Fras vay _ Universidade Estadual Paulista n ‘VAV Faculdade de Ciéncias e Tecnologia unes p Presidente Prudente - SP Bioquimica Experimental Prof. Me. Kevin Felipe Ramos. CINETICA ENZIMATICA CAIQUE MOUREIRA TAVARES GUSTAVO MANOEL MARTINES MILENE KATHLEEN CAVALCANTE DA SILVA PRESIDENTE PRUDENTE 03 / ABRIL - 2023 Digitalizado com CamScannerrc — \ 5 INTRODUGAO 4 5 Ha duas principais condig6es basicas para a manutenoao da vida:, 0 organismo deve ser apto para se auto replicar, e também ser capaz de catalisar reagdes quimicas. Se nao houvesse a presenga da catélise as reagdes quimicas fundamentais para a vida, como a oxidagao da sacarose, nao ocorreriam em tempo adequado para a sustentacdo da vida (NELSON e COX, 2019)-~ Asozimas $80 proteinas que atuam como catalisadores biolégicos, ou seja, elas aumentam a velocidade das reagdes envolvidas nos procassos bioquimicos sem que se altere o equilibrio (SIQUEIRA, 2020). © centro de cada processo bioquimico_séo_as_enzimas. Elas so responsaveis por catalisar cada etapa que transformam e/ou conservam energia quimica. Os estudos da catalise biolégica iniciou-se por volta do fipal-dos anos 1700 a partir da digestéo de carne. Eduard Bi Constatou que a fermentacao de agticar em alcool podia ocorrer por meio de extratos de leveduras ner em 18 devido as moléculas que ficavam ativas mesmo depois de serem retiradas das células (NELSON e COX, 2019). Essa descoberta rendeu para Buchner o Prémio Nobel de Quimica-em_1907 (SIQUEIRA, 2020). Essas moléculas identificadas por Buchner foram denominadas por Frederick W. Kilhne como enzimas (NELSON e COX, 2019). Este termo vem do grego sromos sooo en: dentro; zymos: leveduras, fermento), que significa “em leveduras”(OLIVEIRA, 2017). Todas as enzimas so proteinas globulares, podendo aumentar a velocidade de uma reagéio em até 10 do seu valor de ieee no catalisado. Elas diminuem efetivamente a energia de ativacéo/fazendo assim que ae drasticamente a velocidade das reag6es (Figura 1) (CAMPBELL, 2016). Digitalizado com CamScannerFigura 1: Perfis de energia de uma reacao. Fonte: Reproduzido de CAMPBELL, 2016. As reagées catalisadas por enzimas ocorrem retidas em um bolsao da enzima chamado de sitio ativo, na qual uma molécula a molécula que liga-se nesta regido onde a enzima age é chamada de substrato (Figura 2). 0 sitioativo abrange co substrato, retendo-o da solugao (NELSON e COX, 2019). Figura 2: Sitio ativo de uma enzima. Fonte: Reproduzido de NELSON e COX, 2019. Digitalizado com CamScannerEstudos provenientes de areas da quimica orgénica, fisico-quimica e enzimologia constituem os conhecimentos acerca dos mecanismos de uma reagéo enzimatica. No mecanismo estéo caracterizado os produtos e substrato da reagio, assim como seus intermediérios e as formas enziméticas na qual atuam os ligantes. As constantes de velocidade envolvidas nas reagdes também sdo estimadas. Baseados nos estudos cinéticos, os resultados destes mecanismos, na qual demonstram a velocidade da reago em fungao da concentragdo de substrato, so expressos em modelos matematicos (PINTO, 2019) Normalmente, esquemas de reagdes quimicas so utiizados para expressar 0s modelos mecanisticos, como demonstrado na Figura 3 (PINTO, 2019). Figura 3: Esquema de atividade enzimatica. k, ky E+S = Es = E+P a 1 a Fonte: Reproduzido de (PINTO, 2019). Em que E é a enzima, S o substrato, ES 0 complexo enzima-substrato € k sao as con: de ve ie (PINTO, 2019). Leonor Michaelis e Maud Menten elaboraram em 1913 um modelo amplamente utiizado para diversas enzimas-Eles elaboraram uma equacso da velocidade de uma reag&o com um substrato catalisado por uma enzima. A equacdo de Michaelis-Menten relaciona quantitativamente a velocidade inicial; Vo, a constante de Michaelis, K,. Todos esses termos podem ser medidos experimentalmente. A constante de Michaelis é dada pelo quociente da soma das constantes k,, € ky pela constante k, (K + ke /k;) (NELSON e COX, 2019). Yo] Lo K +S] Este modelo matematico resulta numa fungao hiperbolica retangular com Ky, © Vas como parémetros (Figura 4). A constante Kq possui uma relagéo particular Digitalizado com CamScannercom [S], Kn corresponde ao valor da concentragdo de substrato quando a velocidade inicial 6 igual a metade da velocidade maxima (Vo = Vas, / 2). Ou seja, quanto menor o valor da_constante, menor seré a concentragdo de substrato Se ee necessaria para alcangar 50% de su i i i necesséria para aleangar 60% de sua velocidade maxima, e assim maior a especificidade de ligagdo enzima-substrato (PINTO, 2019). Figura 4: Expresso grafica da equagéo de Michaelis-Menten Curva de Saturagao 125 ‘ordem zero Fonte: Reproduzido de PINTO, 2019. percebe-se pela Figura 4 que ha 3 regides diferentes com relagdo a [S1/ Ke Ocorre uma cinética de primeira ordem: Vial) v=o 0 K, +15) veel K gel ETQ{S) se [S]«K,: vy, @ 7a K{E),{51 Como K[E], € uma constante com dimenséo de tempo", tem-se entéo uma constante de primeira ordem, onde K é a constante de espect cidade (PINTO, 2019). Na regiao de ordem zero: Vv Vaal) _ 0 K+) ' Digitalizado com CamScanneroF Ou seja, a velocidade sera independente de [S] em concentragoes de guibstrato saturante, Jd na regido de ordem mista nao ha simpliicages na equars de Michaelis-Menten, portanto a reacdo ocorre em ordem mista (PINTO, 2019), ve ‘As enzimas possuem uma faixa de pH na qual ocorre sua atividade catalitica maxima, denominado de pH étimo. No sitio ativo hé a presefica das cadeig laterais de aminodcidos que podem atuar como ee ou bases fracas apenas se petmanecerem em certo grau de ionizagéo. A faixede pH em que uma _ encima softe alteracéo em sua atividade pode proporconar um yestioo pare oo de aminoacido envalvido (NELSON e COX, 2019) Susi, ethnic Le As Bnzimas invertases podem sem encontradas em plantas e possuem papel fundamental no ciclo da sacarose, elas agem na quebra desse agiicar transformando-as em hexoses, fazendo com que seja liberado carbono e energia para as células, para o desenvolvimento da respiragao e sintese de compostos (LEITE, et. al. 2011) Estas enzimas também realizam a catélise da(hidrélise da sacarose “em. ° —— licose @ frutose, sendo essa uma reagdo muito exotérmica. Outra fungao das arose a longas distancia, atuando na manuten¢ao, invertases 6 0 transporte de sac: .sma chegue nas células receptoras mesmo quando ha um garantindo que a me: ‘ baixo potencial de sacarose (OLIVEIRA, 2015). = pte still 2. OBJETIVOS ~~ septs ai colecay 2m pestis obpivov ip inética fe usando a invertase como exemplo; ~ Avaliar a atividade enzimatica pela formagao de produtos; Verificar os efeitos do tempo, concentracao de enzima, pH e concentragao © Demonstrar experimentalmente ° vite da ci de substrato sobre a atividade da invertase; Determinar o Km da invertase; « Relacionar a constante Km e os demais parametros cinéticos estudados aos conhecimentos teéricos sobre catalise enzimatica € fisiologia celular? Digitalizado com CamScanner3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1, Materiais e métodos Enzima invertase (0,1 mg proteina.mL"); Tampao citrato/fosfato 0,05 mol." pH 2,0; Tampao acetato 0,05 mol. pH 4,0; Tampao acetato 0,05 mol.L" pH 4,7; ‘Tampao acetato 0,05 mol.L" pH 5,0; ‘Tampao fosfato 0,05 mol.L* pH 6,0; ‘Tampao fosfato 0,05 mol.L* pH 7,0; ‘Tampao fosfato 0,05 mol.L"* pH 8,0; ‘Tampao bicarbonato 0,05 mol.L" pH 9,0; Solugao de sacarose 0,01 mol.L"; Solugdo de sacarose 0,02 mol.L"; Solugdo de sacarose 0,05 mol.L"; = Solugao de sacarose 0,1 mol.L"; - Solugaio de sacarose 0,2 mol.L"; = Solugao de 3,5 di-nitro-salicilato (DNS); Tubo de ensaio (25); Estante para tubos de ensaio (2); Pipeta volumétrica de 10,0 mL (2); Pipeta volumétrica de 2,0 mL (14); Péra de suceao (3); Banho fervente a 100 °C; Pisseta; = Béquer de 250,0 mL (1); Papel higiénico; = Béquer de 50,0 mL. (1); Espectrofotémetro. 3.2, Procedimento experimental As soluges de enzima invertase de Jo_de_3,5- dinitro-saliciato e a_solugéo_de_ sacarese Ome! foram preparadas oro. previamente pelos técnicos de laborat Digitalizado com CamScanner3.2.1. Efeito de concentragao da enzima Inicialmente, enumerou-se 6 tubos de ensaio que foram separados para realizar os testes. Em todos os tubos, com auxilio de uma pipeta volumétrica de 2 mL, adicionou-se 1 mL de tampao acetato 0,05 M de pH 4,7 mL. Em seguida, em cada tubo foi adicionado respectivamente 1,0, 0,9, 0.8, 0,7, 0.6 e 0,5 ml de agua destilada, com uma pipeta volumétrica de 10 mL. Apés, colocou-se em cada tubo cerca de 0,5 mL de solueéo de sacarose 0,2 M, com auxilio de uma pipeta volumétrica de 2 mL. Depois, a partir do segundo colocado em cada tubo respectivamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 € 0,6 mL da solucdo de enzima invertase, com uma pipeta de 2 mL, e em seguida os tubos foram mantidos (sendo o tubo 1 escolhido como branco), foi em repouso em temperatura ambiente por aproximadamente § minulos~—~ ‘Ap6s 0 repouso, foi adicionado em todos os tubos cerca de TmL da solugao de 3,5- dinitro-salicilato (DNS), e posteriormente os tubos foram colocados em banho maria por § minulos em uma temperatura de 100°C/Depois do banho, foi adicionado 6,5 mL de dgua destilada em cada tubo, observou-se a reagdo © os mesmos foram levados para a éspectrofotémetro para leitura da absorbancia em 540 nm e anotado os valores. 3.2.2. Efeito do tempo de incubagao Nesta etapa, enumerou-se 5 tubos de ensaio, onde em cada tubo colocou-se 4 mL da solugdo tampdo acetato 0,05 M de pH 4,7, com auxilio de uma pipeta Volumétrica de 2 mL. Em seguida, com uma pipeta volumétrica de 10 mL, no primeiro tubo foi adicionado 1 mL de agua destilada @ nos tubos restantes foram adicionados 0,8 mL. Logo apés, com uma pips ica de 2 mL, foi colocado tem cada tubo cerca de 0,6 mL da solugdo de sacarose 0,2 M. Posteriormente, com uma pipeta volumétrica de 2 mL, 0,2 mL da solugéo de enzima invertase foi colocada nos tubos 2, 3, 4 € 5, e esperou-se o tempo de incubagao indicado para os tubos 3, 4 e 5 respectivamente: 10 minutos, 20 minutos e 30 minutos. oe Em seguida, com uma pipeta volumétrica de 2 mL, foi adicionado 1 mL da solugdo de 3,5- dimnitro-salicilato em cada tubo, sendo que nos tubos 3, 4 e 5 esperou-se 0 tempo de incubagao. Apés, os tubos foram aquecidos em banho maria de aproximadamente 100 °C_durante § minutos. Depois,com uma pipeta lu Digitalizado com CamScanner10 volumétrica de 10 mL, colocou-se em cada tubo cerca de 6,5 mL de agua destilada, homogeneizou-se 0s tubos e por ultimo os mesmos foram levados para o espectrofotémetro onde foi feito leituras de 540 nm respectivamente—— 3.2.3. Efeito do pH Inicialmente, foram enumerados 8 tubos de ensaio. Nos tubos 1 e 2, foi adicionado, com uma pipeta volumétrica de 2 mL, 1 mL. da solugdo tampéo de Citrato 0,05 M de pH 2,0. No tubo 3, colocou-se 1 mL da solugao tampao de Acetato 0,05 M de pH 4,0, com uma pipeta volumétrica de 2 mL. Ja no tubo 4, com uma pipeta volumétrica de 2 mL, adicionou-se 1 mL da solugdo tampao de Acetato 0,05 M de pH 5,0. No tubo 5, 1 mL da solugao tampao de Fosfato 0,05 M-de pH 6,0 foi acrescentado com uma pipeta volumétrica de 2 mL. Jé no tubo 6, incluiu-se 1 mL da solugdo tampao de Fosfato 0,05 M de .om-uma pipeta volumétrica de 2 mL. No tubo 7, com uma pipet Jumétrica de 2 mL, ja solugao tampao- de Fosfato 0,05 M de pH 8,0 foi acrescida ao tubo. No tubo 8, 1 mL da solugéo tampdo de Bicarbonate 0,05 M de pH 9,0 foi adicionado ao tubo com auxilio de uma pipeta volumétrica de 2 mL. 2 ———Eim seguida, com uma pipeta volumétrica de 10 mL, no primeiro tubo foi adicionado 1 mL de gua destilada e nos tubos restantes foram adicionados 0,8 mL. Depois, com auxilio de uma pipeta volumétrica de 2 mL, em cada tubo mL da solugao de sacarose 0,2 M e posteriormente do tubo 2 a0 8 adicionou-se 0,5 ml {oi adicionado 0,2 ml da solugao de enzima invertase. A seguir, os tubos foram deixados em repouso em tempefatura ambiente por cinco minutos. Mais tarde, com uma pipeta volumétrica de 2 mL, em cada tubo fol adicionado 1 mL da solugao de 35+ dinitro-salicilato, que depois foram Tevados ao banho maria de 100°C por aproximadamente 5 minutos ‘Apés 0 banho, colocou-se em todos 0s tubos, com auxilio de uma pipeta volumétrica de 10 mL, cerca de 6,5 mL de agua destilada, Shdelos mesmos foram 6 a eae homogeneizados € por tiltimo fofam levados para o espectrofotémetro onde foram feitas leituras de 540 nm respectivamente, 3.2.4. Efeito da concentracao do substrato ye Digitalizado com CamScannern Primeiramente, enumerou-se 6 tubos de ensaio. Depois, em cada tubo, foi —= adicionado com auxilio de uma pipeta volumétrica de 2 mL cerca de 1 mL de solugao de tampao acetato 0,05 M de pH 4,7. Em seguida, no primeiro tubo, com —_— uma pipeta volumétrica de 10 mL, foi colocado 1,3 mL de agua destilada, e nos cinco tubos restantes foram colocados 0,3 mL de a om uma pipeta volumétrica de 2 mL, foi adicionado ao tubo 2, cerca de 1 mL_de solugao de sacarose 0,01 M (4 mM). No tubo 3, com auxilio de uma pipeta volumétrica de 2 mL, colocou-se 1 mL da solugao de sacarose 0,02 M (8 mM). J no tubo 4, com uma pipeta volumétrica de 2 mL, adicionou-se 1 mL da solugao de sacarose 0,05 M (20 mM) . Para o tubo 5, foi colocado 1 ml da solugao de sacarose 0,1 M (40 rmM) com auxilio de uma pipeta volumétrica de 2 mL. No tubo 6, fora adicionado 1 mL da solugao de sacarose 0,2 M (80 mM) com uma pipeta volumétrica de 2 ml. tuida, em todos os tubos de ensaio foram adicionados 0,2 mL da solugéo da enzima invertase 0,1 mg/mL. com auxilio de uma pipeta volumétrica de 2 ml. Apés adigao da enzima, os tubos foram deixados em_tepouso_€m_ u-se em cada tubo 1,0 mL da 2a Em seg temperatura ambiente por 5 minutos. Depois, colocot pipeta volumétrica de 2 mL. A seguir, solugdo de 3,5- di-nitro-salicilato com uma °C_por_5 minutos. todos os tubos foram levados ao banho maria de_100 mm uma pipeta volumétrica de 10 ml, em cada tubo foi Posteriormente, cor eem De ee jo 6,5 ml_de agua destilada. Os tubos foram homogeneizados adicionad cffofotémetro para realizarem as leituras em 540 nm seguida levados #0 spe respetivamente,— 4, RESULTADOS E DIScUSSAO 4.4. Efeito da concentracao da enzima Para a primeira andlise, os valores de absorbancia medidos para cada concentragao de invertase s2o ilustrados na Tabela 1 Digitalizado com CamScanner12 Tabela 1: Dados de concentracao de enzima e absorbancia. [Invertase 0,1 mg.mL“]/mL —Absorbancia 01 4,051 0,2 1,883 03 2,224 7 0,4 2,301 05 2,319 Fonte: Autoria propria. ‘Ao plotar os dados de absorbancia em fungao da concentragao de enzima, tem-se 0 grdfico ilustrado na Figura 5. Verificou-se que para valores de concentragaéo de invertase -01_mg.mL" maiores que 0,4 mL_a absorbancia permaneceu estavel (NELSON e COX, 2019). Figura 5: Gréfico da absorbéncia em fungao da concentragao de invertase. 244 . 224 2,04 . ' 184 ve 16-4 14 Absorbancia / 540 nm 1,24 1,04 ot 0.2 03 o4 05 [Invertase 0.1 mg.mL"'] / mL Fonte: Autoria prépria. Digitalizado com CamScanner13 Como justificativa, tem-se_que o aumento da concentracdo de enzima resultaré no aumento da reagdo enzimatica, devido ao favorecimento da formacao do complexo enzima-substrato (CES), quando o meio estiver com substrato em excesso. Porém, na pratica, a concentragao de sacarose permaneceu constante nos cinco tubos de analise. Desta forma, ao aumentar a concantragao de enzima ‘sem aumentar a concentragao de substrato, atingiu-se 0 ponto de saturagao onde a ‘sacarose atuou como limitante da reagdo (NELSON e COX, 2019). ~~ A analise procedeu-se em condigées de meio _alcalino (proveniente do preparo do DNS com NaOH 2,0 mol.L") e quente (aproximadamente 95 °C no banho termostatizado), devido ao favorecimento da reagao entre os produtos da hidrélise da sacarose (dois agticares redutores hexoses) para formagao de enedidis ‘que possuem igaga C=C na estrutura (BOSHAGH, 2021). A partir disso, tem-se a justificativa para utilizagao do DNS, onde o enediol transfere seus elétrons para o 3,5-dinitro-salicilato que € oxidado para 3-amino-5-nitro-salicilato, de colorag4o laranja-marrom forte. A reagao simplificada entre o DNS e 0 acuicar redutor é ilustrada na Figura 6 (BOSHAGH, 2021). Figura 6: Reagdo entre o DNS e 0 produto da hidrélise da sacarose. o_o og 01 on HE osc oa ou ow : cy —— . Hout AK no} —Feaxon ; : ox vo, A on Nl I DNS Fructose 3-Amino-5- Gluconic acid Nitrosalicyic Acid Fonte: Adaptado de BOSHAGH, 2021 A partir da concentragdo de agticar redutor presente no meio, a intensidade da coloragao do 3-amino-5-nitro-salicilato muda, como demonstrado na Figura 7. Por consequéncia, utiizou-se a técnica de colorimetria devido a diferenca de espectrofotémetro foi ajustado para leituras em JA, 1998). intensidade entre as amostras. O. um comprimento de onda’em 540 nm Digitalizado com CamScanner14 Figura 7: Gradiente colorimétrico a partir da concentragao dos aciicares redutores. Fonte: Autoria propria, A justificativa baseia -se que para maioria dos analitos biolégicos, a absorgao ocorre para bandas inferiores (préximas a 270 nm) causando interferéncia na leitura do método colorimétrico. Portanto, para esse ajuste, a medida opera em fungao da absorbancia de luz e da transmitancia da luz no mostrador do aparelho (ZAIA, 1998) 4.2. Efeito do tempo de incubagao Os valores de absorbancia para os tubos de ensaio contendo a enzima invertase em diferentes tempo de incubagdo estao apresentados na Tabela 2 Tabela 2: Dados de tempo de incubagao da enzima e absorbancia. Tempo / min. Absorbancia Zero 0,003 10 1,886 20 2,291 30 2,367 Fonte: Autoria propria. Plotou-se um grafico da absorbancia em fungao do tempo de incubagéo, ou seja, a efetividade da atividade enzimética em relago ao tempo de incubagao. Este grafico pode ser visualizado na Figura 8. Digitalizado com CamScanner15 0 5 10 15 20 25 30 Tempo de incubagao / min. Fonte: Autoria propria. ‘Ao passar do tempo, a invertase ligada a sacarose desloca a formagao para desloca a formagao para <0 minutos a taxa de formaga0 no aumentou muito_-portanto, a atividade enzimatica, foi estabilizada (NELSON e COX, 2019). rer ee ar haibgto mene, a presega da scree en andes ‘lise € é ‘0° , 0s agticares redutores. Porém, verificou-se que para tempo de incubacao maiores we quantidades faz com que a reagdo com a invertase prossiga-se para oxidagdo do DNS. Porém, para o tubo 2, onde no houve tempo de incubacdo, a coloragao foi menos intensa. A justificativa baseia-se que a formagao do complexo enzima-substrato nao foi favorecido e, consequentementt, dos produtos. Logo, nao verificou-se transferéncia de elétrons do enediol para a reagdo redox alterando intensamente a coloragao do meio (NELSON e COX, 2019). ~~ Em contrapartida, para tempos de incubago maiores como foi verificado para os tubos 4 e 5 a coloragao observada fol mais intensa (laranja avermelhado € marrom escuro, respectivamente). A justificativa para a diferenga do gradiente de colorago pontua-se que a formagao do complexo enzima-substrato foi favorecida por mais tempo, ocasionando a hidrélise a formagao das hexoses ondet ~ Digitalizado com CamScanner16 seguidamente, i li ea! , em meio alcalino formou-se o enediol e a transtergritia pela reagao redox mudou-se a coloragao do meio (NELSON e COX, 2019). 4.3. Efeito do pH A Tabela 3 apresenta os valores obtidos de absorbancia dos tubos de ensaio contendo a enzima em diferentes pH. Tabela 3: Dados de absorbancia para pH distinto pH Absorbancia _ 20 0,044 40 4,301 50 1,437 6.0 4,161 7.0 0,936 8,0 0,301 9,0 0,120 _ Fonte: Autoria propria. © gréfico da Figura 9 llustra os resultados da tabela acima, na qual rentes pH. demonstra a relagdo da atividade da enzima nos tampées com difer Digitalizado com CamScanner17 Fig : igura 9: Grafico dos valores de absorbancia em fungdo do pH. 1,5 = Absorbancia / 540 nm 2 am 0,0 pH Fonte: Autoria propria. Percebe-se que em pH 5,0 obteve-se um maior valor de absorbancia do que os demais valores de pH. Isso se deve pelo fato de que cada enzima possui seu pH time, como comentado na introdugso deste relatério, ee valor de pH jeste valor tem-se (6,0) que a enzima possui sua maxima atividade enzimat uma maior concentragao de produtos gerados, possuindo assim um valor maior de absorbancia neste meio. J4 em pH inferior ou superior a 5,0 ocorre uma diminuigéo da absorbancia, devido & menor concentragao de produtos formados gerado pela redugao da atividade enzimética. Essa menor concentragao de produtos é explicada pelos grupos ionizéveis dos residuos de aminodcidos que dificultam a ligagao ‘enzima-substralo (NELSON e COX, 2018). 7 4.4, Efeito da concentracao do substrato Os resultados obtidos para as medidas de absorbancia das amosifas onde variou-se a concentracdo de substrato sao demonstrados na Tabela 4. Digitalizado com CamScanner18 Tabela 4: Dados de concentragao de substrato & absorbancia. ul ‘msacarose] 4lAbsorbancia [Sacarose]/ Absorbancia/ mM 540 nm mm* 2 0,308 0,26 3,24675 8 0,602 0,125 1,66113 20 0,896 0,05 4,11607 40 1,292 0,025 0,77399 80 1,532 0,0125 0,65274 Fonte: Autoria propria, Com os dados da tabela acima plotou-se um grafico da absorbancia obtida em cada, em fungao da concentragao de substrato (Figura 10). de abs em fungao da concentragao de sacarose. Figura 10: Grafico dos valores 18: > B Absorbancia / 540 nm 00 60 80 2 4 [Sacarose] / mM Fonte: Autoria propria. Pelo grafico é possivel observar a relagao entre a concentragao de sacarose nzimatica, Mantendo-se constante a contragao da enzima (substrato) e a atividade er @ B Goncentragao de sacarose corre um aumento na velocidade e aumentando-si Digitalizado com CamScanner19 colisses efetivas entre enzima © da reago, pois a probabilidade de ocorrer jutos (NELSON substrato também aumenta, favorecendo assim 4 e COX, 2019). Porém, para concentragées elevadas de sacarose a velocidade da reagao vai independer da [S], pois [S] >> Kn» devido a concentraga0 wuito Soncentragao de invertase. OU seja, na velocidade zima para que o substrate 5° ligue, pois nao ha mais sitios toda a enzima disponivel esta sendo utiizada (PINTO, 2019). cao dos valores de Ke § ness Para que seja possivel a ‘determina’ psorbancia em fungao do inverso da concentragae dando plotar um grafico do inverso da a izacao dos valores, NOS de substrato (Figura 11), "4 qual owe yon to uma reta (NELSON e COX, 2019)- formagao dos prod de sacarose ser m maxima mais elevada do que a 1s ativos suficientes na el .pao do inverso da concentragao rs0 da absorbancia em fun Figura 11: Grafico inver de sacarose. 35 3,0 25 4UAbsorbancia a 8 0,10 0,15 0,20 0,25 4[Sacarose] / mM" Fonte: Autoria propria. 0,05 0,00 0,05 Digitalizado com CamScanner20 A partir da uses de Michaelis-Menten sabe-se que na metade do valor da velocidade maxima tem-se que K, = [S]. Fazendo assim 0 inverso da equagao de Michaelis-Menten gera-se um grafico duplo reciproco (NELSON e COX, 2019). v_ fs] K +15] max! le equacao de quagao de Michaelis-Menten @ chamada d 680 Ky I Vee Esta forma da e Burra qual produz um grafico linear com uma inclina Lineweaver =—_—e«€_ - —— intersecgao de 1 7 Vas M6 eixo y @ uma intersecgao -1 1 Kn no eixo x, representado na Figura 12 (NELSON e COX, 2019). Figura 12: Gréfico da equagao de Lineweaver-Burk. Ko Inclinagdo = Fonte: Reproduzido de NELSON e COX, 2019. Visto que 0 grafico construido da Figura 11 corresponde 4 uma reta da equagio de Lineweaver-Burk, 6 possivel determinar K,, através da equagao da reta gerada pela tabela da Figura 13 e pela intersegtio no eixo x (NELSON @ COX, 2019). Digitalizado com CamScannera Figura 13: Parametros estatisticos para a reta da equagao de Lineweaver-Burk gerada experimentalmente. A B c D 1] Equation y=a+bx 2| Weight — No Weighting 3] Residual Sum 0,04323 of Squares | 4] Pearson's r 5| Adj. R-Square | 6 J Value | Standard Error (a “intercept > 0.49999 | 0,07794 ay ~~} Siope > 10,7043 0,61079 Fonte: Autoria propria. -0,024, assim: A interseogdo no eixo x correspondeu a um valor de = -0,024> K, = 41,6mM _ F ee ncentragéo_de substrato (sacarose) quando Este valor corresponde a co! valor_corresponde a oe tem-se a metade do valor de velocidade maxima _d: re08 assim como foi previsto a partir da equagao de Michaelis-Menten (PINTO, 2019). Sci, KK Digitalizado com CamScanner8. CONCLUSOES Com base now experimenton raalizados @ rasullados abiidos, phe se conclulr que a cindtica enzination wotte diratamentes multas Influénolas durante 4 ragio, A atividade anzimation aumenta conforma o aumento da concentragto di, q onzima, pordm para lano é necennitlo que A BACHTOBO oslofi on 4700880, que a vatiagto ocorra somonte por parte da concanttagho da anzina, para que nao senda ocorra a limitagto cla range por parte da saoarone, Oxtampo do Inaubagho dum outro falor que lambéry Ini da atividade onzimallen Nolowxe quo no Inelo a Influéncla fol maks seantuad, ndrlo para a roagto nlcangar a atividads luancia no aumento mas ao sor atingido © lompo neco enzimatica, no houve maloros alterngéos do tempo do converato do substrate 6m produto, ou soja, ocorrou uma ostablllzagio da allvidado.— @ pH fol outro fator quo 8d moalrot Influonto na allvidade onzimA citado conformo o aumento do pH, maloros foram 06 valores de monto na atividado enzimatica, eendo esse valor ilica, Como interiormento, absorbéinoia obtidos, indicando clin io om pH igual. a 50. Apés sso valor do pt, a alividado onion diminui, Sinalizando a no formagfio da ligagdo enzima-substralo: A influéncia do substato-Indicou quo 0 aumento. daconcontragao. ds nta a velocidade da reagso alé quo toda onzima néio posoua mals substrato aumenta sitio ativo disponivel para o substrato, assim apds doterminado ponto sua cinésica permanece constants, “th efor voy uu nov eae las pitt aw 6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS BOSHAGH, Fatemeh, Measurement methods of carbohydrates In dark fermentative hydrogen production- A review. International Journal of Hydrogen Enorgy, v. 46, 1n. 47, p. 24028-24050, 2021. Disponivel em: . CAMPBELL, Mary K.; FARRELL, Shawn O. Bioquimlca - Tradugio da 8° odigdo norte-americana. Cengage Learning Brasil, 2016, E-book. ISBN 9788522125005, LEITE, Glauber Henrique Pereira of al. ATIVIDADE DAS ENZIMAS INVERTASES E ACUMULO DE SACAROSE EM CANA-DE-AGUCAR SOB EFEITO DO NITRATO DE POTASSIO, ETEFON E ETIL-TRINEXAPAC, Ciéncias 0 Agrotecnologia Botucatu, ed. 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