células que carregam o plasmídeo Ti (bactérias);
Processo: A infeção das plantas pela A. tumefaciens ocorre principalmente em locais de ferida na planta.
A ferida na planta produz sinais (compostos fenólicos) que levam à indução da expressão dos genes vir do
plasmídeo Ti, que codificam enzimas responsáveis por mediar a transferência da sequência T-DNA
(potencial de induzir tumores) do plasmídeo Ti para as células vegetais e posterior integração do T-DNA no
genoma da planta.
 › Sistemas de Vetores baseados no Plasmídeo Ti
Em E. coli é produzido um vetor de clonagem derivado do Plasmídeo Ti que possui a zona T-DNA mas não
possui os genes vir. O plasmídeo é introduzido em A. tumefaciens desarmada que contem um plasmídeo Ti
desarmado sem T-DNA, mas tem os genes vir. Ao inserir o plasmídeo criado, os genes vir da bactéria iniciam
a mobilização do T-DNA criado para o genoma da bactéria.
Métodos de entrega do DNA
- Transferência de genes mediada pelo plasmídeo Ti;
- Bombardeamento de Microprojéteis;
- Vetores virais;
- Microinjeções; Eletroporação; Fusão de Lipossomas;

› Engenharia de Cloroplastos
A maioria das plantas superiores possuem 50-100 cloroplastos;
Construção de genes:
- Expressão de um gene de interesse no núcleo e alvo no cloroplasto – proteína de fusão com uma
sequência de sinalização para o cloroplasto;
- Expressão de um gene de interesse no cloroplasto;

› Plantas transgénicas
Resistência a insetos*, vírus, herbicidas, fungos, bactérias;
Tolerância à seca e sais;
Modificação do conteúdo nutricional, sabor e aspeto da planta;
Plantas como Bioreatores e produtores de vacinas;
Rendimento;
*Bacillus thuringiensis, uma bactéria do solo gram positiva produz uma proteína/toxina crista (cry) que
mata insetos; Esta prototoxina é produzida juntamente com os endósporos. Quando a prototoxina é
ingerida por larvas, é digerida por uma protease específica. Quando clivada, a toxina é ativada e liga-se
a recetores de membrana do epitélio do intestino levando à formação de poros. Isso leva a um desequilíbrio
do potencial energético, deixando as larvas letárgicas (pouca energia) mas não morrem. Assim, as larvas
são usadas como fonte de nutrientes para os esporos se desenvolverem e multiplicarem.
- Para evitar insetos resistentes à toxina de B. thuringiensis: Usar 2/+ genes de toxinas Bt diferentes; Usar
um gene de toxina Bt e um para uma outra proteína inseticida; Usar um promotor induzível para limitar a
expressão da toxina Bt apenas quando os insetos são um problema.

 Animais Transgénicos
› Ratos transgénicos
Metodologias
- Microinjeção de DNA – o DNA é injetado num ovo após fertilizado e inserido na fêmea; Apenas 5% dos
ovos resulta num descendente modificado;
Aplicações
- Modelos para o estudo de diversas doenças (Alzheimer, Huntington, Artrite, etc)
- Sistemas de teste (p.ex. redução dos níveis de proteínas que contribuem para Alzheimer; correção de
mutações que conduzem a doenças; proteção contra doenças virais).
- Regulação condicional da expressão de genes;
- Controlo condicional de morte celular (para estudo de falha de tecidos/órgãos).

› Aplicações no Gado
Clonagem de gado através de transferência nuclear de células somáticas;
Dadores de órgãos; Produção de compostos farmacêuticos;
Gado resistente a doenças; Melhoramento da qualidade do leite.
Cabras/Ovelhas: Glândulas mamárias como bioreator; Aumento da quantidade de caseína no leite; Leite
com lactase (remove lactose).
› Galinhas transgénicas
› Peixes transgénicos
Genes introduzidos em ovos fertilizados por microinjeção ou eletroporação;
Aumento da velocidade de crescimento, com o gene para hormona de crescimento;
Resistência a doenças; Biossensores para a poluição da água.
*Salmão transgénico