PREPARACIÓN MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO

Establecer los lineamientos para la preparación, esterilización, conservación y control de calidad

de medios de cultivos, homogeneizados y reactivos en el laboratorio de microbiología.

GENERALIDADES Y DEFINICIONES

ASPECTOS PARA TENER EN CUENTA PARA LA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS.

✓ Utilizar preferiblemente, los medios de cultivo deshidratados que ofrecen las firmas
comerciales, pero se pueden preparar en el laboratorio a partir de los componentes
especificados en la formulación.
✓ Los componentes que están en pequeñas concentraciones o son poco solubles, es mejor
añadirlos en forma de soluciones acuosas filtradas, soluciones alcohólicas o alcalinas.
✓ Los componentes como: hidratos de carbono, yema de huevo y sulfito sódico deben
prepararse a parte de los demás componentes del medio, y ser añadidos al medio de
cultivo base en condiciones asépticas.
✓ Disolver los medios por calentamiento hasta ebullición en constante agitación.
✓ Dejar enfriar los caldos a temperatura ambiente y los medios de cultivos a 50ºC, antes de
utilizarlos.
✓ Ajustar el pH del medio agregando solución NaOH o HCl 0.1N según el caso. Si el pH
obtenido es ácido, agregar solución NaOH hasta ajustar. Si el pH es alcalino agregar
solución HCl hasta ajustar.
✓ Dejar secar las placas con medios de cultivo, al lado del mechero con las cajas de Petri
destapadas.
✓ Cerrar muy bien los tubos y recipientes con soluciones o caldos de cultivo, para evitar
derramamiento por el efecto de la ebullición.
✓ Conservar los medios y reactivos en sus envases originales, a temperatura no mayor a 30
°C fuera de la exposición a la luz y la humedad.
✓ Conservar los medios y caldos de cultivos preparados, en la nevera entre 2 y 6 °C de
temperatura.
✓ No utilizar los medios de cultivo deshidratados que presenten alteraciones de color, que
se observen apelmazados o que superen la vigencia establecida por la casa comercial.
✓ Seguir las indicaciones del fabricante para la rehidratación y esterilización de los medios
de cultivo.

CONTROL NEGATIVO: Una cepa cuyo crecimiento y comportamiento no puede evidenciarse,

debido a sus características fisiológicas y bioquímicas, en el medio de cultivo utilizado para el
analito en cuestión.

CONTROL POSITIVO: Una cepa cuyo crecimiento es favorable, en el medio de cultivo utilizado para
el analito en cuestión.

CULTIVO: Es un método utilizado para la multiplicación de microorganismos, tales como bacterias

y hongos, en el que se prepara unas condiciones óptimas para favorecer el proceso deseado.
Pueden ser de dos tipos:
CALDOS DE CULTIVO: Son cultivos de crecimiento líquidos y generalmente se preparan en tubos
de ensayos.

MEDIOS DE CULTIVOS: Son cultivos de crecimiento sólidos y generalmente se preparan en cajas

de Petri grande y pequeñas, se solidifican a una temperatura menor de 45 °C.

DILUYENTE: Es una solución preparada a partir de unos componentes básicos, cuya función radica
en disminuir las concentraciones microbianas de una población, para poder ser examinadas en el
laboratorio. Ejemplo: Solución peptona 0,1 %, solución salina 0,85 %.

FUNDIR: Acción en la que se transforman los medios de cultivos sólidos y semisólidos, a el estado
líquido para permitir su manipulación en las actividades de realización de ensayos.

SOLUCIÓN: Es una mezcla homogénea a nivel molecular o iónico de dos o más sustancias, que no
reaccionan entre sí.

Medios de cultivo a preparar

Leer
información
del fabricante

Pesar la cantidad
necesaria de medio
medir el agua

Esterilizar recipiente
donde se colocará el
medio de cultivo

Preparar medio
de cultivo según Colocar medio
especificaciones de cultivo
del fabricante

Reservar
MATERIALES Y EQUIPOS

✓ Frascos de vidrio con tapa rosca

✓ Agar SPC (Standard Plate Count)
✓ Agar EMB (Eosin Metilen Blue)
✓ Agar Bismuto Sulfito
✓ Peptona Buferada
✓ Caldo Brilla
✓ Vidrios de reloj
✓ Autoclaves
✓ Baño Serológico
✓ Mechero
✓ Trípode
✓ Plancha calentadora
✓ Cajas Petri
✓ Tubos de ensayo
✓ Campanas de Durham

METODOLOGÍA

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS.

Indicaciones generales: La preparación de los medios de cultivos consiste básicamente en seguir

las indicaciones del fabricante, las cuales se encuentran en el inserto de cada medio de cultivo o
reactivo. A continuación se describes las instrucciones generales para preparar los medios de
cultivos y reactivos utilizados en el laboratorio de microbiología:

✓ Leer cuidadosamente las indicaciones descritas en el inserto del frasco.

✓ Pesar en la balanza la cantidad necesaria del polvo.
✓ Cerrar inmediatamente los frascos con medios de cultivos, para evitar que la humedad
altere sus características.
✓ Disolver el polvo deshidratado en agua destilada o desionizada.
✓ Agitar la mezcla, hasta disolver completamente el polvo (En los casos de caldos de cultivo).
En los casos donde los medios de cultivos contienen agar, disolver en baño de vapor y en
constante agitación hasta no observar grumos.
✓ Medir el pH de la mezcla utilizando un pH-metro; si no está disponible, utilizar tirillas
indicadoras de pH.
✓ Si es necesario (Observar en el inserto el requerimiento de pH), ajustar el pH con una
solución de Hidróxido de Sodio (NaOH) 0,1N ó solución de Ácido Clorhídrico (HCl) 0,1N.
✓ Generalmente para los medios líquidos, servir 10 mL en tubos de ensayos taparrosca,
posteriormente incluir en ellos, campanas de Durham y cerrar.
✓ Esterilizar en autoclave 121 °C, 15 PSI durante 15 minutos ó según indicaciones del
fabricante.
✓ Distribuir 20 a 25 ml de medio de cultivo por caja de Petri.
✓ Esperar que solidifiquen.
✓ Rotular el material, describiendo el nombre del medio de cultivo (Para placas de cultivo) y
la fecha de preparación.
ESTERILIZACIÓN.

✓ Seguir las instrucciones del proveedor; generalmente, la esterilización de un medio de

cultivo se realiza a 121°C, 15 PSI durante 15 minutos, pero existen medios que requieren
condiciones especiales de esterilización.
✓ Verificar el cumplimiento de los tiempos para alcanzar la temperatura de esterilización,
con el fin de evitar la degradación de ciertos componentes del medio.
✓ Cuando se esterilizan volúmenes grandes de medio de cultivo, la duración del
calentamiento es más elevada, y podría ocasionar degradación de algunos componentes.
✓ Después de culminado el proceso de esterilización, reducir la presión del equipo
paulatinamente para evitar que la ebullición espontánea del medio levante las tapas del
recipiente y se genere derramamiento.

CONSERVACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS.

✓ Conservar los medios en la nevera entre 2 y 6°C.

✓ Almacenar los medios de cultivos durante máximo tres meses.
✓ No utilizar los medios de cultivo que presenten signos de deshidratación.
✓ Los caldos de cultivo almacenados en tubos de ensayos deben ser conservados por una
semana como máximo.

LICUEFACCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS.

✓ Fundir los medios de cultivos en un baño-maría hirviente. Evitar calentar durante un

periodo de tiempo prolongado.
✓ Antes de servir; conservar los medios de cultivo disueltos en baño-maría a 45 - 50°C.
✓ Servir los medios de cultivos cuando estos se encuentren a una temperatura entre 45 – 50
°C.
✓ No mantener licuado un medio durante más de 4 horas y no fundir un medio de cultivo
más de una vez.
✓ Verter de 20 a 25 ml de medio en las cajas de Petri grandes y verter de 5 a 10 ml de medio
en cajas Petri pequeñas.
✓ Cuando se realiza siembra en profundidad; agregar de 20 a 25 ml de medio de cultivo por
caja de Petri.

PREPARACIÓN DE HOMOGENIZADOS

✓ Utilizar puntas o pipetas estériles, para tomar las alícuotas de muestras y realizar las
diluciones.
✓ Utilizar para cada dilución una punta o pipeta estéril.
✓ No preparar diluciones o placas fluidas bajo la luz solar directa.
✓ Proteger los extremos de las pipetas, del contacto con la superficie de los mesones,
guantes, recipientes de muestras y de otros materiales, para evitar contaminación
cruzada.
✓ Introducir las puntas o las pipetas a una profundidad no mayor de 2.5 cm, en las muestras
o en los tubos con diluyente.
✓ Depositar las porciones de muestra ubicando la pipeta en un ángulo aproximado de 45º,
con el extremo tocando el fondo de la caja de Petri.
 ✓ Levantar la tapa de la caja Petri cuidadosamente para evitar el contacto de los bordes con
la pipeta.
✓ Drenar la alícuota contenida en la pipeta durante unos segundos, afincando la punta de la
pipeta sobre un punto seco de la caja de Petri.

PREPARACIÓN DE DILUYENTES.

Agua Peptonada al 0.1%.

✓ Pesar en la balanza un (1) gramo de peptona.

✓ Agregar en un recipiente de vidrio la cantidad pesada y completar con agua destilada un
volumen de 1000 mL.
✓ Agregar 9, 99 ó 225 mL de solución peptona 0,1% en tubos de ensayos taparrosca o
frascos según el caso, y cerrar correctamente.
✓ Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 PSI durante 15 minutos.

Solución salina isotónica.

✓ Pesar en la balanza 8,5 gramos de Cloruro de Sodio (NaCl).

✓ Agregar en un recipiente de vidrio la cantidad pesada y completar con agua destilada un
volumen de 1000 mL.
✓ Agregar 9, 99 ó 225 mL de solución salina en tubos de ensayos taparrosca o frascos según
el caso, y cerrar correctamente.
✓ Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 PSI durante 15 minutos.

Preparación de diluciones.

✓ Agitar cuidadosamente las muestras 25 veces, para homogeneizar.

✓ Preparar diluciones consecutivas de la muestra, (10-1, 10-2, 10-3,10-n etc.) según el
criterio establecido para cada una de ellas.
✓ Preparar la dilución 10-1 de muestras, midiendo10 ml de la muestra en un frasco de
dilución que contenga 90 ml del agua Peptonada 0.1% o sea el caso su proporción
equivalente 1/9 (1 ml de muestra en 9 ml de diluyente).
✓ Transferir 10 ml de la muestra, en un frasco de dilución con 90 ml de agua de peptona
0.1%, para obtener una dilución 10-1.
✓ Agitar vigorosamente el frasco, dejar en reposo.
✓ Preparar la dilución 10-2, transfiriendo 1ml de la dilución 10-1, a un tubo de dilución que
contenga 9ml de agua Peptonada 0.1%, agitar cuidadosamente.
✓ Preparar la dilución 10-3, transfiriendo 1ml de la dilución 10-2, a un tubo de dilución que
contenga 9 ml de agua Peptonada 0.1%, agitar cuidadosamente.
✓ Repetir estos pasos hasta obtener el número de diluciones necesarias. Cada dilución
sucesiva disminuirá 10 veces la concentración.
✓ El rango de diluciones preparadas puede modificarse en función a la cifra de
microorganismos esperada. Se deben analizar siempre tres diluciones consecutiva
BIBLIOGRAFÍA

ISO/IEC 17025:2005 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y

calibración.

Manual de técnicas de análisis microbiológico de alimentos INVIMA 1998.

ISO 9001:2008 Requisitos de un sistema de gestión de calidad.

Universidad Nacional de Nordeste. 2006. Microbiología General – Medios de cultivos. Disponible

en: http://www.biologia.edu.ar/microgneral/tp4.pdf