第十三章 DNA 的 复 制 和 修 复

生 物 体 的 遗 传 信 息 储 存 在 DNA 中 ， 并 通 过 DNA 的 复 制

由 亲 代 传 给 子 代 。 在 子 代 的 生 长 发 育 中 遗 传 信 息 自 DNA
转 录 给 RNA ， 然 后 翻 译 成 蛋 白 质 以 执 行 各 种 生 命 功 能 ，
使 后 代 表 现 出 与 亲 代 相 似 的 遗 传 性 状 。

1958 年 ， F.Crick 提 出 中 心 法 则 ：

（ 1 ） 以 原 DNA 分 子 为 模 板 ， 合 成 出 相 同 DNA 分 子 的 过

程 。

（ 2 ） 以 某 一 段 DNA 分 子 为 模 板 ， 合 成 出 与 其 序 列 对

应 的 RNA 分 子 的 过 程 。

（ 3 ） 以 mRNA 为 模 板 ， 根 据 三 联 密 码 规 则 ， 合 成 对 应

蛋 白 质 的 过 程 。
中 心 法 则 揭 示 了 生 物 体 内 遗 传 信 息 的 传 递 方 向 。
图

DNA 生 物 合 成 有 两 种 方 式 ： DNA 复 制 和 反 转 录

DNA 体 内 复 制 涉 及 ： 原 核 、 真 核 生 物 的 染 色 体 、 细 菌
质 粒 （ 环 状 ， 双 链 ） 、 真 核 细 胞 器 DNA （ 线 粒 体 、 叶 绿
体 ） 、 病 毒 （ 双 链 ， 环 状 ）
DNA 的 体 外 复 制 ： 分 子 克 隆 。

1
 第 1 节 DNA 的 复 制

1 、 DNA 半 保 留 复 制

1953 年 ， Watson 和 Crick 在 提 出 DNA 双 螺 旋 结 构 模 型 时 就 推

测 DNA 可 能 按 照 半 保 留 机 制 进 行 自 我 复 制 。

P321 图 191 Watson 和 Crick 提 出 的 DNA 双 螺 旋 复 制 模 型

在 复 制 过 程 中 ， 首 先 亲 代 双 链 解 开 ， 然 后 每 条 链 作
为 模 板 ， 在 其 上 合 成 互 补 的 子 代 链 ， 结 果 新 形 成 的 两
个 子 代 DNA 与 亲 代 DNA 分 子 的 碱 基 顺 序 完 全 一 样 ， 而 且
每 个 子 代 DNA 分 子 中 有 一 条 链 完 全 来 自 亲 代 DNA ， 另 一
条 是 新 合 成 的 。

15
1958 年 ， Meselson 和 Stahl 用 N 标 记 E.coli. DNA ， 证 明 了 DNA 的

复 制 是 半 保 留 复 制 。

P322 图 19-2 DNA 的 半 保 留 复 制 。

1963 年 ， Cairns 用 放 射 自 显 影 法 ， 在 显 微 镜 下 首 次 观 察

到 完 整 的 正 在 复 制 的 E. coli. 染 色 体 DNA 。

P323 图 19-3

3
H- 脱 氧 胸 苷 标 记 E.coli. DNA ， 经 过 将 近 两 代 时 间 ， 用 溶

菌 酶 消 化 细 胞 壁 ， 将 E.coli. DNA 转 至 膜 上 ， 干 燥 ， 压 感 光
胶 片 ， 3H 放 出 β 粒 子 ， 还 原 银 ， 在 光 学 显 微 镜 下 观 察 。
用 这 种 方 法 证 明 了 大 肠 杆 菌 染 色 体 DNA 是 一 个 环 状 分 子 ，
并 以 半 保 留 的 形 式 进 行 复 制 。

DNA 的 半 保 留 复 制 可 以 说 明 DNA 在 代 谢 上 的 稳 定 性 。

经 过 多 代 复 制 ， DNA 的 多 核 苷 酸 链 仍 可 以 保 持 完 整 ， 并
存 在 于 后 代 而 不 被 分 解 掉 。

2
2、 复 制 起 点、 单 位 和 方 向

DNA 的 复 制 是 在 起 始 阶 段 进 行 控 制 的 ， 一 旦 复 制 起 始 ，
它 就 会 继 续 下 去 直 到 整 个 复 制 子 完 成 复 制 。

1、 复 制 起 点

复 制 起 点 是 以 一 条 链 为 模 板 起 始 DNA 合 成 的 一 段 序 列 。

有 时 ， 两 条 链 的 复 制 起 点 并 不 总 是 在 同 一 点 上 （ 如 D 环
复 制 ） 。
在 一 个 完 整 的 细 胞 周 期 中 ， 每 一 个 复 制 起 点 只 使 用
一 次 ， 完 成 一 次 复 制 过 程 。

多 数 生 物 的 复 制 起 点 ， 都 是 DNA 呼 吸 作 用 强 烈 （ 甲 醛

变 性 实 验 ） 的 区 段 ， 即 经 常 开 放 的 区 段 ， 富 含 A.T 。

★ 环 状 DNA 复 制 起 点 的 确 定 方 法

P325 图 19-6

★ 复 制 起 点 的 克 隆 和 功 能 分 析 — — 重 组 质 粒 转 化 法

大 肠 杆 菌 的 复 制 起 点 oriC 区 1Kb 的 重 组 质 粒 在 转 化 子 中

的 复 制 行 为 与 其 染 色 体 一 样 ， 受 到 严 密 控 制 ， 每 个 细
胞 只 有 1-2 个 拷 贝 ， 用 核 酸 外 切 酶 缩 短 oriC 克 隆 片 段 的 大
小 ， 最 后 得 到 245bp 的 基 本 功 能 区 ， 携 带 它 的 质 粒 依 然 能
够 自 我 复 制 ， 拷 贝 数 可 以 增 加 到 20 以 上 ， 这 说 明 发 动
复 制 的 序 列 在 245bp 的 基 本 功 能 区 ， 而 决 定 拷 贝 数 的 序 列
在 基 本 功 能 区 之 外 和 1Kb 之 间 。

鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 的 起 点 位 于 一 段 296bp 的 DNA 片 段 上 ，

与 大 肠 杆 菌 的 复 制 起 始 区 有 86% 同 源 性 ， 而 且 有 些 亲 缘
关 系 较 远 的 细 菌 ， 其 复 制 起 点 在 大 肠 杆 菌 中 亦 能 起 作
用 。 因 此 ， 复 制 起 始 区 的 结 构 可 能 是 很 保 守 的 。
起 始 序 列 含 有 一 系 列 对 称 的 反 向 重 复 和 某 些 短 的 成
簇 的 保 守 序 列 。

3
 2、 复 制 单 位

复 制 子 (Replicon) ： Genome 能 独 立 进 行 复 制 的 单 位 ， 每 个 复

制 子 都 含 有 一 个 复 制 起 点 。

原 核 生 物 的 染 色 体 和 质 粒 、 真 核 生 物 的 细 胞 器 DNA 都

是 环 状 双 链 分 子 ， 它 们 都 是 单 复 制 子 ， 都 在 一 个 固 定
的 起 点 开 始 复 制 ， 复 制 方 向 大 多 数 是 双 向 的 ， 少 数 是
单 向 复 制 。 多 数 是 对 称 复 制 ， 少 数 是 不 对 称 复 制 （ 一
条 链 复 制 后 才 进 行 另 一 条 链 的 复 制 ） 。

环 状 DNA 的 复 制 眼 象 θ ， 称 θ 形 复 制 。

真 核 生 物 的 染 色 体 DNA 是 线 形 双 链 分 子 ， 含 有 许 多 复

制 起 点 ， 因 此 是 多 复 制 子 ， 每 个 复 制 子 约 有 100-200Kbp 。

病 毒 DNA 多 种 多 样 ， 环 状 或 线 形 ， 双 链 或 单 链 ， 但 都

是 单 复 制 子 。

3、 复 制 方 向

定 点 起 始 ， 复 制 方 向 大 多 数 是 双 向 的 （ 等 速 进 行 或
异 速 进 行 ） ， 形 成 两 个 复 制 叉 ， 少 数 是 单 向 复 制 ， 形
成 一 个 复 制 叉 。

★ 用 放 射 自 显 影 实 验 判 断 DNA 的 复 制 方 向 及 速 度

低 放 射 性 3H- 脱氧胸苷

高 放 射 性 3H- 脱 氧 胸 苷

a. 单 向
b. 双向等速 三种结果图形
c. 双 向 异 速

E.coli. 的 一 个 温 度 敏 感 株 ， 在 42℃ 时 ， 能 使 DNA 在 完 成

复 制 后 ， 不 再 开 始 新 的 复 制 过 程 ， 而 在 25℃ 时 复 制 功 又

能 能 恢 复 。

4
 4 、 DNA 的 几 种 复 制 方 式

（ 1 ） 、 直 线 双 向 复 制

单 点 ， 双 向 ， T7

多 点 ， 双 向 ， 真 核 染 色 体 DNA

（ 2 ） 、 θ 型 复 制 ： 环 状 双 链 DNA ， 单 向 或 双 向 （ E

.coli. ）

（ 3 ） 、 滚 环 复 制 ： 环 状 单 链 DNA ， Φx174

（ 4 ） 、 D 环 复 制 ： 线 粒 体 、 叶 绿 体 DNA

（ 5 ） 、 多 复 制 叉 复 制 ：

第 一 轮 复 制 尚 未 完 成 ， 复 制 起 点 就 开 始 第 二 轮 的 复
制 。

在 E.coli. 富 营 养 时 ， 可 采 取 多 复 制 叉 复 制 方 式 。 E.coli.

DNA 的 复 制 最 快 可 达 50Kb/min ， 完 全 复 制 需 40min ， 富 营 养

时 ， 20min 分 裂 。 而 真 核 染 色 体 要 6-8 小 时 。

3 、 与 DNA 复 制 有 关 的 酶 及 蛋 白 质 因 子

目 前 已 发 现 30 多 种 酶 及 蛋 白 质 因 子 参 与 DNA 复 制

5
（ 1 ） DNA 的 聚 合 反 应 和 聚 合 酶

DNA 生 物 合 成 5 ，
→ 3 ，
， 化 学 合 成 3 ，
→ 5 ，

1 、 DNA 聚 合 反 应 必 备 的 条 件

⑴ DNA 聚 合 酶

⑵ DNA 模 板 ( 反 转 录 时 用 RNA 模 板 )

⑶ 引物 (DNA 、 RNA 或 蛋 白 质 )

⑷ 4 种 dNTP

⑸ Mg2+

2、 聚 合 反 应 过 程 及 特 点

总 反 应 式 ：
n1dATP DNA pol . dAMP

n2dGTP +DNA dGMP DNA+ （ n1+n2+n3+n4 ） PPi

n3dCTP Mg2+ dCMP

n4dTTP dTMP

P329 图 19-10 P330 图 19-11

在 链 的 延 长 过 程 中 ， 链 的 游 离 3 ，
- 羟 基 ， 对 进 入 的 脱

氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸 α 磷 原 子 发 生 亲 核 攻 击 ， 生 成 3 ，
.5 ， -
磷 酸 二 酯 键 ， 并 脱 下 焦 磷 酸 。
DNA 聚 合 酶 的 反 应 特 点 ：

⑴ 以 4 种 dNTP 为 底 物

⑵ 反 应 需 要 接 受 模 板 的 指 导 ， 不 能 催 化 游 离 的 dNTP 的

聚 合 。

6
 ⑶ 反 应 需 有 引 物 3 ，
- 羟 基 存 在

⑷ 链 生 长 方 向 5 ，
→ 3 ，

⑸ 产 物 DNA 的 性 质 与 模 板 相 同

3 、 由 DNA 聚 合 酶 催 化 的 几 种 DNA 聚 合 类 型

P331 图 19-12

（ 1 ） 发 荚 环 结 构 ： 加 入 单 链 DNA 作 为 模 板 和 引 物 ， 3
＇
羟 基 端 回 折 成 引 物 链 。

（ 2 ） 末 端 延 伸 聚 合 ： 加 入 双 链 DNA 作 为 模 板 和 引 物 ，

3’ 末 端 突 出 作 为 模 板 。

（ 3 ） 分 枝 型 和 切 口 平 移 型 聚 合 ： 加 入 双 链 DNA ， 聚

合 发 生 在 切 口 或 末 端 单 链 区 。

（ 4 ） 环 形 聚 合 ： 加 入 带 引 物 的 环 形 DNA 作 为 模 板 。

4 、 E.coli DNA 聚 合 酶

（ 1 ） 、 E.coli. DNA pol.I （ Kornberg 酶 ， 400 copy/cell ）

单 体 酶 ， 分 子 量 109Kd ， 含 一 个 Zn2+ ， 每 个 细 胞 中 含 400

个 DNA pol.Ⅰ
催 化 活 性 ：

5 ，
→ 3 ，
聚合活性

3 ，
→ 5 ，
外切活性

5 ，
→ 3 ，
外切活性

7
 用 蛋 白 水 解 酶 将 DNA pol.Ⅰ 部 分 水 解 可 得 ：

大 片 段 （ Klenow ） ， 75Kd ， 活 性 ： 5 ，
→ 3 ，
聚 合 活 性 、

3 ，
→ 5 ，
外 切 活 性 。

小 片 段 ， 36Kd ， 活 性 ： 5 ，
→ 3 ，
外 切 活 性 （ 只 作 用 于

双 链 DNA 的 碱 基 配 对 部 分 ， 切 除 修 复 ） 。
Klenow 片 段 的 用 途 ：

a 补 齐 DNA 3 ，
隐 缩 未 端

b. 标 记 DNA 片 段 未 端

c ． cDNA 合 成 第 二 链

d ． d DNA 测 序

（ 2 ） 、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ （ 100 copy/cell ）

单 体 酶 ， 分 子 量 120Kd

催 化 活 性 ： 5 ，
→ 3 ，
聚 合 ( 活 性 很 低 )

3 ，
→ 5 ，
外 切

可 能 在 DNA 的 修 复 中 起 某 中 作 用 。

（ 3 ） 、 E.coli.DNA pol.Ⅲ （ 复 制 酶 ， 10-20 copy/cell ）

寡 聚 酶 ， 全 酶 由 10 种 共 22 个 亚 基 组 成 ， α 、 ε 和 θ

三 种 亚 基 组 成 核 心 酶 。

P334 表 10-3

8
 DNA pol.Ⅲ 是 合 成 新 链 DNA 主 要 的 酶 ， 又 称 复 制 酶 (Replicase)

Pol.Ⅲ 的 5 ，
→ 3 ，
外 切 酶 活 性 只 作 用 于 单 链 DNA 。

P334 表 19-2 E.coli 三 种 DNA 聚 合 酶 的 性 质 比 较

★DNA 聚 合 酶 有 6 个 结 合 位 点

⑴ 模 板 DNA 结 合 位 点

⑵ 引 物 结 合 位 点

⑶ 引 物 3 ，
-OH 位 点 、 反 应 位 点

⑷ 底 物 dNTP 结 合 位 点

⑸5 ，
→ 3 ，
外切位点 (pol.Ⅱ 没 有 )

⑹3 ，
→ 5 ，
外切位点 ( 校 正 )

5 、 真 核 生 物 DNA 聚 合 酶

P334 表 19-4 真 核 生 物 DNA 聚 合 酶

真 核 DNA 聚 合 酶 一 般 不 具 备 外 切 活 力 ， 可 能 由 另 外 的

酶 在 DNA 复 制 中 起 校 正 功 能 。

⑴ DNA 聚 合 酶 α ， 多 亚 基 ， 功 能 与 E.coli. pol.Ⅲ 类 似 ， 是 真

核 DNA 复 制 酶 。

⑵ DNA 聚 合 酶 β ， 主 要 在 DNA 损 伤 的 修 复 中 起 作 用 。

⑶ DNA 聚 合 酶 γ ， 从 线 粒 体 得 到 ， 可 能 与 线 粒 体 DNA

的 复 制 有 关 。

9
 ⑷ DNA 聚 合 酶 δ ， 特 点 ： 有 3 ，
→ 5 ，
外 切 活 力 。

（ 2 ） 引 物 酶 或 RNA 聚 合 酶 （ 引 发 酶 ）

细 胞 内 ， DNA 的 复 制 需 要 引 物 （ DNA 或 RNA ） ， 引 物 酶

或 RNA 聚 合 酶 可 合 成 6-10 个 碱 基 的 RNA 引 物 。

★DNA 复 制 为 什 么 要 用 RNA 引 物 ？ （ 为 什 么 DNA 聚 合 酶

要 用 引 物 ， RNA 聚 合 酶 不 需 要 引 物 ？ ）
P338
⑴ 从 模 板 复 制 最 初 几 个 核 酸 时 ， 碱 基 堆 集 力 和 氢 键
都 较 弱 ， 易 发 生 错 配
⑵ 新 复 制 的 最 初 几 个 核 苷 酸 ， 没 有 与 模 板 形 成 稳 定
双 链 ， DNA 聚 合 酶 的 5 ， → 3 ， 校 对 功 能 难 发 挥 作 用 。

（3 ） 解 螺 旋 酶

大 肠 杆 菌 的 解 螺 旋 酶 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 与 rep 蛋 白 共 同 作 用 ，

将 DNA 两 条 链 解 开 。

解 螺 旋 酶 I 、 II 、 III 沿 着 模 板 链 的 5’→3’ 方 向 随 着 复 制 叉

的 前 进 而 移 动 ， 而 rep 蛋 白 则 在 另 一 条 模 板 链 上 沿 3’→5’ 方
向 移 动 。

（ 4 ） DNA 旋 转 酶

属 DNA 拓 扑 异 构 酶 Ⅱ ， 可 引 入 负 超 螺 旋 ， 消 除 复 制 叉

前 进 时 带 来 的 扭 曲 张 力 。

拓 扑 异 构 酶 分 两 类 ： I 和 II ， 广 泛 存 在 于 原 核 生 物 和

真 核 生 物 。

拓 扑 异 构 酶 I 使 DNA 的 一 条 链 发 生 断 裂 和 再 连 接 ， 反

10
应 无 须 供 给 能 量 ， 主 要 集 中 在 活 性 转 录 区 ， 与 转 录 有
关 。

拓 扑 异 构 酶 Ⅱ 使 DNA 的 两 条 链 同 时 断 裂 和 再 连 接 ， 当

它 引 入 超 螺 旋 时 需 要 由 ATP 供 给 能 量 。 分 布 在 染 色 质 骨
架 蛋 白 和 核 基 质 部 ， 与 复 制 有 关 。

（ 5 ） 单 链 DNA 结 合 蛋 白 （ SSB ）

复 制 叉 上 的 解 螺 旋 酶 ， 沿 双 链 DNA 前 进 ， 产 生 单 链 区 ，

大 量 的 单 链 DNA 结 合 蛋 白 与 单 链 区 结 合 ， 阻 止 复 性 和 保
护 单 链 DNA 不 被 核 酸 酶 降 解 。

（ 6 ） DNA 连 接 酶 （ ligase ）

连 接 双 链 DNA 上 的 切 口 。

大 肠 杆 菌 连 接 酶 只 能 在 模 板 上 连 接 DNA 缺 口 。 T4DNA

ligase 即 可 连 接 粘 性 末 端 的 DNA ， 又 可 连 接 平 齐 末 端 的 双
链 DNA 。

E.coli. 和 其 它 细 菌 的 DNA ligase 以 NAD 为 能 源 ， 动 物 细 胞 和

噬 菌 体 DNA ligase 以 ATP 为 能 源 。

（ 7 ） DNA 复 制 的 拓 扑 结 构

P338-339

4 、 DNA 的 半 不 连 续 复 制

P336 图 19-15 DNA 的 半 不 连 续 复 制

11
 DNA 聚 合 酶 催 化 的 方 向 是 5 ，
→ 3 ，
。

前 导 链 ：
滞 后 链 ：
1968 年 ， 发 现 冈 崎 片 段 。 长 度 ：

细 菌 ： 1Kb-2Kb ， 相 当 于 一 个 顺 反 子 的 大 小 。

真 核 ： 100-200bp ， 约 等 于 一 个 核 小 体 DNA 的 长 度 。

5 、 DNA 复 制 过 程 （ E.coli. ）

P342 图 19-17 大 肠 杆 菌 的 复 制 体 结 构 示 意 图

1、 复 制 的 起 始

引 发 ： 当 DNA 的 双 螺 旋 解 开 后 ， 合 成 RNA 引 物 的 过 程 。

引 发 体 ： 引 物 合 成 酶 与 各 种 蛋 白 质 因 子
（ dnaB 、 dnaC 、 n 、 n ＇ n ＇ ＇ I ） 构 成 的 复 合 体 ， 负 责 RNA
引 物 的 合 成 。

引 发 体 沿 着 模 板 链 5’→3’ 方 向 移 动 （ 与 冈 崎 片 段 合 成 的

方 向 正 好 相 反 ， 而 与 复 制 叉 移 动 的 方 向 相 同 ） ， 移 到
一 定 位 置 上 即 可 引 发 RNA 引 物 的 合 成 。

E.coli.DNA 复 制 原 点 ori C ， 由 245bp 组 成 ， 三 组 13bp 重 复 序 列

（ 近 5 ，
端 处 ） ， 四 组 9 bp 重 复 序 列 （ 另 一 端 处 ） 。

大 肠 杆 菌 复 制 原 点 起 始 复 制 所 需 蛋 白 质 ：
DNaA 在 原 点 处 打 开 双 螺 旋

DNaB 使 DNA 解 旋

DNaC DNaB 结 合 在 原 点 所 需
Hu 刺 激 起 始

12
 引 物 酶 （ DNaG） 合成 RNA 引 物

SSB 结 合 单 链 DNA

RNA 聚合酶 促进DNaA 活 性

旋转酶 松驰 DNA 扭 曲 应 力

20 个 DnaA 结 合 在 四 组 9bp 重 复 区 ， 形 成 起 始 复 合 物 ，

DNA 环 绕 此 复 合 物 。

三 组 13bp 重 复 区 依 次 变 性 ， 产 生 开 放 型 复 合 物 。

DnaB （ 在 DnaC 协 助 下 ） 与 开 放 复 合 物 结 合 ， 进 一 步 解

链 。

2 、 DNA 链 的 延 长 反 应

前 导 链 只 需 要 一 个 RNA 引 物 ， 后 随 链 的 每 一 个 冈 崎 片

段 都 需 要 一 个 RNA 引 物 ， 链 的 延 长 反 应 由 DNA pol.Ⅲ 催 化 。

复 制 体 ： 在 DNA 合 成 的 生 长 点 （ 既 复 制 叉 上 ） 分 布 着

许 多 与 复 制 有 关 的 酶 和 辅 助 因 子 ， 它 们 在 DNA 的 模 板 链
形 成 离 散 的 复 合 物 ， 彼 此 配 合 进 行 高 度 精 确 的 复 制 ，
称 为 复 制 体 。

复 制 体 沿 着 复 制 叉 方 向 前 进 就 合 成 DNA 。

3 、 RNA 引 物 的 切 除 及 缺 口 补 齐

DNA polⅠ 的 5 ，
→ 3 ，
外 切 活 力 ， 切 除 RNA 引 物 。

DNApolⅠ 的 5 ，
→ 3 ，
合 成 活 性 补 齐 缺 口 。

13
 4 、 DNA 切 口 的 连 接

DNA ligase ， 动 物 、 真 核 由 ATP 供 能 ， 原 核 由 NAD 供 能 。

5 、 DNA 合 成 的 终 止

环 状 DNA 、 线 性 DNA ， 复 制 叉 相 遇 即 终 止 。

 小 结 ：

⑴ DNA 解 螺 旋 酶 解 开 双 链 DNA 。

⑵ SSB 结 合 于 DNA 单 链 。

⑶ DNA 旋 转 酶 引 入 负 超 螺 旋 ， 消 除 复 制 叉 前 进 时 带 来
的 扭 曲 张 力 。

⑷ DNA 引 物 酶 ( 在 引 发 体 中 ) 合 成 RNA 引 物 。

⑸ DNA pol.Ⅲ 在 两 条 新 生 链 上 合 成 DNA 。

⑹ DNA polⅠ 切 除 RNA 引 物 ， 并 补 上 DNA 。

⑺ DNA ligase 连 接 一 个 冈 崎 片 段 。

DNA 复 制 过 程 中 ， 聚 合 酶 对 dTTP 和 dUTP 的 分 辨 能 力 高 ,

有 少 量 dUTP 掺 入 DNA 链 中 ， 此 时 ， U- 糖 苷 酶 、 AP 内 切 酶 、
DNA polⅠ 、 DNA ligase 共 同 作 用 ， 切 除 尿 嘧 啶 ， 接 上 正 确 的
碱 基 。

6 、 真 核 生 物 DNA 的 复 制 P343

1、 复 制 起 点 和 单 位

真 核 生 物 染 色 体 DNA 是 多 复 制 子 ， 有 多 个 复 制 起 点 ，

14
可 以 多 点 起 始 ， 分 段 进 行 复 制 。 每 个 复 制 子 大 多 在 100-

200bp 之 间 ， 比 细 菌 染 色 体 DNA （ 单 复 制 子 ） 小 得 多 。

★ 试 验 证 据 ： 5- 氟 脱 氧 胞 苷 标 记

真 核 生 物 DNA 复 制 叉 移 动 的 速 度 此 原 核 的 慢 ， 如 哺 乳

动 物 复 制 叉 移 动 的 速 度 每 分 钟 1-3Kb ， 细 菌 每 分 钟 5Kb 。
真 核 生 物 染 色 体 全 部 复 制 完 成 前 ， 起 点 不 再 从 新 开
始 复 制 。 而 在 快 速 生 长 的 原 核 生 物 中 ， 起 点 可 以 连 续
发 动 复 制 。 真 核 生 物 在 快 速 生 长 时 ， 可 采 用 更 多 的 复
制 起 点 同 时 复 制 。 如 黑 腹 果 蝇 ， 早 期 胚 胎 细 胞 中 相 邻
复 制 起 点 的 平 均 距 离 为 7.9kb ， 而 在 培 养 的 成 体 细 胞 中 ，
平 均 距 离 为 40kb ， 成 体 细 胞 只 利 用 一 部 分 复 制 起 点 。

2、 复 制 过 程 中 组 蛋 白 的 装 配

核 小 体 的 结 构 （ 200bp 左 右 ）

在 真 核 生 物 的 复 制 子 上 ， 亲 代 染 色 体 的 核 小 体 被 逐
个 打 开 ， 组 蛋 白 以 完 整 的 八 聚 体 形 式 直 接 转 移 到 子 代
DNA 的 前 导 链 上 ， 新 合 成 的 组 蛋 白 与 后 随 链 组 装 成 核 小
体 。 因 此 ， DNA 的 复 制 是 半 保 留 的 ， 而 组 蛋 白 则 是 全 保
留 的 。
★ 试 验 证 据 ： 环 己 酮 亚 胺 抑 制 组 蛋 白 合 成 ， 电 子 显
微 镜 下 观 察

3 、 真 核 生 物 DNA 复 制 的 终 止

端 粒 ： 一 段 DNA 序 列 与 蛋 白 质 形 成 的 一 种 复 合 体 ， 是

真 核 细 胞 染 色 体 末 端 所 特 有 的 结 构 。
功 能 ：

⑴ 保 证 线 性 DNA 的 完 整 复 制

⑵ 保 护 染 色 体 末 端
⑶ 决 定 细 胞 寿 命 ， 胚 系 细 胞 含 端 粒 酶 ， 体 细 胞 不 表
达 端 粒 酶 。

15
 端 粒 （ telomeres ） 分 布 于 线 性 真 核 染 色 体 未 端 。 酵 母 端

粒 约 100bp 的 重 复 序 列 ， 形 式 为 ： 5 ，
（ TxGy ） n3 ，
(AxCy) n ， x
和 y 一 般 为 1—4 。

端 粒 末 端 的 重 复 序 列 ， 通 过 端 粒 酶 （ telomerase ） 将 其 加

到 染 色 体 末 端 。

端 粒 酶 含 有 RNA 和 蛋 白 质 （ 起 DNA 聚 合 酶 的 作 用 ） 两

种 组 分 ， RNA 分 子 约 159b ， 含 有 多 个 CyAx 重 复 序 列 ， RNA

分 子 用 作 端 粒 TxGy 链 合 成 的 模 板 。 端 粒 酶 是 一 种 反 转 录
酶 ， 它 只 合 成 与 酶 自 身 的 RNA 模 板 互 补 的 DNA 片 段 。
人 类 体 细 胞 的 端 粒 长 度 ， 随 个 体 年 龄 增 加 而 逐 渐 缩
短 。 细 胞 每 分 裂 一 次 ， 端 粒 缩 短 50-200bp ， 短 至 1-4Kbp 时 ，
细 胞 就 停 止 分 裂 。 若 能 重 建 端 粒 ， 则 细 胞 可 以 永 远 分
裂 。 恶 性 肿 瘤 细 胞 端 酶 表 达 多 。

⑴ 杂 交
图

⑵ 聚 合
图

⑶ 转 位 再 杂 交
图

⑷ 进 一 步 聚 合
图

⑸ 非 标 准 GG 配 对

16
7 、 DNA 复 制 的 调 控

8 、 DNA 复 制 的 真 实 性

《杨 岐 生 》 P144

生 物 体 DNA 复 制 具 有 高 度 真 实 性 ， 复 制 107-1011 碱 基 对 ,

只 有 一 个 错 误 碱 基 。

碱 基 对 的 自 由 能 通 常 在 4-13KJ/mol ， 这 样 的 自 由 能 相 当

于 平 均 参 入 100 个 核 苷 酸 就 可 能 出 现 一 次 错 配 ， 仅 靠
Watson-Crick 双 螺 旋 的 碱 基 配 对 原 则 ， 突 变 率 将 高 达 10-2 。

1 、 DNA 聚 合 酶 对 碱 基 的 选 择 作 用

酶 的 被 动 论 ： 不 同 的 核 苷 酸 在 聚 合 位 点 停 留 时 间 不
同 ， 正 确 的 dNTP 能 长 时 间 停 留 ， 而 参 与 聚 合 。 DNA 聚 合
酶 能 依 照 模 板 的 核 苷 酸 ， 选 择 正 确 的 dNTP 掺 入 引 物 末 端 。

酶 积 极 参 与 理 论 ： DNA 聚 合 酶 对 正 确 与 错 误 的 核 苷 酸 ，

不 仅 亲 和 性 不 同 ， 而 且 将 它 们 插 入 DNA 引 物 端 的 速 度 也
不 同 。

动 力 学 校 正 阅 读 ： 在 新 的 磷 酸 二 酯 键 未 形 成 时 ， dNTP

结 合 在 酶 与 模 板 — 引 物 复 合 物 的 聚 合 位 点 上 ， DNA 聚 合
酶 能 识 别 正 确 与 错 误 的 dNTP 。

DNA 聚 合 酶 对 底 物 的 识 别 作 用 ， DNA 聚 合 酶 有 两 种 底

物 ， 一 种 是 DNA 模 板 — 引 物 ， 另 一 种 是 dNTP 。

DNA 聚 合 酶 先 识 别 DNA 模 板 和 引 物 的 3 ，
未 端 ， 再 识 别

底 物 dNTP ， 是 一 种 有 序 的 识 别 过 程 。

17
 2 、 3， → 5， 外 切 活 性 的 校 正 阅 读

E. coli. DNA pol.Ⅰ 和 pol.Ⅲ 有 3 ，

→ 5 ，
外 切 活 性 ， 可 删 除 错 误 插

入 的 核 苷 酸 。

缺 失 3 ，
→5 ，
外 切 活 性 的 E. coli. DNA pol.Ⅰ ， 催 化 DNA 合 成 时 ，

出 现 错 误 的 几 率 增 高 5-50 倍 。 因 此 ， 3 ， → 5 ， 外 切 活 性 可
以 使 DNA 复 制 的 真 实 性 ， 提 高 1-2 个 数 量 级 。
图

3 、 影 响 DNA 合 成 真 实 性 的 因 素

⑴ 高 浓 度 NMP( 如 3 ，
-AMP, 5 ， -GMP)

NMP 竞 争 酶 的 dNTP 结 合 位 点 ， 抑 制 3 ，
→ 5 ，
外 切 活 性。

⑵ 某 一 种 dNTP 浓 度 银 高 , 可 使 引 物 3 ，
末 端 离 开 外 切 活

性 中 心 。

⑶dNTP 一 般 与 二 价 阳 离 子 结 合 成 活 化 形 式 ， Mg2+ 为 主

要 的 二 价 阳 离 子 。 当 用 其 它 二 价 阳 离 子 （ 如 Mn2+ ） 代 替
Mg2+ 时 ， 会 改 变 酶 的 主 体 结 构 ， 影 响 聚 合 活 性 和 3 ， → 3 ，
外 切 活 性 。

4 、 为 什 么 用 RNA 引 物

⑴ 从 模 板 复 制 最 初 几 个 核 酸 时 ， 碱 基 堆 集 力 和 氢 键
都 较 弱 ， 易 发 生 错 配
⑵ 新 复 制 的 最 初 几 个 核 苷 酸 ， 没 有 与 模 板 形 成 稳 定
双 链 ， DNA 聚 合 酶 的 5 ， → 3 ， 校 对 功 能 难 发 挥 作 用 。

18
 第 2 节 DNA 的 损 伤 及 修 复

DNA 的 损 伤 ， 《 罗 纪 盛 》 P428

一 些 物 理 化 学 因 子 如 紫 外 线 、 电 离 辐 射 和 化 学 诱 变
剂 均 可 引 起 DNA 损 伤 ， 破 坏 其 结 构 与 功 能 。 然 而 在 一 定
条 件 下 ， 生 物 机 体 能 使 这 种 损 伤 得 到 修 复 。

紫 外 线 可 使 DNA 分 子 中 同 一 条 链 上 两 个 相 邻 的 胸 腺 嘧

啶 碱 基 之 间 形 成 二 聚 体 （ TT ） ， 两 个 T 以 共 价 键 形 成 环
丁 烷 结 构 。 CT 、 CC 间 也 可 形 成 少 量 二 聚 体
（ CT 、 CC ） ， 使 复 制 、 转 录 受 阻 。

P346 图 19-22

细 胞 内 具 有 一 系 列 起 修 复 作 用 的 酶 系 统 ， 可 以 除 去
DNA 上 的 损 伤 ， 恢 复 DNA 的 双 螺 旋 结 构 。 目 前 已 知 有 4 种
酶 修 复 系 统 ： 光 复 活 、 切 除 修 复 、 重 组 修 复 、 SOS 反 应
诱 导 的 修 复 ， 后 三 种 不 需 要 光 ， 又 称 为 暗 修 复 。

1、 光 复 活

1949 年 已 发 现 光 复 活 现 象 ， 可 见 光 （ 最 有 效 400nm ） 可

激 活 光 复 活 酶 ， 此 酶 能 分 解 由 于 紫 外 线 形 成 的 嘧 啶 二
聚 体 。 高 等 哺 乳 动 物 没 有 此 酶 。

P347 图 19-23 紫 外 线 损 伤 的 光 复 活 过 程

A 形成嘧啶二聚体 B. 光复合酶结合于损伤部位 C 酶 被 可 见 光 激 活

D. 修 复 后 释 放 酶

19
2、 切 除 修 复

P348 图 19-24 DNA 损 伤 的 切 除 修 复 过 程

在 一 系 列 酶 的 作 用 下 ， 将 DNA 分 子 中 受 损 伤 部 分 切 除 ，

并 以 完 整 的 那 一 条 链 为 模 板 ， 合 成 出 切 去 部 分 ， DNA 恢
复 正 常 结 构 。
I、 结 构 缺 陷 的 修 复 ：

（ 1 ） 核 酸 内 切 酶 识 别 DNA 损 伤 部 位 ， 在 其 附 近 将 其

切 开 。

（ 2 ） 核 酸 外 切 酶 切 除 损 伤 的 DNA 。

（ 3 ） DNA 聚 合 酶 修 复 。

（ 4 ） DNA 连 接 酶 连 接 。

图
II 、 无 嘌 呤 无 嘧 啶 — — 碱 基 缺 陷 或 错 配 — — 脱 碱 基
（ N- 糖 苷 酶 ） ：

甲 基 磺 酸 甲 酯 可 使 鸟 嘌 呤 第 7 位 氮 原 子 烷 基 化 ， 活 化

β— 糖 苷 键 ， 造 成 脱 嘌 呤 作 用 ； 酸 也 能 使 DNA 脱 嘌 呤 。

DNA 复 制 时 ， DNA 聚 合 酶 对 dTTP 和 dUTP 分 辨 力 不 高 ， 有

少 量 dUTP 掺 入 DNA 链 。 细 胞 中 的 尿 嘧 啶 -N- 糖 苷 酶 可 以 切

掉 尿 嘧 啶 。 腺 嘌 呤 脱 氨 形 成 次 黄 嘌 呤 时 也 可 以 被 次 黄
嘌 呤 -N- 糖 苷 酶 切 掉 次 黄 嘌 呤 。
对 于 无 嘌 呤 无 嘧 啶 的 损 伤 有 两 种 修 复 方 法 ：

（ 1 ） AP 核 酸 内 切 酶 切 开 ， 核 酸 外 切 酶 切 除 ， DNA 聚

合 酶 修 复 ， DNA 连 接 酶 连 接 。

（ 2 ） 插 入 酶 插 入 正 确 碱 基

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3、 重 组 修 复

P349 图 19—25 重 组 修 复 的 过 程

切 除 修 复 发 生 在 DNA 复 制 之 前 ， 而 当 DNA 发 动 复 制 时

尚 未 修 复 的 损 伤 部 位 ， 可 以 先 复 制 ， 再 重 组 修 复 。

在 重 组 修 复 过 程 中 ， DNA 链 的 损 伤 并 未 除 去 。

重 组 修 复 至 少 需 要 4 种 酶 组 分 。

重 组 基 因 recA 编 码 一 种 分 子 量 为 40000 的 蛋 白 质 ， 它 具

有 交 换 DNA 链 的 活 力 。 RecA 蛋 白 被 认 为 在 DNA 重 组 和 重 组

修 复 中 均 起 关 键 作 用 。

recB 、 recC 基 因 分 别 编 码 核 酸 外 切 酶 V 的 两 个 亚 基 。

此 外 ， 修 复 合 成 还 需 要 DNA 聚 合 酶 和 连 接 酶 。

4 、 诱 导 修 复 和 应 急 反 应 （ SOS 反 应 ）

诱 导 修 复 是 细 胞 DNA 受 到 严 重 损 伤 或 DNA 复 制 系 统 受

到 抑 制 的 紧 急 情 况 下 ， 为 求 得 生 存 而 出 现 的 一 系 列 诱
导 性 修 复 。
SOS 反 应 诱 导 的 修 复 系 统 包 括 避 免 差 错 的 修 复 （ 无 差
错 修 复 ） 和 倾 向 差 错 的 修 复 。

避 免 差 错 的 修 复 ： SOS 反 应 能 诱 导 光 复 活 切 除 修 复 和

重 组 修 复 中 某 些 关 键 酶 和 蛋 白 质 的 产 生 ， 从 而 加 强 光
复 活 切 除 修 复 和 重 组 修 复 的 能 力 ， 这 属 于 避 免 差 错 的
修 复 。

倾 向 差 错 的 修 复 ： SOS 反 应 还 能 诱 导 产 生 缺 乏 校 对 功

能 的 DNA 聚 合 酶 ， 它 能 在 DNA 损 伤 部 位 进 行 复 制 而 避 免
了 死 亡 ， 可 是 却 带 来 了 高 的 突 变 率 ， 这 属 于 倾 向 差 错

21
的 修 复 。

SOS 反 应 是 由 RecA 蛋 白 和 LexA 阻 遏 物 相 互 作 用 引 起 的 。

RecA 蛋 白 不 仅 在 同 源 重 组 中 起 重 要 作 用 ， 而 且 它 也 是
SOS 反 应 的 最 初 发 动 因 子 。 在 有 单 链 DNA 和 ATP 存 在 时 ，
RecA 蛋 白 被 激 活 而
表 现 出 蛋 白 水 解 酶 的 活 力 ， 它 能 分 解
λ 噬 菌 体 的 阻 遏 蛋白 和 LexA 蛋 白 。 LexA 蛋 白 （ 22Kd ） 许 多
基 因 的 阻 遏 物 ， 当 它 被 RecA 的 蛋 白 水 解 酶 分 解 后 就 可 以
使 一 系 列 基 因 得 到 表 达 其 中 包 括 紫 外 线 损 伤 的 修 复 基
因 uvrA 、 uvrB 、 uvrC （ 分 别 编 码 核 酸 内 切 酶 的 亚 基 ） 以 及
recA 和 lexA 基 因 本 身 ， 还 有 单 链 结 合 蛋 白 基 因 ssb ， 与 λ 噬
菌 体 DNA 整 合 有 关 的 基 因 himA 、 与 诱 变 作 用 有 关 的 基 因
umuDC ， 与 细 胞 分 裂 有 关 的 基 因 sulA ， ruv ， 和 lon ， 以 及 一
些 功 能 不 清 楚 的 基 因 dinA ， B ， D ， F 等 。
SOS 反 应 广 泛 存 在 于 原 核 生 物 和 真 核 生 物 ， 它 是 生 物
在 极 为 不 利 的 环 境 中 求 得 生 存 的 一 种 基 本 功 能 。

然 而 癌 变 有 可 能 也 是 通 过 SOS 反 应 造 成 的 ， 因 为 能 引

起 SOS 反 应 的 作 用 剂 通 常 都 具 有 致 癌 作 用 ， 如 X- 射 线 ，
紫 外 线 ， 烷 化 剂 ， 黄 曲 霉 素 等 ， 而 某 些 不 能 致 癌 的 诱
变 剂 并 不 引 起 SOS 反 应 ， 如 5- 溴 尿 嘧 啶 。 目 前 ， 有 关 致
癌 物 的 一 些 简 便 检 测 方 法 就 是 根 据 SOS 反 应 原 理 而 设 计
的 ， 既 测 定 细 菌 的 SOS 反 应 。

第 3 节 RNA 指 导 的 DNA 合 成 （ 反 转 录 ）

反 转 录 （ reverse transcription ） ： 以 RNA 为 模 板 ， 合 成 DNA 。

与 通 常 转 录 过 程 中 遗 传 信 息 流 从 DNA 到 RNA 的 方 向 相 反 。

1970 年 ， Temin 和 Baltimore 分 别 从 致 癌 RNA 病 毒 （ 劳 氏 肉 瘤

病 毒 和 鼠 白 血 病 病 毒 ） 中 发 现 发 反 转 录 酶 。

致 癌 RNA 病 毒 是 一 大 类 能 引 起 鸟 类 、 哺 乳 类 等 动 物 白

血 病 、 肉 瘤 以 及 其 它 肿 瘤 的 病 毒 。 这 类 病 毒 侵 染 细 胞
后 并 不 引 起 细 胞 死 亡 ， 却 可 以 使 细 胞 发 生 恶 性 转 化 。
经 过 改 造 后 可 以 作 为 基 因 治 疗 的 载 体 。

22
 放 线 菌 素 D （ 抑 制 以 DNA 为 模 板 的 反 应 ， 复 制 和 转 录 ）

能 抑 制 致 癌 RNA 病 毒 的 复 制 ， 可 见 致 癌 RNA 病 毒 的 复 制
过 程 必 然 涉 及 DNA 。

Bader 用 嘌 呤 霉 素 （ puromycin ） 来 抑 制 静 止 细 胞 蛋 白 质 的

合 成 ， 发 现 这 种 细 胞 仍 能 感 染 劳 氏 肉 瘤 病 毒 （ RSV ） ，
证 实 反 转 录 酶 是 由 反 转 录 病 毒 带 入 细 胞 的 ， 而 不 是 感
染 后 在 宿 主 细 胞 中 新 合 成 的 。

1、 反 转 录 酶

由 一 个 α 亚 基 和 一 个 β 亚 基 组 成 ， 含 有 Zn2+ ， 具 有 三 种

酶 活 力 。

（ 1 ） RNA 指 导 的 DNA 聚 合 酶 活 力 （ 以 RNA 为 模 板 ， 合

成 一 条 互 补 的 DNA ， 形 成 RNA—DNA 杂 种 分 子 ） 。

（ 2 ） RNase H 酶 活 力 ， 水 解 RNA—DNA 杂 种 分 子 中 的 RNA ，

可 沿 3’→5’ 和 5’→3’ 两 个 方 向 起 外 切 酶 作 用 。

（ 3 ） DNA 指 导 的 DNA 聚 合 酶 活 力 。

模 板 ： RNA 或 DNA

以 自 身 病 毒 类 型 的 RNA 为 模 板 时 ， 该 酶 的 反 转 录 活 力

最 大 ， 但 是 带 有 适 当 引 物 的 任 何 种 类 的 RNA 都 能 作 为 合
成 DNA 的 模 板 。

引 物 ： RNA 或 DNA

底 物 ： dNTP

二 价 阳 离 子 ： Mg2+ 或 Mn2+

真 核 mRNA3’ 端 有 polyA ， 加 入 oligo dT 后 ， 可 以 作 为 反 转 录 酶

的 模 板 ， 合 成 cDNA 。

23
2 、 病 毒 RNA 的 反 转 录 过 程

所 有 已 知 的 致 癌 RNA 病 毒 都 含 有 反 转 录 酶 ， 因 此 被 称

为 反 转 录 病 毒 （ retrovirus ） ， 反 转 录 病 毒 的 复 制 需 要 经 过
一 个 DNA 中 间 体 （ 前 病 毒 ） 。

1、 反 转 录 病 毒 的 基 因 组 结 构

P353 图 19-27

（ 1 ） 反 转 录 病 毒 基 因 组 通 常 由 两 条 相 同 的 （ + ） RNA

链 组 成 。 5’ 端 附 近 区 域 以 氢 键 结 合 在 一 起 ， 全
长 7-10Kb 。

（ 2 ） 每 一 条 RNA 链 的 两 端 具 有 相 同 的 序 列 ， 形 成 正

向 重 复 序 列 。

（ 3 ） 5’ 端 有 帽 子 结 构 ， 3’ 端 有 polyA ， 与 真 核 mRNA 相 似 。

（ 4 ） 5’ 端 带 有 1 分 子 的 宿 主 tRNA ， 作 为 反 转 录 时 的 引

物 。 某 些 鸟 类 反 转 录 病 毒 携 带 的 是 tRNAtrp ， 鼠 类
是 tRNApro

2、 反 转 录 过 程。

当 致 癌 RNA 病 毒 侵 染 宿 主 细 胞 时 ， 病 毒 RNA 及 反 转 录

酶 一 起 进 入 宿 主 细 胞 ， 病 毒 自 身 带 入 的 反 转 录 酶 使 RNA
反 转 录 成 双 链 DNA 。

（ 1 ） 以 病 毒 （ + ） RNA 为 模 板 ， 合 成 互 补 的 （ - ）

DNA 。

（ 2 ） 切 除 RNA—DNA 杂 种 分 子 中 的 RNA 。

（ 3 ） 以 （ - ） DNA 链 为 模 板 ， 合 成 （ + ） DNA 链 ， 最 后

形 成 两 端 带 有 LTR （ 长 末 端 重 复 序 列 ） 的 双 链

24
 DNA 。

反 转 录 病 毒 只 有 整 合 到 宿 主 染 色 体 DNA 后 才 能 被 转 录 ，

转 录 产 物 经 拼 接 可 以 产 生 不 同 的 病 毒 mRNA 。 LTR （ 长 末
端 重 复 序 列 ） 对 前 病 毒 DNA 整 合 到 宿 主 染 色 体 DNA 以 及
整 合 后 的 转 录 均 起 着 重 要 作 用 。

反 转 录 病 毒 合 成 的 过 程 ：
图

缺 口 的 模 板 （ 基 因 组 ） RNA ， 在 U3 旁 生 成 一 个 正 链

DNA 的 合 成 RNA 的 引 物 ， 而 其 余 的 模 板 RNA 被 降 解 。

正 链 DNA 合 成 开 始 ， 复 制 。

3、 反 转 录 病 毒 的 生 活 周 期

P354 图 19-29

（ 1 ） 病 毒 粒 子 侵 染 细 胞 ， 病 毒 RNA 和 反 转 录 酶 一 起

进 入 细 胞 。

（ 2 ） RNA 被 反 转 录 成 双 链 DNA （ 前 病 毒 ） ， 环 化 ， 进

入 细 胞 核 。

（ 3 ） 反 转 录 病 毒 的 DNA 整 合 到 宿 主 染 色 体 DNA 中 。

（ 4 ） 前 病 毒 DNA 进 行 复 制 ， 转 录 出 功 能 基 因 、 基 因

组 RNA 和 病 毒 蛋 白 。

（ 5 ） 基 因 组 RNA 和 病 毒 蛋 白 在 胞 质 中 组 装 成 新 病 毒

粒 子 ， 转 移 到 质 膜 ， 通 过 出 芽 方 式 释 放 新 病 毒
粒 子 。

25
3、 反 转 录 的 生 物 学 意 义。

1 ． 反 转 录 酶 存 在 于 所 有 致 癌 RNA 病 毒 中 ， 它 的 存 在

与 RNA 病 毒 引 起 细 胞 恶 性 转 化 有 关 。
2 ． 艾 滋 病 毒 （ AIDS ）

人 类 免 疫 缺 陷 病 毒 （ HIV ） ， 也 是 一 种 反 转 录 病 毒 ，

主 要 感 染 T4 淋 巴 细 胞 和 B 淋 巴 细 胞 。 病 毒 粒 子 直 径

100nm ， 球 状 ， 粒 子 外 包 被 两 层 脂 质 质 膜 ， 膜 上 有 糖 蛋

HIV 基 因 组 由 两 条 单 链 正 链 RNA 组 成 ， 每 个 链 长

9.7kb ， RNA 5 ，
端 有 帽 子 结 构 ， 3’ 端 有 PolyA ， 链 上 结 合 有 反

3 ． 乙 肝 病 毒
大 蛋 白 、 中 蛋 白 、 主 蛋 白 （ 表 面 抗 原 ）
核心抗原

双 链 环 状 DNA

乙 肝 病 毒 与 反 转 录 病 毒 的 区 别 ：
P355
4、 真 核 生 物 正 常 细 胞 内 也 存 在 反 转 录 过 程
真 核 生 物 的 谈 色 体 基 因 组 中 存 在 为 数 众 多 的 逆 假 基
因 和 逆 基 因 。

逆 假 基 因 ： 无 启 动 子 和 内 含 子 ， 但 有 polyA 的 残 基 ， 推

测 是 由 mRNA 反 转 录 后 整 合 到 基 因 组 中 去 的 。
逆 基 因 ： 具 有 启 动 子 和 转 录 功 能 ， 无 内 含 子 。 可 能
是 由 于 mRNA 反 转 录 后 刚 好 整 合 到 启 动 子 的 下 游 处 ， 或
者 是 带 启 动 子 的 RNA 序 列 反 转 录 后 整 合 到 基 因 组 中

26
 第 4 节 DNA 合 成 技 术

1 、 cDNA 合 成

1 、 cDNA 文 库 的 构 建

cDNA ： 以 mRNA 为 模 板 ， 用 反 转 录 酶 合 成 第 一 链 ， 去 除

mRNA ， 合 成 的 第 二 链 。
cDNA 文 库 是 获 得 真 核 结 构 基 因 的 最 好 方 法 ， 成 熟 的
mRNA 无 内 含 子 。

（ 1 ） 、 真 核 mRNA 的 分 离 纯 化

特 点 ： 含 量 少 ， 不 均 一 ， 表 达 具 有 发 育 阶 段 性 和 组
织 特 异 性 。

总 RNA ： rRNA 80~85%

mRNA 1~5%

tRNA 及 其 它 小 分 子 RNA 10~15%

不 均 一 ： 在 1~5% 的 mRNA 中 ， 有 10000—30000 种 mRNA 。

分 离 、 纯 化 ：

用 Oligo dT 纤 维 素 柱 （ 亲 和 层 析 法 ） ， 加 入 总 RNA ， 高

盐 洗 脱 ， 先 流 出 非 mRNA ， 降 低 盐 浓 度 ， 加 入 Oligo dA 竞 争 ，
可 洗 出 mRNA 混 合 物 。

免 疫 法 可 分 离 特 定 的 mRNA 。

27
 （ 2 ） 、 cDNA 合 成 （ 反 转 录 酶 ）

A. 自 身 引 物 法 （ S1 核 酸 酶 降 解 法 ）

图
Oligo(dT)15-18 个 核 苷 酸
mRNA5’ 端 序 列 有 丢 失 。
B. 取 代 合 成 法 （ 较 常 用 ）
图

Oliyo （ dT ） 与 mRNA3’ 端 AAA 杂 交 作 为 引 物 ， 合 成 第 一 条

DNA 链 。

RNaseH 在 mRNA 上 产 生 多 个 切 口 。

DNA pol.Ⅰ 切 口 平 移 ， DNA ligase 连 接 ， 合 成 出 第 二 条 DNA 链 。

T4DNA pol. 切 去 端 头 的 RNA-DNA 杂 交 链 。

C. 引 物 合 成 法

可 以 合 成 全 长 cDNA ， mRNA 的 5’ 端 不 丢 失 。

（ 3 ） 、 cDNA 与 载 体 连 接

（ 4 ） 、 重 组 体 的 转 化

（ 5 ） 、 扩 增 、 保 存

2 、 获 取 特 定 mRNA 的 cDNA

（ 1 ） 免 疫 法 分 离 特 定 的 mRNA

28
 （ 2 ） PCR 法

2 、 PCR 技 术 （ 聚 合 酶 链 式 反 应 ）

Polymerase chain Reaction

以 目 的 基 因 或 DNA 片 段 为 模 板 ， 在 引 物 介 导 及 Taq DNA

聚 合 酶 催 化 下 ， 在 体 外 用 核 苷 酸 大 量 合 成 目 的 基 因 或
DNA 片 段 。

它 能 快 速 、 专 一 地 扩 增 所 希 望 得 到 的 目 的 基 因 或 DNA

片 段 。

1、 反 应 物

（ 1 ） 模 板

单 、 双 链 DNA 或 cDNA 都 可 以 作 为 PCR 的 模 板 ， 若 以 RNA

为 起 始 材 料 ， 则 须 经 反 转 录 ， 获 得 第 一 条 cDNA 后 才 能 用
于 PCR 。

（ 2 ） Taq DNA 聚 合 酶

DNA 聚 合 酶 是 进 行 PCR 扩 增 的 关 键 ， 从 水 生 栖 热 菌

（ Thermus aquaticns VT-1 ） 分 离 出 来 。

Taq DNA 聚 合 酶 有 很 好 的 热 稳 定 性 ， 92.5℃ 处 理 130min ， 仍

保 留 50% 的 酶 活 性 ， 在 74℃ 活 性 最 高 ， 错 误 掺 入 核 苷 酸
的 比 率 为 1/7500 。

（ 3 ） 引 物

引 物 是 决 定 PCR 结 果 的 关 键 ， 它 由 寡 核 苷 酸 组 成 ， 15-

30 个 b

（ 4 ） 核 苷 酸 dNTP

29
dNTP 的 浓 度 50-200umul/L 。

（ 5 ） 镁 离 子 Mg2+

2 、 PCR 原 理

变性 95℃

复性 55℃

延伸 72℃

30