Universidade Estadual Paulista See ay Faculdade de Ciéncias e Tecnologia u n e Ss p a Presidente Prudente - SP Bioquimica Experimental Prof. Me. Kevin Felipe Ramos PROTEINAS: REAGOES DE COLORAGAO E PRECIPITAGAO CAIQUE MOUREIRA TAVARES GUSTAVO MANOEL MARTINES MILENE KATHLEEN CAVALCANTE DA SILVA PRESIDENTE PRUDENTE 20 / MARGO — 2023 Digitalizado com CamScannerSUMARIO INTRODUGAO. OBJETIVOS PARTE EXPERIMENTAL RESULTADOS E DISCUSSAO CONCLUSOES REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. © 8 lo 'o ln wo Digitalizado com CamScanner‘INTRODUGAO Nas proteinas muitos aminodcidos esto agrupados pelas ligagses peptiqicas formando uma cadela polipeptidica, representado na Figura 7 (CAMPBELL e FARRELL, 2016). O residuo de aminodcido na qual possui o grupg-arfino livre na eae da extremidade é chamado de residuo aminoterminal (N-terminal), outra extremidade que possui o grupo carboxilico livre € chamado de carboxiterminal (C-terminal) (NELSON e COX, 2019). Figura 1: Cadeia do pentapeptideo Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu. OH Ho! njit—e N-d-coo- A Extremidade Extremidade aminoterminal carboxiterminal Fonte: Reproduzido de NELSON e COX, 2018. f ones cus, ay eee As proteinas so responsaveis por controlar a maioria dos proces$os que ‘ocorrem na célula (NELSON e COX, 2019). As fungdes biolégicas exercidas pelas proteinas se d&o por sua ee natural_ ial (SIQUEIRA, 2020). — ~ Existem quatro niveis diferentes que compdem a-estrutura de uma proteina: estrutura primar ajo, Secunda AR cla-€ Guaternara, Os niveis de estruturas esto ilustrados e resumidos na Figura 2> tridimensic A fungao da proteina esta relacionada intrinsecamente com sua estrutura tridimensional. A manutengdo dessa estrutura se dé, em grande parte, pelas pontes de hidrogénio, pontes dissulfeto, fc gas de van.der Waals, interagdes hidrofébicas - ligagbes bnicas (SIQUEIRA, 2020). As diferencas nas estruturas das proteinas resultam_em Sirens propriedades fisico-quimicas como soldbiidade, carga elética, tamanho & massa meee Porém, é através dessas diferentes propriedades que faz com que as Digitalizado com CamScanneree” proteinas em uma mistura possam ser separadas umas das ute fa1OQUIMICA J PRATICA, [s.l: s.n., S.4)). Ve Quando ocorre a perda da estrutura tridimensionata proteina sem que haja © rompimento das ligages peptidicas ha o que chamamos de desnaturagao. Esse fenémeno pode ser reversivel ou ieversivel. Or processo Serd reversivel se a proteina conseguir restaurar sua forma original depois da agao e remogao do agente desnaturante. O proceso seré irreversivel quando o agente desnaturante for muito pp are a agressivo para a proteina ou ficar exposto nele por muito tempo (SIQUEIRA, 202 __ Figura 2: Estruturas das proteinas. Esratura prima: estutura mais - ‘simples da qual odes as demais deriva, E a unido dos aminodcidos pela ligag peptide. Exc glasona, citocina © HAD. formagéode ponles de hcrogént intracadeia. ‘cnalog: aspect helical, caracoreica de protenas elsticas © fieas em resiéuos de gina. ‘Bx colageno o elastin. eestuluta aspecto de barras nlparlelese epresentadas ‘oquemnatcamente na forma de “spt ‘Caracterstiea de protelnasrildase ricas ‘em residuos de proina Ex: una, easco e che de animats Intragées qu ‘gupamentosfuneonais das cadeias Iaterals dos aminoscidos. Ex: Mioglebina. Estrutura quaterndrta: conjunto de cesruturas teri formando dominios (gnendmes). Be ‘Dimer: reatina quinase, hemogicbina.| ‘Qctamero: Acéo Aminclevlinico ‘esidronensse (ALAD). Fonte: Reproduzido de SIQUEIRA, 2020. Stemmandis Jo. A desnaturagao pode ocorrer por fatores fisicos como: temperatura, radiagao, ultrassom e agitagdo mecanica, e também por fatores quimicos como: mudanga d jetais e solventes organicos. Muitos pH, detergentes, acidos, bases, sais, fons de m eS Digitalizado com CamScannerdesses fenémenos geram precipitados devido a ligagéo que certas substancias formam com as cadeias peptidicas (SIQUEIRA, 2020). fons de pesados conseguem formar compostos insoluiveis ao interagirem com ,\ «<3 certas proteinas. O Hg’*, Pb, Cu?* e Fe? reagem com as cargas negativas das proteinas formando um precipitado, essa reagdo é facilitada se o pH estiver acima ) do ponto isoslétrco da protena, Se a proteina estver em pH abaixo do seu ponto si" isoelétrico pode-se utilizar uma base proveniente de um Acido forte para que o fon negativo interaja com a parte positiva das proteinas formando um complexo insoliivel (BIOQUIMICA PRATICA, [s.L: s.n., s.dJ). as Esse método faz com que a proteina perca sua fungéio. de modo irreversivel. As bases do TCA (tricloroacético) sao muito utilizadas para remover proteinas do soro € do leite para analisar a presenga de célclo e magnésio (BIOQUIMICA PRATICA, [s.l: 8.n., sd). oS A ago dos sais em proteinas depende da concentracgéo desses sais. A osmose explica esse processo, na qual a 4gua passaré do meio menos concentrado para o mais concentrado, ou seja, com maior quantidade de sais e menor quantidade de agua. Ao adicionar-se sal no meio ocorre uma competi¢ao pela gua com a _proteinaA-qua migra do meio intracelular para 0 meio extracelular (salting out) onde esto sal-devido a sua alta concentragao, fazendo com que a célula murche (SIQUEIRA, 2020). Ao adicionar mais sal na célula de proteina, a agua ira migrar do meio extracelular para o meio intracelular causando sua lise, pois o meio intracelular estara com uma concentragao maior. Também ha casos em que se adicionam pequenas quantidades de sal para facilitar a solubilidade das proteinas, pois faz com al para facitara solubil ue facilite a interagéo-4gua-proteira (SIQUEIRA, 2020). ed a reads » onbriclrnw ( bivuty | 4 celoneips Ne (x ee pager oF que altera o ponto isoelétrico da proteina, fazendo com que haja a perda da estrutura a Se union 3 tridimensional desta (LUIS, 2012). (pouss ow 4 ee eee Caro age : cause naw Comm voaregt Deno dor clue 4.2.1.3 Precipitacao por reagao com sais de metais pesados Para este processo, misturou-se em um tubo de ensaio 1,0 mL de solugao de proteinase 1,0 mL de acetato de chumbo a 5%. Ao decorrer da reagao, observou- se uma coloragéo turva levemente branca, indicando teste. bositivo para lesfiaturagao da protina~Sendo este, dentre os trés testes de precipitacdo, o que jisJevou tempo para precipitar. Neste método, o reagente precipitante.e desnaturante é o metal pesado Pb”*, sendo que uma das formas ata solubilidade de proteinas, é a adigdo de fons ao meio em que se encontraat (LUIS, 2012). Assim, quando o agente desnaturante é adicionado a solugao, ocorre uma mudanca na estrutura tercidria da mesma, fazendo com que a precipitagao ocorra devido a combinagao do cation metalico com os fragmentos de cargas i provenientes dos residuos de aminodcidos, como Asp’ Glu (-COO: ), das ligagdes Deptidicas presentes na proteina (LUIS, 2012).. Digitalizado com CamScanner16 4.1.2.4 Precipitacao por ago de solventes organicos Neste método, misturou-se em um tubo de ensaio 1,0 mL da solugéo de proteina e aproximadamente 4,0 mL de alcool etilico, agitousse_o tubo e foi observado a formagao de ugrBrectptado levemente bran A precipitagao de proteinas em solventes orgénicos se basela na diferenca de polaridade entre estes compostos. A quantificagao da polaridade de es 6 definida pela constante dielétrica, que mede @ interagdo solvente e soft im que quanto maior a constante maior a interagao entre o solvente e soluto(LIMA, 2014). Quando se tem uma solugo de apenas agua e proteina as interagdes presentes sao as seguintes: dgua-proteina e paerepecin Om 2014). Sabendo que a agua possui uméralla constante dielétrica de 78,36(MEDEIROS e KANIS, 2009), entende-se que nesta condigio a interagao agua-proteina -€ favorecida, fazendo com que a mesma seja soltivel em agua (LIMA, 2014). Porém, 0 etanol, solvente organico utilizado no método, possui uma baixa constante dielétrica de apenas 25,30 (MEDEIROS e KANIS, 2009). Assim, a interago proteina-proteina prevalece sopré a interago etanol-proteina e ocorre a precipitagdo da mesma (LIMA, 2014), 4.3 Reagées de precipitagao sem desnaturagao 4.3. Efeito da forga iénica sobre a solubilidade das proteinas a) Solubi cao (“salting-in”) ‘Ao adicionar em tomo de 4,0 mL de agua destilada com a pipeta volumétrica de 10,0 mL_ao ‘contendo fara de ovo, observou-se a.démora para formagao Fécipitado de proteinasslenominado como globul istrada na Figura 11. Digitalizado com CamScanner17 Figura 11: Precipitado de salting-in. i Fonte: Autoria propria. Além disso, devido a agitagéio com o bastao de vidro, observou-se a formagao i -$@ inicio & adigéio de NaCl ao de espuma na parte superior. Apés cinco minutos, deu-se inicio a adig meio. ficativa baseia- da proteinaz& j sal, logo, ocorre uma diminuigao Essa @digao dé sal ocasionou a dissolug: se no aumento das interacdes das @, consequentemente, aumenta a solubilidade da interagao_proteina-prote) (NELSON e COX, 2019). Outros sais soldveis podem ser ae de que ocorra a redissolugéo da pr Slee exemplo, halet6® (psincaimente cloretos e (0K - brometos), nitgatés e sulfafos (NELSON e COX, 2019), b) Precipitacao (“salting-out”) Para o salting-out, observou-se que ao adicionar a solugao saturada de sulfato de aménio formou-se novamente um precipitado de globulinas, representado na ae a Figura 12. Figura 12: Precipitado de salting-out. Fonte: Autoria propria. Digitalizado com CamScanner/ / azul viol 18 Esse fenémeno 6 justificado devido ao aumento da forga iénica_proveniente roteina. O efeito da de um sal_mui el aumentando as interagdes_proteina: LSON e COX, 2019). adigéio de sais em um meio proteico ¢ ilustrado na Figura 13 (NEI Figura 13: Precipitado de salting-out. ZZ Solubility e 4 eee Hydrate shell Salting in salting out! salt concentration ——> Fonte: Autoria propria. Para o salting-in, tem-se um um meio hidratado em que a solubilidade é Conforme verifica-se 0 aumento da favorecida devido as Interagoes proteina-sal. proteina-proteina é favorecida, ceases a concentragao de sal, a interagao diminuicggo da aqua de hidratagao e, consequentemente, da solubilidade (NELSON e COX, 2019). CONCLUSOES stir da pratica realizada foi possivel caracterizar-as.proteinas da clara do Apai assim como verificou-se a precipitagao das proteinas a precipi oar ovo disponiveis no laborat6rio, com desnaturagao 6 Sem desnaturacao. As (Gin ngs ts comprovaram que certos composts conseguem reagir com certas roteinas presentes.gerando.compostos.coloridos. A reagao osoga ie opin a solugéo de proteinas da clara do ovo corraborou com os dados te6ri605, pols fol visivel a mudanga de coloragdo da reagéo para 0 jolea, resultado da formagao da purpura de RUhemann, Assim como a reagdo Digitalizado com CamScanner19 / ee Fureto ue © complexo formado pela reagaio entre o Cu®* em meio basico com a solugdo de proteinas una colaragao-violeta do meio. As réagdes de _precipitagao) de_proteinas comprovaram que Teagir a solugéio de proteica com 0 TCA, e-fambém com o acetato de chumibo, geram um precipitado que separa as proteinas. O solvente organico etanol farfibem gerou %) ica do mesmo ser inferior a da agua. (cdg : precipitado devido a constante dielé a ea 7 A técnica de sating-in e salting lizada também corroborou com os Onde no salting-in ocasionou a dissolugao da dados encontrados na Tit sal,e proteina devido & maior interagdo entre a proteina e dgua quando se adiciona .ot um precipitado gerado pelo aumento da forga iénica proveniente 0 salting-out fos Dee ee do sal solubilizado na qual aumenta a interagdo proteina-proteina. Portanto visto que os resultados obtidos na pratica corroboram com os dados encontrados na literatura, e os objetivos da pratica foram alcangados com sucesso, péde-se dizer que a pratica foi realizada com sucesso. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS G BIOQUIMICA PRATICA. = [sl: sn, Sd. Disponivel__ em: hito:/ww.repositorio.ufma.br:8080/isouilbitstream/1/445/1/Livro%20de%20Biogul mica%20Pratica.pdf>. : sas RY CAMPBELL, Mary FAR wn . Bioquimica - Tradugao da 8" edigao {ot} morte-americana. Cengage Learing Brasil, 2016. E-book. ISBN 9788522125005. we” ne" FERREIRA, R. 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