Tema 4.

Otros métodos de separación

1. Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)

La SFC es una modalidad híbrida entre la GC y la LC que combina las mejores

características de cada una de ellas y permite separar compuestos que no se podrían separar
por cualquiera de las dos como son los compuestos no volátiles o térmicamente lábiles o los
compuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por CL.

1.1. Concepto de fluido supercrítico: La temperatura crítica de una sustancia es la

temperatura por encima de la cual no puede existir en fase líquida independientemente de la
presión. La presión de vapor a esa temperatura es la presión crítica. Una sustancia por
encima de la temperatura y la presión crítica se denomina fluido supercrítico. En este estado
las sustancias tienen unas propiedades especiales:
- Difusividad más alta que en los líquidos.
- Viscosidades más bajas que en los líquidos.
- Alta capacidad para disolver moléculas grandes no volátiles.
- Los analitos disueltos en ellos pueden ser fácilmente recuperados permitiendo que las
disoluciones se equilibren con la atmósfera a temperaturas bajas.
Un ejemplo de sustancia con la que se puede trabajar como fluido supercrítico es el
dióxido de carbono que es barato e inocuo.

1.2. Instrumentación para la cromatografía de fluidos supercríticos: Los equipos

instrumentales para la SFC son bastante parecidos a los de HPLC aunque se necesitan añadir
dos instrumentos:
- Un horno como el de la cromatografía de gases para mantener la temperatura
termostatizada y mantener la temperatura de la fase móvil.
- Un restrictor o dispositivo de contrapresión para mantener la presión en la columna en
un nivel deseado y para convertir el eluyente de fluido supercrítico a gas y poder
arrastrarlo al detector. Un restrictor típico es un capilar directamente unido al extremo
final de la columna. A veces puede ser una parte integrante de la columna.

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 Un instrumento de SFC está equipado con uno o más microprocesadores que permiten el
control de una serie de variables instrumentales:
- Efectos de la presión: Influye en el factor de retención, k´, debido al incremento de la
densidad de la fase móvil a medida que aumenta la presión. Esto se traduce en un
aumento de la capacidad disolvente de la fase móvil, lo que acorta los tiempos de
elución.
- Fases estacionarias: La SFC se emplea en columnas abiertas más que en columnas
rellenas. Las columnas abiertas son semejantes a las columnas de sílice fundida.
- Fases móviles: La más usada es el dióxido de carbono porque disuelve moléculas
orgánicas no polares, es transparente al UV, inolora, no tóxica, de fácil disponibilidad y
barata. Su temperatura crítica es de 31 ºC y su presión crítica es 72,9 atmósferas.
- Detectores: La principal ventaja de la SFC frente a la HPLC es que se pueden usar
detectores de ionización de llama que es de respuesta universal a compuestos orgánicos,
de elevada sensibilidad y exento de problemas. También se pueden usar espectrómetros
de masas y muchos detectores usados en HPLC como detector de absorción en el UV, en
el IR, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico de llama.

1.3. Comparación de la SFC con otros tipos de cromatografía: Como los fluidos
supercríticos tienen propiedades intermedias entre los gases y los líquidos, la SFC combina
características de las dos cromatografías:
- La FSC, como la GC, es más rápida que la LC debido a que la viscosidad más baja hace
posible obtener velocidades de flujo más elevadas.
- Las velocidades de difusión en FSC son intermedias entre las de gases y las de líquidos.
- Como consecuencia de lo anterior, el ensanchamiento de banda es mayor en los FSC que
en los líquidos, pero menor que en los gases.
- En GC la fase móvil solo sirve para el desplazamiento de zona; en LC además
interacciona con los solutos modificando los factores de selectividad, α. En un fluido
supercrítico el proceso es una volatilización a baja temperatura por lo que compuestos de
alto peso molecular pueden ser eludidas en la columna a temperaturas bajas. Por lo tanto,
se pueden producir interacciones entre las moléculas de soluto y las moléculas de fluido
supercrítico por lo que también existen posibilidades de modificar el factor de
selectividad al cambiar la fase móvil.

1.4. Aplicaciones de la SFC: Se usa para separar productos naturales, fármacos, alimentos,
pesticidas y herbicidas, tensioactivos, polímeros, combustibles fósiles, explosivos y
propelentes.

2. Extracción con fluidos supercríticos (SFE)

Los análisis de materiales complejos a veces requieren la separación del analito. Un

método de separación debe ser rápido, sencillo, barato, sin pérdidas ni degradaciones y no
producir deshechos.

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 Los fluidos supercríticos presentan se pueden usar para separaciones porque presentan las
siguientes ventajas:
- Es un método rápido porque la velocidad de difusión en el fluido es alta y la viscosidad
es baja.
- El poder disolvente puede modificarse por los cambios en la presión y la temperatura.
- Muchos de los fluidos supercríticos son gases a temperatura ambiente por lo que la
recuperación del analito es sencilla.
- Son baratos, no tóxicos e inertes por lo que se pueden eliminar fácilmente.

2.1. Instrumentación: La instrumentación para SFE es sencilla. Consta de:

- Una fuente o depósito de fluido (generalmente una bombona de CO2). El medio de
extracción más frecuente para SFE es el dióxido de carbono (o el dióxido de carbono con
algún modificador orgánico como alcoholes de bajo peso molecular como el metanol)
por ser un medio excelente para especies no polares y un buen medio para especies
polares. Sin embargo, no es un buen medio para especies de elevada polaridad excepto si
se añaden modificadores.
- Una bomba de desplazamiento con presión de 400 atmósferas y un caudal para el
fluido presurizado.
- Una válvula para controlar el flujo del fluido crítico en una cubeta de extracción
calentada.
- Una válvula de salida que lleva a un restrictor de flujo que presuriza fluido y lo
transfiere al interior de un dispositivo de acumulación. Para recoger el analito se
emplean dos técnicas:
o Independiente: Los dos analitos se recogen por inmersión del restrictor en un
volumen del disolvente y dejando que el fluido supercrítico se escape a la atmósfera.
o En línea: El efluente se transfiere a un sistema cromatográfico. Su principal ventaja
es la eliminación de la manipulación de las muestras entre la extracción y la medida
y la potencial mejora de la sensibilidad porque no hay disolución de los analitos.

Un sistema de SFE puede actuar de dos modos:

- Extracción dinámica: Es el más usado. La válvula entre la cubeta de extracción y el
restrictor permanece abierta de manera que el fluido supercrítico fresco llega
continuamente a la muestra y la sustancia extraída fluye continuamente hacia el
recipiente donde se recoge y donde tiene lugar la despresurización.

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- Extracción estática: La válvula entre la cubeta de extracción y el restrictor está cerrada
y la cubeta de extracción está presurizada en condiciones estáticas. Después de un
periodo adecuado la válvula de salida se abre y el contenido de la cubeta se transfiere a
través del restrictor por un flujo dinámico por bombeo de fluido.

3. Electroforesis capilar

Es un método de separación que se basa en la diferente velocidad de migración de las

especies cargadas en una disolución amortiguadora a la que se aplica un campo eléctrico
constante. Se lleva a cabo inyectando una muestra en una disolución tampón alojada en un
tubo estrecho o en un medio soporte poroso y plano. El potencial eléctrico que se aplica a
continuación a la disolución tampón impulsa a los iones de la muestra a migrar hacia un
electrodo u otro. Para que se produzca la separación es imprescindible que el analito tenga
carga y la migración dependerá del tamaño y de la forma del ion y de la viscosidad del medio
por lo que las separaciones se basan en la relación q/m de los analitos.
La electroforesis se puede dar en dos versiones. Electroforesis convencional y
electroforesis capilar. La convencional se lleva a cabo sobre un gel semisólido y poroso
donde se disponen las muestras y tras el paso de la corriente se tiñe. Es muy usada en el
campo de la bioquímica, pero es lenta y difícil de automatizar. La electroforesis capilar
permite separaciones con volúmenes pequeños y con una elevada resolución.

3.1. Velocidad de migración y alturas de plato: La velocidad de migración de un ion, v, en

cm/s, en el seno de un campo eléctrico es el producto de la intensidad de campo eléctrico por
la movilidad electroforética:
V
v=μe E=μe
L
La movilidad electroforética es directamente proporcional a la carga eléctrica del analito e
inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento.
En electroforesis, a diferencia de la cromatografía, la resistencia a la transferencia de masa
no contribuye al ensanchamiento de banda ya que solo está implicada una fase. Por eso solo
hay que considerar la difusión longitudinal. Por lo tanto, para la electroforesis el número de
platos es:
μ V
N= e
2D
donde D es el coeficiente de difusión del soluto.
Para que aumente la resolución hay que aumentar el potencial, ya que es independiente de
la longitud de la columna y aquí radica la diferencia entre la electroforesis convencional y la
capilar. En la convencional el efecto Joule limita el potencial a 500 V mientras que en la
capilar los potenciales varían de 20.000 a 60.000 V por lo que el número de platos es mucho
mayor.

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3.2. Flujo electroosmótico: Al aplicar un potencial elevado a un capilar con un tampón se
produce un flujo electroosmótico por el que el disolvente migra también hacia los electrodos.
La causa es la doble capa eléctrica que se forma en la interfase sílice/disolución. A pH
superiores a 3, los grupos silanol (Si-OH) están ionizados presentando carga negativa por lo
que los cationes del tampón se agrupan sobre la superficie de sílice formando una doble capa
eléctrica. Por el contrario, los cationes son atraídos hacia el cátodo (electrodo -) y como están
solvatados arrastran al resto de la disolución con ellos.
La electroósmosis produce un perfil plano en la disolución, a diferencia del perfil
parabólico del flujo en LC cuyo
origen es la presión. Debido a esto,
el flujo electroosmótico no
contribuye de manera significativa
al ensanchamiento de banda.
La velocidad de flujo electroosmótico es, en general, mayor que las velocidades de
migración de los iones individuales y llega a ser el mecanismo de bombeo de la fase móvil
que arrastra a todas las partículas, tanto las cargadas positiva y negativamente como las
neutras hacia el mismo extremo del capilar de modo que todas pueden detectarse al pasar por
un punto común. De esta forma, la velocidad de un ion es la suma de la velocidad de
migración y de la velocidad de flujo electroosmótico:
v=( μe + μeo ) E
De esta forma el orden de elución es el siguiente: Primero
los cationes rápidos, después los cationes lentos, todas las
especies neutras en una única zona seguidos de los aniones
lentos; finalmente aparecen los aniones más rápidos. Sin
embargo, es posible que a veces la velocidad del fluo
electroosmótico no sea lo bastante grande como para superar la
velocidad a la que se mueven los aniones hacia el ánodo y en
este caso, estas especies se desplazarán hacia el ánodo y no
hacia el cátodo, como se puede observar en la figura adjunta.

El flujo electroosmótico se puede invertir añadiendo un tensoactivo catiónico al tampón

para que se absorba sobre la pared capilar y quede cargada positivamente. Esto se usa para
acelerar la separación de los aniones.
Si se desea evitar el flujo electroosmótico se recubre la pared del capilar con un reactivo
como el trimetilclorosilano, para eliminar los grupos silanol de la superficie.

3.3. Instrumentación en electroforesis capilar: La instrumentación es sencilla: Un capilar

de sílice fundida relleno de un tampón conecta dos recipientes con el mismo tampón y dos
electrodos de platino. La introducción se lleva a cabo por un extremo y la detección por el
otro extremo. Sin embargo, como los volúmenes de muestra son pequeños hay dificultades
en la introducción de la muestra y en la detección.

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- Introducción de la muestra: Los métodos más frecuentes son la inyección
electrocinética y la inyección por presión.
o Inyección electrocinética: Uno de los extremos del capilar se coloca en un recipiente
con la muestra y se aplica un potencial durante un tiempo determinado, entrando la
muestra en el capilar debido a los fenómenos de migración iónica y de flujo
electroosmótico. A continuación, el electrodo se introduce en la disolución tampón.
El problema de esta técnica es que introduce una mayor cantidad de los iones más
móviles.
o Inyección por presión: El extremo del capilar se coloca momentáneamente en un
recipiente con la muestra y se introduce esta por diferencia de presión. Se introducen
todos los iones por igual pero no puede utilizarse en capilares rellenos de gel.
- Detección: Los detectores son semejantes a los de HPLC, aunque hay que tener en
cuenta que, debido a la diferente velocidad de
migración, las bandas atraviesan el detector a
diferentes velocidades por lo que las áreas de
los picos dependen de los tiempos de
retención.
o Métodos de absorbancia: para mejorar la
sensibilidad de las medidas de
absorbancia se han diseñado varios
métodos. Por ejemplo doblar el extremo
del capilar en z, formar una burbuja cerca
del extremo del capilar o depositar en el
extremo del capilar un recubrimiento de
plata reflectante.
o Detección indirecta: Se usa en especies que debido a su pequeña absortividad
molar, resultan difíciles de detectar sin derivatización. Se incorpora un ion
cromóforo al tampón de la electroforesis haciendo que el detector reciba una señal
constante. Cuando el analito desplaza a estos iones la señal desciende y se puede
cuantificar.
o Detección por fluorescencia: Incrementa la sensibilidad y la selectividad para los
analitos fluorescentes.
o Detección electroquímica: Puede ser conductimétrica y amperométrica.
o Detección por espectrometría de masas: Los procesos más empleados son la
electronebulización y el bombardeo por átomos rápidos. Se usa mucho para la
separación de proteínas y fragmentos de ADN.

3.4. Aplicaciones de la electroforesis capilar: Se llevan a cabo de cuatro maneras

diferentes:

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- Electroforesis capilar de zona (CZE): La composición del tampón es constante en toda
la zona de separación por lo que el potencial aplicado hace que los iones migren solo en
función de su propia movilidad y se separen en zonas solapadas o totalmente resueltas.
Se pueden separar iones pequeños o moléculas:
o Iones pequeños: En las separaciones de cationes estos se mueven hacia el cátodo
mientras que en las separaciones de aniones se invierte el flujo electroosmótico
tratando las paredes del capilar con una sal de alquilamonio.Esta es la técnica más
usada en la actualidad para separar iones pequeños.
o Separación de moléculas: Se pueden separar moléculas de pequeño tamaño siempre
que sean cargadas o puedan derivatizarse para dar un ion.

- Electroforesis
capilar en gel (CGE): Se
lleva a cabo en una
matriz polimérica con
estructura de gel poroso cuyos poros contienen una mezcla tampón en la que se lleva a
cabo la separación. El gel más usado es poliacrilamida con un agente de
entrecruzamiento. Se usa para separar proteínas, fragmentos de ADN y oligonucleótidos
que tienen la misma carga, pero distinto tamaño.
- Isotacoforesis capilar (CITP): Las bandas de todos los analitos migran a la misma
velocidad y sirve para separar cationes o aniones, pero no ambos a la vez. La muestra se
inyecta entre dos tampones con diferente movilidad por lo que al proporcional el
potencial inicial los iones migran a una velocidad característica hasta separarse en las
distintas bandas adyacentes. Una vez separados todos migran a la misma velocidad
porque el potencial es menor para las bandas más móviles y mayor para las bandas
menos móviles por lo que la corriente es la misma en todas las zonas del tampón.

- Isoelectroenfoque capilar (CIEF): Se utiliza para la separación de especies anfóteras

como aminoácidos o proteínas que tienen un grupo amino y un grupo ácido.
Los compuestos anfóteros pueden aceptar o ceder un protón y pueden estar en un estado
con una carga positiva y una negativa (estructura de zwitterion). Si las condiciones de
pH del medio son tales que las formas catiónicas son idénticas a las formas aniónicas no
se produce migración, lo cual ocurre en el punto isoleéctrico. En cambio, si el pH
cambia se producirá la migración.
La separación se lleva a cabo en una mezcla de tampones cuyo pH varía a lo largo del
sistema de separación. Una vez realizada la separación es necesario movilizar el
contenido del capilar. Esto se consigue aplicando una diferencia de presión o mediante el
cambio de la disolución del compartimento del electrodo.

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4. Electrocromatografía capilar (CEC)

Es una mezcla de la electroforesis capilar y la HPLC. Al igual que en la electroforesis

capilar, proporciona una alta eficacia en las separaciones; al igual que en la HPLC se utiliza
para la separación de especies no cargadas.
La fase móvil se transporta a través de la fase estacionaria por bombeo ejercido por el
flujoelectroosmótico y no por bombeo mecánico, lo que simplifica el equipo y además
provoca un perfil de flujo plano que mejora la eficacia de la separación.
Hay dos tipos de electrocromatografía capilar:

4.1. Electrocromatografía en columna rellena: Es la menos desarrollada. En ella un

disolvente polar se mueve por el flujo electroosmótico a través de un capilar que contiene un
relleno típico de HPLC en fase inversa. Las separaciones dependen de la distribución de los
analitos entre la fase móvil y la fase estacionaria líquida retenida por el relleno.

4.2. Cromatografía capilar electrocinética micelar (MECC o MEKC): Sirve para separar
solutos no cargados de bajo peso molecular. En esta técnica se introduce un tensioactivo
(dodecil sulfato de sodio) en el que se forman micelas que son una fase estable que es capaz
de alojar compuestos no polares en el interior solubilizando así compuestos apolares.
Cuando se introduce una muestra los distintos componentes se distribuyen entre la fase
acuosa y el interior de la micela en función de la polaridad: si la polaridad del soluto es alta
se queda en la fase acuosa y si es baja se queda en la micela.

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 Cuestiones teóricas del tema 4
(Se ha respetado la numeración del libro de texto)

29.1. Definir:
a- Temperatura y presión críticas de un gas: La temperatura crítica es aquella por encima
de la cual una sustancia no puede estar en estado líquido independientemente de la
presión. A la presión de vapor de una sustancia a su temperatura crítica se le llama presión
crítica.
b- Fluido supercrítico: Es una sustancia que está a una temperatura y presión por encima
del punto crítico.

29.2. ¿Qué propiedades de un fluido supercrítico son importantes en cromatografía?

Son tres: La densidad, el coeficiente de difusión y la viscosidad.

29.3. ¿En qué se diferencian los equipos instrumentales de la cromatografía de fluidos

supercríticos de los de HPLC y los de GC?
El equipo es parecido al de HPLC pero con dos diferencias:
- Un horno como el de la cromatografía de gases para mantener la temperatura
termostatizada y mantener la temperatura de la fase móvil.
- Un restrictor o dispositivo de contrapresión para mantener la presión en la columna en
un nivel deseado y para convertir el eluyente de fluido supercrítico a gas y poder
arrastrarlo al detector. Un restrictor típico es un capilar directamente unido al extremo
final de la columna. A veces puede ser una parte integrante de la columna.

29.4. Describir el efecto de la presión en los cromatogramas obtenidos en cromatografía

de fluidos supercríticos.
Influye en el factor de retención, k´, debido al incremento de la densidad de la fase móvil
a medida que aumenta la presión. Esto se traduce en un aumento de la capacidad disolvente
de la fase móvil, lo que acorta los tiempos de elución.

29.5. Citar alguna de las propiedades más ventajosas del CO 2 supercrítico como fase
móvil para las separaciones cromatográficas.
Es una sustancia que disuelve moléculas orgánicas no polares, es transparente al UV,
inolora, no tóxica, de fácil disponibilidad y barata. Su temperatura crítica es de 31 ºC y su
presión crítica es 72,9 atmósferas

29.6. Comparar la cromatografía de fluidos supercríticos con los otros métodos de

cromatografía en columna.

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- La FSC, como la GC, es más rápida que la LC debido a que la viscosidad más baja hace
posible obtener velocidades de flujo más elevadas.
- Las velocidades de difusión en FSC son intermedias entre las de gases y las de líquidos.
- Como consecuencia de lo anterior, el ensanchamiento de banda es mayor en los FSC que
en los líquidos, pero menor que en los gases.
- En GC la fase móvil solo sirve para el desplazamiento de zona; en LC además
interacciona con los solutos modificando los factores de selectividad, α. En un fluido
supercrítico el proceso es una volatilización a baja temperatura por lo que compuestos de
alto peso molecular pueden ser eludidas en la columna a temperaturas bajas. Por lo tanto,
se pueden producir interacciones entre las moléculas de soluto y las moléculas de fluido
supercrítico por lo que también existen posibilidades de modificar el factor de
selectividad al cambiar la fase móvil.

29.7. Predecir el efecto que tendrán sobre el tiempo de elución en SFC con dióxido de
carbono supercrítico las siguientes modificaciones:
a- Incremento de la velocidad de flujo (a temperatura y presión constantes): Hará que el
tiempo de retención sea menor
b- Incremento de la presión (a temperatura y caudal constantes): Hará que el tiempo de
retención sea mayor.
c- Incremento de la temperatura (a presión y caudal constantes): Hará que el tiempo de
retención sea menor porque disminuye la viscosidad.

29.8. Para las extracciones con fluidos supercríticos, diferenciar entre:

a- Procesos de recogida en línea e independiente: En línea el efluente es transferido a un
sistema cromatográfico mientras que en el independiente se deja que el fluido supercrítico se
escape a la atmósfera.
b- Extracciones estáticas y dinámicas: En las estáticas la válvula entre la cubeta y el
extractor está cerrada y en las dinámicas está abierta.

29.9. Citar las ventajas de las extracciones con fluidos supercríticos sobre las
extracciones con líquidos.
Los fluidos supercríticos presentan se pueden usar para separaciones porque presentan las
siguientes ventajas:
- Es un método rápido porque la velocidad de difusión en el fluido es alta y la viscosidad
es baja.
- El poder disolvente puede modificarse por los cambios en la presión y la temperatura.
- Muchos de los fluidos supercríticos son gases a temperatura ambiente por lo que la
recuperación del analito es sencilla.
- Son baratos, no tóxicos e inertes por lo que se pueden eliminar fácilmente.

29.10. ¿Cómo se recuperan los analitos después de una extracción con fluidos
supercríticos?

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 Se pueden recoger de dos formas: recogida independiente y recogida en línea.

30.1. ¿Qué es el flujo electroosmótico? ¿Por qué tiene lugar?

Al aplicar un potencial elevado a un capilar con un tampón se produce un flujo
electroosmótico por el que el disolvente migra también hacia los electrodos. La causa es la
doble capa eléctrica que se forma en la interfase sílice/disolución. A pH superiores a 3, los
grupos silanol (Si-OH) están ionizados presentando carga negativa por lo que los cationes del
tampón se agrupan sobre la superficie de sílice formando una doble capa eléctrica. Por el
contrario, los cationes son atraídos hacia el cátodo (electrodo -) y como están solvatados
arrastran al resto de la disolución con ellos.

30.2. Sugiera una manera de evitar el flujo electroosmótico.

Si se desea evitar el flujo electroosmótico se recubre la pared del capilar con un reactivo
como el trimetilclorosilano, para eliminar los grupos silanol de la superficie.

30.3. ¿Por qué el pH afecta a las separaciones de aminoácidos por electroforesis?

Porque cada aminoácido tiene un punto isoeléctrico diferente.

30.4. ¿Cuál es el fundamento de la electroforesis capilar de zona?

Un disolvente polar se mueve por el flujo electroosmótico a través de un capilar que
contiene un relleno típico de HPLC en fase inversa.

30.5. ¿Cuál es el fundamento de la cromatografía capilar electrocinética micelar? ¿En

qué se diferencia de la electroforesis capilar de zona?
Sirve para separar solutos no cargados de bajo peso molecular. En esta técnica se
introduce un tensioactivo (dodecil sulfato de sodio) en el que se forman micelas que son una
fase estable que es capaz de alojar compuestos no polares en el interior solubilizando así
compuestos apolares.
Cuando se introduce una muestra los distintos componentes se distribuyen entre la fase
acuosa y el interior de la micela en función de la polaridad: si la polaridad del soluto es alta
se queda en la fase acuosa y si es baja se queda en la micela.

30.6. Describa una ventaja importante de la cromatografía capilar electrocinética

micelar con respecto a la cromatografía líquida convencional.
Sirve para separar solutos no cargados de bajo peso molecular.

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