UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE VITRIA DE SANTO ANTO CURSO DE GRADUAO EM CINCIAS BIOLGICAS

Perfil fitoqumico, atividade antioxidante e toxicidade preliminar do extrato bruto das folhas de Pseudobombax marginatum (A. St.-Hil., Juss & Cambess.) A. Robyns.

VITRIA DE SANTO ANTO

2010 Sarah Romini de Lima Basto

Perfil fitoqumico, atividade antioxidante e toxicidade preliminar do extrato bruto das folhas de Pseudobombax marginatum (A. St.-Hil., Juss & Cambess.) A. Robyns.

Projeto apresentado ao Curso de Graduao em Licenciatura em Cincias Biolgicas como requisito para concluso do Componente Eletivo, pela graduanda Sarah Romini de Lima Basto, sob orientao dos professores Msc. Tssia Campos de Lima e Silva e co-orientao de Msc. Tadeu Jos da Silva Peixoto Sobrinho.

VITRIA DE SANTO ANTO

2010

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo. Aos meus pais Jos Maria e Jacilene por sempre me apoiarem, compreenderem-me, e ajudado a formar a pessoa que sou hoje. minha famlia por estar sempre ao meu lado. Aos Professores Tssia Campos de Lima e Silva e Tadeu Jos da Silva Peixoto Sobrinho pelo apoio, pacincia, compreenso e ensinamentos que me foram repassados, assim como, todos meus professores do Centro Acadmico de Vitria, em especial aos Professores, Augusto Santiago, Carlos Daniel Perez, Anglica Uejima. todos do LAPRONAT que de forma direta e indireta me ajudaram na realizao e concretizao desse trabalho. todos meus amigos, aos de perto, aos de longe, aos de sempre, aos que fazem sculos que no vejo, aos que passaram rapidamente na minha vida, aos que ficaram, aos que conviveram comigo e ajudaram na minha luta do dia-a-dia, enfim, todos vocs que modificaram de alguma forma meu ser. todos que me apoiaram e que sabiam a hora certa de me dizer uma palavra amiga, sem exceo, meus agradecimentos.

SUMRIO
1. 2.

INTRODUO...............................................................................................05 REVISO DA LITERATURA.........................................................................07

2.1..........................................................................................................A

ESPCIE Pseudobombax marginatum (St. Hil.) Robyns..........................08

2.2.......................................................................................................... AS

PLANTAS MEDICINAIS E SEU METABOLISMO.......................................10 2.3................................................................................................................ ATIV IDADE ANTIOXIDANDE..............................................................................11 2.4................................................................................................................TOCI XIDADE PRELIMIAR...................................................................................12
3. 4. 5. 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 6.

JUSTIFICATIVA.............................................................................................14 OBJETIVOS...................................................................................................17 METODOLOGIA............................................................................................19 REA DE ESTUDO E COLETA DE MATERIAL VEGETAL.......................20 SECAGEM E PREPARAO DO EXTRATO............................................20 CARACTERIZAO QUMICA DO EXTRATO..........................................20 QUANTIFICAO DE FENIS TOTAIS ...................................................21 QUANTIFICAO DE FLAVONIDES TOTAIS.......................................22 ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE...............................................22 BIOENSAIO DE LETALIDADE SOBRE Artemia salina Leach..................23 ANLISE ESTATSTICA.............................................................................23 RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................24 TRIAGEM FITOQUMICA............................................................................25 QUANTIFICAO FENIS TOTAIS E FLAVONIDES TOTAIS .............26 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE......................................................................27 ANLISE TOXICOLGICA........................................................................29 CONCLUSES..............................................................................................31 REFERNCIAS.................................................................................................33 ANEXOS ...........................................................................................................36

6.1
6.2

6.3
6.4

7.

RESUMO
A diversidade vegetal do Brasil uma das maiores do planeta, nela que se encontra grande parte das importantes propriedades teraputicas, entretanto, somente uma pequena parcela destes vegetais tm sido alvo de estudo. A Caatinga o nico bioma exclusivamente brasileiro, no entanto, o que apresenta os menores ndices de estudos publicados. Trata-se de um tipo vegetacional semi-rido nico, com uma abrangncia quase que exclusivamente na regio Nordeste. Nos ltimos anos, houve um crescente interesse por plantas utilizadas na medicina popular devido aos seus diferentes efeitos farmacolgicos, alm disto, h um grande interesse das indstrias farmacuticas pelo uso da biodiversidade como fonte de novos frmacos, j que nos dias atuais, os produtos naturais so responsveis por cerca de 40% dos frmacos disponveis para o tratamento de vrias patologias. A espcie Pseudobombax marginatum (St.Hil.) Robyns, proveniente das regies tropicais e subtropicais utilizada como medicamentos por diversos povos. Estudos etnofarmacolgicos afirmam que a P. marginatum possui uso antiinflamatrio e analgsico, porm, no h comprovao cientfica. Neste sentido, a falta de estudos sobre a atividade desta espcie remete a necessidade de analisar o seu potencial. O presente estudo objetivou caracterizar o perfil fitoqumico do extrato foliar de P. marginatum atravs de cromatografia em camada delgada, analisar a atividade antioxidante atravs da captao de DPPH e avaliar a toxicidade preliminar do extrato bruto frente s larvas de Artemia salina Leach. As folhas de P. marginatum exibiram uma diversidade fitoqumica acentuada, apresentando antocianinas, antraquinonas agliconas e glicosdicas, compostos fenlicos (flavonides, taninos e cidos fenlicos), cumarinas e terpenides (mono, sesqui, di e triterpeno). No foram detectados alcalides gerais, naftoquinonas, saponinas e xantinas na amostra. Os grupos que mais se destacaram em diversidade foram os terpenides e compostos fenlicos. Quanto s quantificaes foi observado um importante teor de fenis totais (426,9610,77 mg/g de extrato bruto etanlico) e flavonides (88,764,93 mg/g de extrato bruto foliar etanlico) na espcie sendo necessrio aprofundamentos futuros. Com relao atividade antioxidante, a amostra apresentou bom desempenho (CE 50 = 108,207,53 g/mL), se comparado com os padres utilizados (cido ascrbico, rutina e padro). O ensaio com as larvas de A. salina apresentou CL50 = 10.770 g/mL, indicando no haver toxicidade. O extrato vegetal de P. marginatum, devido ao seu elevado potencial antioxidante e atoxicidade, pode ser considerado um recurso promissor para o tratamento de enfermidades causadas por agentes oxidativos que podem desencadear doenas degenerativas.

Palavras-chave: Pseudobombax marginatum, Caatinga, DPPH, Folin-Ciocalteu, Artemia salina.

1. INTRODUO
1. INTRODUO Ao longo da histria observou-se que as plantas foram os primeiros recursos teraputicos utilizados, e constituam a nica forma de preveno, tratamento e cura. Com o avano da tecnologia, principalmente na produo sinttica de frmacos, as plantas medicinais foram postas em segundo plano. Atualmente, a procura de plantas com propriedades medicinais vem aumentando constantemente, a ponto que o mercado mundial de fitoterpico gira em torno de 22 bilhes de dlares/ano (PINTO et al., 2002). O Brasil apresenta uma das maiores biodiversidades vegetais do Planeta, da qual, grande parte pode apresentar importantes propriedades teraputicas, porm, uma pequena quantia destas foi estudada (MATOS, 1998). A Caatinga o bioma menos estudado do Brasil, trata-se de um tipo vegetacional semi-rido nico, ocorrendo somente no Brasil, quase que exclusivamente na regio Nordeste (ALBUQUERQUE, 2002). Na estao seca as plantas da Caatinga demonstram sua complexidade, pois os seres que nela vivem desenvolveram muitas estratgias de sobrevivncia em condies de variao na amplitude trmica e um regime de chuvas curto e irregular, demonstrando assim, suas possveis atividades biolgicas (SIQUEIRA et al., 2009), desta forma, observa-se um grande potencial a ser explorado, tornando-se extremamente oportuno face s atuais necessidades e demandas produtivas. Pseudobombax marginatum (St.-Hil.) Robyns, representante da famlia Bombacacaea, vastamente encontrada no Nordeste, principalmente na regio da Caatinga muito utilizada por populaes que habitam essas regies, dos quais afirmam que tal planta possui propriedades farmacolgicas e so utilizados para a cura de inflamaes e como analgsicos, porm tal afirmao ainda no foi cientificamente comprovada. Desta forma, o presente trabalho visa a anlise do perfil qualitativo fitoqumico, atividade antioxidante, toxicidade preliminar do extrato

bruto vegetal oriundo da folha de P. marginatum, do qual nos permitir a pioneira avaliao desta rea, atravs das quantificaes de fenis e flavonides totais.

2. REVISO DA LITERATURA
2. REVISO DA LITERATURA
2.1 Caractersticas botnicas Pseudobombax marginatum (St.-Hil.) Robyns (Figura 1), uma espcie representante da famlia Bombacaceae Kunth, onde se encontra cerca de 30 gneros e, aproximadamente, 200 espcies de distribuio tropical, predominante nas Amricas. No Brasil, ocorrem cerca de 18 gneros e 100 espcies amplamente distribudas, habitando diferentes formaes vegetais (BARROSO et al. 1987). P. marginatum nativa da regio Nordeste onde popularmente usada para cura de inflamaes e como analgsico.

Figura 1. Pseudobombax marginatum (St.-Hil.) Robyns coletado em Soledade/PB (080413S x 362052W). Fonte: Arquivo pessoal.

Popularmente conhecida por embiratanha, P. marginatum facilmente distinta das demais espcies pela presena de tricoma estrelado, de raio curto e ereto que recobre a face abaxial dos fololos e o clice, encontrado apenas nessa espcie (Figura 2). Fololos quase ssseis e os estames numerosos, em torno de 500 a 900,

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agrupados em 5 falanges a partir do tubo estaminal (at 300 e livres entre si nas demais espcies) (DUARTE, 2006).

Figura 2. Representao esquemtica da folha de Pseudobombax marginatum (St.-Hil.) Robyns. Fonte: (DUARTE,2006).

Diferentemente das demais espcies, P. marginatum encontra-se em perodo de florao de abril a setembro, principalmente de junho a agosto (Marlia, 2006). Planta de porte arbreo que pode atingir at 7 metros de altura. Apresentam folhas glabrescentes, com 6 a 9 fololos, discolores, obovados, pice agudo, base cuneada a aguda, margem inteira, revoluta, ocasionalmente crenada, face adaxial escura, recoberta de tricomas estrelados com escamas esparsas, glabrescente at glabra, face abaxial clara, pubescente, densamente recoberta de tricomas estrelados de raios eretos, mais escamas esparsas, glabrescente, nervuras secundrias 13-23 pares (ALBUQUERQUE, 2002). Suas flores possuem de 10,5-14 cm de comprimento com tricomas estrelados esparsos de raios adpressos, glabrescentes; receptculo com 15 nectrios formando um anel contnuo; clice 1,5-1,7x1,7-2,2 cm, cupuliforme, borda truncada a ondulada, externamente recoberto de tricomas estrelados esparsos de raios eretos, mais escamas castanhas, glabrescente, internamente serceo apenas na borda; ptalas 9-13,5 cm, lanuginosas na base, face dorsal densamente recoberta de tricomas dourados, face ventral recoberta de tricomas estrelados de raios longos e curtos, flexuosos; estames ca. 500, parcialmente concrescidos em tubo e depois agrupados em 5 falanges distintas; tubo estaminal 1,5-1,8 cm, lanuginoso na base, parte livres dos filetes 5,5-9,5cm; ovrio com cerrca de 0,5 cm; estilete 10-10,5 cm. Cpsula no examinada (DUARTE, 2006).

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2.2 Metabolismo secundrio vegetal Uma das caractersticas dos seres vivos a presena de atividade metablica. O metabolismo nada mais do que o conjunto de reaes qumicas que ocorrem no interior das clulas. No caso das clulas vegetais, o metabolismo costuma ser dividido em primrio e secundrio. Entende-se por metabolismo primrio o conjunto de processos metablicos que desempenham uma funo essencial no vegetal, tais como a fotossntese, a respirao e o transporte de solutos (PEREZ, 2004). Os compostos envolvidos no metabolismo primrio possuem uma distribuio universal nas plantas. Esse o caso dos aminocidos, dos nucleotdeos, dos lipdios, carboidratos e da clorofila. Em contrapartida, o metabolismo secundrio origina compostos, que no possuem uma distribuio universal, pois no so necessrios para todas as plantas. Embora o metabolismo secundrio nem sempre seja necessrio para que uma planta complete seu ciclo de vida, ele desempenha um papel importante na interao das plantas com o meio ambiente (BOUVIER, et al., 2003). Um dos principais componentes do meio externo cuja interao mediada por compostos do metabolismo secundrio so os fatores biticos. Desse modo, produtos secundrios possuem um papel contra a herbvora, ataque de patgenos, competio entre plantas e atrao de organismos benficos como polinizadores, dispersores de semente e microrganismos simbiontes. Contudo, produtos secundrios tambm possuem ao protetora em relao a estresses abiticos, como aqueles associados com mudanas de temperatura, contedo de gua, nveis de luz, exposio radiao ultravioleta e deficincia de nutrientes minerais (BOUVIER, et al., 2003). Existem trs grandes grupos de metablitos secundrios: terpenos, compostos fenlicos e alcalides. Os terpenos so formados a partir do cido mevalnico (no citoplasma) ou do piruvato e 3-fosfoglicerato (no cloroplasto). Os compostos fenlicos so derivados da rota do chiquimato em associao com a do acetato. Por fim, os alcalides so derivados de aminocidos aromticos (triptofano, tirosina), os quais so derivados do cido chiqumico, e tambm de aminocidos

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alifticos (ornitina, lisina).

A importncia econmica do metabolismo secundrio

reside em trs grandes reas: a fitomedicina, a nutracutica e as aplicaes industriais diversas. Com a facilidade que se tem hoje em isolar genes que codificam enzimas chaves do metabolismo secundrio, as possibilidade de avano destas trs reas econmicas sero bastante potencializadas no futuro atravs da biotecnologia (CUNNINGHAM & GANTT, 1998). Embora as plantas venham sendo utilizadas como medicamentos h tempos imemorveis, temos assistido nos dias atuais a uma retomada da chamada fitomedicina. As razes para isso so diversas, estando entre elas os altos preos dos remdios convencionais, os quais, entre outras coisas, refletem certo abuso pela propriedade intelectual de princpios ativos que, em sua grande maioria, foram extrados das prprias plantas. Alm disso, os remdios caseiros baseados em extratos vegetais complexos, contendo diversos metablitos, podem ter certa vantagem sobre as drogas convencionais, as quais costumam ser baseadas em um nico principio ativo (BRISKIN, 2000). Desse modo, a presena de vrios compostos em um s remdio pode ter um efeito sinrgico e benfico. Por outro lado, o uso de um s princpio ativo obriga que esse esteja em doses elevadas (farmacolgicas), as quais nem sempre so fisiologicamente adequadas e podem provocar efeitos coletarias. A presena de vrios princpios ativos nos extratos vegetais explicada pelo fato das plantas normalmente desenvolverem uma srie de metablitos com funes complementares defesa contra pragas e doenas. Essa estratgia impede o desenvolvimento de resistncia por parte dos organismos infecciosos. Muitos desses compostos, apesar de serem suficientes para eliminar insetos ou mesmo vertebrados de grande porte, quando utilizados em doses adequadas convertem-se em medicamentos (GILBERT & COOKE, 2001). Desse modo, produtos secundrios envolvidos na defesa atravs de atividade citotxica contra patgenos podem ser teis como agentes antimicrobianos na medicina. Alm disso, aqueles envolvidos na defesa contra herbvora atravs de atividade neurotxica podem ter efeitos benficos para o homem, atuando como antidepressivos, sedativos, relaxantes musculares ou anestsicos (BRISKIN, 2000).

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2.3 Atividade antioxidante A excessiva produo de radicais livres pode acarretar diversas formas de desestruturao celular e sua cronicidade pode estar envolvida com a etiognese ou com o surgimento de numerosas doenas. O aumento do processamento de radicais livres pode ocorrer devido hiperxia (aumento na quantidade de oxignio em tecidos e rgos) quando ocorre exposio de um individuou ou at mesmo a nvel celular a certos componentes qumicos, radiao ou a inflamao tecidual local, resultando em estresse oxidativo, caracterizado por um desequilbrio entre oxidantes e antioxidantes, no qual ocorre predominncia de radicais livres (EL-HABIT et al., 2000). Em funo da numerosa diversidade de qumica existente, particularmente, entre os compostos fenlicos, foram desenvolvidos vrios ensaios para avaliar a capacidade antioxidante de diferentes amostras. Alguns determinam a habilidade dos antioxidantes para captar radicais livres gerados no meio da reao, em outros ocorre avaliao da eficincia dos antioxidantes em suspender a peroxidao lipdica por meio da quantificao dos produtos da reao, como dienos conjugados e hidroperxidos, assim como dos produtos de decomposio da peroxidao lipdica ou medindo a inibio da oxidao do lipdio do sistema pelo antioxidante a ser testado (MELO et al., 2006). 2.4 Toxicidade preliminar Os laboratrios de produtos naturais constantemente promovem anlises visando descoberta de novas propriedades com potencial teraputico. Dentre as mais atuais, a avaliao da letalidade dos extratos frente s larvas do microcrustceo Artemia salina Leach. (Figura 3) um exemplo bastante eficaz destes bioensaios que permite realizar uma triagem da planta a ser testada, avaliando a toxicidade geral, apresentando facilidade e rapidez na sua execuo associado ao baixo custo, desta forma, intensificando e favorecendo estudos rotineiros nos laboratrios (MEYER et al, 1982).

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Figura 3. Metanuplius do microcrustceo Artemia salina Leach usadas para determinar a toxicidade preliminar. Fonte: Nourriture, 2007.

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3. JUSTIFICATIVA

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3. JUSTIFICATIVA
O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o nico recurso teraputico de muitas comunidades e grupos tnicos. As observaes populares sobre o uso e a eficcia de plantas medicinais de todo mundo, mantm a prtica do consumo de fitoterpicos, tornando vlidas as informaes teraputicas que foram sendo acumuladas durante sculos (MACIEL et al., 2002). Em relao medicina caseira, se de um lado sabe-se que o uso de plantas em forma de chs, xaropes, infuses, etc, difundido em nosso meio, de outro lado, limitado o conhecimento acerca dos princpios ativos contidos nas mesmas. A evoluo da indstria qumica e farmacutica possibilitou que a medicina passasse a preferir substncias puras sintticas, com isso parte da cultura popular foi depreciada, havendo descrdito sobre a teraputica caseira com plantas e desestimulando a pesquisa necessria nessa linha (ANNICHINO et al., 1986). Adicionalmente, ocorre o uso de plantas medicinais associadas e/ou substitudas por medicamentos sintticos. Andreatini (2000) relatou que a resistncia absoluta de profissionais quanto prescrio de plantas medicinais com ao comprovada, pode privar determinado paciente de uma medicao eficaz, enquanto, a descrena destes profissionais pode gerar prescries de plantas medicinais que podem apresentar importantes efeitos adversos, assim como a possibilidade de interaes medicamentosas. Fonte adicional de preocupao reside no fato que as plantas medicinais, apesar de apresentarem muitas semelhanas com medicamentos, no possuem os mesmos controles de prescrio e de venda, o que pode aumentar a freqncia e os riscos de automedicao, portanto, a atitude mais adequada em relao as mesmas, consider-las com o mesmo rigor com que se lida com os medicamentos, baseando a conduta clnica em evidncias cientficas consistentes e reconhecendo, quando for o caso, sua eficcia, mas tambm seus efeitos adversos e as possibilidades de interaes medicamentosas (ANDREATINI, 2000). Dados do Sistema Nacional de Informaes Txico-Farmacolgicas (2003) mostraram que dos 2616 casos de intoxicao por plantas registradas no Brasil em humanos e animais, 1955 (74,7%), foram em humanos e dos nove registros de bitos em humanos e animais, 55,5% foram em humanos.

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Estes dados mostram a necessidade do estudo mais aprofundado sob as propriedades teraputicas das plantas medicinais. Desta forma, visando diminuir o uso incorreto e em contrapartida aumentar os saberes cientficos, o presente trabalho tem por justificativa avaliar as propriedades teraputicas e toxicolgicas de do extrato foliar de Pseudobombax marginatum.

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4. OBJETIVOS

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4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral Analisar o perfil fitoqumico, determinar a atividade antioxidante e a toxicidade preliminar do extrato proveniente da folha de Pseudobombax marginatum (St.-Hil.) Robyns. 4.2 Objetivos especficos
Realizar

a caracterizao qualitativa fitoqumica das folhas de P.

marginatum;
Realizar doseamento de fenis e flavonides totais da espcie medicinal da

Caatinga selecionada para estudo;

Avaliar a capacidade de Pseudobombax marginatum (St.-Hil.) de captar o

radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil);

Testar a bioatividade (toxicidade) das folhas de P. marginatum em Artemia

salina Lench.

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5. METODOLOGIA

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5. METODOLOGIA
5.1 rea de estudo e coleta de material vegetal As amostras de Pseudobombax marginatum (ST Hil.) Robyns, foram coletadas em Abril de 2010, no Estado da Paraba, na cidade de Soledade (080413S x 362052W). O material testemunho est depositado no Herbrio Prof. Vasconcelos Sobrinho PEUFR, da Universidade Federal Rural de Pernambuco UFRPE, catalogado sob nmero de registro 50433. As amostras coletadas apresentavam folhas e caule verde-escuro, sem nenhum dano aparente de predao. 5.2 Secagem e preparao do extrato As folhas frescas de P. marginatum foram estabilizadas durante dois dias em estufa a 452C, pesadas (221,35g), pulverizadas em triturador, padronizadas a 16 Mesh (1,0 mm) e submetidas macerao com lcool etlico (80GL) at esgotamento. Os extratos foram evaporados sob presso reduzida (temperatura de 452C) e apresentaram um aspecto turvo, odor forte e colorao verde-escuro. 5.3 Caracterizao qumica do extrato Aps evaporao do solvente, os extratos foram avaliados atravs de mtodos cromatogrficos segundo Wagner e Bladt (1996) procurando-se evidenciar os principais grupos do metabolismo secundrio (Tabela 1).
Tabela 1. Sistemas de eluio, padres e reveladores utilizados para evidenciar os principais grupos de metablitos secundrios segundo Wagner e Bladt (1996). Grupo Alcalides gerais Sistema eluente Tolueno: acetato de etila: dietilamina (70:20:10v/v) Acetato de etila: cido frmico: cido actico glacial: gua (100:11:11:26v/v) ter de petrleo: acetato de etila: cido frmico (75:25:1v/v) Padro Quinina Yoimbina Azul de metileno Revelador Dragendorff

Antocianinas Antraquinonas agliconas

Anisaldeido-sulfrico cido fosfomolbdico / H2SO4 etanlico 10%

Antraquinona

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Compostos fenlicos Cumarinas Derivados antracnicos Iridides Lignanas Mono, sesqui e diterpenos Naftoquinonas Saponinas Triterpenos e esterides Xantinas

Acetato de etila: cido frmico: cido actico glacial: gua (100:11:11:26v/v) Tolueno: ter (1:1 saturado com cido actico 10%v/v) Acetato de etila: metanol: gua (100:13,5:10v/v) Acetato de etila: metanol: gua (77:15:8v/v) Clorofrmio: metanol: gua (70:30:4v/v) Tolueno: acetato de etila (93:7v/v) Tolueno: cido frmico (99:1v/v) Clorofrmio: cido actico: metanol: gua (64:32:12:8v/v) Tolueno: clorofrmio: etanol (40:40:10v/v) Acetato de etila: metanol: gua (100:13,5:10v/v)

Rutina Quercetina Escopoletina Alona Carvacrol Timol Extrato de linhaa Carvacrol Timol Biflorina Lapachol Saponina Lupeol Sitosterol Cafena

NEU KOH etanlico 10% KOH etanlico 10% Vanilina sulfrica Vanilina fosfrica Vanilina sulfrica KOH etanlico 10% Anisaldedo-sulfrico Lieberman-Burchard Iodo - KI HCl

5.4 Contedo de fenis totais Para determinar o contedo fenlico total foi utilizado o mtodo de FolinCiocalteu (AMORIM et al., 2008; FOLIN e CIOCALTEU, 1927). Alquotas (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5) do extrato foram transferidas para bales volumtricos de 100,0 mL e em seguida adicionados 5,0 mL de uma soluo aquosa do reagente FolinCiocalteu a 10% e 10,0 mL de uma soluo aquosa de carbonato de sdio a 75,0 mg/L, completando o volume do balo com gua destilada. Para os fenis residuais, alquotas dos extratos foram mantidos sob agitao constante durante trs horas com 1,0 g de casena. Aps filtrao, o volume foi completado para 25,0 mL com gua destilada. Alquotas deste filtrado foram transferidas para bales de 100 mL e os fenis residuais foram determinados pelo mtodo Folin-Ciocalteu. Aps 30 minutos em temperatura ambiente, as medidas das absorbncias foram realizadas em espectrofotmetro a 760 nm, sendo utilizada gua destilada para zerar o aparelho. Os resultados foram expressos como mg equivalente de cido tnico / g de extrato.

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5.5 Contedo de flavonides totais O estudo foi conduzido segundo metodologia descrita por Peixoto Sobrinho et al. (2008). Alquotas (0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0) do extrato foram transferidas para bales volumtricos de 25,0 mL. Em seguida foram adicionados 0,6 mL de cido actico glacial, 10,0 mL de uma soluo metanlica de piridina a 20% e 2,5 mL de um soluo metanlica de cloreto de alumnio a 50,0 mg/L, completando o volume com gua destilada. A curva de calibrao foi construda com rutina (1,0-20,0 g/mL) e todos os reagentes descritos anteriormente. Aps 30 minutos em temperatura ambiente, as leituras foram realizadas a 420 nm, sendo utilizada gua destilada para zerar o espectrofotmetro. Os resultados foram expressos como mg equivalente de rutina / g de amostra seca. 5.6 Estudo da atividade antioxidante A atividade antioxidante quantitativa foi avaliada a partir da capacidade de reduzir o radical livre DPPH pela metodologia descrita por Sousa et al. (2007). As amostras (em triplicata) foram maceradas com etanol 80%. Para a realizao do ensaio antioxidante, as amostras ou controles foram diludos em etanol concentrao final de 5,0 -150,0 g/mL. Alquotas (0,5; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15,0; 17,5; 20,0) destas solues reagiram com a soluo etanlica de DPPH a 50,0 g/mL em tubo de ensaio e, aps 30 minutos em temperatura ambiente e ao abrigo de luz, a reduo do radical livre DPPH foi quantificada a 517 nm. Todo o procedimento foi realizado em duplicata. Os percentuais de DPPH remanescentes (% DPPHREM) foram calculados conforme a Equao 1 e as concentraes eficientes (CE50) foram determinadas a partir da anlise de regresso obtida atravs de uma curva exponencial das porcentagens de DPPH remanescente de cada concentrao versus absorbncia.

% DPPHREM = DPPHT=t /DPPHT=0 x100

(1)

Onde: DPPHT=t correspondem concentrao de DPPH no meio aps a reao com o extrato ou controle e DPPHT=0 que corresponde concentrao inicial de DPPH.

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5.7 Bioensaio de letalidade sobre Artemia salina Leach. (CL50) O bioensaio com A. salina foi baseado na tcnica descrita por Meyer et al. (1982), estabeleceram uma correlao entre o grau de toxicidade e a concentrao letal mdia (CL50), apresentada por extratos de plantas sobre larvas de A. salina, sendo considerado txico at 500,0 g/ml, moderadamente txico de 500-1000,0 g/ml e atxico acima de 1000 g/ml. Utilizou-se 10 mg do extrato bruto e foram adicionados 100 L de Cremophor e 1 mL de Tween 80 a 5% para ajudar a solubilizao do mesmo. A soluo foi em seguida homogeneizadas e o volume completado para 5 mL com gua salinizada filtrada pH 8,0. Desta soluo retirou-se alquotas e a transferiu-se para outro balo de 5 mL e o volume completado com o mesmo solvente, obtendo-se concentraes de 1000, 750, 500, 250, 100 e 50 g/mL para o extrato. Os ovos de A. salina (20 mg) incubados sob iluminao artificial por 48 horas para que houve a ecloso das larvas (metanuplios), e estas, foram separadas em sete grupos com 10 a 13 indivduos cada. O primeiro grupo recebeu a soluo controle (solvente e tensoativos) e os seis seguintes receberam as solues do extrato em diferentes concentraes. As amostras, em seguida, submetidas iluminao artificial durante 24 horas, aps este perodo contabilizou-se as larvas vivas e mortas. O experimento foi realizado em triplicata para cada extrato. Para obteno das CL50 ser utilizada a anlise PROBIT atravs do software STATPLUS 2005 com 95% de confiana. 5.8 Anlise estatstica Foi utilizado o teste Kolmogorov-Smirnov para analisar a normalidade dos dados. Os resultados foram avaliados atravs da ANOVA. um critrio e, quando necessrio, seguido de comparaes mltiplas pelo teste de Tukey (AYRES et al., 2007). Os valores de CE50 foram calculados a partir de uma curva exponencial de 1 ordem. Foram utilizadas as anlises de regresso e correlao entre o contedo de fenis totais, taninos e flavonides e a concentrao eficiente de cada extrato (CE 50).

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Foi utilizado o programa GraphPad Prism 5 para construo dos grficos e testes estatsticos.

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6. RESULTADOS E DISCUSSO

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6. RESULTADOS E DISCUSSO
6.1 Triagem fitoqumica Observou-se nas folhas de P. marginatum a presena de antocianinas, antraquinonas agliconas e glicosdicas, compostos fenlicos (flavonides, taninos e cidos fenlicos), cumarinas, e terpenides (mono, sesqui, di e triterpeno). Os resultados da anlise fitoqumica realizada com os extratos etanlicos das folhas esto apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Caracterizao fitoqumica das folhas de Pseudobombax marginatum (St.-Hil.) Robyns coletadas em Soledade/PB. Grupo metablico Alcalides gerais Antocianinas Antraquinonas agliconas Folhas + ++ ++ +++ + + +++ ++ ++ + + + + -

Compostos fenlicos

Cumarinas Derivados antracnicos Lignanas Mono, sesqui e diterpenos Naftoquinonas Saponinas Triterpenos e esterides Xantinas

Legenda: - = ausente; + = fraco; ++ = moderado; +++ = forte.

Os grupos que mais se destacaram em diversidade foram os terpenides e compostos fenlicos. Na anlise fitoqumica do extrato etanlico das folhas de P. marginatum no foram detectadas as presenas de alcalides gerais, lignanas, naftoquinonas, saponinas e xantinas. Dentre os compostos no detectados, apenas

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as naftoquinonas j foram isoladas de plantas desta famlia na espcie Bombacopsis glabra por SHIBATANI et al. (1999) e KISHORE et al. (2003). De acordo com os resultados obtidos sugere-se que a espcie apresente potencial para atividade antiflamatria e analgsica, pois segundo a literatura, os compostos fenlicos so usados com esta finalidade. J o grupo de terpenides so as principais fontes de leos essenciais e, portanto, podem estar sujeito a apresentar propriedades antinflamatria, analgsica e antioxidante. As amostras estudadas apresentaram fenis simples e flavonides, compostos que tm grande importncia devido as suas aes farmacolgicas, com destaque para ao antioxidante, antidiabtica e hipocolesterolemiante (HARBORNE e WILLIAMS, 2000; MARTENS e MITHFER, 2005). 6.2 Quantificao de fenis e flavonides totais Na Figura 4a pode ser observada a curva de calibrao construda com cido tnico usada para quantificar os fenis totais e na Figura 4b a curva de calibrao construda com rutina usada na quantificao dos flavonides, onde a equao de correlao e o coeficiente de determinao podem se visualizados. As anlises de regresso das curvas de calibrao esto dentro dos limites estabelecidos (mnimo aceitvel R2 = 0,99) e apresentam alta linearidade.

Figura 4. (a) curva de calibrao construda com cido tnico (1,0-5,0 g/mL) usada para quantificar os fenis totais; (b) curva de calibrao construda com rutina (2,0-20,0 g/mL) usada para quantificar os flavonides.

O teste Kolmogorov-Smirnov no apresentou valores uni e bilaterais significativos, indicando que os dados possuem distribuio normal e com isso foram

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empregados testes paramtricos de anlise de varincia e correlao. O contedo de fenis totais e flavonides das folhas de Pseudobombax marginatum (St.-Hil.) Robyns so apresentados na Tabela 3.
Tabela 3. Teores Mdios de Fenis Totais e Flavonides seguidos de Desvio-Padro das folhas de P. marginatum (St.-Hil.) Robyns.

Nome popular Embiratanha

Amostra Fenis totais Flavonides

Teor DP (%) 426,96 10,77 88,76 4,93

CV (%) 2,52% 5,56%

Pode ser observado que a planta se apresenta promissora para aes farmacolgicas, visto que a mesma exibiu teores de fenis e flavonides totais em forma crescente a amostra e alquotas, e assim, enquadrada nos parmetros do padro. 6.3 Atividade antioxidante A atividade antioxidante foi avaliada atravs da captao do DPPH, um radical livre estvel temperatura ambiente e que produz cor violeta na soluo etanlica. Este radical reduzido na presena de molculas antioxidantes, o que promove queda da intensidade de cor em 517 nm (reduo da colorao violeta na soluo). considerado vantajoso este mtodo, pois consiste num mtodo rpido e economicamente acessvel. A curva de calibrao utilizada para avaliar a atividade antioxidante quantitativa pelo mtodo do DPPH pode ser visualizada na Figura 5, obtendo equao de correlao e coeficiente de determinao de y = 0,0302x + 0,0006 e R2 = 0,9998, respectivamente.

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Figura 5. Curva de calibrao construda com 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) no intervalo de 1,040,0 g/mL usada para realizar o estudo da atividade antioxidante.

A CE50 representa o valor da concentrao relacionada com o DPPH remanescente reduzido metade. O valor do CE50 foi obtido atravs da regresso linear sendo que a folha da espcie apresentou atividade antioxidante considervel (CE50 = 108,207,53 g/mL). No entanto este resultado no se repete quando testadas com os padres (cido ascrbico e Rutina). Observa-se, na Tabela 4, que no caso do cido ascrbico (500,0 g/mL) o valor determinado para o CE50 foi de 13,9539 g/mL e para a Rutina (500 g/mL) foi 40,4759 g/mL. Deve-se levar em considerao que os padres so compostos isolados, o que leva a crer que o extrato bruto obteve uma atividade importante. Esse fato se deve provavelmente ao maior teor de taninos presentes nessa espcie, com variados tipos estruturais estudados referidos.
Tabela 4. Concentrao eficiente mdia (CE50) das folhas de de P. marginatum (St.-Hil.) Robyns. comparado aos padres cido ascrbico e Rutina.

Espcie ou Controle cido ascrbico Rutina P. marginatum (St.-Hil.) Robyns.

Parte usada Folha

Rendimento 14,05 0,35

CE50 DP (g/mL) 13,954 40,476 108,20 7,53

Com o resultado da anlise antioxidante observou-se padres considerveis desta atividade. Levando em considerao os dados dos padres, pode-se considerar a espcie como um promissor fitocosmecutico, concordando assim com Bombacopsis quinata, um outro gnero da famlia Bombacaceae, do qual relatado na literatura, foi a nica espcie estudada deste gnero, que foram isolados a flavona 5-hidroxi-3,6,7,8,4-pentametoxiflavona e vrios triterpenos pentacclicos (CALDERON et al., 2000). 6.4 Anlise toxicolgica

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Meyer et al. (1982) estabeleceram uma correlao entre o grau de toxicidade e a concentrao letal mdia (CL50), apresentada por extratos de plantas sobre larvas de A. salina, sendo considerado txico at 500,0 g/ml, moderadamente txico de 500-1000,0 g/ml e atxico acima de 1000 g/ml. Foi observado durante o experimento que, aps 24 horas de exposio, no houve um nmero significativo de bitos das larvas de A. salina expostas para as folhas. A anlise comportamental das larvas na concentrao 1000,0 g/mL em relao ao controle, demonstrando que concentraes elevadas dos extratos tm influncia direta sobre a movimentao das larvas. As larvas expostas concentrao mxima (1000,0 g/mL) dos extratos da folha apresentaram percentuais de vivos superiores a 90%. Desta forma, atravs da Figura 6 pode-se observar que o extrato de P. marginatum se apresentou atxica com valores de CL50 de 10.770 g/mL.

Figura 6 - Percentual de sobreviventes expostos concentraes crescentes de Pseudobombax marginatum CL50 =10.770 g/mL

O resultado da anlise de toxicidade se apresentou bastante relevante, visto que futuras manipulaes para extrair as propriedades medicinais. Esse resultado se mostrou similar relacionada avaliao da toxicidade preliminar de outro gnero da famlia Bombacaceae, Pachira aquatica (Bombax aquaticum Schum.) da qual se apresentou atxica sobre a Artemia salina Leach. (KELLY et al., 2002).

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7. CONCLUSO
7. CONCLUSO
No estudo fitoqumico de P. marginatum foi observado dois grupos de maiores destaques, os terpenides e os compostos fenlicos, desta forma, reconhecendo a atividade antioxidante do extrato. A apresentao desses grupos qumicos sugere o potencial farmacolgico dito por estudo etnofarmacolgicos, assim, designando seu potencial para cura de inflamaes e como analgsicos.

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No que diz respeito toxicidade preliminar, o extrato de P. marginatum apontou significativa importncia, pois os resultados de CL50 ficaram acima de 10.000 g/ml, ou seja, o extrato bruto proveniente da folha de P. marginatum se apresentou atxico. A realizao de estudos como este, fornece informaes sobre plantas medicinais da Caatinga, como os resultados de P. marginatum, que despertaram interesse em avaliar seu potencial farmacolgico, pois apresentou os excelentes resultados antioxidantes, tornando necessrio o aprofundamento do seu potencial teraputico.

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ANEXOS

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Foto1: Folha de P. marginatum retiradas da estufa. Fonte: Arquivo pessoal.

Foto 2: Folhas de P. marginatum trituradas no moinho de facas. Fonte: Arquivo pessoal.

Foto 3: Filtrao do macerado de P. marginatum. Fonte: Arquivo pessoal.