LABORATORIO ESTATAL DE SALUD PÚBLICA

SECCION DE FISICOQUIMICOS

MÉTODO DE PRUEBA

DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL
POR ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA)

CLAVE: SFQ-M-010

REVISIÓN: 00
ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

QFB Jorge Alberto QFB. Raquel Alejandra

Leice
Cach Rivero Castillo Rodríguez
Izquierdo alejandro
Coordinación de Laboratorios Dirección
Sección de Fisicoquímicos

R 03/02/2020 CGI-F-001-1
 CLAVE:
LABORATORIO ESTATAL DE SALUD PÚBLICA SFQ-M-010-1
SECCIÓN DE FISICOQUÍMICOS REVISIÓN.:
00
FECHA:
MÉTODO DE PRUEBA 15/12/2022
DETERMINACIÓN DE CLENBUTEROL POR ENSAYO
PÁGINA:
INMUNOENZIMÁTICO (ELISA) 2 de 8

FECHA: 15/12/2022

1. OBJETIVO

Proporcionar información fundamental y organizada para asegurar la obtención de resultados confiables

mediante la aplicación correcta de la técnica para el análisis de las muestras.

2. ALCANCE

Aplica para la Determinación de Clenbuterol en carne e hígado de bovino.

3. DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD

- Objetivo
Determinar el clorhidrato de Clenbuterol en muestras

- Alcance
Aplica para muestras de músculo e hígado de bovino.

- Fundamento
La base de la prueba es la reacción antígeno-anticuerpo. Los pocillos de microtitulación están recubiertos con
anticuerpos de captura dirigidos contra anticuerpos anti-Clenbuterol. La placa de microtitulación ya está
sensibilizada con anticuerpos anti-Clenbuterol, que están unidos por los anticuerpos de captura inmovilizados.
El Clenbuterol libre y conjugado enzimático compite por los sitios de unión de anticuerpos (inmunoensayo
enzimático competitivo). Cualquier conjugado no unido se elimina en un paso de lavado. El conjugado unido
convierte el cromógeno en un producto azul. La adición de la solución de paro conduce a un cambio de color
de azul a amarillo. La medición se realiza fotométricamente a 450 nm. La absorción es inversamente
proporcional a la concentración de Clenbuterol en la muestra.

- Referencia Normativa:

Inserto Kit RIDASCREEN Clenbuterol R1711 para ELISA.

- Términos y Definiciones:

Antígeno: Molécula ajena o tóxica para el organismo (por ejemplo, una proteína derivada de una bacteria),
que una vez dentro del cuerpo, atrae y se une con alta afinidad a un anticuerpo específico.

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Anticuerpo: También conocido como inmunoglobulinas, abreviado Ig, son glucoproteínas del tipo gamma
globulina. (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).

ELISA: Ensayo por inmunoabsorción Ligado a Enzimas. Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno
inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable,
por ejemplo, cambio de color lo que permite medir indirectamente mediante espectrometría el antígeno en la
muestra.

Clenbuterol: El Clenbuterol es un fármaco simpaticomimético indicado para el tratamiento de enfermedades

respiratorias por su efecto broncodilatador. En personas que padecen de desórdenes respiratorios como asma se
emplea como medicamento para facilitarles la respiración. Se le encuentra comúnmente como hidrocloruro de
Clenbuterol. El uso actual del Clenbuterol en humanos es limitado a causa de su vida media prolongada. Sin
embargo, debido a sus notables efectos anabolizantes se utiliza para acelerar el desarrollo del ganado vacuno y
como agente dopante en diferentes disciplinas deportivas.

- Equipo e Instrumentos

Lector de Microplacas (Lector de Elisa) 450 nm.

Centrífuga de 3500 a 4500 rpm.
Vortex de un plato con regulador de agitación.
Homogeneizador.
Baño María o Placa de Calentamiento.
Balanza Granataria con sensibilidad 0.01g
Refrigerador de 2°C a 8°C.
Congelador T°C promedio -20°C.
Termómetro de vidrio con escala de 20°C a 100°C inmersión parcial.
Termómetro de vidrio con escala de -5°C a 20°C.
Micropipeta Unicanal de volumen variable de 2 a 20μL.
Micropipeta Unicanal de volumen variable de 50 a 300μL.
Micropipeta Unicanal de volumen variable de 100 a 1000μL.
Micropipeta Unicanal de volumen variable de 30 a 300μL.
Micropipeta Multicanal de 8 canales volumen variable de 50 a 300μL.
Micropipeta Multicanal de 8 canales volumen variable de 30 a 300μL.

- Materiales
Puntas para pipetas de 2 A 20μL.
Puntas para pipetas de 30 a 300μL.
Reservorios
Guantes de Nitrilo
Cuchillos
Tablas de Picar
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Matraces volumétrico de 50, 100 y 500mL.

Vasos de Precipitado de 50, 100, 250 y 600mL.
Pipetas serológicas de 1, 5 y 10mL.
Auxiliar de pipeteado.
Tubos cónicos de 50 mL para centrífuga.
Espátulas de porcelana.

- Reactivos

Químicos:
Acetonitrilo de 99% de pureza.

Agua Tipo 1
Kit RIDASCREEN Clenbuterol ensayo inmunoenzimático Marca r-biopharm R1711. Con placa de 96
micropozos.
6 estándares (std.1 [0 ppt], std.2 [75 ppt], std.3 [150 ppt], std.4 [300 ppt], std.5 [900 ppt], std.6 [2700ppt]
1 solución Conjugado.
1 solución sustrato/cromógeno
1 solución de paro.
1 solución buffer de lavado.
Solución decolorante R 1699

Patrón de referencia
RIDA Clenbuterol Spiking Solution (Clenbuterol en buffer de lavado) r-biopharm R1799.

- Condiciones Ambientales

Para este método se requiere una temperatura estable de 20-25 oC.

- Procedimiento

Fase Pre- Analítica

Preparación de las disoluciones de Trabajo

Si no se requiere usar el total del buffer de lavado y para alargar su tiempo de vida útil se puede preparar de
la siguiente manera:

Buffer de lavado Madre (Washer buffer Salt Tween) (Clen1/xx)

Disolver el sobre en 100 mL de agua desionizada. Este concentrado, almacenado de 2 a 8°C, caduca
después de aproximadamente de 8 a 12 semanas.

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Buffer de lavado 1+9 (Clen2/xx)

A partir de esta disolución concentrada 10 veces, realizar disoluciones de una parte de esta disolución con 9
partes de agua desionizada (1+9).
Disolver el contenido del sobre en un litro de agua desionizada.
La vida útil del buffer es de 4 a 6 semanas almacenada a 2-8°C.
:

Reactivo 1 Decolorante de muestra (R1699) 1:4 (1+3) (Clen3/xx)

Diluir una parte del reactivo 1 del decolorante de muestra en tres partes de agua desionizada.
Se requiere 350 μL (0.35 mL) para cada muestra. Calcular la cantidad a preparar para el total de muestras
que se van a analizar.

Preparación de la muestra

Músculo de Bovino
Pesar 5 gramos de la muestra y homogeneizar completamente.
Pesar 2 gramos de la muestra homogeneizada en un tubo cónico para centrífuga y añadir 6 mL de
Acetonitrilo y agitar vigorosamente durante 10 segundos.
Agitar 15 minutos boca abajo.
Centrifugar 10 minutos a 3 000 g (rcf) a temperatura ambiente (20 – 25°C).
Transferir 4 mL del sobrenadante a un nuevo vial de vidrio y evapore para completar sequedad bajo una
corriente débil de aire o nitrógeno a 60°C.
Reconstituir el residuo seco en 2 mL de tampón de lavado.
Utilizar 50μL por pocillo en el ensayo.

Hígado de Bovino
Pesar 10 g aproximadamente de la muestra y homogeneizar completamente.
Pesar 3 g de la muestra en un tubo cónico para centrifuga y añadir 1.5 mL de Acetonitrilo (≥ 99%).
Agitar vigorosamente durante 10 segundos.
Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25°C).
Agitar en vórtex durante 10 segundos.
Centrifugar 10 minutos a 4 000 g (rcf) a temperatura ambiente (20 a 25°C).
Transferir 250 μL del sobrenadante a otro tubo cónico de 50 mL.
Añadir 350 μL de la solución decolorante Reactivo 1 diluido 1:4
Agitar en el vórtex brevemente.
Añadir 100 μL de la solución decolorante Reactivo 2 .
Agitar en Vórtex brevemente.
Incubar 5 min a temperatura ambiente (20 a 25°C)
Centrifugar 2 minutos a 12 000 g (rcf) a temperatura ambiente (20 a 25°C).
Añadir 50 mL solución decolorante Reactivo 3
Mezclar cuidadosamente invirtiendo el tubo
Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (20 a 25°C).
Centrifugar 2 minutos a 12 000 g (rcf) a temperatura ambiente (20 a 25°C).
Decantar el sobrenadante en otro tubo cónico de 50 mL para centrífuga.
Utilizar 50 μL por pocillo en el ensayo.
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Fase Analítica

Ensayo inmunoenzimático.

Sacar el kit RIDASCREEN Clenbuterol R-1711 del refrigerador y dejar que alcance la temperatura ambiente.

Insertar el número de pocillos suficientes en la microplaca para todos los estándares, controles y muestras.
Las muestras se realizarán por duplicado.
Registrar las posiciones de los estándares y de las muestras. Anexo 2.
Agregar 50 μL de cada estándar por duplicado a pocillos separados.
Agregar 50 μL de muestra preparada por duplicado en pozos separados.
Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20 a 25°C) y en la oscuridad.
Retirar el líquido de los pocillos y deposítelos en la tarja.
Golpear vigorosamente (tres veces seguidas) el soporte de los pocillos boca abajo sobre papel absorbente
para asegurar una completa extracción de líquido de los pozos.
Depositar en los pocillos 250 μL del buffer de Lavado.
Verter el buffer de lavado en la tarja y golpear vigorosamente (tres veces seguida) el soporte de los pocillos
boca abajo sobre papel absorbente. Repetir dos veces más.
Agregar 50 μL de conjugado a cada pocillo y agitar suavemente la placa manualmente.
Incubar en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente (20 a 25°C).
Retirar el conjugado de los pozos y verterlos sobre la tarja.
Quitar el resto del conjugado golpeando vigorosamente el soporte de los pocillos tres veces sobre papel
absorbente.
Agregar 250 μL del buffer de lavado
Verter el buffer de lavado en la tarja y golpear vigorosamente (tres veces seguida) el soporte de los pocillos
boca abajo sobre papel absorbente. Repetir dos veces más.
Agregar 100 μL de sustrato/cromógeno a cada pocillo.
Mezclar suavemente agitando la placa manualmente.
Incubar durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (20 a 25°C).
Agregar 100 μL de la solución de paro a cada pocillo.
Mezclar suavemente agitando la placa manualmente.
Medir la absorbancia a 450 nm sin filtro después de transcurridos 15 minutos de la adición de la solución de
paro.

Fase Post- Analítica

Inactivar la placa al finalizar la lectura con hipoclorito de sodio al 0,1% y desechar.

Retención de Muestra:
Retener la muestra separada en la parte pre-analítica durante 7 días naturales contados a partir de la fecha
de emisión de resultados.
Transcurrido este período de tiempo inactivar la muestra y desechar la muestra a la basura municipal.
Lavado de Material:
Lavar el material utilizado en la determinación conforme al Procedimiento de aseguramiento de la Calidad
de los Resultados Analíticas. (SFQ-P-005).

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- Cálculos

Ingresar los datos obtenidos de la medición de las absorbancias al Software RIDASOFT Win para obtener
los resultados.

- Interpretación de Resultados

Resultado debajo del Límite de Corte (< 2 000 ppt)= NEGATIVO

Resultado arriba del Límite de corte: (>2 000 ppt)= POSITIVO.

- Reproducibilidad y Repetibilidad
Parámetro Criterio
Repetibilidad
Desviación Estándar Relativa DSR= ≤ 20%
Precisión Intermedia

- Control de Calidad

Análisis por duplicado de cada muestra

Análisis de controles negativos y positivos.
Aplicación de las buenas prácticas de laboratorio.
Instrumentos de medición calibrados y/o verificados.
.

- Validez de la Prueba

Temperatura ambiente de la realización del ensayo= 20 a 25°C

Absorbancia del Estándar 1 (Std con cero de concentración) = >0.8
%DSR entre repeticiones de las inoculaciones en el pozo de la ELISA= ≤20%
Recuperación: 70-130%.

- Bioseguridad

Conforme al Procedimiento para la Evaluación de Riesgo Biológico CGI-P-021

- Anexos

Anexo 1. Listado de claves para las disoluciones de trabajo

Disoluciones Clave
Disolución Buffer de Lavado (100 mL) Clen1/xx
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Disolución Buffer de Lavado (1+9) Clen2/xx

Reactivo 1 Decolorante de Muestra (R1699) Clen3/xx

Anexo 2. Posición de Estándar y muestras en la placa.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Std1 Std5 M2 M6
B Std1 Std5 M2 M6
C Std2 Std6 M3 M7
D Std2 Std6 M3 M7
E Std3 C- M4 M8
F Std3 C- M4 M8
G Std4 M1 M5 C+
H Std4 M1 M5 C+
Std=Estándar C-= Control Negativo M= Muestras. C+= Control Positivo.

4. REGISTROS

A través del Formato Listado Maestro de Documentos Internos (CGI-F-002-1), como se indica en el
Procedimiento Control Información Documentada del SGI (CGI-P-002).

5. DISTRIBUCION

A través del Formato Distribución de Documentos Internos (CGI-F-002-3) y el Formato Historial de Revisiones
(CGI-F-002-4), como lo indica el Procedimiento Control de Información Documentada del SGI (CGI-P-002).

6. CONTROL DE CAMBIOS

A través del Formato Solicitud de Creación, Actualización o Anulación de Documentos Internos (CGI-F-002-2)
como se indica en el Procedimiento Control de Información Documentada del SGI (CGI-P-002).

7. ANEXOS
N/A

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