Los corticoesteroides inhalados regulan el receptor ACE2 del SARS-CoV-2

en la EPOC mediante la supresión del interferón de tipo I.

Financiación: Este trabajo fue apoyado por una Beca de Formación en
Investigación Clínica del Wellcome Trust para A.S. (subvención número
WT096382AIA), un Premio Semilla en Ciencia del Wellcome Trust para A.S.
(subvención número 215275/Z/19/Z), una subvención de la Sociedad Británica de
Quimioterapia Antimicrobiana COVID-19 para A.S., un premio al investigador
superior del Instituto Nacional de Investigación Sanitaria (NIHR) a S.L.J., el plan
de financiación del profesorado clínico (PM) del NIHR y la financiación del plan del
Colegio Imperial y el Centro de Investigaciones Biomédicas (BRC) del NIHR.
Conflictos de intereses: S.L.J. ha recibido personalmente honorarios de
consultoría de Myelo Therapeutics GmbH, Concert Pharmaceuticals, Bayer, y
Sanofi Pasteura, y Aviragen; él y su institución recibieron honorarios de consultoría
de Synairgen, Novarits, Boehringer Ingelheim, Chiesi, GlaxoSmithKline, y
Centocor. S.L.J. es un inventor de patentes sobre el uso de interferones inhalados
para el tratamiento de las exacerbaciones de enfermedades de las vías
respiratorias. M.A.C. fue empleado por Chiesi Pharmaceuticals desde enero de
2015 hasta noviembre de 2017. A.S. ha recibido honorarios por hablar de
AstraZeneca. El resto de los autores declaran que no hay intereses en conflicto.
Resumen
La enfermedad del virus de la coronación 2019 (COVID-19) causada por el SARS-
CoV-2 es una nueva enfermedad infecciosa de rápida propagación. Los primeros
informes de casos de COVID-19 hospitalizados han mostrado una frecuencia
relativamente baja de enfermedades pulmonares crónicas como la enfermedad
pulmonar obstructiva crónica (EPOC), pero un mayor riesgo de resultados
adversos. Los mecanismos de la susceptibilidad alterada a la adquisición de virus
y/o a la enfermedad grave en los grupos de riesgo no se conocen bien. Los
corticoesteroides inhalados (SCI) se utilizan ampliamente en el tratamiento de la
EPOC, pero se desconoce hasta qué punto estas terapias protegen o exponen a
los pacientes con EPOC al riesgo de un aumento de la gravedad de la EPOC-19.
Aquí, utilizando una combinación de modelos de enfermedad in vitro e in vivo en
humanos y animales, mostramos que la administración de SCIatenúa la expresión
pulmonar de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) del receptor de
entrada viral SARS-CoV2. Este efecto fue impulsado mecánicamente por la
supresión del interferón de tipo I como interferón exógeno -β revirtió la regulación
descendente de la ACE2 por el ICS.
Los ratones deficientes en el receptor del interferón tipo I-α/β (Ifnar1-/-) también
tuvieron una expresión reducida de ACE2.
En conjunto, estos datos sugieren que el uso de terapias con SCI en la EPOC
reduce la expresión del receptor de entrada del SARS-CoV2, el ACE2, y este
efecto puede contribuir a la alteración de la susceptibilidad a la COVID-19 en
pacientes con EPOC.
Introducción
La enfermedad del virus de la coronación 2019 (COVID-19) causada por la
infección del SARS-CoV-2 es una nueva infección de rápida propagación que
puede causar un espectro de enfermedades que van desde una enfermedad leve
autolimitada hasta una grave insuficiencia respiratoria que requiere asistencia
respiratoria. En la orientación actual se propugna que las personas de alto riesgo,
incluidas las que padecen enfermedades pulmonares crónicas como el asma
grave y la EPOC, deben ser protegidas para reducir el riesgo de adquisición del
virus (1). Esta orientación se basa en el amplio conocimiento previo de que estas
condiciones son exquisitamente susceptibles de ser exacerbadas por una serie de
infecciones de virus respiratorios (2). Sin embargo, las primeras pruebas han
indicado que la prevalencia del asma y la EPOC entre los casos de COVID-19
hospitalizados puede ser inferior a la de la población general, en contraste con
otras comorbilidades crónicas como la hipertensión y la diabetes, lo que hace
especular sobre un posible fenotipo protector (3). Por el contrario, se ha
demostrado que la EPOC (pero no el asma) se asocia con un mayor riesgo de
mortalidad relacionada con COVID-19 (4, 5), lo que sugiere que estos pacientes
podrían teóricamente estar protegidos contra la adquisición del virus, pero
paradójicamente con un mayor riesgo de complicaciones si se infectan.
Los corticoesteroides inhalados (CEI) son terapias de base para las enfermedades
de las vías respiratorias y confieren efectos beneficiosos, incluida la protección
contra las exacerbaciones (6, 7), lo que sugiere que estos medicamentos pueden
reducir el riesgo de adquisición de virus o, alternativamente, suprimir la
inflamación inducida por el virus y prevenir las manifestaciones sintomáticas. A la
inversa, nosotros y otros, hemos demostrado que los SCI tienen el efecto adverso
de suprimir las respuestas inmunitarias innatas a la infección por rinovirus y gripe,
lo que da lugar a una mayor replicación del virus (8-10), aunque se ha notificado el
efecto opuesto (protector) de los SCI in vitro en el caso del coronavirus estacional
229E (11) y el SARS-CoV-2 (12). Por lo tanto, no está claro si, en general, los ISC
tienen un efecto protector o perjudicial en las respuestas inmunitarias al SARS-
CoV-2 y se desconoce en qué medida estos medicamentos ampliamente
utilizados protegen o exponen a los pacientes con asma o EPOC al COVID-19.
El SARS-CoV-2 utiliza la enzima convertidora de angiotensina (ECA)-2 del
receptor de entrada con cebado de la proteasa serina TMPRSS2 (Transmembrane
protease, serina 2) para entrar en la mucosa respiratoria y causar una infección
activa (13). Recientemente se ha informado de un aumento de la expresión de la
ECA2 epitelial en fumadores y sujetos con EPOC (14) y se postula que es un
factor que predispone a estos individuos a un resultado adverso de la COVID-19.
Por el contrario, el ACE2 se regula a la baja en el asma (15), un efecto que puede
deberse a los efectos supresores de las citoquinas de tipo 2 (16) o estar
relacionado con el uso de los ISC (17).
Las nuevas pruebas también indican que la expresión de los IECA se co-localiza
con los genes inmunes que participan en las vías de señalización del
interferón(18). Además, Ziegler y otros han aclarado recientemente que los IECA
son genes estimulados por el interferón en las células epiteliales respiratorias
humanas (19), lo que indica que las vías antivirales pueden ser importantes para
la regulación de la expresión pulmonar de los IECA. Hemos informado
anteriormente de que los CSI suprimen potencialmente la expresión epitelial de los
IFN de tipo I y los genes estimulados por el interferón (ISG) en una serie de
modelos de EPOC in vitro e in vivo (8), y es posible que la supresión de los IFN
por medio de los CSI pueda reducir la regulación de la IECA2 en los pulmones y,
por lo tanto, sea un determinante importante de la susceptibilidad al SARS-CoV-2
en los pacientes con enfermedades pulmonares crónicas.
Aquí, mostramos que la administración de ICS atenúa la expresión pulmonar de
ACE2, un efecto observado consistentemente a través de un rango de modelos de
EPOC humanos y animales. Usando experimentos funcionales, demostramos que
la regulación descendente de ACE2 está mecánicamente relacionada con la
supresión del interferón tipo I por el ICS. Estos datos indican que el uso de
terapias con CSI altera la expresión del receptor de entrada del SARS-CoV-2 y,
por lo tanto, puede contribuir a alterar la susceptibilidad a la COVID-19 en
pacientes con EPOC.
Resultados
La expresión del ARNm del ACE2 se reduce en los pacientes con EPOC que
toman corticosteroides inhalados.
Datos recientes indican que la expresión del ARNm del ICE2 en el esputo se
reduce en los sujetos asmáticos que toman CSI (17), pero no está claro si se
produce una supresión similar en el contexto de la EPOC. Por lo tanto,
inicialmente utilizamos una cohorte comunitaria de 40 sujetos con EPOC (20) para
determinar si el uso de ICS afecta a la expresión de ACE2 en la EPOC. 36 de los
40 sujetos tenían suficiente muestra para la evaluación y se estratificaron de
acuerdo con el uso actual (n=18) o el no uso (n=18) de los CSI. No hubo
diferencias significativas entre estos grupos en cuanto a edad, gravedad de la
enfermedad, hábito de fumar u otras comorbilidades que se sabe que afectan a la
expresión de los IECA y/o que se asocian con un mayor riesgo de COVID-19
(Tabla 1). La expresión del ARNm del ICS2 de las células del esputo fue
detectable en 22/36 sujetos con EPOC (61,1%) y, de acuerdo con observaciones
previas en el asma (17), se redujo significativamente en los usuarios del ICS en
comparación con los no usuarios (Fig 1a). La expresión de células de esputo de la
proteasa serina TMPRSS2 que utiliza el SARS-CoV-2 para la entrada en la
mucosa (13) fue detectable en todos los sujetos sin que se observara una
diferencia significativa entre los usuarios y no usuarios de CSI (Fig 1b). De manera
análoga, el receptor alternativo del SARS-CoV CD147 (21) (gen: Basigin BSG) fue
detectable en todos los sujetos sin que se observaran diferencias entre los
usuarios y no usuarios de los SCI (Fig. 1 suplementaria).
La administración de corticoesteroides inhalados suprime la expresión
pulmonar de ACE2 en ratones
Dado que la causa y el efecto no se pueden inferir de un estudio transversal en
humanos, a continuación evaluamos si la administración pulmonar experimental
del propionato de fluticasona (PF) del CSI en ratones, a una dosis que
previamente se demostró que inducía la activación de los receptores de
glucocorticoides (GR) pulmonares (8, 22), tenía efectos similares en la expresión
del Ace2. Una sola administración de 20µg de PF en ratones (Fig. 2a) indujo una
significativa disminución de la expresión del ARNm del Ace2 pulmonar a las 8
horas (un punto temporal en el que también hemos demostrado previamente que
se produce una significativa activación del GR (8)). Este efecto persistió a las 24
horas después de la administración, pero se resolvió a partir de las 48 horas (Fig
2b). En consonancia con los efectos observados en el esputo humano, la
administración de PF no tuvo ninguna expresión de efecto de Tmprss2 o pulmón
de ratón Bsgin (Fig. 2 suplementaria). La supresión del Ace2 por la PF ocurrió de
forma dosis-dependiente con una pérdida de supresión a una concentración diez
veces menor (2µg)(Fig 2c), dosis a la que también se pierden los efectos sobre la
activación de los GR (8). Observamos una supresión similar de la expresión del
ARNm del Ace2 en el pulmón con la administración de 20µg de otra budesonida y
beclometasona de CSI de uso común, lo que sugiere que el efecto del CSI en el
Ace2 no es dependiente de la clase (Fig 2d). Para corroborar los efectos
observados en la expresión del ARNm del Ace2, posteriormente medimos los
niveles de proteína en el homogeneizado de pulmón de los ratones tratados con
CSI mediante ELISA. Observamos una supresión similar de la proteína ACE2 total
del pulmón que se produjo a las 24 horas posteriores a la administración, lo que
concuerda con los efectos observados en el nivel de ARNm (Fig 2e)
La desregulación del ACE2 por la FP está funcionalmente relacionada con la
supresión del IFN de tipo I
Recientemente se ha informado de que el ACE2 se co-localiza con la expresión de
los genes relacionados con el IFN de tipo I (13, 18) y también se ha demostrado
que es un gen estimulado por el interferón (ISG) en el tracto respiratorio (19), lo
que sugiere que el IFN de tipo I puede ser un importante regulador de la expresión
del ACE2 pulmonar. Consecuentemente con esto, observamos que la expresión
del Ace2 pulmonar basal en ratones se correlacionó positivamente con la
expresión del ARNm del ISG 2'-5' OAS y las concentraciones de BAL del IFN-λ en
un análisis combinado de los ratones tratados con FP y vehículo (Fig 3a). Dados
nuestros datos anteriores que muestran que los pacientes con EPOC tratados con
SCI tienen una expresión basal reducida de IFNb en las vías respiratorias (8),
planteamos la hipótesis de que la regulación a la baja del ACE2 por la PF puede
estar funcionalmente relacionada con sus efectos supresores sobre la señalización
del IFN de tipo I. En consecuencia, la administración recombinante de IFNb (Fig
3b) podría revertir la supresión mediada por PF del ARNm del Ace2 y de la
proteína ACE2 (Fig 3c), lo que indica que el efecto de la PF en la expresión de la
ACE2 está funcionalmente relacionado con los efectos supresores sobre el IFN de
tipo I.
Si los ratones de Nnar-/- han reducido la expresión basal del ACE2
Para confirmar aún más la importancia funcional del IFN de tipo I en la regulación
de la IECA pulmonar, evaluamos los niveles de expresión pulmonar basal en
ratones deficientes en la señalización del IFN (Ifnar-/-). En comparación con los
ratones de control de tipo silvestre, los ratones Ifnar-/- tuvieron una pequeña, pero
estadísticamente significativa, reducción en la expresión del ARNm de la IECA2
pulmonar (Fig 4a) con una tendencia concomitante (P=0,15) hacia la reducción de
los niveles de proteína de la IECA2 pulmonar (Fig 4b). Estas observaciones
confirman además el papel regulador clave que desempeña la señalización de IFN
de tipo I en la expresión pulmonar de la IECA2.
El efecto supresor de los ICS sobre la expresión del ACE2 se produce en el
epitelio bronquial
Los datos existentes indican que el ACE2 se expresa principalmente en el epitelio
nasal y bronquial y está ausente de las células inmunes (16). Dados nuestros
datos previos que indican que la PF también ejerce sus efectos inhibidores sobre
la inmunidad principalmente en el epitelio pulmonar (8, 23), a continuación,
evaluamos si también se observaron efectos supresores sobre la ICE2 tras la
administración ex vivo de ICS en células epiteliales bronquiales cultivadas de la
EPOC (CEB, Fig 5a). En el cuadro 2 se muestran las características básicas de
los sujetos incluidos en estos análisis. De acuerdo con los recientes estudios de
expresión in situ en pacientes con EPOC (14), encontramos que la expresión
basal de la ICE2 se incrementó en ~3 veces en las CEB de los pacientes con
EPOC en comparación con los no fumadores sanos (Fig 5b). De acuerdo con
nuestros hallazgos en usuarios humanos de CSI y en el modelo de ratón de
administración de CSI (Figs 1 y 2), la administración de PF (a una concentración
clínicamente relevante de 10nM) indujo una supresión de ~75% en la expresión
del ACE2 (Fig 5c).
La PF regula la expresión de la IECA pulmonar en un modelo de ratón de
EPOC.
Para confirmar aún más que la administración del ICS suprime la expresión del
ACE2 en la EPOC, empleamos un modelo de ratón de enfisema inducido por
elastina que recapitula muchos rasgos distintivos de la enfermedad humana (24).
Los ratones fueron tratados por vía intranasal con una dosis única de elastasa
pancreática porcina (Fig 6a).
y la expresión del ACE2 pulmonar se midió a los 10 días de su administración
(punto de tiempo en el que se establecen las características de la enfermedad
similares a la EPOC (24)) y otros 7 días más tarde. De acuerdo con nuestros
hallazgos en las células de la EPOC humana, los ratones tratados con elastasa
habían aumentado significativamente (~5 veces) la expresión de ACE2 pulmonar a
los 10 días con un aumento adicional a >15 veces a los 17 días (Fig 6b). La
administración de una dosis única de PF a los 10 días atenuó el aumento
significativo de las concentraciones de ARNm del Ace2 pulmonar (Fig 6c) y de
proteínas ACE2 medidas 24 horas más tarde en ratones tratados con elastasa (Fig
6d). Por lo tanto, los efectos supresores de los CSI sobre la ICE2 también se
producen en un modelo in vivo de una enfermedad similar a la EPOC.
Discusión
Los mecanismos que impulsan la susceptibilidad alterada a la COVID-19 en las
enfermedades pulmonares crónicas y si las terapias comúnmente utilizadas, la
ICS, promueven o protegen contra la infección por el SARS-CoV-2 es una
cuestión crucial para el campo. En este estudio, demostramos de manera
consistente, a través de una gama de modelos humanos y animales, que el ACE2,
un receptor que facilita la entrada del SARS-CoV en el tracto respiratorio, está
aumentado en la EPOC y suprimido por el tratamiento con CSI. Nuestros estudios
indican un nuevo mecanismo para la regulación a la baja del ACE2 por el CSI a
través de la supresión del interferón tipo I.
Hay pruebas claras que respaldan la premisa de que el ACE2 media la entrada de
las células del SARS-CoV2 en el tracto respiratorio y también actúa como un
receptor importante de los coronavirus SARS-CoV1 y NL63 (13, 25, 26). La
entrada viral se produce como un proceso de dos etapas con la unión inicial de la
porción N-terminal de la proteína viral al receptor de la ECA2, seguida de la
división de la proteína viral facilitada por el receptor de la proteasa transmembrana
serina 2 (TMPRSS2) (13). El bloqueo terapéutico de la TMPRSS2 inhibe la
entrada del SARS-CoV-1 y -2 en las células, lo que apoya un papel crítico de esta
proteasa en la patogénesis viral (13). Nuestros datos indican una clara regulación
a la baja de la ICE2 por parte de los CSI, pero sin efecto concomitante sobre la
TMPRSS2. Aunque el papel preciso de la ICE2 en la patogénesis de COVID-19 no
está totalmente caracterizado, varias líneas de evidencia indican el importante
papel que desempeña en la mediación de la entrada del virus y en la facilitación
de la patogénesis de la enfermedad del SARS-CoV. En el SARS-CoV-1, una
mayor expresión de los IECA aumenta la susceptibilidad in vitro a la infección (27).
Además, en los modelos animales, la sobreexpresión de Ace2 aumenta la entrada
del SARS-CoV-1, los anticuerpos anti-ACE2 pueden bloquear la invasión viral y se
observa una menor patología pulmonar en los ratones con deficiencia de Ace2
(25, 28, 29).
El IECA2 se expresa principalmente en las células del cáliz nasal y en los
neumocitos de tipo II del tracto respiratorio (30) y se regula al alza en los grupos
de sujetos que se sabe que están asociados con el aumento de la gravedad de la
enfermedad, entre ellos las personas de edad avanzada(31) y los pacientes con
diabetes(17), lo que indica que puede desempeñar una función clínicamente
importante en la determinación de la susceptibilidad a la adquisición de virus y/o el
desarrollo de enfermedades graves en los grupos de riesgo. Se ha demostrado
igualmente que la expresión de los IECA2 aumenta en la EPOC: mediante análisis
transcriptómicos e inmunohistoquímicos combinados, Leung y otros demostraron
recientemente que la expresión epitelial de los IECA2 aumenta en los cepillados
bronquiales/muestras de tejidos de sujetos con EPOC frente a los controles
sanos(32), efectos que también se han demostrado anteriormente en modelos
animales de exposición al humo del cigarrillo(33). Nuestros datos que muestran un
aumento de la expresión de los ACE2 en los cultivos de células epiteliales de las
vías respiratorias y en un modelo de ratón con elastasa de la EPOC son
coherentes con estos hallazgos. Las tasas de pacientes con EPOC hospitalizados
con COVID-19 han sido relativamente bajas, y oscilan entre el 1,1% de las
cohortes chinas y el 5% de las estadounidenses (34-37)
Sin embargo, los pacientes con EPOC tienen un mayor riesgo de enfermedad
grave y mortalidad por COVID-19 (4).
Estos datos sugieren que la EPOC puede estar asociada con una posible
protección contra la necesidad de hospitalización (posiblemente debido a la
reducción del riesgo de adquisición del virus) pero una mayor propensión a la
enfermedad grave en caso de infección. La pandemia original del SARS-CoV-1
también se caracterizó por una prevalencia extremadamente baja de
comorbilidades de enfermedades pulmonares crónicas (38, 39), efecto que
también podría haber sido impulsado por la supresión del ICS2 en estos sujetos.
El mecanismo subyacente a estas supuestas alteraciones de la susceptibilidad no
se ha explorado ampliamente. Nuestros datos sugieren que la supresión de ACE2
por las terapias comúnmente usadas ICS puede ser un factor importante que dicta
la susceptibilidad en la EPOC.
Actualmente no se ha demostrado una relación causal directa entre el ICE2 y el
aumento de la susceptibilidad a la adquisición del SARS-CoV-2 o su posterior
gravedad, y no podemos concluir de manera inequívoca que la disminución del
ICE2 por parte de los CSI sea un efecto que confiera protección desde el punto de
vista clínico. En el asma, una enfermedad en la que se prescriben más
comúnmente los CSI que en la EPOC, la expresión del ACE2 se reduce en
comparación con los sujetos sanos (15) y también se atenúa aún más en los
usuarios de CSI (17). A diferencia de la EPOC, no se ha demostrado que el asma
esté asociada con un aumento de la mortalidad por COVID-19 (5) y el uso más
generalizado de los CSI con la supresión asociada de los IECA2 podría ser
teóricamente un factor que lo impulsara. Por el contrario, es importante señalar
que hay pruebas que sugieren que la supresión de la ICS2 también podría
teóricamente empeorar el resultado. En modelos de ratón de aspiración de ácido
inducido experimentalmente y sepsis, la supresión genética de ACE2 empeora la
lesión pulmonar aguda, un efecto que es parcialmente rescatado por la
administración recombinante de ACE2(40). El ACE2 también degrada la
angiotensina II, que puede impulsar la producción de citoquinas proinflamatorias
(41, 42), lo que puede ser perjudicial en el contexto de la hiperinflamación
característica de la COVID-19 grave (43). La regulación a la baja de la ICE2 por el
CSI podría, por lo tanto, eliminar las funciones protectoras homeostáticas críticas
dentro de los pulmones y, por lo tanto, promover la enfermedad grave en COVID-
19.
El uso de los SCI también puede tener otros efectos perjudiciales en la inmunidad
innata a otros virus respiratorios (que también puede ocurrir en el contexto de la
infección por el SARS-CoV-2), entre ellos la supresión del interferón de tipo I, que
provoca un aumento de la replicación del virus (8-10) y una patología inducida por
el virus que incluye la hipersecreción de la mucosidad y la infección bacteriana
secundaria (8). Por lo tanto, actualmente no podemos determinar si el claro efecto
supresor del CSI sobre la expresión del ICE2 que se muestra en nuestros
experimentos tendría en general efectos protectores o perjudiciales en el contexto
de la enfermedad clínica. Se necesitan más experimentos de manipulación
funcional (por ejemplo, la provocación del SARS-CoV-2 en animales con
agotamiento del ECA2 tratados con CSI), junto con estudios prospectivos del uso
de los CSI como predictor de la susceptibilidad a la infección por el SARS-CoV-2,
para comprender las consecuencias directas de este efecto. Si la regulación
descendente de los ICE2 confiere protección contra la infección por SARS-CoV-2,
entonces nuestros resultados sugerirían que estas terapias deberían continuar de
manera estricta en sujetos con asma y EPOC. También podría indicar que las
terapias que se están ensayando actualmente, como la recombinante IFN-β,
podrían teóricamente inducir el efecto adverso de aumentar el IECA2 y promover
una mayor entrada viral.
Es importante comprender el mecanismo mediante el cual los SCI suprimen la
expresión del ACE2 para delinear la forma en que este efecto podría aprovecharse
como factor de protección o invertirse si se considera perjudicial. Hemos
demostrado anteriormente que los SCI pueden suprimir el IFN de tipo I tanto en
estado estable como durante la infección activa del virus (8). Aquí, mostramos que
este efecto impulsa directamente la supresión de la expresión de ACE2 ya que la
administración del IFN-β recombinante en combinación con la FP podría revertir la
regulación a la baja de ACE2. Además, los ratones Ifnar -/- que carecen de
señalización de IFN tipo I también han reducido el ACE2 proporcionando evidencia
adicional de que la expresión está directamente regulada por el IFN tipo I. Estos
hallazgos son coherentes con estudios recientes que muestran que los genes
relevantes para las vías de IFN (IFNAR1, IFITM1) se expresan en los neumocitos
ACE2+ de tipo 2 y que los IFN de tipo I pueden aumentar la regulación de ACE2
en una serie de sistemas experimentales (13). Además, demostramos que otros
dos SCI de uso común, la budesonida y la beclometasona, tienen efectos similares
sobre el IECA2, lo que confirma que, en contraste con el deterioro de la inmunidad
antibacteriana (22), el efecto supresor del SCI sobre el IECA2 no depende de la
clase. Esto también es consistente con el mecanismo de supresión del IFN, ya que
también hemos demostrado anteriormente que la budesonida suprime el IFN en
un grado similar al de la PF (8).
En resumen, estos estudios indican que el uso de corticoesteroides inhalados en
la EPOC suprime la expresión del receptor ACE2 del SARS-CoV-2 a través de un
mecanismo dependiente de interferón de tipo I. Es probable que estos efectos
contribuyan a la alteración de la susceptibilidad a la COVID-19 en los pacientes a
los que se les prescriben estas terapias.
Ahora se necesitan más estudios para dilucidar los efectos precisos que la
expresión alterada del IECA2 tiene en la adquisición de la infección por el SARS-
CoV-2 y la gravedad asociada en la COVID-19.
Materiales y métodos
La cohorte de EPOC del Hospital St. Mary's
Se utilizó una cohorte de 40 personas previamente reclutadas para un estudio
longitudinal realizado en el hospital St Mary's entre junio de 2011 y diciembre de
2013 para investigar la relación entre el uso de los CSI y la expresión de los
ACE2. El estudio recibió la aprobación ética del Comité de Ética de la
Investigación de East London (número de estudio 11/LL/0229). Todos los sujetos
incluidos tenían EPOC confirmada espirométricamente y fueron vistos cuando
estaban clínicamente estables (sin episodios de infecciones agudas, tratamiento
con antibióticos o tratamiento con corticosteroides orales en las 8 semanas
previas). Todos los pacientes fueron sometidos a evaluación clínica, espirometría
y tuvieron esputo espontáneo o inducido, tomado y procesado como se describió
anteriormente (20, 44) Los sujetos fueron estratificados en base al uso actual o no
de CEI, ya sea en un inhalador de un solo agente o en combinación con
broncodilatadores.
Tratamiento de las células epiteliales bronquiales primarias cultivadas
Se obtuvieron BECs primarias broncoscópicas de seis sujetos con EPOC
confirmada espirométricamente y seis sujetos de control sanos no fumadores. El
estudio fue aprobado por el comité de ética de Bromley (REC: 15/LO/1241). Las
células primarias fueron cultivadas en frascos T75 cubiertos de colágeno en medio
LH-9 hasta un 80% de confluente antes de ser sembradas a 2,5 x 105 células por
pozo en una placa de 24 pozos. Las células fueron tratadas con 10nM FP (Sigma
Aldrich) o dimetilsulfóxido de vehículo (DMSO), como se informó anteriormente
(23).

Modelos de ratones
En todos los estudios se utilizaron ratones C57BL/6 hembra de 8 a 10 semanas de
edad. Los ratones fueron comprados en los laboratorios Charles River del Reino
Unido, alojados en jaulas ventiladas individualmente dentro de condiciones
específicas libres de patógenos. Los ratones Ifnar- -/- fueron criados en la casa en
un fondo C57BL/6. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo
la autoridad del Ministerio del Interior del Reino Unido dentro de la Ley de
Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 (número de licencia del proyecto
70/7234).
El propionato de fluticasona, Budesonida o polvo de Beclometasona (Sigma-
Aldrich) fue resuspendido en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración de 357
µg/mL y luego diluido 1: 1000 en PBS estéril.
Se trató a los ratones por vía intranasal bajo una ligera anestesia de isofluorano
con una solución de 50 µl que contenía 20, 6,7 ó 2 µg de fluticasona o 20 µg de
budesonida o beclometasona (8, 22). Los ratones fueron sacrificados para los
análisis finales a las 8, 24, 48 o 96 horas después de la administración de PF. En
algunos experimentos, dos horas después de la administración de PF, los ratones
fueron tratados adicionalmente por vía intranasal con 50µL de PBS que contenía
104 unidades de IFN-b recombinante (8).
Extracción de ARN, síntesis de ADNc y PCR cuantitativa
El ARN se extrajo de lisados de células epiteliales de las vías respiratorias
primarias, células de esputo humano o tejido pulmonar de ratones usando un kit
RNeasy (Qiagen). Se utilizaron 2µg para la síntesis de ADNc utilizando el kit RT
Omniscript (Qiagen). La PCR cuantitativa se llevó a cabo utilizando cebadores y
sondas específicas previamente descritas y normalizadas al gen de mantenimiento
del ARNr 18S. (8) Las reacciones se analizaron utilizando la máquina de PCR en
tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems).
Ensayos de proteínas
Se utilizó un kit duoet ELISA (Abcam) disponible en el mercado para medir las
concentraciones totales de ACE2 en el homogeneizado de pulmón de ratón. El
límite inferior de detección de este ensayo es de 10 pg/mL. También se midieron
las concentraciones de IFN-λ en el BAL de los ratones utilizando un kit duoet
ELISA disponible en el mercado (Bio-techne), como se informó anteriormente (8).
Análisis estadísticos
Para los experimentos con animales se utilizaron grupos de 5 ratones por
condición y los datos se presentan como media+/-SEM representativa de al menos
dos experimentos independientes. Los datos fueron analizados por el ANOVA de
un solo uso con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. La expresión del
ARNm en las células de esputo de los usuarios del SCI frente a los no usuarios o
en los lisados celulares de las células epiteliales cultivadas ex vivo y tratadas con
PF se comparó con la prueba U de Mann Whitney. Todos los análisis se realizaron
utilizando el Prisma GraphPad versión 8. Las diferencias se consideraron
estadísticamente significativas cuando P<0,05.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES
Concepción y diseño: LJF, NG, JAW, NWB, PM, SLJ, AS; Trabajo experimental:
LJF, NG, HF, JA, PF, SVK, MT, MAC, AS; Escritura y Evaluación Crítica de
Manuscritos: Todos los autores
RECONOCIMIENTOS: Nulo
 Bibliografia
1. . Public Health England. COVID-19: Guidance on social
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Figuras

Figura 1: Expresión del gen del esputo de ACE2 y TMPRSS2 en sujetos con
EPOC estratificados según el uso o no de corticoesteroides inhalados. Se
tomaron muestras de esputo de una cohorte de pacientes con EPOC cuando
estaban clínicamente estables durante al menos 6 semanas. Los pacientes fueron
estratificados según el uso o no uso actual de corticoesteroides inhalados (ICS).
La expresión del ARNm de las células del esputo de (a) ACE2 y (b) TMPRSS2 se
midió mediante PCR cuantitativa. Los gráficos de caja y bigotes muestran la
mediana (línea dentro de la caja)), el rango intercuartílico (IQR; caja) y de mínimo
a máximo (bigotes). Comparaciones estadísticas realizadas con la prueba U de
Mann Whitney. *P<0.05
Figura 2: La administración de corticoesteroides inhalados regula la
expresión de ACE2 en el pulmón del ratón.
a) Los ratones C57BL/6 fueron tratados por vía intranasal con una dosis única de
propionato de fluticasona (PF) o control DMSO del vehículo. b) La expresión del
ARNm del Ace2 pulmonar se midió mediante qPCR en los puntos temporales
indicados tras la administración de 20g de PF c) La expresión del ARNm del Ace2
pulmonar se midió mediante qPCR en las 24 horas siguientes a la administración
de una dosis única de PF en dosis de 20, 6,7 y 2g. d) La expresión del ARNm del
Ace2 pulmonar se midió mediante qPCR a las 24 horas de la administración de
una dosis única de 20 g de budesonida (Bud), beclometasona (Beclo) o control del
vehículo. e) La proteína ACE2 en el homogeneizado de tejido pulmonar se midió
mediante ELISA a las 24 horas de la administración de una dosis única de 20 g de
PF. Los datos representan la media (+/-) de SEM de 4-5 ratones por grupo de
tratamiento, representativo de al menos dos experimentos independientes. Datos
analizados por un ANOVA unidireccional con un post-test de Bonferroni. *P<0,05
*** P <0,001. ns = no significativo. VEH = control de vehículos.
Figura 3: La disminución del ACE2 por la inhalación de corticoesteroides
está funcionalmente relacionada con la supresión del IFN de tipo I.
a) Correlación entre el ARNm del Ace2 pulmonar y el OAS y el IFN del BAL 2'-5'-λ
en ratones C57BL/6.
(b) Los ratones C57BL/6 fueron tratados intranasalmente con propionato de
fluticasona (20g) o control DMSO del vehículo y adicionalmente con control
recombinante IFN- o PBS. c) La expresión del ARNm del Ace2 pulmonar y
d) Las concentraciones de proteína ACE2 en los pulmones se midieron a las ocho
horas de la administración de PF. Los datos representan la media (+/-) de SEM de
4-5 ratones por grupo de tratamiento, representativa de al menos dos
experimentos independientes. Los datos fueron analizados por la correlación de
rango de Spearman (a) o por el ANOVA unidireccional con el post-test de
Bonferroni (c). *P<0,05 ** P <0,01. ns = no significativo.
Figura 4: Los ratones con deficiencia de receptores de IFN tipo I tienen una
expresión pulmonar reducida de ACE2.
El tejido pulmonar fue cosechado de ratones de tipo salvaje o Ifnar1-/- C57BL/6. a) La
expresión del ARNm del Ace2 pulmonar se midió mediante qPCR y b) la concentración de
proteína del Ace2 pulmonar se midió mediante ELISA. Los datos representan la media
(+/-) de la SEM de 5 ratones por grupo de tratamiento, representativa de por lo menos dos
exprimentes independientes. Los datos se analizaron mediante la prueba T. * P <0,05 ** P
<0,01.
Figura 5: La expresión del ACE2 aumenta en la EPOC y es suprimida por la
administración de fluticasona en los cultivos de células epiteliales bronquiales.
(a) Las células epiteliales bronquiales primarias de 6 sujetos con EPOC y 6 sujetos de
control sanos se cultivaron ex vivo y se trataron con propionato de fluticasona (PF) 10nM
o medio de control. Se recogieron lisados de células. La expresión del ARNm del ACE2 se
midió en la línea de base (b) y a las 24h después de la administración del FP (c) en los
BEC de la EPOC. Los datos se muestran como la mediana (+/- IQR). Comparaciones
estadísticas realizadas con la prueba de la U de Mann Whitney. **P<0.01.
Figura 6 La expresión del ACE2 se incrementa en un modelo de ratón de
EPOC y se suprime con la administración de fluticasona.
a) Los C57BL/6 se trataron por vía intranasal con una dosis única de elastasa o
PBS como control y el tejido pulmonar se cosechó a los 10 ó 17 días. Algunos
ratones fueron tratados con propionato de fluticasona (PF) de control de vehículos
(VEH) a los 10 días, antes de la toma de muestras 24 horas más tarde. b)
Expresión del ARNm del Ace2 pulmonar en ratones tratados con elastasa frente a
los tratados con PBS a los 10 y 17 días después del tratamiento. c) A los 10 días
del tratamiento con elastasa, los ratones C57BL/6 fueron tratados con una dosis
única de 20g de propionato de fluticasona (FP) o control del vehículo (VEH). El
tejido pulmonar se cosechó a las 24 horas de la administración del FP. El ARNm
del ACE2 se midió mediante qPCR (panel izquierdo) y la proteína del ACE2 se
midió mediante ELISA (panel derecho). Los datos representan la media (+/-) de
SEM de 5 ratones por grupo de tratamiento, representativo de al menos dos
exprimentes independientes. Datos analizados por un ANOVA unidireccional con
post-test de Bonferroni. *P<0,05 **P<0,01. ns = no significativo.
 Tabla 1: Características demográficas y clínicas de los pacientes con EPOC incluidas en
los análisis de ARNm de la figura 1 y la figura suplementaria 1
Usuarios No usuarios Valor p
de ICS de ICS
n=18 n=18
Edad 68.5 (61.25 – 73.5) 67 (62.25-70.75) 0.61
Hombre 12 (66.7%) 14 (77.8%) 0.71
FEV1 (% predicho) 65 (50-77) 67 (63-82) 0.43
ORO etapa I/II/III/IV 3/11/2/2 5/10/3/0 -
Exacerbaciones previas en el 1.5 (1-4) 1 (0-1)
año anterior
Fumador actual 6 (33.3%) 7 (38.9%) 1.0
Comorbilidades Diabetes
Hipertensión Obesidad 1 (5.6%) 2 (11.1%) 1.0
2 (11.1%) 0 (0%) 0.49
3 (16.7%) 2 (11.1%) 1.0
3 (16.7%) 2 (11.1%) 1.0
Enfermedad cardíaca Fluticasona 8 (44,4%)
isquémica Budesonida 9 (50%) n/a -
Beclometasona 1 (5,6%)

Sujetos con Sujetos sanos Valor P

EPOC (n=6) (n=6)
Edad 70 (67-71.5) 58 (56.5-60.25) 0.009
Hombre 3 (50%) 5 (83.3%) 0.54
Fumador actual 2 (33.3%) 0 (0%) 0.45
Diabetes mellitus 1 (16.7%) 0 (0%) 1.0
Obesidad 1 (16.7%) 0 (0%) 1.0
Hipertensión 3 (50%) 0 (0%) 0.18
Tabla 2: Variables demográficas y clínicas en la EPOC y sujetos sanos incluidos en los
experimentos de células epiteliales de las vías respiratorias primarias (Figura 5)
Figura suplementaria 1: Expresión del gen del esputo de la BSG en sujetos con
EPOC estratificada según el uso de corticoesteroides inhalados. Se tomaron
muestras de esputo de una cohorte de pacientes con EPOC cuando estaban
clínicamente estables durante al menos 6 semanas. Los pacientes fueron
estratificados según el uso actual o no de corticoesteroides inhalados (ICS). La
expresión del ARNm de la célula del esputo de la BSG se midió por PCR
cuantitativa. Los gráficos de caja y bigotes muestran la mediana (línea dentro de la
caja)), el rango intercuartílico (IQR; caja) y de mínimo a máximo (bigotes).
Comparaciones estadísticas realizadas con la prueba U de Mann Whitney.
Figura suplementaria 2: No hay efecto de la administración de propionato de
fluticasona en la expresión de Tmprss2 o Bsg en el pulmón de un ratón. Los
ratones C57BL/6 fueron tratados por vía intranasal con una única dosis de 20g de
propionato de fluticasona (FP) o control DMSO del vehículo. (a) la expresión del
ARNm de Tmprss2 y (b) de Bsg en el pulmón se midió mediante qPCR a las 8
horas después de la administración de FP. Los datos representan la media (+/-) de
SEM de cinco ratones por grupo de tratamiento, representativa de al menos dos
exprimentes independientes. Datos analizados por un ANOVA unidireccional con
post-test de Bonferroni. *P<0,05 ***P<0,001. ns = no significativo.