Inleiding

Volgens de wet is het niet toegestaan om met een alcoholpromillage van 0,5 of hoger de weg op te
gaan. Voor beginnend bestuurders geldt een alcoholpromillage van 0,2 of hoger. De politie houdt af
en toe alcoholcontroles, waarbij er een aanhouding plaatsvindt, er wordt gevraagd of er meegewerkt
wil worden aan een ademanalyse. Naast een ademanalyse is er soms ook nog een bloedonderzoek
nodig. Dit kan komen doordat de bestuurder niet in staat is om een blaastest te doen of er is een
bezwaar of de uitslag van de ademanalyse. Bij dat bloedonderzoek wordt er gekeken naar
bloedplasma’s, want na alcoholgebruik komt de alcohol in het bloed terecht. 

Als er sprake is van een dodelijk slachtoffer en de bestuurder heeft een verleden met alcoholgebruik,
kan er een levercoupe onderzocht worden. Zo kan er bekeken worden of er al lang aan
alcoholgebruik gedaan wordt. 1 Veel mensen met langdurig alcoholgebruik krijgen vaak last van
levercirrose. Dit is dat de levercellen zijn afgebroken en hierdoor kunnen ze niet goed meer
functioneren.

Bij dit onderzoek is er sprake van een dodelijk ongeluk en een alcoholcontrole op nieuwjaarsnacht. 

Bij het dodelijk ongeluk zijn bestuurder A (man) en B (vrouw)  tegen elkaar opgebotst. Bestuurder A
is in kritieke toestand in het ziekenhuis opgenomen en bestuurder B is ter plekke overleden.
Bestuurder B had een verleden met onder invloed rijden. Doordat bestuurder B niet in staat is om
een ademanalyse te doen wordt er bloedplasma afgenomen om te onderzoeken of er alcohol in het
spel was. Er werd ook een levercoupe afgenomen bij bestuurder B. Ook bij bestuurder A word een
bloedplasma afgenomen.

Bij de alcoholcontrole op nieuwjaarsnacht zijn er 2 bestuurders aangehouden. Bestuurder C (man)

heeft na de ademanalyse een te hoog promillage, maar hij houdt vol niet gedronken te hebben. Het
bloedplasma monster van bestuurder C afgenomen en onderzocht, doordat bestuurder C een
bezwaar heeft tegen de uitslag. Bestuurder D (vrouw) is ook aangehouden voor een alcoholcontrole
maar wilt hier niet aan meewerken. De politie vermoedt naast alcoholgebruik ook drugsgebruik.

Het doel van het eerste deelonderzoek is om het alcoholpromillage in het bloedplasma van de vier
bestuurders te bepalen door middel van een Gas Chromatografie. Er wordt hierbij verwacht dat het
promillage van de alcohol van de bestuurders A, B, C en D tussen de 0 en de 3,5 zullen zitten. Bij
bestuurder A wordt er geen/een laag alcohol promillage verwacht, tussen de 1 en de 0,5. Bij
bestuurder B zal het promillage van de alcohol wat aan de hoge kant zitten, bestuurder B heeft een
verleden met alcoholgebruik. Bij bestuurder C zal het alcohol promillage 0,8 zijn, aan de hand van de
uitslag van de blaastest. Bij bestuurder D wordt er ook een wat hoger alcohol promillage verwacht,
doordat bestuurder D niet mee wilde werken aan een ademanalyse.

Het doel van het tweede deelonderzoek is om te bepalen of er schade aan de lever van bestuurder B
is door alcoholmisbruik door middel van het gebruiken van histochemische kleuringen en de
microscoop. De verwachting hierbij is dat er schade van alcohol aan de pathogene lever van
bestuurder B aangetroffen worden. De schade van alcohol aan de lever zou bepaald kunnen worden
door het vinden van een leververvetting of littekenweefsel. Dit wordt duidelijk door de HE-
kleuring. Bij leververvetting zie je meer lichte (gele) levercellen.  De kleuring wordt uitgevoerd zodat
de schade die de lever heeft gekleurd wordt. 
1
Leeswijzer
In dit verslag zal het volgende aan bod komen; allereerst wordt er wat achtergrond informatie
beschreven in de theoretische achtergrond. Vervolgend wordt er beschreven wat de methode van de
gaschromatograaf en de histologie is. Hierbij zijn alle benodigde materialen te vinden die er nodig
zijn voor het onderzoek. Hierna worden de resultaten beschreven van de afgenomen bloedplasma
monsters en bij de histologie zijn er resultaten van de levercoupes te zien of er schade is door de
alcohol. Na de resultaten volgt een discussie, hier wordt op teruggereflecteerd op de onderzoeken
van de gaschromatografie en de histologie. Ook wordt de betrouwbaarheid van de resultaten
aangetoond. Hierna word er een conclusie getrokken uit de resultaten. En dan als laatst zijn er nog
bronnen en bijlagen te vinden.

Theoretische achtergrond
Alcohol
Alcohol bestaat uit koolstof (C), waterstof (H) en zuurstofatomen (O). Alcohol kan
goed oplossen is water en is daardoor dus een polaire stof. Dit komt doordat alcohol
een OH- groep bevat. Er kan met het waterstofatoom van de OH- groep en het
zuurstofatoom van water een waterstofbrug gevormd worden.
Alcohol wordt veel gebruikt om op te drinken, hierdoor komt de alcohol in het lichaam terecht. Als
alcohol opgenomen wordt in hete lichaam, komt het in het bloed terecht. Bloed bestaat voor
ongeveer 50% uit rode bloedcellen, witte bloedcellen en de bloedplaatjes. De andere 50% van het
bloed bestaat uit plasma. Het plasma bestaat uit water, hierin zijn eiwitten, vetten, hormonen en
mineralen in opgelost². Alcohol is een polaire stof, waardoor het goed oplosbaar is in water. Doordat
de stof goed oplosbaar is in water gaat de alcohol in het plasma zitten. Als mensen niet mee willen
werken aan een blaastest wordt er een bloedplasmamonster afgenomen. Dit wordt gedaan om te
zien hoeveel alcohol er in het bloed bevindt.

Alcohol kan zorgen voor een goed gevoel, maar zodra er teveel alcohol in het bloed komt kan dit
veranderen. Volgens de wet mag er bij een alcoholpromille lager dan 0,5 nog autogereden worden.
Dit is anders bij beginnend bestuurders, daar is een alcoholpromille van 0,2 het maximale. Naarmate
er steeds meer alcohol in het bloed wordt opgenomen, worden de zintuigen steeds meer verdoofd
en kan het zelfs gebeuren dat de persoon in een coma raakt en dood kan gaan. Dit kan voorkomen
als de persoon meer dan 4 promille in het bloed heeft zitten. De hoeveelheid alcoholpromille wordt
bij dit onderzoek door middel van gaschromatografie bepaald. ²

De extractie van alcohol

Voordat de gaschromatograaf kan worden gebruikt moet het bloed eerst geëxtraheerd
worden, dit moet zodat het alcohol uit het bloed kan worden gehaald. De extractie methode is
gebaseerd op het verschil in oplosbaarheid. De extractie van het alcohol wordt gedaan door
middel van Natriumchloride (NaCl) toe te voegen, de NaCl zorgt ervoor dat het water
verzadigd is. Als de THF en propanol (extractievloeistof) wordt toegevoegd zal de alcohol aan
de extractievloeistof gaan binden. Vervolgens wordt het plasma met NaCl en de
extractievloeistof gecentrifugeerd. Hierbij zullen het water en NaCl naar beneden zakken in de
centrifugebuis, omdat dit de zwaardere deeltjes zijn. Daarboven op zit de extractievloeistof met
alcohol. ³

Gaschromatografie
De extractievloeistof met de alcohol kan vervolgens in de gaschromatograaf. Met behulp van de
gaschromatograaf kan er bepaald worden hoeveel alcohol er in het plasma zit. Een gaschromatograaf
is voor gassen. Een gaschromatograaf bestaat uit een mobiele- en stationaire fase. De mobiele fase is
het draaggas, bij dit onderzoek is het draaggas stikstof met waterstof gemengd. De flow regelaar
bepaald hoe snel de geïnjecteerde stof door de kolom gaat. Als de flow regelaar te hoog ingesteld
staat kan het zijn dat twee stoffen als één stof gezien worden. Als de daadwerkelijke injectie
plaatsvindt, gebeurt dit met een injectiespuit met een scherpe punt. De lucht moet namelijk uit de
spuit en de punt moet door het septum heen kunnen. Als de stof
geïnjecteerd is word de stof verdampt en daarna meegenomen door het
draaggas naar de kolom, stationaire fase. Er wordt gebruik gemaakt van
een apolaire kolom, de apolaire stoffen zullen veel affiniteit hebben met
de apolaire kolom. De polaire stoffen zullen weinig tot geen affiniteit
hebben met de kolom en zullen dus snel uit de kolom komen. Affiniteit is
de mate dat de stof zich aan de kolom hecht. Als de stof uit de kolom is
gaat de stof naar de detector. De stof die het meest polair is zal dan de
minste retentietijd hebben en zal het eerst op het chromatogram te zien zijn. ⁴
Door middel van het chromatogram kan er een kwalitatieve (welke componenten in het mengsel
zaten) en kwantitatieve (hoeveelheid stof aanwezig) analyse gedaan worden. Er wordt hierbij gebruik
gemaakt van de interne standaardmethode. De interne standaardmethode is dat de hoeveelheid
ethanol wordt bepaald door het piekoppervlak van ethanol in het monster te berekenen ten opzichte
van het piekoppervlak van een bekende concentratie propanol en dat vervolgens te vergelijken met
standaardoplossingen van ethanol in plasma. ³

Materiaal en methode

Apparatuur
Het apparatuur dat er bij dit experiment gebruikt wordt zijn de gaschromatograaf (Aligent 6850),
vortex, schudmachine, bovenweger, centrifuge en Microsoft Excel

Materialen
De materialen die er bij dit experiment gebruikt worden zijn, centrifugebuizen, doppen (geel), filters,
maatkolven (10 mL, 100 mL en 250 mL) en een sampler (100 µl, 1000 µl)
Chemicaliën
De chemicalien die bij dit experiment gebruikt worden zijn ethanol (99,8% , het catalogusnummer is
603-002-00-5), propanol (99+% het catalogusnummer is 603-117-00-0), extractievloeistof (THF:
propanol (200:1)), NaCl (99,5%, het catalogusnummer is 613-167-00-5), runderplasma en MilliQ

Methode
Eerst werd de stockoplossing van ethanol bereidt. Dit werd gedaan door 5 mL milliQ in een 10 mL
maatkolf te doen. Vervolgens werd hier 1 mL ethanol aan toegevoegd. Het was erg belangrijk om de
maatkolf meteen af te dekken met een stop. Hierna werd de milliQ aangevuld tot de maatstreep.
Vervolgens werden de maatkolven volgens het onderstaande schema aangevuld met 5 mL milliQ.
Hierna werd er 0; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,500; 1,00 en 2,00 ml van de stockoplossing in de 10 ml
maatkolven gepipetteerd. De maatkolven werden aangevuld met milliQ tot de maatstreep. De
maatkolf werd meteen gesloten na het pipeteren. De stockoplossingen van de zeven maatkolven
hadden een concentratie van 0 tot 15,80 g/L ethanol.

De tweede stap was het bereiden van standaarden in blanco plasma. Dit werd gedaan door in de 7
centrifugebuizen een blanco plasma van 0,5 mL milliQ te pipeteren. Hiervoor is een sampler van 100
tot 1000 ul gebruikt. De sampler was ingesteld op 500 ul met een blauwe punt. Vervolgens werd er 0,5
ml milliQ in elke centrifugebuis gedaan. Hierna werd er 0,1 ml van elke stockoplossing van ethanol
(zie stap 1 en onderstaande tabel) in een van de centrifugebuizen gepipetteerd. De standaardreeks
had een eindconcentratie van 0 tot 3,16 g/L. En een eindconcentratie van 0 tot 4,0 volume
promillage in 0,5 mL plasma.

Als derde stap werd het monster voorbereid. Hierbij werden de centrifugebuizen gecodeerd met
dezelfde codering als het monster. Vervolgens werd er 0,5 mL van elk monster in een centrifugebuis
gepipetteerd. Daarna werd er 0,6 mL milliQ in de centrifugebuizen gepipetteerd.

Bij de vierde stap werd het monster geëxtraheerd. Dit werd gedaan door eerst een extractievloeistof
te maken. Er werd 5 mL tetrahydrofuraan in een maatkolf van 10 mL gedaan. Met een sampler werd
hier 50 µl propanol aan toegevoegd. De maatkolf werd aangevuld tot de streep met THF en werd
gehomogeniseerd. Na het pipeteren werd de maatkolf direct gesloten.

Vervolgens werd er aan elke buis van de tweede en derde stap 1 gram NaCl toegevoegd. Deze buizen
werden 2 seconden op de vortex gemengd. (een deel NaCl werd er opgelost, het deel dat overbleef
was de verzadigde oplossing). Aan elke buis werd 1,0 mL extractievloeistof toegevoegd met interne
standaard. De buizen werden vervolgens 5 minuten geschud op de schudmachine op maximale stand
of 1 minuut op de vortex met maximale stand. De buizen werden vervolgens 10 minuten bij 2500
rpm gecentrifugeerd. Hierbij was het belangrijk dat de buizen in evenwicht waren. Nadat de buizen
uit de centrifuge kwamen werd 250 ul van de bovenste (heldere) laag uit de centrifuge buis
overgebracht naar een 1,5 ml buisje (“epje”) met dezelfde codering of nummer gebracht. Dit
gebeurde voor alle buizen. Het was hierbij belangrijk om alleen de heldere laag uit de buisjes te
halen.

Stap vijf was dan het injecteren van de GC. Eerst werd er gecheckt of de GC goed was ingesteld. De
GC moest ingesteld worden bij injectie op split (30:1) en 250 °C. De oven werd ingesteld op 55 °C
isotherm. De kolom werd ingesteld op capillair, Alltech Eneco-Cap 5, CP index 8, 30m x 0,25mm, film
dikte: 0,25 µm. De druk van de kolom werd op 35 kPa ingesteld, dit komt doordat de flow op 1.0
ml/min werd ingesteld. De runtijd werd ingesteld op 4 min. Er werd bij dit experiment gebruik
gemaakt van een FID detector (vlamionisatiedetector) en die werd ingesteld op 300°C.  
De standaarden en monsters werden met een spuit over een filter gespoten in een schone buis.
Vervolgens werd er 1 μl van elke standaard en elk monster in de GC geïnjecteerd.

Resultaten
Voor dit onderzoek werden er bloedmonsters van alle vier de bestuurder onderzocht door middel
van de gaschromatograaf. Uit de chromatograaf kunnen we retentietijden halen (zie tabel 1) met
daarbij behorende area’s van de ethanol en propanol.

Stof Retentietijden (minuten)

Ethanol 2,983
Propanol 3,214
THF 3,621
Ta b e l 1: r e t e n ti e ti j d e n v a n e t h a n o l, p r o p a n o l e n TH F
Met de area’s van ethanol en propanol kan de ratio worden berekend. De ratio word berekend door
area ethanol te delen door area propanol. Aan de hand van die ratio’s en de bijbehorende Volume
prom EtOH is er een grafiek ontstaan met een lineaire trendlijn (zie figuur 1).

Kalibratielijn van de verdunningsreeks

0.6

0.5
f(x) = 0.238571448621554 x − 0.00539615413533834
0.4 R² = 0.975906785634374
0.3
ratio

0.2

0.1

0
0 0.5 Volume 1prormillage1.5
ethanol 2 2.5
F ig u u r 1: K a l ib ra ti e li j n b e s tu u r d e r B

Met deze kalibratielijn is er een formule opgesteld om het alcoholpromillage te berekenen van
bestuurder B (bekijk de bijlagen voor de berekening van monster B).

Bestuurder Alcoholpromillage
A 0,32
B 0,28
C 1,7
D 0,0289 -> 0
Ta b e l 2: a lc o h o l p r o m il la g e b e s tu u d e r s

Conclusie
De verwachting van het onderzoek is dat bestuurder A geen of een laag alcoholpromille heeft.
Volgens de resultaten heeft bestuurder A een alcoholpromille van 0,32. Bestuurder A is een
beginnend bestuurder en mag niet boven een alcoholpromillage van 0,2 zitten, dat is hier niet het
geval en bestuurder A mocht dus niet de weg op wegens teveel alcoholgebruik. De verwachting voor
bestuurder B was een alcoholpromillage dat aan de hoge kant zou zitten. Uit de resultaten is
gebleken dat bestuurder B een alcoholpromillage van 0,28 had. Dit is niet zoals veracht een hoog
percentage. Bij bestuurder C was de verwachting dat er een alcoholpromillage van 0,8 zou zijn. Na
het onderzoek blijkt het dat het alcoholpromillage 1,7 is. Dit is een stuk hoger dan verwacht en
mocht dus niet achter het stuur. Bij bestuurder D werd er een alcoholpromillage verwacht dat aan de
hoge kant zou zitten. Uit de resultaten blijkt dat het alcoholpromillage kleiner dan 0,0289 is. Dit is dus
afgerond naar 0 en heel wat anders dan de verwachting.

Discussie
Bestuurder A en B waren in een ongeluk terechtgekomen. Bestuurder A had een alcoholpromillage
dat te hoog was om achter het stuur te zitten. Bestuurder B had een alcoholpromillage van 0,28 dit is
lager dan verwacht. Mevrouw mocht wel gewoon de weg op, want het was geen beginnend
bestuurder dus onder een alcoholpromillage van 0,5 mogen gevorderde bestuurders de weg op.

Bestuurder C en D waren aangehouden voor een blaascontrole, hierbij heeft bestuurder C 0,8
promille geblazen. Uit de resultaten van het bloedplasma onderzoek blijkt dat bestuurder C een
alcoholpromillage van 1,7 heeft en dat is dus erg hoog en komt niet overeen met de verwachting van
0,8 promille. Dit grote verschil zou kunnen komen, doordat bestuurder C niet goed heeft geblazen of
er is een fout gemaakt tijden het onderzoek met het pipetteren en/of injecteren bij de
gaschromatograaf. Bestuurder D is het tegenovergestelde van de verwachting. Er is dan
waarschijnlijk veel drugsgebruik in het spel geweest, waardoor het leek of er veel alcohol genuttigd
was.

De R2 moet tussen de 0,95 en de 1 zitten voor een resultaat dat vrijwel betrouwbaar is. Bij ons
onderzoek voor bestuurder B is de R2 0,9759 en zal dus vrijwel betrouwbaar zijn.

Aanbeveling
Bij het onderzoek worden alle bloedplasma samples gedaan door een ander tweetal, hierdoor
kunnen er verschillen zitten in de resultaten. Het tweetal kan de chemicaliën op een andere manier
pipeteren en voeren het onderzoek uit op een andere gaschromatograaf. Om dit onderzoek te
verbeteren zou de standaardreeks door dezelfde persoon gepipetteerd moeten worden en zal ook de
GC door dezelfde persoon moeten geïnjecteerd worden. En dit moet dan voor alle 4 de bloedplasma
samples om zo tot het beste resultaat te komen.

Bijlagen
Berekening alcoholpromillage met ratio (ethanol/propanol)
0,06098 is de ratio van het monster

Y= 0,2386x – 0,0054
0,06098 = 0,2386x – 0,0054
0,06098 + 0,0054 = 0,2386x
0,06638 = 0,2386x
X = 0,278206202

Ratio van de standaardreeks

standaardreeks Volume prom EtOH ratio

1 0 0
2 0,0625 0,052389
3 0,125 0,02552
4 0,25 0,022831
5 0,5 0,108542
6 1 0,20026
7 2 0,49206

Ratio
Monster B 0
MonsterBduplo 0,06098

Bronnenlijst
1. Leveraandoeningen door alcoholgebruik. (2022, 16 juni). Maag Lever Darm
Stichting. https://www.mlds.nl/ziekten/leveraandoeningen-door-alcoholgebruik/
2. Bloed: het transportsysteem van ons lichaam | Sanquin. (n.d.).
https://www.sanquin.nl/. https://www.sanquin.nl/over-bloed
3. Bloed: het transportsysteem van ons lichaam | Sanquin. (n.d.).
https://www.sanquin.nl/. https://www.sanquin.nl/over-bloed
4. Ministerie van Algemene Zaken. (2021, June 23). Met hoeveel alcohol mag ik deelnemen aan
het verkeer? Rijksoverheid.nl. https://www.rijksoverheid.nl/onderwerpen/verkeersveiligheid/
vraag-en-antwoord/mag-ik-met-alcohol-op-deelnemen-aan-het-verkeer
5. https://brightspace.avans.nl/d2l/le/lessons/109689/topics/752445
6. Theorie: gaschromatograaf. (n.d.). Technologie
Carolus. https://technologiecarolus.weebly.com/theorie-gaschromatograaf.html
7. NCBI - WWW Error Blocked Diagnostic.
(n.d.). https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC543875/